注射用淫羊藿总黄酮的制备方法

专利名称：注射用淫羊藿总黄酮的制备方法
技术领域：
本发明为淫羊藿总黄酮的制备方法，尤其是注射用淫羊藿总黄酮的制备方法。
背景技术：
淫羊藿为小檗科(Berberidaceace)淫羊藿属(Epimedium)植物，全世界约有四十余种。中国有二十三个种和四个变种。中华人民共和国2000年版药典一部收载了淫羊藿(Epimedium brevicormum Maxim.)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanense T.S.)、朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)五种淫羊藿，其地上部分作为药用部位。具有补肾阳，强筋骨，祛风湿之功效。用于阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛；更年期高血压等症(见药典[功能与主治])。现代药理学研究表明，淫羊藿具有多方面的生理活性，其对内分泌系统、心血管系统和蛋白质合成及核酸代谢的作用最为显著，尤其是淫羊藿总黄酮及其有效成分淫羊藿苷的心血管方面活性，近年来得到了医药学的肯定和重视。刘崇铭等[刘崇铭等.淫羊藿甙对心脏的影响.中草药，1982，11(9)30～32]的研究证明，淫羊藿苷及淫羊藿煎剂均可抑制心肌收缩力，从而降低心肌耗氧量；淫羊藿制剂能扩张外周血管，改善微循环，增大血流量。此外，其降压作用也与外周阻力下降有关。浙医大生理研究室用淫羊藿提取物(乙醇粗提物)对离体兔心冠脉流量进行观察，发现小剂量(0.2g/kg)能增加冠脉流量，剂量增大作用反而减弱。汪芳裕等[汪芳裕，等.淫羊藿总黄酮的药理作用.第四军医大学学报，1986，7(2)164～166]的研究发现，淫羊藿总黄酮可提高大鼠耐缺氧能力，减慢大鼠心率，并能对抗异丙肾上腺素加快心率的作用。淫羊藿总黄酮可抑制家兔体外血栓形成，可降低全血粘度和抑制红细胞的聚集[高其铭.西安医科大学学报.1992，13(3)223～226]。王敏等用麻醉家兔和狗以电磁流量计测定了淫羊藿苷对脑血流作用，结果表明动脉和静脉给予淫羊藿苷均能显著增加脑血流量，降低脑血管阻力，其作用与罂粟碱相似，作用强度弱于罂粟碱，但作用时间较长[王敏等.淫羊藿甙扩张脑血管作用的研究.沈阳药学院学报.1991，8(4)273～276]。
天然药物化学和现代药理学研究证明淫羊藿有效成分主要为淫羊藿总黄酮苷。自1935年日本的赤井左一郎等从箭叶淫羊藿的叶中分离得到淫羊藿苷以来，已经从淫羊藿中分离得到一百多种黄酮类化合物。刘宝庆、徐绥绪[刘宝庆，马洪升，牟平.淫羊藿甙的分离与鉴定.中草药，1980，11(5)201；徐绥绪，王志学，吴立军，王乃利，陈英杰.淫羊藿甙及Epimedoside A的分离与鉴定.中草药，1982，13(5)9～11]等较早的从朝鲜淫羊藿地上部分分离得到淫羊藿苷、淫羊藿次苷A、去氧甲基淫羊藿苷等。次后，又有人从朝鲜淫羊藿中分离得到近30个黄酮类化合物，其中包括朝藿苷甲、乙，朝藿苷A、B、C，朝藿定A、B、C，淫羊藿次苷C，宝藿苷I、II，箭叶淫羊藿苷A、B、C，淫羊藿素等[徐美珍，程志铭.淫羊藿属植物的化学研究进展.中国中药杂志，1997，22(10)631～632]。孙朋悦等从朝鲜淫羊藿中分离得到了三个双黄酮类化合物，分别是银杏双黄酮(Ginkgetin)，异银杏双黄酮(Isoginkgetin)和7-去甲银杏双黄酮(Biobetin)[Pengyue Sun，Yingjie Chen，Noriko Shimizu，Tadahiro Takeda.Studies on the constituents of Epimedium koreanurnIII.Chemical Pharmaceutical Bulletin，1998，46(2)355～358]。