专利名称：免疫调节杂环化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的杂环化合物、其制备方法、含有它们的组合物和临床治疗从免疫调节受益的医学病症的方法和用途，这些医学病症是，例如自身免疫疾病、类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、哮喘、移植、系统性红斑狼疮和银屑病。本发明更特别涉及新颖的、用于免疫抑制的杂环化合物，它们是能抑制CD80和CD28相互作用的CD80拮抗剂。
背景技术：
免疫系统拥有在免疫应答之中和之后通过各种调节机制控制在淋巴细胞的激活和失活之间的体内稳态的能力。特异地抑制和/或关闭免疫应答是其中的一种机制。那么，当MHC分子将抗原呈递到T-细胞受体时，只有存在辅助刺激信号才能合适地激活T-细胞。不存在这些辅助信号时，淋巴细胞不会激活，同时既会诱导称为无反应性或耐受性的功能性失活，T-细胞也会由程序性细胞凋亡而特异性地消除。
一种这样的辅助刺激信号参与在特化的呈抗原细胞上的CD80与在T-细胞上的CD28之间的相互作用，该信号已证实对全T-细胞激活是必需的(Lenschow等著。(1996)Annu.Rev.Immunol.，14，233-258)。因此，需要提供可抑制这种CD80/CD28相互作用的化合物。
发明详述本发明提供结构式(I)所示的化合物或其药学或兽医学上可接受的盐、水合物或溶剂化物 其中R1和R3独立代表H、F、Cl、Br、-NO2和-CN；任选被F或Cl取代的C1-C6烷基；或任选被F取代的C1-C6烷氧基；R4代表羧酸基团(-COOH)或其酯、或-C(＝O)NR6R7、-NR7C(＝O)R6、-NR7C(＝O)OR6、-NHC(＝O)NR7R6或-NHC(＝S)NR7R6，其中R6代表H，或结构式为-(Alk)m-Q的基团，其中m是0或1，Alk是任选取代的二价直链或支链C1-C12亚烷基，或C2-C12亚烯基，或C2-C12亚炔基或二价的C3-C12的碳环基团，任何这些基团可含有一个或多个-O-、-S-或-N(R8)-键，其中R8代表H或C1-C4烷基、C3-C4链烯基、C3-C4炔基或C3-C6环烷基；Q代表H或-NR9R10，其中R9和R10独立地代表H、C1-C4烷基、C3-C4链烯基、C3-C4炔基、C3-C6环烷基、酯基团，可任选取代的碳环或杂环基团；或当R9和R10与其所连接的N相连时形成一个可任选取代的环；R7代表H或C1-6烷基，或当R6、R7与它们所连接的一个或几个原子相连时形成具有5、6或7个环原子的可任选取代的单环杂环；X代表一根键或结构式为-(Z)n-(Alk)-或-(Alk)-(Z)n-的二价基团，其中Z代表-O-、-S-或-NH-，Alk见与R6有关的定义，n是0或1。
化合物(I)可以互变体的形式存在，例如(I1)和(I2) 在下文中，本发明的化合物可代表和指(I)的任何互变体形式，同时应理解为结构(I)的任何和所有互变体形式，特别是(I1)和(I2)均包括在本发明中。
通用结构式(I)所示的化合物是CD80拮抗剂。它们抑制CD80和CD28之间相互作用从而抑制了T细胞激活，因此调节了免疫应答。
因此本发明也包括(i)用于治疗从免疫调节受益的医学病症，特别是用于免疫抑制的结构式(I)所示的化合物或其药学或兽医学上可接受的盐。
(ii)结构式(I)所示的化合物或其药学或兽医学上可接受的盐在制造用于治疗从免疫调节受益的医学病症，特别是用于免疫抑制的药物中的用途。
(iii)在包括人类的哺乳动物中免疫调节，特别是免疫抑制的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物施加免疫调节有效剂量的结构式(I)所示的化合物或其药学或兽医学上可接受的盐。
(iv)包括结构式(I)所示的化合物或其药学或兽医学上可接受的盐和药学或兽医学上可接受的赋形剂或载体的药学或兽医学组合物。
从免疫调节受益的病症包括急性弥散性脑脊髓炎肾上腺机能不全变应性脉管炎和肉芽肿病淀粉样变性病(Amylodosis)强直性脊柱炎哮喘自身免疫阿狄森病自身免疫脱发自身免疫慢性活动型肝炎自身免疫溶血性贫血自身免疫Neutrogena自身免疫血小板减少紫癜(thrombocytopenic purpura)贝切特氏病小脑变性慢性活动型肝炎慢性炎性脱髓鞘多神经根神经病慢性单克隆丙种蛋白神经病典型结节性动脉周围炎先天性肾上腺增生寒冰病杜林病糖尿病伊顿-兰伯特肌无力综合症脑脊髓炎后天性大疱性表皮松懈症结节性红斑谷蛋白敏感性肠道病古德帕斯彻氏综合症传染性神经元炎淋巴瘤样甲状腺炎甲状腺机能亢进原发性血色素沉着症膜性肾小球肾炎分离中枢神经系统脉管炎(Isolated