专利名称：具有抑制β－内酰胺酶抑制活性的多肽及编码的DNA的制作方法
技术领域：
本发明涉及一段多肽及编码该多肽的基因，和利用表达载体制备所述多肽的方法，具体地说，涉及一种编码β-内酰胺酶抑制多肽的基因，以及利用表达载体制备所述多肽的方法，和所述的多肽的药学用途。
背景技术：
β-内酰胺类抗生素(青霉素和头孢菌素)在临床上用于治疗多种细菌感染疾病，但随着抗生素的广泛应用以及某种程度上的滥用，耐药菌在不断地产生，它们对许多β-内酰胺抗生素耐药，从而使这类药物对耐药菌感染的疾病无效。微生物来源的β-内酰胺酶的抑制剂棒酸(Clavulanic acid)及其β-内酰胺砜类化合物舒巴坦(Sulbactam)和他佐巴坦(Tazobactam)，均在七十年代至八十年代被发现并证实是有效的β-内酰胺酶的抑制剂，且作为“自杀者”与β-内酰胺抗生素合并用药，可达到抑制β-内酰胺酶活力、增强β-内酰胺抗生素疗效的目的。然而，无论是砜类还是棒酸类抑制剂，对一些细菌产生的由染色体介导的I型β-内酰胺酶的抑制作用都很小。
近来人们从带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中分离到β-内酰胺酶抑制蛋白(β-lactamase inhibitory protein，BLIP)的出现(参见Doran JLeta1 J Bacteriol.1990 Sep；172(9)4909-18.)给人们带来了很多启发，随后又有BLIP-I(参见Kang SG et al J Biol Chem.2000 Jun 2；275(22)16851-6.)、BLIP-II(参见Park HU，et al Microbiology.1998 Aug；144(Pt 8)2161-7)被发现，关于BLIP类蛋白的研究也受到人们的关注。
目前国内尚无关于β-内酰胺酶抑制蛋白方面的报道，而国外文献查阅发现有三个具有抑制β-内酰胺酶活性的蛋白，并对BLIP进行了关键结合位点方面的分析研究(参见Strynadka NC，et al Nat Struct Biol.1996Mar；3(3)233-9.)。从国外文献报道来看，目前的研究还是比较大的β-内酰胺酶结合蛋白，由于其分子量比较大，有165个氨基酸组成，并不适合开发成为临床使用的药物，即使有BLIP表达的研究(参见Liu HB，et al.JBiotechnol.2004 Mar 18；108(3)207-17.)，主要还是其与β-内酰胺酶结合以及抑制的机理研究。
另外对中国以及美国专利查询均未发现有β-内酰胺酶抑制蛋白方面的内容，只有β-内酰胺酶抑制剂即小分子化合物的报道，未见有适合用于基因工程表达药物的专利。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种具有抑制β-内酰胺酶活性的多肽及其编码DNA，以满足生物医药领域发展的需要。
本发明的技术构思是这样的发明人参考了关键结合位点设计并合成了随机寡核苷酸库，从中筛选到的24肽，体外作用表明具有抑制β-内酰胺酶的活性，该多肽的氨基酸序列如SQ3SQ3FTIHCSVTAAGDYYCVHGANGTSF由于BLIP的分子量较大，有165个氨基酸，不适合开发成为药物，因此尝试在保持BLIP与β-内酰胺酶的结合能力的前提下，通过随机寡核苷酸库的筛选来获得更短的、抑制β-内酰胺酶作用更强的短肽。
根据BLIP与β-内酰胺酶的构效关系，将BLIP中的46～51位氨基酸残基作为随机序列的核心序列，在核心序列的两侧加上一些随机序列，共有9个NNY(N为A、T、C、和G，而Y为C或T)。在通过PCR方法将随机的单链寡核苷酸大量扩增为双链，然后经过一系列基因操作将扩增后的随机双链基因与pGAD424质粒载体中的激活域融合，构建随机核苷酸文库(猎物质粒文库)，库容量达到107。
β-内酰胺酶抑制多肽的编码基因，其DNA序列如SQ2SQ1TTCACTATCC ACTGCNNYNN YNNYGCTGCA GGTGACTACT ACNNYNNYNN YNNYNNYNNYGGCACCTCTT TC其中NNY代表随机的寡核苷酸，N为A、T、C或G，而Y为C或T优选的基因序列如SQ2SQ2TTCACTATCC ACTGCAGTGT CACTGCTGCA GGTGACTACT ACTGTGTTCA TGGCGCTAATGGCACCTCTT TC该段基因共由72个核苷酸组成，编码了24个氨基酸，推测分子量是2600道尔顿。