淫羊藿中除含黄酮类化合物外，还含有木脂素类、酚苷类、紫罗酮类、倍半萜类、苯乙醇苷类[徐美珍，程志铭.淫羊藿属植物的化学研究进展.中国中药杂志，1997，22(10)631～632；林新，李文魁，肖培根.淫羊藿的研究新进展.中国药学杂志，1997，32(8)449～552；李文魁，张如意，肖培根.淫羊藿属药用植物研究进展.国外医学-植物药分册，1993，8(4)147～154；刘信顺，杨滨.淫羊藿属植物的化学成分.中草药，1990，21(9)36～39]，以及大量多糖、叶绿素等化合物。
淫羊藿所含黄酮类化合物可以分为六大类8-异戊烯基取代的黄酮化合物、8-类异戊烯基取代的黄酮化合物、双类异戊烯基取代的黄酮化合物、其它位置的异戊烯基取代的黄酮化合物、双黄酮化合物和无异戊烯基取代的黄酮化合物。8-异戊烯基取代的黄酮苷类化合物是其主要药理活性成分之一。淫羊藿属植物所含的黄酮类化合物虽有相同的母核，但已发现各化学成分在种之间的分布和含量有很大差异，而不同植物所含化合物的差异往往导致某种药效的差异。譬如宝藿苷-I有较好的抗肿瘤和免疫活性，而其它单体却效果不显。事实上，仅以淫羊藿苷作为淫羊藿属植物唯一质量控制标准显然是不够全面。
有关淫羊藿总黄酮制备方法的文献很多，常见的方法有醇沉、萃取、过滤等，然而众多文献报道的研究结果常有矛盾之处。陕西中医学院王昌利等用正交实验法将箭叶淫羊藿的总黄酮水提取与醇提取工艺进行比较，认为最佳工艺是水提取(《中成药》1996，18(5)1-3)。中国中医研究院中药研究所赵小妹等认为淫羊藿水提醇沉法所得淫羊藿苷含量最高(《中国实验方剂学杂志》2000，6(6)3-5)。而四川省中药研究所黎万寿等认为巫山淫羊藿中淫羊藿甙的最佳工艺是“15倍量70％乙醇溶液回流提取1h/次，共2次”(《时珍国医国药》2000，11(11)971)。申庆亮的正交研究结果表明箭叶淫羊藿用“乙醇回流为最佳提取方法，水提醇沉法浓缩时间过长，引起甙类成分水解”(《中成药》2001，23(5)377)。王成军等研究认为提取箭叶淫羊藿中淫羊藿总黄酮最佳工艺为“80％乙醇，25倍量，回流提取1h“(《基层中药杂志》2002，16(5)33)。兰州医学院药学系马慧萍等研究认为“最佳提取工艺为10倍量70％乙醇提取3次，每次1.5h；分离工艺中酸碱沉淀法较理想；甲醇纯化后总黄酮含量高达58.61％”(《华西药学杂志》2002，17(1)1-3)。陕西韩泽民等研究认为淫羊藿“乙醇提取效果与水提效果没有明显差异”，“用DM130大孔树脂吸附，60％乙醇洗脱，乙酸乙酯溶解后，用60％乙醇反复结晶”(《中草药》2002，33(10)906-907)。总之，虽然有关淫羊藿总黄酮制备方法的文献很多，但是研究结果常有矛盾之处，这可能与药材品种以及提取纯化的目的不同有关。由于各篇文献未报道总黄酮具体组成成份，更没有将制剂与疗效相结合进行研究，所以很难评定众多研究的优劣，更难以选择参考的对象，因而使后来的研究者产生许多疑虑。再者，现有工艺中也未有符合注射用淫羊藿总黄酮的制备方法，多将淫羊藿黄酮制成口服制剂，作为治疗抗骨质疏松药物。
目前的制备工艺所用溶剂种类较多，不利于工业化实施；所得提取物，因在产品纯度、性状尤其是疗效方面都不符合药典注射用药标准，所以严重影响了淫羊藿总黄酮注射液的开发和在心血管疾病治疗方面的应用前景。

发明内容
本发明要解决的技术问题是研究可工业化实施的注射用淫羊藿总黄酮制备方法。探讨如何通过对若干常规提取分离步骤的逐一改进以及组合方式的改进，设计具有协同作用的提取分离系统，仅使用乙醇这一种有机溶剂来提取分离纯化淫羊藿总黄酮，使原料在纯度、性状和疗效方面均符合药典规定的注射用标准。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案。
