专利名称：：一种微生物的固定化方法
技术领域：
：本发明涉及微生物的固定化，具体地说是一种以乳化-内部凝胶化体系固定微生物的海藻酸-壳聚糖微胶囊制备方法。
背景技术：
：固定化微生物技术具有很好的优越性，如微生物在一定空间区域内密度高，微生物流失问题被消除，反应速度加快，发酵后处理过程简便等。即固定化微生物技术构成一种髙效、快速、能连续处理的发酵系统，在很多领域得到广泛应用。在众多的固定化方法中，以海藻酸盐凝胶包埋法使用较多，而且应用的也比较成熟。该方法具有条件温和、细胞稳定性好、承载细胞数量多、不易泄漏等优点(肖美燕，徐尔尼，陈志文.包埋法固定化细胞技术的研究进展.食品科学，2003,24(4):158~161.)。现有海藻酸盐固定化细胞主要釆用喷雾干燥法、锐孔挤出法、滴定法、静电滴定法制备凝胶珠，但这些方法存在许多问题，如不能制备出粒径<200微米的海藻酸钙凝胶珠，且制备规模小，很难实现工业化(刘袖洞，何洋，马小军等.微胶囊及其在生物医学领域的应用.科学通报，2000,45(23):2476~2485)。
发明内容针对上述问题，本发明提出一种新型的微生物细胞固定化制备方法一一乳化-内部凝胶化体系，制备固定微生物的海藻酸-壳聚糖微胶囊。为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为一种微生物固定化方法，以重悬微生物的海藻酸钠溶液和纳米碳酸钙为分散相，液体石蜡或植物油为分散介质，Span85为表面活性剂，通过搅拌乳化形成液滴，再以冰醋酸为凝胶引发剂制备包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠，该凝胶珠与壳聚糖溶液反应交联，形成聚阳离子-聚阴离子络合膜，最终形成包埋微生物的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。本发明实现了微生物固定化微胶囊球型度高、粒径均匀分布、细胞活性高及其规模化制备。具体操作过程如下，1)室温下，将均匀混合有微生物和纳米级碳酸钙的海藻酸钠溶液作为分散相添加到分散介质中，然后搅拌乳化5-10分钟，形成乳液；分散相中海藻酸钠溶液的重量体积浓度为1.5-2.0%，分散相中纳米级碳酸每的重量体积浓度为0.010.-0.020%;所述分散介质为含有span85的液体石蜡或植物油，分散相与分散介质的体积比为1:2-20;分散相中微生物种子的浓度为1(r-l(Tcfu/ml;分散介质中span85的体积百分含量为0.O5-/。；2)在上述乳液中加入含有体积浓度为5-10%冰醋酸的液体石蜡或植物油调节乳液P^4-6，继续搅拌5-IO分钟，形成包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠，加入过量去离子水静置10分钟；3)用筛网将上述步骤中得到的混合液进行过滤并用含有质量百分含量为1%的tween80的水溶液进行反复冲洗，收集凝胶珠；4)将包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠与壳聚糖溶液反应8-30分钟，形成包埋有微生物的海藻酸-壳聚糖微胶囊，膜厚在5-50iam;海藻酸钙凝胶珠与壳聚糖溶液体积比为1:2-5;壳聚糖溶液的重量体积浓度为0.1-1%。所述步骤l)中搅拌乳化釆用的搅拌器转速为100-1000转/分；所述步骤2)中去离子水与乳液的体积比为1:2-5;所述步骤3)中筛网目数为40-200目；所述步骤4)中壳聚糖脱乙酰度>90%，粘均分子量10-150KDa。本发明具有如下优点1.设备简单，易于操作。本发明采用的固定化微生物的乳化体系，所使用的机械设备只有一种简单的机械搅拌器，且操作步骤简单。2.产量可控，能实现规模化。本发明釆用的固定化微生物的乳化体系，制备微胶囊的产量高，易于放大，可规模化生产，适合于微生物细胞的高密度、规模化培养。3.微生物活性高，且微胶囊在培养液中稳定，细胞不易泄漏。本发明采用的固定化微生物的乳化体系，制备条件温和，制备过程中微生物细胞活性保持良好，细胞泄漏率较低，适合于酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌、硝化细菌等多种微生物的固定化包埋、培养。4.微胶囊粒径小，改善溶质扩散。本发明釆用的固定化微生物的乳化体系，制备出微胶囊粒径较小，更有利于营养物质和代谢产物在微囊内扩散。总之，与传统的海藻酸钙凝胶固定化技术相比，本发明方法具有设备简单、操作方便、细胞活性高、可规模化生产的优点。图1a为海藻酸钠液体石蜡体积为2:3时微胶囊的粒径及粒径分布图。图1b为海藻酸钠液体石蜡体积为h3时微胶囊的粒径及粒径分布图。图2a为本发明工艺固定后酵母菌存活率。图3a为本发明制备的海藻酸-壳聚糖微囊化酵母菌培养初始Oh的显微照片。图3b为本发明制备的海藻酸-壳聚糖微囊化酵母菌培养12h的显微照片。