专利名称：：一种利用中国红豆杉细胞诱导产生紫杉烷的方法
技术领域：
：本发明涉及植物细胞培养技术，具体地说是一种大幅度提高中国红豆杉细胞培养生产紫杉烷的产量并促使其外泌，同时诱导新紫杉烷化合物产生的方法。紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌、乳腺癌的一线用药，是迄今为止少数几个最具抗癌活性的天然化合物之一，每年有数十亿美元的销售额，但药源问题仍然是紫杉醇研究者们要解决的首要问题。全世界能够生产紫杉醇的植物种类不多，生长缓慢，紫杉醇的含量极低，即使在含量最高的树皮中平均也只有万分之一点五。而通过砍伐红豆杉属植物来获取紫杉醇严重破坏生态平衡和生物多样性，最终将导致资源枯竭。紫杉醇化学全合成虽然早已成功，但合成路线长，产率低，成本高，不能商业化生产。半合成是目前临床应用紫杉醇的主要来源，半合成的前体为由红豆杉枝叶中分离得到的baccatinIII(巴卡亭III)或10—deacetylbaccatinIII(10_脱乙酰基巴卡亭ni)，但依然远远满足不了临床及实验的需要。利用植物细胞培养方法生产紫杉醇因其环境友好、生产周期短、可控性强等优点日益受到人们的重视。但不产紫杉醇或紫杉醇产率低仍然是该项技术普遍面临的难题。在努力拓展紫杉醇的药源并提高紫杉醇产量的同时，科学家亦投身到紫杉烷类化合物的研究中，期望找到抗癌活性更好的紫杉垸类化合物或者找到合适的先导化合物。已经有几百种紫杉烷从紫杉原植物或细胞培养液中分离出来。云南紫杉烷Tc(TaxuyunnanineC)是一种具有类神经生长因子(NGF)活性的化合物，能够强化NGF的作用，有利于老年痴呆症(Alzheimer'sdisease)的治疗。Tc与紫杉醇同属于三环二萜类化合物。其结构式如下
背景技术：
Tc被推测是紫杉醇生物合成途径中的代谢中间产物，可以作为紫杉醇或其它有用化合物合成的前体，具有潜在的商业价值。自从在中国红豆杉悬浮细胞培养体系中发现含量较高的TC以来，华东理工大学的钟建江教授所在的生物反应器国家重点实验室使用各种调控技术提高Tc的产量，使Tc产量在1升气升式反应器中达到612mg/L。后来他们实验室又与钱旭红教授合作，使用后者合成的新诱导子，使得摇瓶中Tc的最高产量达827mg/L，反应器中Tc的最高产量达738mg/L。Choietal.Tc在中国红豆杉细胞培养第35天获得Tc的最高产量为885.9mg/L。综观提高Tc产量所使用的各种调控技术，均着眼于对Tc生物合成途径的调控，很少关注对Tc后生物合成途径—即Tc合成后贮存和转运方面的调控。这正是我们这项技术的发明点所在通过在中国红豆杉悬浮细胞培养体系中添加合适的吸附剂，使Tc由胞内被高效地吸附到胞外，从而解决高含量Tc累积在胞内时对细胞生长的伤害，对Tc进一步生产的阻遏。这项既对Tc生物合成过程进行调控亦对其后生物合成过程进行调控的技术大大增加了Tc产量进一步提高的空间和潜力。在中国红豆杉悬浮培养体系中，通过诱导剂诱导、补糖添加及吸附剂联合调控来提高云南紫杉垸产量，还未见报道。
发明内容本发明的目的是提供一种利用中国红豆杉(Taxiischinensis)悬浮培养体系，以诱导剂重复诱导、补糖及吸附剂添加相结合的联合调控手段提高云南紫杉垸产量同时诱导新紫杉垸化合物产生的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为将中国红豆杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50200g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中加入浓度为12000uM的诱导剂、50-200g的无菌吸附剂和1050g的糖；在细胞指数生长中期，再次加入浓度为l2000uM的诱导剂；所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子。