一种注射用淫羊藿总黄酮苷的制备方法，包括如下步骤取淫羊藿药材用50-70％乙醇提取2次，每次1～2小时；合并醇提液，浓缩至80℃测定密度约为1.1～1.2mg/ml的浸膏A；向浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量达到80％～85％，静置分层后，留取上清液，回收上清液中的乙醇至80℃测定密度为1.05～1.15mg/ml浸膏B；向浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量达到20％～30％，静置分层，留取上清液，回收上清液中的乙醇至无醇味，得水液C；取水液C上大孔树脂柱，先用水洗涤，再用水和乙醇混合溶液梯度洗脱；留取70％乙醇洗脱液，浓缩，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿总黄酮苷粗品。
所述制备方法中取淫羊藿总黄酮苷粗品，加入95％乙醇，超声或者回流后，过滤，收集滤液，回收乙醇，浓缩成浸膏，70℃真空干燥后粉碎，得注射用淫羊藿总黄酮苷。
所述制备方法中取朝鲜淫羊藿用60-70％乙醇加热提取；向稠浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量达到80％～82％，静置分层，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液含醇量达80～82％，静置分层，将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。
所述制备方法中向稠浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量达到25％～30％，静置分层，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量达到25％～30％，静置分层，留取上清液；将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
所用大孔树脂柱型号为D101或DM-301型树脂，按浸膏A计算树脂重量，浸膏A和树脂的重量比为1∶5～1∶10，先用水洗涤，后用30％乙醇洗脱；再用70％乙醇洗脱；留取70％乙醇洗脱液。可以将淫羊藿总黄酮苷粗品，加95％乙醇，超声20min或热回流促溶，0～4℃冷藏后过滤，收集乙醇滤液；沉淀反复加95％乙醇2-4次，每次均用超声或热回流促溶、冷藏、过滤，收集乙醇滤液；合并乙醇滤液，回收乙醇，浓缩成稠浸膏，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿总黄酮苷。
本发明优选的制备方法是向稠浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量达到80％～82％，静置分层，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量达到80％～82％，静置分层，留取上清液；沉淀反复加入乙醇2-4次，每次都使溶液的含醇量达到80％～82％，静置分层，留取上清液；将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。向稠浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量达到25％～30％，静置分层，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量达到25％～30％，静置分层，留取上清液；沉淀反复加入乙醇1-3次，每次都使溶液的含醇量达到25％～30％，静置分层，留取上清液；将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