图3c为本发明制备的海藻酸-壳聚糖微囊化酵母菌生长曲线，其中，固定化的酵母菌为处理组；游离酵母菌为对照组。图4为本发明制备的海藻酸-壳聚糖微囊化乳酸菌初始显微镜照片。图5为本发明工艺制备的固定化后的乳酸菌存活率。图6为本发明工艺制备的固定化乳酸菌生长曲线，其中，固定化的乳酸菌为处理组；游离乳酸菌为对照组。图7为本发明工艺制备的固定化后的大肠杆菌存活率。图8为本发明制备的海藻酸-壳聚糖微囊化乳酸菌培养14h显微镜照片。图9为本发明工艺制备的固定化大肠杆菌生长曲线，其中，固定化的大肠杆菌为处理组；游离大肠杆菌为对照组。具体实施方式实施例11)室温下，将均勾混合有啤酒酵母和纳米级碳酸钙的海藻酸钠溶液作为分散相添加到分散介质中，然后在搅拌器转速为150转/分搅拌乳化5分钟，形成乳液；分散相中海藻酸钠溶液的重量体积浓度为1.5%，分散相中纳米级碳酸钩的重量体积浓度为0.020%;所述分散介质为含有span85的液体石蜡，分散相与分散介质的体积比为1:3;分散相中微生物种子的浓度为105cfu/ml;分散介质中span85的体积百分含量为0.1%;2)在上述乳液中加入含有体积浓度为5%冰醋酸的液体石蜡调节乳液pH=6，继续搅拌5-10分钟，形成包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠，加入相当于乳液体积2倍的去离子水静置10分钟；3)用200目的筛网将上述步骤中得到的混合液进行过滤并用含有tween8G的水溶液进行反复冲洗，收集凝胶珠；4)将包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠与分子量为20kDa,脱乙酰度为99%的壳聚糖溶液反应IO分钟，形成包埋有酿酒酵母的海藻酸-壳聚糖微胶囊，膜厚在20)im;海藻酸钙凝胶珠与壳聚糖溶液体积比为1:3;壳聚糖溶液的重量体积浓度为0.1%。釆用本发明提出的微生物固定化方法，用激光粒度仪(美国Beckman-Coulter公司LS-100Q型)检测微胶囊粒径结果，力(/油比1:3时，微胶囊平均粒径为255|am(见附图1、表1)。表l不同水/油比时微胶囊的粒径及粒径分布<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>^:微胶囊平均粒径，CT:单分散系数以啤酒酵母为模型，用本发明提出的微生物固定化方法，制备的包埋啤酒酵母的海藻酸-壳聚糖微胶囊，在制备过程中，酵母菌活性保持在80%以上(见附图2)。以啤酒酵母为模型，用本发明提出的微生物固定化方法，制备的包埋啤酒酵母的海藻酸-壳聚糖微胶囊，摇瓶培养12h后，酵母菌聚集成团，生长状态良好，微胶囊无破碎(见附图3a,b);酵母菌生长曲线表明，该工艺制备的微囊化酵母菌增殖速度明显高于游离培养组(见附图3c)。实施例2除分散相与分散介质的体积比为2:3外，其它条件同具体实施例1。该条件下，微胶囊平均粒径为372(im(见附图1、表1)。实施例31)室温下，将均匀混合有乳酸菌和纳米级碳酸钙的海藻酸钠溶液作为分散相添加到分散介质中，然后在搅拌器转速为1000转/分搅拌乳化10分钟，形成乳液；分散相中海藻酸钠溶液的重量体积浓度为2.0%，分散相中纳米级碳酸钩的重量体积浓度为0.010%;所述分散介质为含有span85的植物油，分散相与分散介质的体积比为1:5;分散相中微生物种子的浓度为106cfU/ml;分散介质中span85的体积百分含量为2%;2)在上述乳液中加入含有体积浓度为10%冰醋酸的植物油调节乳液pH=5,继续搅拌10分钟，形成包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠，加入相当于乳液体积5倍的去离子水静置10分钟；3)用200目的筛网将上述步骤中得到的混合液进行过滤并用含有tween80的水溶液进行反复冲洗，收集凝胶珠；4)将包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠与分子量为20kDa,脱乙酰度为99。/。的壳聚糖溶液反应IO分钟，形成包埋有酿酒酵母的海藻酸-壳聚糖微胶囊，膜厚在20jam;海藻酸努凝胶珠与壳聚糖溶液体积比为1:5;壳聚糖溶液的重量体积浓度为1.0%。该工艺制备的微胶囊的平均粒径为168.34jam,C.V值为24.3%。以乳酸菌为模型，用本发明提出的微生物固定化方法，制备的固定乳酸菌的海藻酸-壳聚糖微胶囊，在制备过程中，乳酸菌活性保持在70%以上(见附图5)。