专利名称：清除动物皮中抗原物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种清除动物皮中抗原物质的方法，属于生物医用材料的加工领域。
背景技术：
我们知道，皮胶原是胶原中的一个大家族，主要是I型和III型胶原，是哺乳动物体内结构组织的主要成分，构成人体大约30％的蛋白质。据报道，迄今为止，已发现的胶原类型共有18种或19种(阎隆飞，孙之荣《蛋白质分子结构》.北京清华大学出版社，1999)。概括地说，胶原的生物学性质主要表现在以下4个方面，即(1)低抗原性；(2)在人体内被吸收的特性；(3)诱导细胞增殖、生长；(4)促进血小板凝结。(但卫华，王坤余，曾睿等，胶原的医学应用及其发展前景，《生物医学工程与临床》.2004，8(1)45-48)动物真皮胶原是一种天然生物材料，具有较好的生物相容性，较弱的抗原性，且亲水性好，对细胞的吸附作用强。由于它本身就是一种细胞外基质成分，还兼具诱导细胞增殖和分化的作用。因此，长期以来，人们利用动物真皮胶原的性能特点，研究开发出一系列胶原基生物医用材料，如生物敷料、人工皮肤、生物医用膜、止血海绵、脱细胞真皮基质材料、可注射胶原溶液以及组织工程支架材料等等，部分胶原基生物医用材料已应用于临床，被证明具有一定的疗效。
实践证明，胶原基生物医用材料所面临的最大问题是生物相容性在制造过程中难以控制，因而，易导致胶原基生物医用材料在使用过程中的可靠性和安全性的问题。例如，美国生产的一种用于除皱美容的可注射胶原溶液，就是因为临床应用时有20％的人过敏而不能打开市场。如前所述，皮胶原具有低抗原性，但这种低抗原性在一定条件下也会影响材料的生物相容性，发生超急性排斥反应。这可能就是迄今为止胶原基生物医用材料的可靠性和安全性仍然是难以解决的根源所在。
所谓抗原，是指一组能被T或B细胞识别的有机物质，包括多肽、寡糖及脂质酸等小分子，其化学成分常不同于宿主细胞自身的化学组成而能被T及B细胞识别。
我们业已定性地查明，在动物皮中存在的抗原物质主要是(1)动物皮的表皮细胞、其它细胞成分及其碎片；(2)原胶原分子中的“端肽”，即原胶原分子的多肽链中的氨基末端(N端)和羧基末端(C端)。这两个区域，属于非螺旋区，具有很大的种属差异性，起到主要的免疫原性作用。这种免疫原性作用可能在制备胶原溶液或膜材料时会表现出来，而在脱细胞真皮基质材料中因为一般没有“端肽”结构(实际上是端肽未被“活化”)，而不会有任何表达；(3)动物真皮胶原纤维之间的细胞成分；(4)其它小分子物质，主要包括非胶原蛋白的降解产物或某些外源性化学物质等。由于这些抗原物质的存在，导致了胶原基生物医用材料的可靠性和安全性极不稳定，因而，严重地限制了胶原基生物医用材料的应用和发展。
如上所述，彻底清除动物皮胶原中的抗原，就等于打开了生物材料资源的一个重要宝库，其前景无论怎样评价都不过分。特别值得一提的是，随着干细胞及其应用研究的不断深入，动物皮作为胶原基生物医用材料的理想原料，将会发挥越来越重要的作用。
以往有关清除动物皮中抗原物质的报道，一般仅限于脱细胞作用。这种脱细胞作用，主要是依赖于NaCl、表面活性剂和某种特殊的酶制剂来实现的。这种方法常用来制备脱细胞真皮基质材料。当需要采用酸解或酶解的方法来提取皮胶原时，水解后的皮胶原的肽链中，可能包括带有“端肽”的链段，这种链段可能具有免疫原性，因而，属于抗原物质。这种抗原物质的存在，成为胶原基生物医用材料的可靠性和安全性屡屡受到质疑的根本原因。
已有技术仅考虑了存在于动物皮内的一种抗原物质——细胞，而没有全面考虑到其它抗原物质的存在及其危害，且尚有以下不足(1)脱细胞方法复杂，且不具有可控性；(2)不适于工业化生产；(3)目标单一。