本发明优选的制备方法还有向稠浸膏A中加10倍量的80％～82％乙醇，静置分层，留取上清液；沉淀再加入2倍量的80％～82％乙醇，静置分层，留取上清液；沉淀反复加入2倍量的80％～82％乙醇1-3次，静置分层，留取上清液；将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。向稠浸膏B中加10倍量25-30％乙醇，静置分层，留取上清液；沉淀再加入2倍量25-30％乙醇，静置分层，留取上清液；沉淀反复加入2倍量25-30％乙醇1-3次，静置分层，留取上清液；将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
本发明操作简单、得率高、药效好，且经济、快速、实用性较强。本发明用50-70％乙醇比用水的提取率高，并且可防止黄酮苷的酶解，优选用70％乙醇；乙醇的用量根据药材的性状决定，如果切制后可用15倍量，不切制要用20倍量，溶剂量以淹没药材为宜；药材提取两次，每次2小时，经分析总黄酮已经提取比较完全。浓缩成稠浸膏，是为了节省乙醇用量和沉淀完全。“80-85％乙醇沉淀”是为了除去提取物中大量的多糖；重复用80-85％乙醇处理沉淀，例如用2倍量的80-85％乙醇处理沉淀，可将多糖包裹的黄酮溶出；优选用“80-82％乙醇沉淀”并重复处理。“20-30％乙醇沉淀”可有效除去提取物中的叶绿素，反复用20-30％乙醇处理沉淀，可将叶绿素包裹的黄酮溶出，例如反复用2倍量的20-30％乙醇处理沉淀；优选用“25-30％乙醇沉淀”并重复处理。两次醇沉颠倒次序，效果不好，因为多糖量高，如果先去除叶绿素，多糖包叶绿素，影响纯度和色泽。上样量和树脂重量比应控制在1∶5～10，上样量如果超载，分离效果不好。大孔树脂柱先用水洗脱的目的是除去水溶性的杂质，如蛋白质、氨基酸、无机盐、鞣质、多糖等；20-30％乙醇洗脱是除去极性较大的杂质，如色素、8位不带异戊烯基的黄酮等；而所需要的8-异戊烯基取代的黄酮类化合物极性适中，主要在70％乙醇洗脱部位。最后用95％乙醇超声促溶处理的目的是为了除去原料中的部分色素和多糖，改善原料的性状，以便达到注射用的要求。因为柱层析后所得淫羊藿总黄酮粗品色泽较深，配成注射剂后总有少许沉淀。发明人曾试用乙酸乙酯萃取处理，虽然色泽较好，但收率低；发明人也曾试用正丁醇萃取，但仍解决不了色泽问题；发明人试用75％乙醇回流处理，该方法收率虽高，但色泽和性状最差。最后发现用95％乙醇超声促溶解或95％乙醇回流促溶解处理后的色泽、产率均佳。本发明制备方法中80-85％乙醇沉淀与层析梯度洗脱时乙醇浓度的选择是不但影响纯度而且影响得率的关键步骤。除此之外，50-70％乙醇提取和最后95％乙醇处理亦为严重影响得率关键步骤。本工艺的产品收率约为0.9～1.1％，即100公斤药材可得0.9～1.1公斤总黄酮，淫羊藿总黄酮苷的含量大于80％。
本制备工艺所得原料含有80％以上的淫羊藿总黄酮(淫羊藿总黄酮的测定方法为2000年版药典一部收载的总黄酮测定方法)，符合国家新药报批中“以有效部位为组分的注射液，其有效部位的含量应不少于总固体量的70％(静脉用不少于80％)”的规定。其中，主要成分淫羊藿苷的含量不少于总固体量的20％。国家新药报批资料《中药注射剂研究的技术要求》规定“供配制注射液用的原料或半成品，在提取、纯化过程中可能引入有害有机溶剂者，应作有害有机溶剂残留量检查”。因此，为了避免引入有害有机溶剂，降低提取和纯化成本，本发明只使用了乙醇这种无害的有机溶剂，通过对若干常规提取分离步骤的逐一改进以及组合方式的改进，形成具有协同作用的提取分离系统。不需要作有害有机溶剂残留量检查，非常适合工业化生产。只使用乙醇，而使制成注射液原料在纯度、性状和疗效方面符合药典标准，显示本发明优良效果。