以乳酸菌为模型，用本发明提出的微生物固定化方法，制备的固定乳酸菌的海藻酸-壳聚糖微胶囊，摇瓶培养14h后，乳酸菌聚集成团，生长状态良好，微胶囊无破碎(见附图8);乳酸菌生长曲线表明，该工艺制备的微囊化乳酸菌增殖速度明显高于游离培养组(见附图6)实施例41)室温下，将均勾混合有大肠杆菌和纳米级碳酸钙的海藻酸钠溶液作为分散相添加到分散介质中，然后在搅拌器转速为400转/分搅拌搅拌乳化8分钟，形成乳液；分散相中海藻酸钠溶液的重量体积浓度为1.8%,分散相中纳米级碳酸钩的重量体积浓度为0.015%;所述分散介质为含有span85的液体石蜡，分散相与分散介质的体积比为1:20;分散相中微生物种子的浓度为10"cfu/ml;分散介质中span85的体积百分含量为1%;2)在上述乳液中加入含有体积浓度为7%冰醋酸的液体石蜡调节乳液pH=4,继续搅拌18分钟，形成包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠，加入过量去离子水静置10分钟；3)用200目的筛网将上述步骤中得到的混合液进行过滤并用含有tween80的水溶液进行反复冲洗，收集凝胶珠；4)将包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠与分子量为100kDa,脱乙酰度为99%的壳聚糖溶液反应30分钟，形成包埋有酿酒酵母的海藻酸-壳聚糖微胶囊，膜厚在3Gnm;海藻酸每凝胶珠与壳聚糖溶液体积比为1:4;壳聚糖溶液的重量体积浓度为0.5%。该工艺条件下制备的微胶囊凝胶珠平均粒径238.22nm，C.V值为28.1%。以大肠杆菌为模型，用本发明提出的微生物固定化方法，制备的包埋大肠杆菌的海藻酸-壳聚糖微胶囊，在制备过程中，大肠杆菌活性保持在80%以上(见附图7)。大肠杆菌生长曲线表明，该工艺制备的微囊化大肠杆菌增殖速度明显高于游离培养组(见附图9)。权利要求1.一种微生物固定化方法，其特征在于以重悬微生物的海藻酸钠溶液和纳米碳酸钙为分散相，液体石蜡或植物油为分散介质，Span85为表面活性剂，通过搅拌乳化形成液滴，再以冰醋酸为凝胶引发剂制备包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠，该凝胶珠与壳聚糖溶液反应交联，形成聚阳离子-聚阴离子络合膜，最终形成包埋微生物的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。2.按照权利要求l所述的固定化方法，其特征在于具体操作过程如下，1)室温下，将均匀混合有微生物和纳米级碳酸钙的海藻酸钠溶液作为分散相添加到分散介质中，然后搅拌乳化5-10分钟，形成乳液；分散相中海藻酸钠溶液的重量体积浓度为1.5-2.0%,分散相中纳米级碳酸钩的重量体积浓度为0.010-0.020%;所述分散介质为含有span85的液体石蜡或植物油，分散相与分散介质的体积比为1:2-20;分散相中微生物种子的浓度为104-10"cfu/ml;分散介质中span85的体积百分含量为0.05-2%;2)在上述乳液中加入含有体积浓度为5-10%冰醋酸的液体石蜡或植物油调节乳液P^4-6,继续搅拌5-10分钟，形成包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠，加入过量去离子水静置10分钟；3)用筛网将上述步骤中得到的混合液进行过滤并用含有质量百分含量为1%的tween80的水溶液进行反复冲洗，收集凝胶珠；4)将包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠与壳聚糖溶液反应8-30分钟，形成包埋有微生物的海藻酸-壳聚糖微胶囊，膜厚在5-50jam;海藻酸钙凝胶珠与壳聚糖溶液体积比为1:2-5;壳聚糖溶液的重量体积浓度为0.1-1%。3.按照权利要求2所述的固定化方法，其特征在于所述步骤l)中搅拌乳化釆用的搅拌器转速为100-1000转/分。4.按照权利要求2所述的固定化方法，其特征在于所述步骤2)中去离子水与乳液的体积比为1:2-5。5.按照权利要求2所述的固定化方法，其特征在于所述步骤3)中筛网目数为40-200目。6.按照权利要求2所述的固定化方法，其特征在于所述步骤4)中壳聚糖脱乙酰度>90%,粘均分子量10-150KDa。全文摘要本发明涉及微生物固定化，其以重悬微生物的海藻酸钠溶液和纳米碳酸钙为分散相，液体石蜡或植物油为分散介质，Span85为表面活性剂，通过搅拌乳化形成液滴，再以冰醋酸为凝胶引发剂制备包埋有微生物的海藻酸钙凝胶珠，该凝胶珠与壳聚糖溶液反应交联，形成聚阳离子-聚阴离子络合膜，最终形成包埋有微生物的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。该方法制备过程条件温和，仪器设备要求简单，易规模化，且制备过程中微生物细胞活性保持良好，细胞泄漏率较低。因此，该技术适合酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌、硝化细菌等多种微生物的固定化包埋，实现微生物的高密度和规模化培养。文档编号C12N11/04GK101319210SQ20071001163公开日2008年12月10日申请日期2007年6月8日优先权日2007年6月8日发明者于炜婷,吕国军,孙志杰,林军章,马小军申请人:中国科学院大连化学物理研究所