本发明还涉及上述的DNA克隆及表达载体。
运用酵母双杂交系统对随机核苷酸文库进行初筛和复筛，最终得到了一株阳性转化子，分离其中的质粒并命名为pYG202。β-半乳糖苷酶的定量测定表明其与β-内酰胺酶在体内的相互作用测得的米勒单位分10.2。
制备抑制β-内酰胺酶的多肽的方法，包括用表达载体转化宿主菌，优选的宿主菌为大肠杆菌。
将短肽与GST蛋白进行融合表达，通过亲和层析、凝血酶消化等一系列步骤最终获得的短肽，体外检测其与β-内酰胺酶的相互作用，结果表明短肽可以抑制β-内酰胺酶的活性。
筛选新β-内酰胺酶抑制剂，需要纯度较高的β-内酰胺酶来验证筛选得到的短肽是否具有抑制作用。因此，首先将β-内酰胺酶基因克隆至pLY-5载体中，构建表达质粒pYG201。在pYG201质粒中β-内酰胺酶基因处于λ噬菌体PL启动子控制下，通过42℃热激解除阻遏物(cIts857)的阻遏，高效表达β-内酰胺酶。外源蛋白高效表达易形成包含体，通过对包含体的溶解、复性和纯化过程的研究，最终获得有活性的β-内酰胺酶并达到90％以上的纯度。
通过常规的PCR方法将随机的单链寡核苷酸大量扩增为双链，再经过一系列常规的基因操作，将扩增后的随机双链基因与pGAD424质粒载体中的激活域融合，构建随机核苷酸文库，即猎物质粒文库。通过对酵母转化条件的研究确定了转化的最佳条件，其最佳条件是选择聚乙二醇4000为促进剂和42℃热激时间为30min，获得的转化率为1.4×105cfu/μg DNA。
将pYG111和随机寡核苷酸文库共同转化酵母Y153，通过初筛和复筛最终得到了一株阳性转化子，分离得到的质粒命名为pYG202。β-半乳糖苷酶的定量测定表明其与β-内酰胺酶在酵母体内的相互作用测得的米勒单位为10.2。
所说的pYG111质粒为含有来自pBR322质粒中所编码的TEM-1型β-内酰胺酶基因的质粒；pYG111质粒可采用文献公开的方法进行构建，在中国医药工业杂志2004年第35卷第1期第16页中已经有公开的报道；所述的pBR322质粒为一常用的大肠杆菌克隆载体质粒，可从上海生工生物工程技术服务有限公司处购得。
将编码基因克隆到质粒pGEX-4T-1的多克隆位点中，得到重组质粒pYG205。加入适量的IPTG诱导外源基因在宿主中表达GST-多肽融合蛋白，运用Sepharose 4B亲和层析介质分离纯化GST-多肽，然后用凝血酶(thrombin)将多肽从融合蛋白中切下。体外测定多肽与β-内酰胺酶的结合作用，结果表明它可以抑制酶的活性。
pGEX-4T-1质粒为一常用的大肠杆菌表达载体质粒，将目的蛋白与GST(谷胱肝肽S-转移酶)蛋白融合表达，可从Amersham Biosciences Ltd.公司购得。
本发明的多肽及编码该多肽的基因在医药学中有广泛的用途，可用于药物的制备，与β-内酰胺抗生素联合应用。
本发明的具有抑制β-内酰胺酶抑制活性的多肽及编码的DNA1.分子量较小，易于克隆与表达，并可通过串联提高表达量；2.通过构效关系证明所编码的多肽与β-内酰胺酶特异性结合；3.所筛选到的DNA序列显示体内能结合β-内酰胺酶的编码基因；4.体外实验表明该DNA序列所编码的多肽能特异性地抑制β-内酰胺酶的活性；5.如能与β-内酰胺抗生素合用，能通过抑制耐药菌的β-内酰胺酶的活性来提高抗生素的功效。
图1显示了表达β-内酰胺酶的重组质粒的构建过程。
图2显示了β-内酰胺酶表达的包含体SDS/PAGE电泳。2号为表达的包含体。
图3显示了纯化β-内酰胺酶的洗脱组分。
图4显示了纯化的β-内酰胺酶SDS/PAGE电泳。6号为纯化的酶。
图5显示了纯化的β-内酰胺酶活性的测定。
图6显示了双链随机寡核苷酸的构建过程。
图7显示了寡核苷酸文库质粒构建过程。
图8显示了酵母双杂交系统筛选得到的阳性子再经复筛在膜上显示蓝色。
图9显示了筛选得到的阳性质粒pYG202。