发明内容
本项发明的目的是针对已有技术的不足而提供一种清除动物皮中抗原物质的方法，其特点是利用超临界流体处理器及某些化学试剂，在维持动物皮的三维组织构造不变的前提下，彻底清除存在于动物皮中的抗原物质，为利用动物皮胶原制备安全、可靠的生物医用材料奠定良好的基础。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原材料份数除特别说明外，均为重量份数。
清除动物皮中的抗原物质的方法(1)选取健康的动物，经屠宰，剥下皮，取其新鲜皮100份，放入转鼓中，加入温度28-36℃水200-500份，渗透剂JFC 5-30份，转动30-120min，控干废液。再加入温度为28-36℃水200-500份，盖好转鼓门，转动30 120min。如此反复操作3-5次。然后，充分水洗，用离心机脱水。
(2)从离心机中取出动物皮，放入超临界流体处理器内，加入平平加5-20份、洗衣粉5-30份和渗透剂JFC 3-10份，在温度0-40℃、压力7.0-30.0Mpa的条件下处理20-240min。
(3)从超临界流体处理器内取出动物皮，放入转鼓中，加入常温水200-500份，盖好转鼓门，转动30-120min，控干废液。再加入常温200-500份，盖好转鼓门，转动30-120min。如此反复操作3-4次。充分水洗之后，用离心机脱水。
(4)从离心机中取出动物皮，放入超临界流体处理器内，加入复合酶皮胶原处理剂E-895 2-10份，平平加3-15份，在温度0-30℃、压力7.2-25.0Mpa的条件下，处理30-120min。加入硫化钠0.5-8份、氢氧化钠0.5-5份和氧化钙5-10份，在温度0-30℃、压力7.2-25.0Mpa的条件下处理40-90min。加入加酶浸灰助剂EA 0.3-5重量份，在温度0-30℃、压力7.2-25.0Mpa的条件下处理30-240min。
(5)从超临界流体处理器内取出动物皮，放入转鼓中，加入常温水200-500份，盖好鼓门，转动30-120min。控干废液。再加入常温水200-500份，盖好转鼓门，转动30-120min。然后，充分水洗。加入温度为28-34℃水200-400份、氯化铵或硫酸铵1.0-8.0份、硫酸0.1-0.8份和平平加0.2-1.0份，转动40-180min。控干废液。加入常温水200-500份，盖好转鼓门，转动30-120min，控干废液。再加入常温水200-500份，盖好转鼓门，转动30-120min。充分水洗之后，将动物皮取出，用离心机脱水。
(6)从经脱水后的动物皮上取样，检测，判定动物皮中抗原物质的清除效果。达到要求后，即可按常规方法进行后续操作。
本发明中所用的动物皮为新鲜的无病毒感染的、无皮肤病及无病史的动物皮，若为猪、牛、羊家畜皮，则应选取未用饲料喂养的猪、牛、羊家畜。
本发明中所用转鼓为悬挂式木转鼓或不锈钢转鼓。
本发明采用光学显微镜观察检测的方法来判别动物皮中抗原物质的清除效果，具体方法是首先，随机抽取待测样品，从待测样品上取15mm×15mm大小的材料作为试样，放入10％中性甲醛溶液中固定24h；其次，用冷冻切片机进行组织切片，切片厚度为0.8μm；再次，采用铁苏木素法对其进行染色，脱水，然后用树胶封固；最后，在高级光学显微镜进行组织切片观察。皮胶原纤维呈红色，细胞核呈暗褐色，表皮呈黄色，肌肉呈黄色。经本发明处理的胶原，应只含有胶原纤维，呈红色。故在光镜下观察未见暗褐色与黄色、只见红色即为合格样品。
本发明处理过的动物皮胶原，主要用于1.制备3D-SC人工皮肤材料。