所述非生物诱导剂为硝酸银、水杨酸或茉莉酸及其衍生物，所述糖为蔗糖或葡萄糖；所述衍生物为甲基茉莉酸酮酯(MJA)、2—羟乙基茉莉酸(HEJA)、3—氟乙基茉莉酸(TFEJA)或2，3-二羟丙基茉莉酸(DHPJA)。中国红豆杉细胞的培养条件为旋转式摇床，转速60200rpm，培养温度为2030。C，暗培养；培养周期为1530天，每隔14-20天传代一次；所述细胞指数生长初期是指细胞接种于培养基后的第410天，即诱导剂的第一次添加时间；细胞指数生长中期是指细胞接种于培养基后的第1015天，即诱导剂的第二次添加时间；在第一次添加诱导剂和第二次添加诱导剂的期间还可添加紫杉烷的的合成前体0.252.0克/每升培养基；合成前体可为醋酸钠或苯甲酸。所述吸附剂为经处理对紫杉烷类化合物有较强的吸附能力并对细胞无毒的多孔材料，如各种大孔吸附树脂。中国红豆杉细胞的常用培养基组成为，于MS基础培养基中添加0.l1.0mg/L6—节基腺嘌呤，0.10.5mg/L2，4一二氯苯氧乙酸，0.11.0mg/L萘乙酸，20200mg/L抗坏血酸及1060g/L蔗糖，pH值为5.56.5。本发明方法原理在添加诱导剂和补糖同时添加特定种类和浓度的吸附剂能显著提高Tc产量，其主要原因有以下三方面1、诱导剂能有效刺激植物细胞次生代谢能力，促进紫杉垸的生物合成生产；2、通过补糖可弥补因细胞快速生长和代谢造成的碳源不足；3、通过特定吸附剂加入使细胞壁上的紫杉垸外泌到胞外，从而解除了产物的反馈抑制，避免了紫杉垸存在于胞内时对细胞生长的伤害及对进一步生产的阻碍，同时也避免了紫杉烷在胞内的降解。本发明具有如下优点1、联合应用重复诱导、添加补料和吸附剂来促进中国红豆杉细胞云南紫杉垸Tc的生产，获得的产量大大超出目前文献报道的最高值。目前文献报道的在摇瓶中培养中国红豆杉细胞，其云南紫杉烷Tc的最高产量为827±29mg/L，而本调控手段可使Tc最高产量达1830.42±62.69mg/L，为文献报道最高值的2.2倍。2、本发明使得云南紫杉垸Tc90%以上外泌，被吸附到吸附剂里。这就大大简化了提取分离纯化的操作，降低了成本，为进一步工业化生产提供了很大的可能性。3、本发明同时还得到了两个新的紫杉院，为紫杉烷及紫杉醇生物合成途径的研究提供了新的线索。在联合诱导培养体系中，提取分离纯化得到的两种新紫杉烷为2—脱乙酰基云南紫杉垸C和2，14-脱乙酰基云南紫杉烷C。2，14-脱乙酰基云南紫杉烷C是首次发现的新紫杉烷化合物。4、本发明还可同前体添加等其它技术相结合，进一步提高紫杉烷的产5、本发明的细胞培养条件可以保证细胞快速生长并保证良好的均一性。图1为实施例3第3组实验Tc胞内外分配情况图。具体实施方式以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一步说明。一种利用中国红豆杉细胞诱导产生紫杉垸的方法，包括以下步骤(1)中国红豆杉细胞的培养本实验细胞株最初由中国红豆杉(T.Chinesis)幼茎诱导的愈伤组织悬浮培养而来，采用文献公开的Murashige-Skoog(MS)培养基，添加0.l1.0mg/L6—节基腺嘌呤，0.10.5mg/L2，4一二氯苯氧乙酸，0.11.0mg/L萘乙酸，20200mg/L抗坏血酸及1060g/L蔗糖，pH值为5.56.5。每隔14天传代一次，使用旋转式摇床，转速60200rpm,培养温度为2030(2)Tc的联合诱导生产将步骤(l)所获得的中国红豆杉细胞置于含上述培养基的摇瓶中培养，细胞接种量为50200g/L湿重。培养条件为旋转式摇床，转速60200rpm，培养温度为203CTC，暗培养。培养周期为1530天。在摇瓶培养过程中利用诱导剂进行诱导，在细胞指数生长前期和中期分别进行一次诱导，培养基中诱导剂添加的最终浓度为12000uM。在第一次添加诱导剂的同时进行补糖，补加量为1050g/L，所加的糖为蔗糖。在第一次添加诱导剂的同时添加吸附剂，加入量为50g/L以上。由获得的培养物分离得到细胞部分和吸附剂部分，分别提取Tc。Tc生产率最高可达80.67mg/(Ld)，最高产量可达1830.42mg/L。