图10显示了该阳性质粒编码的多肽体内与β-内酰胺酶的作用强度，1号、2号为对照，5号为阳性质粒。
图11显示了阳性质粒上的插入片段的测序结果，以及相应的编码的氨基酸序列。
图12显示了表达质粒pYG205的构建过程。
图13显示了表达阳性多肽融合蛋白的洗脱组分。
图14显示了纯化的融合蛋白SDS/PAGE电泳。1号为纯化得到的样品。
图15显示了切割后的多肽，2号为得到的样品。
图16显示了多肽体外对β-内酰胺酶的抑制活性。
图17显示了不同浓度的多肽对β-内酰胺酶的抑制活性。
具体实施例方式
实施例1β-内酰胺酶的表达纯化pYG111质粒中含有来自pBR322质粒中所编码的TEM-1型β-内酰胺酶基因，且在克隆该基因时在其两侧加上了EcoRI和BamHI酶切位点。为使TEM-1型β-内酰胺酶基因大量表达，用EcoRI和BamHI消化分别质粒pYG111和pLY-5，分别回收pYG111上切出的β-内酰胺酶基因小片段和pLY-5载体大片段，用T4连接酶连接起来，得到了β-内酰胺酶高表达质粒pYG201，构建流程如图1所示。
诱导后的细胞培养液以8000r/min离心10min后收集菌体，沉淀的菌体用蒸馏水洗涤1次，再离心。将得到的菌体(湿重0.25g)用1×PBS洗涤1次后再悬浮，用超声破碎仪进行细胞破碎，工作15s，间歇5s，共进行20次。细胞破碎液以10000r/min离心15min，此时由重组蛋白形成的包含体已在沉淀中。将沉淀用洗涤液I和洗涤液II各洗涤一次，10000r/min离心15min，这样便得到了较纯的包含体。SDS-PAGE检测结果见图2，灰度分析表明其纯度达到了80％。
将上述的包含体溶解液以15000r/min离心20min去除不溶性杂质后，再加入包含体溶解液至总体积为30ml，装入截留分子量为14,000Da的透析袋中，用300ml复性液透析过夜。次日将复性液稀释5倍后继续透析过夜，再稀释5倍继续透析过夜，然后换用去离子水透析过夜。随后将蛋白溶液用PEG6000浓缩至1/3体积左右，在浓缩过程中要注意蛋白液体积的变化，不要浓缩过度以免发生蛋白沉淀。将浓缩液用pH7.0的0.02mol/L磷酸缓冲液平衡过夜。次日，将平衡好的蛋白溶液过Sephadex G-75柱，用pH7.0的0.02mol/L磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱流速为0.2ml/min，以4ml/tube收集洗脱液。检测各管收集液的A280值并检测各管洗脱液的β-内酰胺酶活性。洗脱图谱见图3。
收集有酶活的部分，合并后用蒸馏水透析去除盐，用冷冻干燥机冻干保存。取少量样品用水溶解后作SDS-PAGE检测，结果如图4所示，灰度分析显示其蛋白纯度在90％以上。
取22mg冻干样品溶于1ml pH7.0的0.05mol/L的磷酸缓冲液中，测定该酶液的蛋白含量。在酶反应体系中含有100μl氨苄青霉素(100mg/ml)和20μl酶液，最终用缓冲液补足至3ml，25℃下反应，在235nm波长下测定酶反应的动力学曲线。在对照中以20μl缓冲液代替酶液，其它一样。测定结果如图5所示。最后计算得酶比活为6732U/mg蛋白(图5)。
实施例2构建寡核苷酸文库用PCR方法将单链随机寡核苷酸扩增为双链，它与普通的PCR扩增反应有所不同，随机寡核苷酸片段扩增原理见图6所示。此PCR反应中模板为含有9个NNY的随机序列，其包含的信息量非常大。在PCR扩增时要尽量保持寡核苷酸的种类数不变，以确保在构建寡核苷酸库时随机序列DNA的多样性。
将PCR酶切产物与适量的相同酶切的pGAD424大片段连接起来，按上述质粒DNA量扩大100倍转化E.coli感受态细胞(1000ml培养液)，涂布100个LB+Amp平皿，置于37℃恒温箱中培养16h，每个平皿上长满了菌落可达105个克隆。收集平皿上所有的转化子，可获得～107个克隆作为一个随机寡核苷酸文库，收集菌落并接入LB+Amp(共40ml)液体培养基中，于37℃下振摇4h，加入甘油，使甘油的终浓度为20％，然有分装于1.5ml的eppendorf管，-70℃下保存。寡核苷酸文库的构建过程如图7所示。