vasculitis of the central nervoussystem)Kawasaki氏病(Kawasaki’s disease)最小变化肾病(Minimal change renal disease)混杂性脉管炎(Miscellaneous vasculitides)混合结缔组织病传导阻滞的多病灶运动神经病(Multifocal motor neuropathy with conductionblock)多发性硬化重症肌无力视性眼阵挛/肌阵挛综合症类天疱疮天疱疮恶性贫血多肌炎/皮肌炎传染后关节炎(Post-infective arthritides)原发性肝硬化银屑病反应性关节炎莱特氏病视网膜病类风湿性关节炎硬化性胆管炎Sjgren氏综合症全身强直综合症亚急性甲状腺炎系统性红斑狼疮系统性坏死性血管炎系统性硬皮病大动脉炎颞动脉炎血栓闭塞性血管炎I型和II型自身免疫多腺综合症溃疡性结肠炎眼色素层炎韦格纳肉芽肿病用在文中的术语“酯”指-COOR形式的基团，其中R是名义上从醇类ROH衍生出的基团。酯基团的例子包括生理学上可水解的酯，例如甲酯，乙酯，正和异丙酯、正-、仲-和叔-丁酯和苄基酯。
用在文中的术语“亚烷基”指有两个未满足化合价的直链或支链的烷基链，例如-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH(CH3)CH2-、-CH(CH2CH3)CH2CH2CH2-和-C(CH3)3。
用在文中的术语“亚烯基”指有两个未满足化合价的直链或支链的链烯基链，例如-CH＝CH-、-CH2CH＝CH-、-C(CH3)＝CH-和-CH(CH2CH3)CH＝CHCH2-。
用在文中的术语“亚炔基”指有两个未满足化合价的直链或支链的炔基链，例如-C≡C-、-CH2C≡C-和-CH(CH2CH3)C≡CCH2-。
除非在文中有其它特定的说明，文中应用于任何部分的术语“取代”指以至少1种选自下组的取代基取代例如(C1-C6)烷基、(C1-C6)链烯基、(C2-C6)炔基、氟取代的(C1-C6)烷基、氟取代的(C1-C6)链烯基、氟取代的(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基和氟取代的(C1-C6)烷氧基(包括在特定情况下环在相邻的环C原子上被亚烷二氧基取代，例如亚甲二氧基或亚乙二氧基)、(C1-C6)烷硫基、苯基、苄基、苯氧基、苄氧基、羟基、巯基、氨基、氟代、氯代、溴代、氰基、硝基、氧代、-COOH、-SO2OH、-CONH2、-SO2NH2、-CORA、-COORA、-SO2ORA、-NHCORA、-NHSO2RA、-CONHRA、-SO2NHRA、-NHRA、-NRARB、-CONRARB或-SO2NRARB，其中RA和RB是独立的(C1-C6)烷基或(C2-C6)烷氧基团或5-7个环成员的单环碳环或杂环基团，或是当RA和RB与和其相连的氮原子结合起来时形成环。当“取代”指用苯基、苄基、酚基或苄氧基取代时，其苯环自身可由除苯基、苄基、苯氧基或苄氧基之外的任何前述的基团取代。
用在文中的术语“芳基”指单-、双-或三环碳环芳香基团，也指两个这种基团共价相连的。这种基团的例子是苯基，联苯基和萘基。
用在文中的非限定术语“碳环基”或“碳环的”包括芳基、环烷基和环烯基并指环原子均为碳的环系统(单环的、二环的、三环的或桥连的)。
用在文中的非限定术语“环烷基”指在环碳原子之间仅含有单键的碳环的环系统。
用在文中的非限定术语“环烯基”指在一对环碳原子之间至少含有一根双键的碳环的环系统。
用在文中的术语“杂芳基”指含有一个或多个选自S、N和O的杂原子的单-、双-或三环的芳基。这种基团的例子是噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡咯基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噻唑基、苯并异噻唑基、吡唑基、噁唑基、苯并噁唑基、异噁唑基、苯并异噁唑基、异噻唑基、三唑基、苯并三唑基、噻二唑基(thiadiazolyl)、噁二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吲哚基和吲唑基。