2.酸解或酶解后作为胶原基生物医用材料(如医用胶原膜、手术缝线、止血海绵、可注射胶原溶液等)的原料。
3.制备组织工程支架材料。
4.制备组织重建基质材料。
本发明具有以下优点1.在维持动物皮胶原的三维组织构造的前提下，快捷、高效地清除了动物皮胶原的纤维间质、细胞及其碎片等抗原物质以及其它一切非胶原成分。经处理后的动物皮适合多种用途。
2.方法简便易行，快速高效，为制备一系列具有良好生物相容性、适当生物降解速率的生物医用材料奠定了良好的基础。
3.开辟了动物皮胶原医学利用的崭新道路，可以避免采用动物肌腱、鼠尾腱等提取胶原所存在的资源短缺的困难和问题。
4.为其它类型胶原中抗原的清除提供了可靠的借鉴方法，本方法也可推广应用到其它类型的胶原中的抗原物质的清除。
5.具有显著的经济效益、社会效益和环境效益。
四
图1为皮胶原组织构造的光镜图之一由图1可见，皮胶原纤维分散良好，皮胶原纤维间洁净、不含杂质，皮胶原纤维编织规则，确认为合格。
图2为皮胶原组织构造的光镜图之二由图2可见，皮胶原纤维分散良好，皮胶原纤维间洁净、不含杂质，皮胶原纤维编织较为疏松，确认为合格。
图3为皮胶原组织构造的光镜图之三由图3可见，皮胶原纤维分散良好，但皮胶原纤维间含有较多杂质，确认为不合格。
图4为皮胶原组织构造的光镜图之四由图4可见，皮胶原纤维分散良好，但皮胶原纤维间含有少量杂质，仍确认为不合格。
五具体实施例方式
下面通过实施例对本发明进行具体地描述，有必须在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1(1)选取健康的猪，经屠宰，剥下皮，取新鲜猪皮100kg，放入转鼓中，加入温度为28℃的水220kg，渗透剂JFC 8kg，盖好转鼓门，转动60min，控干废液。再加入温度为28℃水220kg，盖好转鼓门，转动60min。如此反复操作3次。然后，充分水洗，用离心机脱水。
(2)从离心机中取出猪皮，放入超临界流体处理器内，加入平平加O 8kg、洗衣粉5 kg和渗透剂JFC 3kg，在温度5℃、压力9.0Mpa的条件下处理60min。
(3)从超临界流体处理器内取出猪皮，放入转鼓中，加入常温水220kg，盖好转鼓门，转动60min，控干废液。再加入常温水220kg，盖好转鼓门，转动60min。如此反复操作3次。充分水洗之后，用离心机脱水。
(4)从离心机中取出猪皮，放入超临界处理器内，加入复合酶皮胶原处理剂E-8953kg、平平加6kg，在温度5℃、压力8.0Mpa的条件下，处理60min。加入硫化钠2.0kg、氢氧化钠0.8kg和氧化钙4.0kg，在温度5℃、压力8.0Mpa的条件下处理40min。加入加酶浸灰助剂EA 1.5kg，在温度5℃、压力8.0Mpa的条件下处理120min。
(5)从超临界流体处理器内取出猪皮，放入转鼓中，加入常温水220kg，盖好转鼓门，转动60min。控干废液。再加入常温水220kg，盖好转鼓门，转动60min。然后充分水洗。加入温度为28℃水220kg，氯化铵(或硫酸铵)2.5kg、硫酸0.2kg和平平加O 0.5kg，转动90min。控干废液，加入常温水220kg，盖好转鼓门，转动60min，控干废液。再加入常温水220kg，盖好转鼓门，转动50min。充分水洗之后，将猪皮取出，用离心机脱水。
(6)从经脱水后的猪皮上取样、检测，判定猪皮中抗原的清除效果。达到要求后，即可按常规方法进行后续操作。