实施例3酵母双杂交系统的筛选用各100μg的pYG202和pYG111共同转化用1L培养液制备的Y153感受态细胞，涂布100个SD-L-W-H+3-AT(25mM)平板，将长出较大的菌落挑出，共挑出6000个点种于SD-L-W-H+3-AT(25mM)平板上。待菌落长至适当大小时，进行筛选和检测β-半乳糖苷酶活性的颜色反应。经过初筛得到62个阳性转化子，将硝酸纤维滤膜上出现的蓝色菌落在原始平板上找出对应的菌落。
首先利用酶法分离上述初筛获得的阳性转化子中的质粒DNA，但这里分离得到是两种质粒的混合物，而我们需要的是含有表达能与β-内酰胺酶有相互作用肽的基因。利用大肠杆菌一次只能接受一个质粒的特性，将分离到的质粒DNA混合物转化合适的大肠杆菌宿主中，由于阳性质粒带有Leu2基因，而pYG111带有Trp1基因，因此选择亮氨酸缺陷型的大肠杆菌作为宿主就可以将上述的两种质粒分开。E.coli C600的基因型为thi-1thr-1 leu1 lacY1 proA2 supE44，即在缺乏亮氨酸的培养基中不能生长。将混合质粒转化E.coli C600，涂布含有Thia和Pro的M9基本培养基即可筛选含有阳性质粒的转化子。经鉴定后，质粒分别单独转化Y153和再与pYG111共同转化到Y153中，分别涂布SD-L+W和SD-L-W-H+3-AT(25mmol/L)平板，于30℃下培养一周，用膜影印法检测各平板，结果为单独转化的平板上没有出现蓝色，而与pYG111共同转化的平板中出现蓝色，结果见图8所示，将得到的阳性质粒命名为pYG202(图9)。
实施例4多肽与β-内酰胺酶的体内相互作用将阳性菌株和酵母Y153(作为对照)接入5ml SD培养基中，在30℃下培养OD600至0.6～1.2，收集菌体后用等体积的Z缓冲液重悬，置于液氮速冻后，在37℃水浴中融解，重复此过程3～4次，然后定量测定β-半乳糖苷酶的活性，结果如图10所示，对照Y153，Y153(BD/AD)的米勒单位分别为0.2和0.25，这结果表明没有相互作用的菌株是不表达β-半乳糖苷酶的，而Y153(pYG111/pYG202)测得的米勒单位为10.2，表明pYG202在酵母体内表达的多肽与β-内酰胺酶有相互作用。
实施例5编码多肽的DNA序列测定用EcoRI和ClaI双酶切pYG202，将酶切得到的小片断与pBlu2KSM连接起来，进行序列测定。测序工作由上海申能博彩公司测定。测序结果及编码的氨基酸序列如图11。
实施例6多肽基因的克隆及表达将通过酵母双杂交方法筛选获得的阳性质粒pYG202的插入基因亚克隆到pGEX-4T-1中构建融合蛋白表达载体，图12为pYG205质粒的构建路线图。
实施例7多肽的纯化和切割诱导表达pYG205后将收集的菌体用适当体积的1×PBS悬浮，进行超声破碎。细胞破碎液以14,000rpm离心15min，上清液用0.45μm的滤膜过滤除去杂物。将过滤液上Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱，样品开始过亲和柱的流速为0.4ml/min，待样品吸附后用层析平衡缓冲液洗GST融合蛋白吸附后的柱子，直至A280小于0.02；然后用2个床体积的洗脱缓冲液以0.2ml/min的流速将GST融合蛋白洗脱下来。按每管5ml收集样品，检测各管的A280，得到的吸附(1-12管)和洗脱(13-17管)图谱见图13。
用SDS-PAGE电泳检测各个步骤的蛋白，检测结果见图14所示。
用Bradford法测定收集到的GST-短肽融合蛋白总量，结果共为50mg。由于一个单位的凝血酶(thrombin)加入含有100μg融合蛋白的PBS溶液中，在22℃下放置16h，大于90％的融合蛋白被消化。所以加入500单位的凝血酶，置于22℃水浴中酶切反应16h。将反应后的混合液用截留分子量10,000Da的超滤膜进行超滤，收集流出的液体。冷冻干燥后，用少量的去离子水溶解，将其装入截留分子量为1,000Da的透析袋中，透析脱盐，再冷冻干燥，最后用分析小分子多肽的SDS-PAGE电泳检测分离得到的多肽。SDS-PAGE检测结果如图15所示。检测结果表明用凝血酶可以将短肽从融合蛋白中切下来。
实施例8