用在文中的术语“杂环基”或“杂环的”包括上述定义的“杂芳基”和特别是指含有一个或多个选自S、N和O的杂原子的单-、双-或三环的桥连的非芳香基，同时也指由单环非芳香基组成的基团，该单环非芳香基含有一个或多个这种杂原子并且与另一个这种基团或单环碳环基团共价相连。这种基团的例子是吡咯基、呋喃基(furanyl)、四氢呋喃基、噻吩基、哌啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、嘧啶基、吗啉基、呱嗪基、吲哚基、吗啉基、苯并呋喃基、吡喃基、四氢吡喃基、奎宁环基、异噁唑基、苯并咪唑基、亚甲二氧基苯基、亚乙二氧基苯基、马来酰亚氨基(maleimido)和琥珀酰亚氨基。
一些本发明的化合物因为存在不对称碳原子而含有一个或多个手性中心。不对称碳原子的存在使得在每个手性中心出现有R或S立体化学的立体异构体或非对映异构体。本发明包括所有这些立体异构体和非对映异构体及其混合物。
本发明的成盐化合物的盐包括生理学可接受的酸加成盐和碱盐(base salts)。合适的酸加成盐由可形成无毒盐的酸制得。例子包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、重碳酸盐/碳酸盐、重硫酸盐/硫酸盐、硼酸盐、右旋樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二苯磺酸盐、乙苯磺酸盐(esylate)、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、羟苯酰苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐(naphthylate)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、糖二酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。合适的碱盐由可形成无毒性的盐的碱制得。其例子包括铝盐、精氨酸、双苄基乙撑二胺、钙盐、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁盐、甲基葡胺、乙醇胺、钾盐、钠盐、缓血酸胺和锌盐。
方法本发明的，其中R4代表酰氨基团-C(＝O)NR6R7的化合物可通过合适的胺类HNR6R7和结构式(II)所示的化合物反应使羧酸基团酰胺化来制备 R1，R3，X，R6和R7见上述与结构式(I)有关的定义。
化合物(II)(即本发明的化合物(I)中的R4是羧酸基团)可通过结构式(III)所示的化合物与结构式(IV)所示的肼反应来制备 该反应可能导致产生位置异构物(IIA)和(IIB)的混合物 所需要的异构物(IIA)可从该混合物中分离出。
R4是酯或酰胺基团的化合物(I)也可通过中间体(III)与合适的肼(IVA)反应来制备 其中R4是酯或酰胺基团。同样，该反应也会导致要将所需的酯或酰胺异构体(I)分离出的羧酸(IIA)和(IIB)的酯或酰胺类似物的混合物。此外，羧酸化合物(II)可简单地酯化或酰胺化。
R4是“逆酰胺”基团-NR7C(＝O)R6的化合物(I)的制备可通过羧酸(II)经Curtius重排(见Ninomiya，K.；Shioiri，T.；Yamada，S.Tetrahedron(1974)，30(14)，2151-7)成异氰酸酯(V)
然后将异氰酸酯基团水解成氨基，再用例如酰氯Cl-C(＝O)R6使氨基酰化。在R7不是氢的情况下，R7取代基可在异氰酸酯还原步骤或酰化步骤之后导入。
在另一条得到本发明的“逆酰胺”(R4＝-NR7C(＝O)R6)化合物的途径中，异氰酸酯部份被硝基取代的结构如(V)所示的化合物被还原成对应的胺，然后酰化得到所需的逆酰胺。
R4是脲基团-NHC(＝O)NHR6或硫脲基团-NHC(＝S)NHR6的化合物(I)的可通过将异氰酸酯(V)或相应的异硫氰酸酯与合适的胺类H2NR6反应来制备。
R4是氨基甲酸酯基团-NR7C(＝O)OR6的化合物(I)的可通过将异氰酸酯与合适的醇类R6OH反应来制备。
制备本发明的化合物(I)和中间体(例如(III))的详细合成方法见文中的实施例。
在本发明的化合物中基团R4X-优选在苯环的4号位置。
X可以是，例如单键或-CH2-或-CH2CH2-。优选单键。
R3可以是，例如H、F、Cl、甲基、甲氧基或亚甲二氧基。当前优选R3是H。
R1可以是，例如H、F、Cl、甲基、甲氧基或亚甲二氧基。当前优选R1是H或氟，特别是在3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基环系统上的6号位置。
R4代表羧酸基团(-COOH)或其酯，或是上述定义的-C(＝O)NR6R7、-NR7C(＝O)R6、-NR7C(＝O)OR6或-NHC(＝O)NHR6。
当R4是酯基团时，其例子包括结构式为-COOR的那些，其中R是甲基、乙基、n-或异丙基、n-、仲或叔丁基或苄基。