本发明通过药理实验证实淫羊藿总黄酮苷具有良好的心脑血管活性，可治疗卒中易感型自发性高血压病、冠心病和心绞痛，同时又改善脑缺血和脑缺氧，所以注射剂型较为合适。
黄酮类化合物作为淫羊藿属植物的主要化学成分，迄今已经分离得到上百个黄酮化合物。在研究中发现各化学成分在种之间的分布和含量有很大差异，如果以淫羊藿苷作为淫羊藿属植物或者淫羊藿总黄酮苷有效部位的唯一质量控制标准显然是不全面的。为了全面控制淫羊藿属植物及其有效部位淫羊藿总黄酮苷的内在质量，筛选部分有代表性的化合物作为指示标准，通过各化合物的含量和相对比较，能够了解淫羊藿属植物及其有效部位的质量。
具体实施例方式
原料朝鲜淫羊藿于2000年夏季采收于辽宁本溪，阴干粉碎。生药材由沈阳药科大学生药学教研室鉴定。阳性对照品维拉帕米为SIGMA公司的产品，NE(重酒石酸去甲肾上腺素)上海禾丰制药有限公司产品，动物采用Sprague-Dawley大鼠(本校实验动物中心提供)。
新树脂的预处理D101或DM-301型树脂(天津农药股份有限公司树脂分公司生产)用适量的丙酮，在60℃左右温浸三次，直至浸液在试管中用水稀释不产生浑浊为止。树脂用水漂洗至无丙酮味后上柱备用。树脂的再生树脂使用3～5次后，可用5％的HCl溶液处理几次，直至溶液无色为止，用水漂洗至中性。再用5％的NaOH溶液处理，直至溶液无色为止，最后用水漂洗至中性。
实施例1朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)药材9.74Kg，用20倍量(重量体积比g/ml，即1g药材加20ml的乙醇。下同)的70％乙醇煎煮两次，每次2小时。提取液回收乙醇，浓缩成密度约为1.2g/ml(80℃测定)的浸膏，共得1.68Kg。取浸膏500g，加入95％乙醇使含醇量达到80％，充分搅拌后静置24小时，留取上清夜。沉淀再用2倍量(重量体积比g/ml，即浸膏500g需加入1000m1)的80％乙醇同法处理两次。合并上清夜，回收乙醇浓缩成密度约为1.05g/ml(80℃测定)的浸膏。向浸膏中加入乙醇使含醇量达到30％，充分搅拌后静置24小时后，留取上清夜。沉淀再用2倍量(重量体积比g/ml，即浸膏500g需加入1000m1)的30％乙醇同法处理两次。合并上清夜，回收乙醇至无醇味的水液，取该水液上处理好的D101大孔树脂柱吸附。树脂柱用去离子水充分洗涤后，先用30％乙醇再用70％乙醇梯度洗脱。将70％乙醇洗脱部位浓缩，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿总黄酮苷36.5克(收率7.3％)。
淫羊藿总黄酮苷粉末用20倍量(重量体积比g/ml，即1g粉末加20ml的乙醇)的95％药用乙醇，40KHz超声20min促溶，冷藏(0～4℃)，过滤，收集滤液。滤渣用10倍量的95％药用乙醇，同法再处理四次。合并五次滤液，回收乙醇，70℃真空干燥后粉碎，可得淫羊藿总黄酮苷注射用原料22.1克，收率60.5％(总收率约为0.7％，即100公斤药材得0.7公斤总黄酮)。其中总黄酮含量(以淫羊藿苷计)为89.6％，淫羊藿苷含量为26.3％。
经检测本发明注射液原料符合国家新药报批资料《中药注射剂研究的技术要求》规定，在纯度、性状和疗效方面符合药典标准。
实施例2取实施例1中浸膏500g，加入10倍量(重量体积比g/ml。下同)的80％乙醇(经测试含醇量为80％)，充分搅拌后静置24小时，留取上清夜。沉淀再用2倍量的80％乙醇同法处理两次。合并上清夜，回收乙醇浓缩成密度约为1.15g/ml(80℃测定)的浸膏。向浸膏中加入10倍量的30％乙醇(此时含醇量为30％)，充分搅拌后静置24小时后，留取上清夜。沉淀再用2倍量的30％乙醇同法处理两次。合并上清夜，回收乙醇至无醇味的水液，取该水液上处理好的D101大孔树脂柱吸附。树脂柱用去离子水充分洗涤后，先用30％乙醇再用70％乙醇梯度洗脱。将70％乙醇洗脱部位浓缩，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿总黄酮苷35.2克(收率7.0％)。