多肽在体外对β-内酰胺酶的抑制活性比较了有无短肽存在时TEM-1型β-内酰胺酶降解氨苄青霉素的快慢。从图16中可以看出，加入短肽后曲线的斜率，即氨苄青霉素的降解速率明显变小，表明短肽对酶的活性有抑制作用。
接下来检测了短肽浓度对酶活抑制作用的影响，如图17所示。可以看出随着短肽浓度的增大其对酶活的抑制作用也在不断加大。
序列表<110>上海医药工业研究院<120>具有抑制β-内酰胺酶抑制活性的多肽及编码的DNA<130>SPI048461<160>3<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(16，17，19，20，22，23，43，44，46，47，49，50，52，53，55，56，58，59)<223>N＝A或T或C或G<222>(18，21，24，45，48，51，54，57，60)<223>Y＝C或T<400>1TTCACTATCC ACTGCNNYNN YNNYGCTGCA GGTGACTACT ACNNYNNYNN YNNYNNYNNY 60GGCACCTCTT TC 72<210>2<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>2TTCACTATCC ACTGCAGTGT CACTGCTGCA GGTGACTACT ACTGTGTTCA TGGCGCTAAT 60GGCACCTCTT TC 72<210>3<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN
<400>3Phe Thr Ile His Cys Ser Val Thr Ala Ala Gly Asp Tyr Tyr Cys Val1 5 10 15His Gly Ala Asn Gly Thr Ser Phe20
权利要求
1.抑制β-内酰胺酶的多肽的编码基因，它的DNA序列如下TTCACTATCC ACTGCNNYNN YNNYGCTGCA GGTGACTACT ACNNYNNYNN YNNYNNYNNYGGCACCTCTT TC其中N代表A、T、C或G中的一种，Y为C或T中的一种。
2.根据权利要求1所述的抑制β-内酰胺酶的多肽的编码基因，它的DNA序列如下TTCACTATCC ACTGCAGTGT CACTGCTGCA GGTGACTACT ACTGTGTTCA TGGCGCTAATGGCACCTCTT TC
3.根据权利要求1或2的DNA序列编码的抑制β-内酰胺酶的多肽的氨基酸序列如下phe Thr Ile His Cys Ser Val Thr Ala Ala Gly Asp Tyr Tyr Cys Val His Gly Ala Asn Gly Thr Ser Phe5 10 15 20
4.一种包括权利要求1或2的DNA序列的表达载体。
5.一种包括权利要求4所述的表达载体的宿主菌。
6.根据权利要求5所述的宿主菌，其特征在于该宿主菌为大肠杆菌。
7.制备抑制β-内酰胺酶的多肽的方法，包括用权利要求4所述的表达载体转化宿主菌。
8.根据权利要求7所述的制备抑制β-内酰胺酶的多肽的方法，其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌。
9.一种从权利要求5所述的宿主菌培养物中获得如权利要求3所述抑制β-内酰胺酶的多肽的方法。
10.权利要求3所述的多肽在制备治疗细菌感染疾病中的应用。
全文摘要
本发明公开了一段能够抑制β－内酰胺酶的多肽，及编码该多肽的基因，和利用表达载体制备所述多肽的方法。该段基因共由72个核苷酸组成，编码了24个氨基酸，推测分子量是2600道尔顿。利用该基因在大肠杆菌中表达重组的多肽并且纯化，实验证明它能抑制β－内酰胺酶的活性，因此该多肽可以用作与β－内酰胺类抗生素合用药来治疗细菌感染。
文档编号A61P31/04GK1778916SQ20041008457
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月25日 优先权日2004年11月25日
发明者朱宝泉, 孙伟, 龚家玮, 朱春宝, 胡又佳 申请人:上海医药工业研究院