当存在R6时，其代表H或结构式为-(Alk)m-Q的基团，其中m，Alk和Q如上述定义。当m是1时，Alk可以是，例如直链或支链的C1-C6亚烷基团，例如-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-和-CH2CH(CH3)CH2-。Alk也可以是，例如二价的亚环丙基、亚环戊基或亚环己基基团。Alk基团可被，例如OH、氧代、CF3、甲氧基或乙氧基任选取代。Alk基团可任选含有一杂原子，例如以醚、硫醚或氨基链的形式。
Q基团可以代表，例如H；-NR9R10其中R9和R10可以相同或不同并选自H、甲基、乙基、正-或异丙基或叔丁基；酯基团，例如甲酯、乙酯或苄酯；或是可任选取代的芳基、芳氧基、环烷基、环烯基或杂环基团，例如苯基、苯氧基、环戊基、环己基、呋喃基、噻吩基、奎宁环基、哌啶基或哌嗪基。
当存在R7时，其代表H或C1-C6烷基，例如甲基、乙基、正-或异丙基、正-、仲或叔丁基；或当R6和R7与它们所连接的一个或几个原子相连时形成具有5、6或7个环原子的可任选取代的单环杂环。
特别优选以下这些情况，R4代表-C(＝O)NR6R7或-NHC(＝O)NR7R6，其中R7是H，R6代表结构式为-(Alk)m-Q的基团，其中m是1，二价基团Alk含有3或4个碳原子并且是未取代的，Q代表NR9R10，其中R9和R10独立代表H、C1-C4烷基、C3-C4链烯基、C3-C4炔基、C3-C6环烷基、酯基团、可任选取代的碳环或杂环基团；或当将其与和其相连的氮原子结合时形成一可任选取代的环。
特别优选如结构式(IC)所示的本发明化合物的亚类 其中X和R4如上所述。在该亚类中，R4X-基团可以在苯环的4号位置。该亚类特别包括X是单键并且R4是-C(＝O)NR6R7，其中R6和R7如上所述的化合物。例如，在这样的化合物中R6可以是奎宁环基而R7是H。
具体的本发明化合物包括在本文实施例中的那些化合物。
优选的本发明化合物是结构式(A)所示的4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-N-(2，2-二氟-乙基)-苯甲酰胺
或其药学或兽医学可接受的盐，水合物或溶剂化物。
另一个优选的本发明化合物是结构式(B)所示的N-[3-(叔丁基-甲基-氨基)-丁基]-4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺 或其药学或兽医学可接受的盐，水合物或溶剂化物。
如上所述，本发明包括含有结构式(I)所示的化合物或其药学或兽医学上可接受的盐和药学或兽医学上可接受的赋形剂或载体的药学或兽医学的组合物。在这样的组合物中，要了解任何特定病人的具体剂量水平取决于一系列因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、总的健康状况、性别、饮食情况、给药时间、给药途径、排出率、药物的组合情况和要接受治疗的特定疾病的起因和严重性。最优化的剂量水平和给药频率通过临床试验确定。
本发明涉及的化合物可以任何与其药代动力学性质一致的途径制备给药。口服给药的组合物的形式可以是药片、胶囊、粉末、颗粒、锭剂、液体或凝胶制剂，例如口服的、局部的或无菌非肠道的溶液或悬浮液。用于口服的药片和胶囊可以是单剂形式，并且可以含有常规的赋形剂，例如粘合剂(例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮)；填充剂(例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘油)；压片润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉)或可接受的润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。药片可以用常规药学实践中公知的方法包衣。口服的液体制剂的形式可以是，例如水或油的悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂，或是制成干粉在使用前用水或其它的合适载体重新配制。这样的液体制剂可含有常规的添加剂，例如悬浮剂(例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖糖浆、明胶氢化的可食用油脂)；乳化剂(例如卵磷脂、山梨聚糖单油酸酯或阿拉伯胶)；非水载体(可以含有可食用的油)例如杏仁油、分馏的椰油、油酯(例如甘油、丙二醇或乙醇)；防腐剂(例如甲基或丙基p-羟基苯甲酸酯或山梨酸)，并且如果需要可以加入常规的调味剂或染色剂。