实施例2(1)选取健康的山羊，经屠宰，剥下皮，取新鲜山羊皮100kg，放入转鼓中，加入温度为32℃的水350kg，渗透剂JFC 16kg，盖好转鼓门，转动75min，控干废液。再加入温度为32℃水350kg，盖好转鼓门，转动75min。如此反复操作4次。然后，充分水洗，用离心机脱水。
(2)从离心机中取出山羊皮，放入超临界流体处理器内，加入平平加12kg、洗衣粉7.5kg和渗透剂JFC 6.0kg，在温度22℃、压力18.0Mpa的条件下处理150min。
(3)从超临界流体处理器内取出山羊皮，放入转鼓中，加入常温水350kg，盖好转鼓门，转动75min，控干废液。再加入常温水350kg，盖好转鼓门，转动75min。如此反复操作4次。充分水洗之后，用离心机脱水。
(4)从离心机中取出山羊皮，放入超临界处理器内，加入复合酶皮胶原处理剂E-895 6.0kg、平平加9.0kg，在温度15℃、压力16.0Mpa的条件下，处理90min。加入硫化钠4.5kg、氢氧化钠3.0kg和氧化钙8.0kg，在温度15℃、压力16.0Mpa的条件下处理60min。加入加酶浸灰助剂EA 2.5kg，在温度15.0℃、压力16.0Mpa的条件下处理150min。
(5)从超临界流体处理器内取出山羊皮，放入转鼓中，加入常温水350kg，盖好转鼓门，转动75min。控干废液。再加入常温水350kg，盖好转鼓门，转动75min。然后充分水洗。加入温度为31℃水300份，氯化铵(或硫酸铵)4.5kg、硫酸0.45kg和平平加0.7kg，转动110min。控干废液。加入常温水350kg，盖好转鼓门，转动75min，控干废液。再加入常温水350kg，盖好转鼓门，转动75min。充分水洗之后，将山羊皮取出，用离心机脱水。
(6)从经脱水后的山羊皮上取样、检测，判定山羊皮中抗原的清除效果。达到要求后，即可按常规方法进行后续操作。
实施例3
(1)选取健康的黄牛，经屠宰，剥下皮，取新鲜黄牛皮100kg，放入转鼓中，加入温度为36℃的水500kg，渗透剂JFC 30kg，盖好转鼓门，转动120min，控干废液。再加入温度为36℃水500kg，盖好转鼓门，转动120min。如此反复操作5次。然后，充分水洗，用离心机脱水。
(2)从离心机中取出黄牛皮，放入超临界流体处理器内，加入平平加20kg、洗衣粉30kg和渗透剂JFC 10kg，在温度40℃、压力25.0Mpa的条件下处理240min。
(3)从超临界流体处理器内取出黄牛皮，放入转鼓中，加入常温水500kg，盖好转鼓门，转动120min，控干废液。再加入常温水500kg，盖好转鼓门，转动120min。如此反复操作5次。充分水洗之后，用离心机脱水。
(4)从离心机中取出黄牛皮，放入超临界处理器内，加入复合酶皮胶原处理剂E-895 10.0kg、平平加15.0kg，在温度30℃、压力25.0Mpa的条件下，处理120min。加入硫化钠8.0kg、氢氧化钠5.0kg和氧化钙10.0kg，在温度30℃、压力25.0Mpa的条件下处理90min。加入加酶浸灰助剂EA 5.0kg，在温度30℃、压力25.0Mpa的条件下处理240min。
(5)从超临界流体处理器内取出黄牛皮，放入转鼓中，加入常温水500kg，盖好转鼓门，转动120min。控干废液。再加入常温水500kg，盖好转鼓门，转动120min。然后充分水洗。加入温度为34℃水400kg，氯化铵(或硫酸铵)8.0kg、硫酸0.80kg和平平加1.0kg，转动180min。控干废液，加入常温水500kg，盖好转鼓门，转动120min，控干废液。再加入常温水500kg，盖好转鼓门，转动120min。充分水洗之后，将黄牛皮取出，用离心机脱水。