(3)Tc的提取和测定取100mg干细胞粉末(或250mg吸附剂)，加4mL1:1(v/v)的甲醇&二氯甲垸，室温超声提取3h并4000rpm离心10min，上清液旋转蒸发，蒸干后溶于4mL二氯甲烷，以lmL纯净水萃取4次，每萃取1次4000rpm离心5min，弃去水层。二氯甲烷层旋转蒸发，溶于lmL色谱纯甲醇，0.22um膜过滤，备做HPLC。HPLC采用Agilent1100高效液相色谱仪，检测波长为227nm。色谱柱采用中国科学院大连化学物理研究所102组一快速分析与检测课题组装填的AlkylPhenyl柱(4.6腿X250mm，5ym)，流动相为乙腈水=58:42，流速1.0mL/min，进样量10uL。(4)新紫杉烷化合物的制备、纯化及结构鉴定收集几批实验中吸附了紫杉烷的吸附剂，以8倍体积甲醇二氯甲垸l:l(v/v)室温超声提取3h，提取液旋转蒸发，溶于色谱纯甲醇，过滤，准备做制备。制备工作在中国科学院大连化学物理研究所1804组一药物化学课题组完成。制备色谱仪为watersDP4000，制备色谱柱为CAPCELLPAKC18柱(Type:UG80，SIZE:20X250腿，5Mm)，流动相为乙腈水=60:40，流速-15ml/min。经制备得到两个较纯化合物，但经TLC检测发现不是单一的点，继续做硅胶柱层析纯化。两个样品分别以石油醚丙酮=90:10和95:5洗脱，收集得到纯品。两个纯品已经中国科学院上海药物研究所进行了结构鉴定，结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>2—脱乙酰基云南紫杉烷C，分子式C26H3807分子量462.26。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>实施例1采用中国红豆杉悬浮细胞；培养条件lOOmL摇瓶悬浮培养，采用MS培养基，另添加0.2mg/L2，4_二氯苯氧乙酸，0.5mg/L萘乙酸，0.5mg/L6—苄基腺嘌呤，100mg/L抗坏血酸及30g/L蔗糖。将过滤得到的2g湿细胞接种到含有20mL上述培养基的摇瓶中，旋转式摇床转速100rpm，25"C培养。第7天添加MJA至最终浓度为100pM，同时添加100g/LXAD-7,继续培养至21天，收获细胞并在5(TC干燥。细胞密度在第15天达到最高(干重12.7g/L)。Tc分析测定结果如下表(*代表最大值)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>同时得到两种云南紫杉烷Tc的衍生物2，14-脱乙酰基云南紫杉烷C和2—脱乙酰基云南紫杉烷C。实施例2培养条件同实施例1，在第7天添加DHPJA至最终浓度为100uM，同时添加100g/LXAD-7HP，继续培养至21天。细胞密度在第12天达到最高(干重13.2g/L)。Tc的生产能力见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>同时得到两种云南紫1杉烷Tc的衍3fe物2，14-脱乙酰基云南紫杉垸C和2—脱乙酰基云南紫杉烷C。实施例3培养条件同实施例1，第一组在第7天添加DHPJA至100tiM，同时补加蔗糖20g/L;第二组在第7天和第12天分别添加DHPJA至100uM，在第7天补加蔗糖20g/L;第三组在第7天和第12天分别添加DHPJA至100uM，在第7天补加蔗糖20g/L，同时添加XAD-7100g/L，继续培养至21天，细胞密度在第21天达最高(干重18.4g/L)。Tc的生产能力见下表。第一组(同时诱导和补糖)培养时间(天)Tc含量(mg/gDW)Tc产量(mg/L)Tc产率(mg/(L'd))<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第二组(补糖和重复诱导)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第三组(补糖、添加吸附剂和重复诱导)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>同时得到两种云南紫杉垸Tc的衍生物2，14-脱乙酰基云南紫杉烷C和2—脱乙酰基云南紫杉垸C。