淫羊藿总黄酮苷粉末用20倍量的95％药用乙醇，加热回流20分钟，冷藏(0～4℃)，过滤，收集滤液。滤渣用10倍量的95％药用乙醇，同法再处理四次。合并五次滤液，回收乙醇，70℃真空干燥后粉碎，可得淫羊藿总黄酮苷注射用原料23.6克，收率67％。其中总黄酮含量(以淫羊藿苷计)为87.5％，淫羊藿苷含量为25.4％。经检测本发明注射液原料符合国家新药报批资料《中药注射剂研究的技术要求》规定，在纯度、性状和疗效方面符合药典标准。
实施例3淫羊藿药材1.02Kg，用20倍量的50％乙醇煎煮两次，每次1.5小时。提取液回收乙醇，浓缩成密度约为1.15g/ml(80℃测定)的稠浸膏，共得176g。向浸膏中加入95％乙醇使含醇量达到85％，充分搅拌后静置24小时，留取上清夜。沉淀再用2倍量的85％乙醇同法处理两次。合并上清夜，回收乙醇浓缩成密度约为1.15g/ml(80℃测定)的浸膏。向浸膏中加入乙醇使含醇量达到20％，充分搅拌后静置24小时后，留取上清夜。沉淀再用2倍量的20％乙醇同法处理两次。合并上清夜，回收乙醇至无醇味的水液，取该水液上处理好的DM-301大孔树脂柱吸附。树脂柱用去离子水充分洗涤后，先用30％乙醇再用70％乙醇梯度洗脱。将70％乙醇洗脱部位浓缩，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿总黄酮苷12.0克(收率6.8％)。
淫羊藿总黄酮苷粉末用20倍量的95％药用乙醇，40KHz超声20min促溶，冷藏(0～4℃)，过滤，收集滤液。滤渣用10倍量的95％药用乙醇，同法再处理四次。合并五次滤液，回收乙醇，70℃真空干燥后粉碎，可得淫羊藿总黄酮苷注射用原料8.7克，收率72.5％。其中总黄酮含量(以淫羊藿苷计)为89.8％，淫羊藿苷含量为27.9％。检测结果同上。
实施例4朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)药材3.05Kg，用20倍量的60％乙醇煎煮两次，每次2小时。提取液回收乙醇，浓缩成密度约为1.1g/ml(80℃测定)的稠浸膏，共得488g。向浸膏中加入95％乙醇使含醇量达到82％，充分搅拌后静置24小时，留取上清夜。沉淀再用2倍量的82％乙醇同法处理两次。合并上清夜，回收乙醇浓缩成密度约为1.15g/ml(80℃测定)的浸膏。向浸膏中加入乙醇使含醇量达到25％，充分搅拌后静置24小时后，留取上清夜。沉淀再用2倍量的25％乙醇同法处理两次。合并上清夜，回收乙醇至无醇味的水液，取该水液上处理好的D101大孔树脂柱吸附。树脂柱用去离子水充分洗涤后，先用30％乙醇再用70％乙醇梯度洗脱。将70％乙醇洗脱部位浓缩，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿总黄酮苷29.8克(收率6.1％)。
淫羊藿总黄酮苷粉末用20倍量的95％药用乙醇，40KHz超声20min促溶，冷藏(0～4℃)，过滤，收集滤液。滤渣用10倍量的95％药用乙醇，同法再处理四次。合并五次滤液，回收乙醇，70℃真空干燥后粉碎，可得淫羊藿总黄酮苷注射用原料20.5克，收率68.8％。其中总黄酮含量(以淫羊藿苷计)为86.7％，淫羊藿苷含量为26.8％。检测结果同上。
实施例5本发明对淫羊藿总黄酮中分离得到的宝藿苷-I、淫羊藿次苷-I、朝藿苷C、淫羊藿苷、脱水淫羊藿素、去甲基脱水淫羊藿素六种黄酮类化合物(前四种为黄酮苷，后两种为苷元)，进行了扩张血管方面的活性测试。