(6)从经脱水后的黄牛皮上取样、检测，判定黄牛皮中抗原的清除效果。达到要求后，即可按常规方法进行后续操作。
本发明中所用复合酶皮胶原处理剂为成都迪澳胶原高技术有限公司生产、加酶浸灰助剂EA为广东新会皮革化工厂生产、平平加、洗衣粉和渗透剂JFC为上海助剂厂生产。其余化学试剂，均为市售的分析纯制剂。
权利要求
1.一种清除动物皮中抗原物质的方法，其特征在于(1)选取健康的动物，经屠宰，剥下皮，取新鲜动物皮100重量份，放入转鼓中，加入温度为28-36℃水200-500重量份，渗透剂JFC 5-30重量份，转动30-120min，控干废液，再加入温度为28-36℃水200-500重量份，盖好转鼓门，转动30-120min，如此反复操作3-5次，然后，充分水洗，用离心机脱水，(2)从离心机中取出动物皮，放入超临界流体处理器内，加入平平加5-20重量份、洗衣粉5-30重量份和渗透剂JFC 3-10重量份，在温度0-40℃、压力7.0-30.0Mpa的条件下处理20-240min，(3)从超临界流体处理器内取出动物皮，放入转鼓中，加入常温水200-500重量份，盖好转鼓门，转动30-120min，控干废液，再加入常温水200-500重量份，盖好转鼓门，转动30-120min，如此反复操作3-5次，充分水洗之后，用离心机脱水，(4)从离心机中取出动物皮，放入超临界流体处理器内，加入复合酶皮胶原处理剂E-895 2-10重量份，平平加3-15重量份，在温度0-30℃、压力7.2-25.0Mpa的条件下，处理30-120min；加入硫化钠0.5-8重量份、氢氧化钠0.5-5重量份和氧化钙0.5-10重量份，在温度0-30℃、压力7.2-25.0Mpa的条件下处理40-90min；加入加酶浸灰助剂EA 0.3-5重量份，在温度0-30℃、压力7.2-25.0Mpa的条件下处理30-240min，(5)从超临界流体处理器内取出动物皮，放入转鼓中，加入常温水200-500重量份，盖好转鼓门，转动30-120min，控干废液，再加入常温水200-500重量份，盖好转鼓门，转动30-120min，然后，充分水洗，加入温度为28-34℃水200-400重量份、硫酸铵或氯化铵1.0-8.0重量份、硫酸0.1-0.8重量份和平平加0.2-1.0重量份，转动40-180min，控干废液，加入常温水200-500重量份，盖好转鼓门，转动30-120min，控干废液，再加入常温水200-500重量份，盖好转鼓门，转动30-120min，充分水洗之后，将动物皮取出，用离心机脱水，(6)从经脱水后的动物皮上取样、检测，判定动物皮中抗原物质的清除效果，达到要求后，即可按常规方法进行后续操作。
2.按照权利要求1所述清除动物皮中抗原物质的方法，其特征在于动物皮为新鲜的无病毒感染的、无皮肤病及无病史的动物皮，若为猪、牛、羊家畜皮，则应选取未用饲料喂养的猪、牛、羊家畜。
3.按照权利要求1所述清除动物皮中抗原物质的方法，其特征在于所用转鼓为悬挂式木转鼓或不锈钢转鼓。
全文摘要
本发明公开了一种清除动物皮中抗原物质的方法，其特点是利用超临界流体处理器及化学试剂，在维持动物皮的三维组织构造不变的前提下，快速、有效地彻底清除动物皮中的抗原物质。经过处理后的动物皮，适合多种医学应用的需要，为动物皮的医学应用开辟一条新的途径。
文档编号A61L15/32GK1569245SQ20041002250
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月12日 优先权日2004年5月12日
发明者但卫华, 廖隆理, 李志强, 陈敏, 王坤余, 曾睿, 但年华 申请人:四川大学