为局部应用于皮肤，该药物可以制成霜剂、洗剂或软膏剂。用于药物的霜剂或软膏剂是本领域公知的常规制剂，例如描述于药学标准教科书(例如英国药典)中的。
为局部应用于眼睛，该药物可在合适的无菌水或非水载体中配制成溶液或悬浮液。其中也可以包括添加剂，例如缓冲液(例如偏亚硫酸氢钠或依地酸二钠)，防腐剂，包括杀菌剂和杀真菌剂(例如苯基乙酸汞或苯基硝酸汞、氯化苄烷铵或双氯苯双胍己烷)和增稠剂，例如羟丙甲纤维素。
活性成份也可在无菌介质中以肠胃外给药。取决于载体和所使用的浓度，药物既可悬浮又可溶解在载体中。有利的是，佐剂(例如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂)也可溶解在载体中。
本发明的具体上述方式描述于以下非限制性实施例中以下是用于试验描述的缩写DMF 二甲基甲酰胺DMA 二甲基乙酰胺DMSO 二甲基亚砜HBTU O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基六氟磷酸脲鎓HPLC 高效液相色谱LCMS 液相质谱NMR 核磁共振光谱实施例1步骤1制备(苯腙)丙二酸
二羟丙二酸钠一水合物(5.00g，27.8mmol)溶解在1M的盐酸(50ml)中得到无色的混浊溶液。将苯肼(3.00g，2.72ml，27.8mmol)于室温滴加入搅拌的混合物中。90分钟后过滤收集形成的黄色沉淀并以水洗涤(50ml)。滤饼用乙酸乙酯/己烷[1∶1]研碎，过滤，然后减压干燥。分离得到黄色粉末状的标题化合物(4.74g，22.7mmol，82％)。LCMSm/z 207[M-H]+。
此外，产品也可以用乙酸乙酯(2×250ml)从液相中萃取，有机相以硫酸镁干燥，过滤并减压除去溶剂。
步骤2制备(苯基亚肼基)丙二酰氯 (苯基亚肼基)丙二酸(1.00g，4.80mmol)在惰性气体中与无水氯仿(15ml)混合得到黄色的悬浮液。于室温搅拌混合物并分批加入五氯化磷(2.19g，10.5mmol)。反应混合物加热回流1.5小时得到绿色溶液。混合物冷却至室温并以己烷(15ml)稀释。过滤收集形成的绿色沉淀物，并减压干燥。分离到绿色粉末状的标题化合物(645mg，2.63mmol，53％)。
步骤3制备4-羟基噌啉-3-羧酸甲酯 (苯基亚肼基)丙二酰氯(2.45g，0.01mmol)在惰性气体中与1，2-二氯乙烷(15ml)混合得到黄色的悬浮液。滴加四氯化钛(1.89g，1.09ml)形成棕色溶液。混合物加热回流过夜后，冷却至室温并滴加甲醇(15ml)终止反应。继续搅拌30分钟，减压除去挥发物。加入水(100ml)，所得到的悬浮液以正-丁醇(2×50ml)萃取。合并的有机相用水洗(2×20ml)并减压浓缩。分离到绿色固体状的标题化合物(1.04g，5.10mmol，51％)。LCMSm/z 205[M+H]+。
步骤4制备4-氯噌啉-3-羧酸甲酯 在惰性气体中，将亚硫酰氯(8.15g，5ml)滴加入4-羟基噌啉-3-羧酸甲酯(0.50g，2.45mmol)。混合物加入回流1.5小时，冷却至室温，减压除去剩余的亚硫酰氯。向残留物中加入甲苯(5ml)。混合物于室温搅拌过夜。过滤收集固体并减压干燥。分离到棕色固体状的标题化合物(248mg，1.11mmol，45％)。LCMSm/z 223[M+H]+。
步骤5制备4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酸 将4-肼基苯甲酸(68.4mg，0.45mmol)于室温与乙醇(5ml)混合得到奶油色的悬浮液。加入4-氯噌啉-3-羧酸甲酯(100mg，0.45mmol)，化合物加热至40-50℃1个小时。反应混合物冷却至室温并减压除去溶剂。向残留物中加入乙酸乙酯(10ml)。混合物在室温下搅拌1小时。过滤收集固体并减压干燥。分离到棕色粉末状的标题化合物(120mg，0.39mmol，86％)。LCMSm/z 307[M+H]+.NMR[DMSO-d6]δ＝7.69-7.77(m，1Haryl)；7.81-7.90(m，2Haryl)；8.05(d，J＝8.85，2Haryl)；8.20(d，J＝7.92Hz，1Haryl)；8.33(d，J＝8.85Hz，2Haryl)；14.64(s，NH)。
此外，反应也可于室温进行。在这种情况下，需要更长、2-3小时的反应时间。
实施例2制备N-[(二甲基氨基)丙基]-4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酰胺