大鼠断头处死后开胸，取出胸主动脉，置于含95％O2和5％CO2饱和营养液中。去除血管周围的结缔组织，剪成6～8毫米的动脉环。放于37.2摄氏度的营养液的浴槽中，通95％O2和5％CO2，前负荷1.0g。
对高钾预收缩的大鼠胸主动脉的舒张作用在K-H液中标本平衡1小时，标本预先用80mmol/L的KCl敏化，加入终浓度为80mmol/LKCL使主动脉环收缩，收缩达最大时加入本发明淫羊藿总黄酮苷，观察其对主动脉条收缩的舒张作用。(结果见表)对高钙预收缩的大鼠胸主动脉的舒张作用在无钙K-H液标本平衡1小时，标本预先敏化，加入80mmol/L的KCl，收缩达最大时加入2.5mmol/LCaCl2再次刺激主动脉环收缩，收缩达最大时加入本发明淫羊藿总黄酮苷，观察其队主动脉条收缩的舒张作用。(结果见表)对NE预收缩的大鼠胸主动脉的舒张作用使用K-H液标本平衡1小时，标本预先敏化。预先加入本发明淫羊藿总黄酮苷15～20分钟后，加入1.18×10-7mol/L NE使主动脉环收缩，观察其对主动脉条收缩的舒张作用。实验结束后，计算本发明淫羊藿总黄酮苷对血管收缩的抑制率。(结果见表)表样品对由KCl，CaCl2和NE诱导主动脉收缩的影响样品 终浓度 样品抑制百分率mean±sd(n)(mol/L)高钾模型 高钙模型 NE模型宝藿苷-I 10-552.5±22.6(3) 5.6±9.6(3)23.8±9.8(3)淫羊藿次苷-I 10-60±0(3) 0±0(3)0±0(3)朝藿苷C 10-549.2±7.9(3) 18.0±1.7(3) 17.7±11.0(4)淫羊藿苷 10-538.1±8.8(3) 0.6±1.2(3)4.2±7.2(3)脱水淫羊藿素 10-50±0(3) 0.5±1.1(4)2.8±4.8(3)去甲基脱水淫羊藿素10-530.4±9.0(3) 27.2±7.4(3) 33.6±5.2(3)实验结果表明宝藿苷-I、朝藿苷C、淫羊藿苷、去甲基脱水淫羊藿素对主动脉条收缩有抑制作用。宝藿苷-I、淫羊藿苷和去甲基脱水淫羊藿素在10-5mol/L的浓度水平上，对80mmol/L KCl所致的主动脉条收缩均有一定的抑制作用。朝藿苷C、去甲基脱水淫羊藿素在10-5mol/L的浓度水平上对2.5mmol/L CaCl2所致主动脉条收缩有一定的抑制作用。对于1.18×10-7mol/L的NE引起的主动脉环收缩，宝藿苷-I、淫羊藿苷和去甲基脱水淫羊藿素在该浓度时表现出较明显的抑制作用。这可能与抑制细胞外钙内流作用有关。
权利要求
1.注射用淫羊藿总黄酮苷的制备方法，包括如下步骤取淫羊藿药材用50-70％乙醇提取；合并醇提液，浓缩至密度约为1.1～1.2mg/ml的浸膏A；向浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量达到80％～85％，静置分层后，留取上清液，回收上清液中的乙醇至80℃测定密度为1.05～1.15mg/ml浸膏B；向浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量达到20％～30％，静置分层，留取上清液，回收上清液中的乙醇至无醇味，得水液C；取水液C上大孔树脂柱，先用水洗涤，再用水和乙醇混合溶液梯度洗脱；留取70％乙醇洗脱液，浓缩干燥后，得淫羊藿总黄酮苷粗品。
2.权利要求1的制备方法，其特征在于取淫羊藿总黄酮苷粗品，加入95％乙醇，超声或者回流后，过滤，收集滤液，回收乙醇，浓缩成浸膏，70℃真空干燥后粉碎，得注射用淫羊藿总黄酮苷。