实施例4培养条件同实施例1，在第7天和第12天分别添加DHPJA至100iiM，在第7天补加蔗糖20g/L，同时添加XAD-7HP100g/L，继续培养至30天。细胞密度在第18天达到最高(干重17.lg/L)。Tc的生产能力见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>同时得到两种云南紫杉烷Tc的衍牛物2，14-脱乙酰基云南紫杉烷C和2—脱乙酰基云南紫杉烷C。权利要求1.一种利用中国红豆杉细胞诱导产生紫杉烷的方法，其特征在于将中国红豆杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50～200g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中加入浓度为1～2000μM的诱导剂、50-200g的无菌吸附剂和10～50g的糖；在细胞指数生长中期，再次加入浓度为1～2000μM的诱导剂；所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子。2.按照权利要求1所述方法，其特征在于:所述非生物诱导剂为硝酸银、水杨酸或茉莉酸及其衍生物，所述糖为蔗糖或葡萄糖。3.按照权利要求2所述方法，其特征在于:所述衍生物为甲基茉莉酸酮酯、2—羟乙基茉莉酸、3—氟乙基茉莉酸或2，3-二羟丙基茉莉酸。4.按照权利要求1所述方法，其特征在于:所述中国红豆杉细胞的培养条件为旋转式摇床，转速60200rpm，培养温度为2030。C，暗培养；培养周期为1530天，每隔14-20天传代一次。5.按照权利要求1所述方法，其特征在于:所述细胞指数生长初期是指细胞接种于培养基后的第410天，即诱导剂的第一次添加时间。6.按照权利要求1所述方法，其特征在于:所述细胞指数生长中期是指细胞接种于培养基后的第1015天，即诱导剂的第二次添加时间。7.按照权利要求l所述方法，其特征在于在第一次添加诱导剂和第二次添加诱导剂的期间还可添加紫杉烷的的合成前体O.252.0克/每升培养基。8.按照权利要求1所述方法，其特征在于:所述合成前体为醋酸钠或苯甲酸。9.按照权利要求l所述方法，其特征在于所述吸附剂为经处理对紫杉烷类化合物有较强的吸附能力并对细胞无毒的多孔材料，如各种大孔吸10.按照权利要求l所述方法，其特征在于:所述中国红豆杉细胞的常用培养基组成为，于MS基础培养基中添加O.11.0mg/L6—苄基腺嘌呤，0.10.5mg/L2，4—二氯苯氧乙酸，0.11.0mg/L萘乙酸，20200mg/L抗坏血酸及1060g/L蔗糖，pH值为5.56.5。全文摘要本发明涉及植物细胞培养技术，具体地说是一种利用中国红豆杉细胞诱导产生紫杉烷的方法，将中国红豆杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50～200g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中加入浓度为1～2000μM的诱导剂、50-200g的无菌吸附剂和10～50g的糖；在细胞指数生长中期，再次加入浓度为1～2000μM的诱导剂；所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子。本发明因绝大部分紫杉烷类化合物外泌到胞外被吸附到吸附剂上，因而大大简化了提取分离纯化的操作，从而降低了成本，易于实现工业化生产。另外，由于本发明可诱导产生新的紫杉烷化合物，紫杉烷作为一线抗癌药物—紫杉醇的前体化合物，该技术有重要的商业应用前景。文档编号C12N5/04GK101319199SQ20071001162公开日2008年12月10日申请日期2007年6月8日优先权日2007年6月8日发明者卫张,虞星炬,金美芳,高明波申请人:中国科学院大连化学物理研究所