4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酸(25mg，0.08mmol)与DMF(1ml)混合。在加入HBTU(30.3mg，0.08mmol)之后加入二异丙基乙胺(21mg，28μl，0.16mmol)和3-二甲基氨基丙胺(8.2mg，10.0μl，0.09mmol)。混合物于室温搅拌2小时。产物用制备型HPLC纯化。分离到红色固体状的标题化合物(12.6mg，0.032mmol，40％)。LCMSm/z 391[M+H]+。
实施例3制备N-苄基-4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酰胺 将4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酰胺(52mg，0.17mmol)与DMF(2ml)混合。在加入HBTU(64.5mg，0.17mmol)之后加入二异丙基乙胺(22mg，29μl，0.17mmol)和苯甲基胺(18.2mg，18.6μl，0.17mmol)。混合物于室温搅拌4小时。产物用制备型HPLC纯化。分离到红色固体状的标题化合物(6.6mg，0.02mmol，10％)。LCMSm/z 396[M+H]+。
实施例4步骤1制备4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酰氯
将亚硫酰氯(90ml)加入4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酸(2.36g，7.70mmol)。混合物在氮气中加热回流2小时。得到暗红色溶液，冷却至室温并减压除去剩余的亚硫酰氯。向残留物中加入甲苯(30ml)并于室温在氮气中搅拌混合物直至沉淀完全。过滤收集固体并以甲苯洗涤(2×30)。分离到红色固体状的标题化合物(2.20g，6.77mmol，88％)。LCMSm/z 321[M+H]+(样品在甲醇中形成甲酯)。
步骤2制备N-[(环己基氨基)丙基]-4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酰胺 4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酰氯(97mg，0.30mmol)溶解在无水DMA(2ml)中。在)加入二异丙基乙胺(39mg，53μl，0.60mmol)后加入N-环己基-1，3-丙二胺(52mg，0.60mmol。混合物搅拌30分钟后以正-丁醇萃取(2×20ml)。合并的有机相以水洗涤并减压浓缩直至观察到有沉淀。加入己烷(20ml)和乙酸乙酯(10ml)，过滤收集固体并减压干燥。分离到暗红色粉末状的产物(82mg，0.18mmol，62％)。LCMSm/z 445[M+H]+。
实施例5步骤1制备[(2-氟苯基)亚肼基]丙二酸
二羟丙二酸钠一水合物(2.21g，12.3mmol)溶解在1M的盐酸(50ml)中得到无色的混浊溶液。将盐酸2-氟-苯肼(2.00g，12.3mmol)于室温分批加入搅拌的混合物中。形成了黄色沉淀，混合物以水(50ml)稀释并继续搅拌过夜。加入乙酸乙酯(150ml)，各相剧烈混合直至固体溶解。分离各相并用乙酸乙酯洗涤水相(50ml)。合并的有机相用硫酸镁干燥，过滤并减压除去溶剂。分离到黄色粉末状的标题化合物(2.55g，11.7mmol)。LCMSm/z 227[M-H]+。
步骤2制备[(2-氟苯基)亚肼基]丙二酰氯 在惰性气体中将(2-氟苯基亚肼基)丙二酸(1.33g，5.88mmol)于无水氯仿(20ml)混合得到黄色悬浮液。悬浮液于室温搅拌并分批加入五氯化磷(2.69g，12.9mmol)。反应混合物加热回流2小时得到暗黄色溶液。混合物冷却至室温并减压浓缩直至产生沉淀。过滤收集固体，并以己烷(30ml)洗涤固体，然后减压干燥。分离到黄色粉末状的标题化合物(760mg，2.89mmol)。
步骤3制备8-氟-4-羟基噌啉-3-羧酸甲酯 在惰性气体中将(2-氟苯基亚肼基)丙二酰氯(19.4g，74mmol)与1，2-二氯乙烷(100ml)混合得到黄色悬浮液。滴加四氯化钛(13.9g，8.08ml，74mmol)形成棕色溶液。混合物加热回流过夜。再加入四氯化钛(13.9g，8.08ml，74mmol)并继续加热24小时。反应混合物冷却至0-5℃并滴加甲醇(50ml)终止反应。继续于室温搅拌1小时并减压除去挥发物。加入水(300ml)，所得到的悬浮液以乙酸乙酯(3×100ml)萃取。合并的有机相以硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。分离到黄色固体(12g粗产品)。LCMSm/z223[M+H]+。