3.权利要求1的制备方法，其特征在于取朝鲜淫羊藿用60-70％乙醇加热提取；向稠浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量达到80％～82％，静置分层，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液含醇量达80～82％，静置分层，将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。
4.权利要求1的制备方法，其特征在于向稠浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量达到25％～30％，静置分层，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量达到25％～30％，静置分层，留取上清液；将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
5.权利要求1的制备方法，其特征在于大孔树脂柱型号为D101或DM-301型树脂，按浸膏A计算树脂重量，浸膏A和树脂的重量比为1∶5～1∶10，先用水洗涤，后用30％乙醇洗脱；再用70％乙醇洗脱；留取70％乙醇洗脱液。
6.权利要求2的制备方法，其特征在于将淫羊藿总黄酮苷粗品，加95％乙醇，超声20min或热回流促溶，0～4℃冷藏后过滤，收集乙醇滤液；沉淀反复加95％乙醇2-4次，每次均用超声或热回流促溶、冷藏、过滤，收集乙醇滤液；合并乙醇滤液，回收乙醇，浓缩成稠浸膏，70℃真空干燥后粉碎，得淫羊藿总黄酮苷。
7.权利要求3的制备方法，其特征在于向稠浸膏A中加乙醇，使溶液的含醇量达到80％～82％，静置分层，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量达到80％～82％，静置分层，留取上清液；沉淀反复加入乙醇2-4次，每次都使溶液的含醇量达到80％～82％，静置分层，留取上清液；将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。
8.权利要求4的制备方法，其特征在于向稠浸膏B中加乙醇，使溶液的含醇量达到25％～30％，静置分层，留取上清液；沉淀再加入乙醇，使溶液的含醇量达到25％～30％，静置分层，留取上清液；沉淀反复加入乙醇1-3次，每次都使溶液的含醇量达到25％～30％，静置分层，留取上清液；将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
9.权利要求7的制备方法，其特征在于向稠浸膏A中加10倍量的80％～82％乙醇，静置分层，留取上清液；沉淀再加入2倍量的80％～82％乙醇，静置分层，留取上清液；沉淀反复加入2倍量的80％～82％乙醇1-3次，静置分层，留取上清液；将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得稠浸膏B。
10.权利要求8的制备方法，其特征在于向稠浸膏B中加10倍量25-30％乙醇，静置分层，留取上清液；沉淀再加入2倍量25-30％乙醇，静置分层，留取上清液；沉淀反复加入2倍量25-30％乙醇1-3次，静置分层，留取上清液；将留取的上清液合并，回收其中的乙醇，得水液C。
全文摘要
一种防治心血管疾病的注射用淫羊藿总黄酮苷的制备方法。将淫羊藿药材用乙醇回流提取，提取液回收乙醇浓缩后，上大孔树脂柱吸附，用水洗涤后，再用不同浓度的乙醇梯度洗脱，浓缩干燥后可得含量大于80％的淫羊藿总黄酮苷。本发明操作简单、得率高、药效好，且经济、快速、实用性较强。
文档编号A61P9/10GK1634910SQ200410065668
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月11日 优先权日2004年11月11日
发明者孔令义, 童玉玺, 袁杰 申请人:中国药科大学