步骤4制备4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酸 上一步骤所得的8-氟-4-羟基噌啉-3-羧酸甲酯粗品(1.00g，4.95mmol)溶解于亚硫酰氯(50ml)。溶液加热回流2-3小时直至观察不到有气体冒出。反应混合物冷却至室温并减压除去剩余的亚硫酰氯。中间体粗品用甲苯(3×25ml)共沸蒸馏。得到暗棕色固体，并以乙醇(25ml)溶解。加入4-肼基苯甲酸(640mg，4.21mmol)，混合物于室温搅拌过夜。过滤收集固体，与1M的HCl(100ml)混合，过滤，以己烷(50ml)洗涤并减压干燥。得到棕色固体(890mg的粗品)。LCMSm/z[M+H]+325。
实施例6步骤1制备4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酰氯 上一步骤所得的4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酸粗品(1.45g)溶解在亚硫酰氯(50ml)中。混合物加热至70℃2-3个小时直至观察不到有气体冒出。混合物冷却至室温并减压除去剩余的亚硫酰氯。残留物与甲苯(2×20ml)一起共沸蒸馏得到固体。过滤收集固体，用甲苯洗涤并减压干燥。分离到黄色粉末状的产物(670mg，1.95mmol)。LCMSm/z[M+H]+339(样品溶解于甲醇形成甲酯)。
步骤2制备4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-N-(吡咯烷-1-基-丁基)苯甲酰胺
将4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酰氯(100mg，0.29mmol)溶解于无水DMA(2ml)中。加入二异丙基乙胺(75mg，101μl，0.58mmol)之后加入吡咯烷(41mg)。混合物于室温搅拌过夜。加入水(5ml)和n-丁醇(5ml)。分离各相。有机相以水(2×5ml)洗涤。减压除去挥发物。分离到棕色粉末状的产物(50mg，0.11mmol，37％)。LCMSm/z[M+H]+463。
实施例7制备4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-N-(1，2，2，6，6-五甲基哌啶-4-基)苯甲酰胺 将4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酰氯(100mg，0.29mmol)溶解于无水DMA(2ml)中。加入二异丙基乙胺(75mg，101μl，0.58mmol)之后加入4-氨基-1，2，2，6，6-五甲基哌啶(49mg，0.29mmol)。混合物搅拌过夜。加入水(5ml)和正-丁醇(5ml)。分离各相。有机相以水(2×5ml)洗涤并减压浓缩溶液。分离到暗红色固体状的标题化合物(50mg，0.105mmol，36％)。LCMSm/z[M+H]+477。
实施例8步骤1制备2-(4-硝基苯基)-1，2-二氢-3H-吡唑并[4，3-c]噌啉-3-酮
在惰性气体中将亚硫酰氯(326mg，200ml)滴加入4-羟基噌啉-3-羧酸甲酯(10.0g，49mmol)中。混合物加热回流2.5小时，冷却至室温并减压除去剩余的亚硫酰氯。向残留物中加入甲苯(100ml)并减压除去之。再次加入甲苯(100ml)重复此过程。得到棕色的半固体物质并溶解于乙醇(200ml)。分批加入4-硝基苯肼(5.99g，39.2mmol)。混合物于室温搅拌过夜。混合物加热至40-45℃1小时，然后冷却至室温。过滤收集固体，固体与乙醇(100ml)一起研碎并减压干燥。分离到棕色固体状的标题化合物(8.42g，27.4mmol，70％)。LCMSm/z 308[M+H]+。
步骤2制备2-(4-氨基苯基)-1，2-二氢-3H-吡唑并[4，3-c]噌啉-3-酮 将2-(4-硝基苯基)-1，2-二氢-3H-吡唑并[4，3-c]噌啉-3-酮(11.4g，37.2mmol)悬浮于乙醇(100ml)和水(100ml)的混合液中。加入铁粉(11.1g，200mmol)和氯化铵(5.34g，100mmol)。混合物加热至80℃过夜，冷却至室温并用碳酸钾碱化至pH9-10。用Celite衬垫过滤除去固体。滤液以正-丁醇(2×200ml)萃取。合并的有机相减压浓缩得到暗红色固体。固体与甲醇(100ml)一起研碎，过滤并减压干燥。分离到暗红色粉末状的标题化合物(5.58g，20.1mmol，57％)。LCMSm/z 278[M+H]+。
步骤3制备N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N-[4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯基]脲
在0-5℃，将2-(4-氨基苯基)-1，2-二氢-3H-吡唑并[4，3-c]噌啉-3-酮(44mg，0.16mmol)于氮气中悬浮在甲苯(0.5ml)中。加入DMA(0.5ml)之后加入N，N’-羰基二咪唑(26mg，0.16mmol)。混合物在0-5℃搅拌1小时，然后与3-二甲基氨基丙胺(18mg，0.18mmol)的甲苯(0.5ml)溶液混合。继续搅拌1小时，并用制备型HPLC纯化产物。分离到暗红色粉末状的标题化合物(2.6mg，6μmol，4％)。LCMSm/z 406[M+H]+。
实施例9制备4-(3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)苯甲酸乙酯 标题化合物同实施例1中步骤5的方法制备，其中用4-肼基苯甲酸乙酯替代其母体酸。MSMH+＝335.2结果BIAcore生物分子相互作用分析的使用生物素化的人CD80(hCD80-BT)是膜结合受体分子的重组可溶性形式，它与CD28结合启动T细胞激活。人们广泛地研究了CD80与CD28之间的相互作用(Collins等著，2002)。生物素化的人HLA-A2-tax是膜结合受体分子的重组可溶性形式，用在本实施例中作为对照蛋白，并且不期望它与本发明化合物相互作用。
BIAcore S51TM系统用于筛选上述实施例1-4的化合物。一系列S传感器芯片CM5接在BIAcore S51TM上。使用标准的胺偶合方法将抗生物素蛋白链菌素偶合到羧甲基表面上。芯片表面用0.2M EDC/0.05M NHS激活，接着与抗生物素蛋白链菌素(0.25mg/ml，在10mM乙酸钠中，pH5.0)结合，未占据的位点用1M乙二胺饱和。
BIAcore S51传感器芯片有两个分开的、用于固定蛋白质的传感器位点。hCD80-BT固定在抗生物素蛋白链菌素覆盖的一个传感器位点的表面直至观察到的应答为约3000RU。与化合物非特异结合的对照蛋白固定在第二个传感器位点上。用于这些试验的对照蛋白是生物素化的、人类HLA蛋白的可溶性形式。
在运行缓冲液(10mM，pH7.4，150mMNaCl，0.005％P20；5％DMSO)中配制一系列化合物的稀释溶液(1000nm-0.05nm)。
BIAcore S51TM使用运行缓冲液以流速30μl/分钟运行。注射入化合物和用于校正溶剂效应影响的数据的DMSO标准溶液。自动记录数据并使用BIAcore S51评估软件分析。
CD80与内源性蛋白配体(CD28)之间的相互作用是高度特异的，但是相对较弱的，其KD是4750nM，截断率大于0.2s-1。实施例2，3，4，6和7的化合物对CD80相对CD28有较高的亲和力和较长的停留时间，其KDs小于100nM并且截断率为2×10-2，这意味着这些噌啉能有效地与内源性配体竞争。未观察到这些噌啉与对照蛋白相互作用。
参考文献Collins AV等.(2002)Immunity 17，201-210“The interaction property ofcostimulatory molecules revisited”。
对人类Jurkat T细胞生产白介素-2(IL-2)的抑制作用方法人类Raji细胞以每孔2×105的浓度分散在96-孔圆底微滴定板的RPMI-1640培养基中，该培养基添加了10％的小牛血清、1％青霉素/链霉素和1％谷氨酰胺(RPMI培养基)。要检测的化合物(溶解在100％的DMSO中)在RPMI培养基中稀释8倍达到所期望的终浓度然后加入孔中达到所需要的终浓度并且总体积为每孔200μl。于37℃孵育20分钟之后，Jurkat T细胞以每孔2×105的浓度加入。CD3的单克隆抗体(UCHT1，R&D系统)以终浓度1μg/ml加入培养基，在指明处，还要以2.5μg/ml的浓度加入CD28的单克隆抗体(CD28.2，BD-Pharmingen)。细胞于37℃孵育5小时，然后将这些板离心并按照生产商的建议使用IL-2Eli-pair试剂盒(DIACLINEResearch，Besancon，France)对收集的上清液进行IL-2ELISA试验。
例如，实施例2的化合物(AV1142005)在30μM有65％的抑制活性。
均相时间分辨荧光试验上述的实施例进行无细胞的均相时间分辨荧光(HTRF)试验测试来确定其作为CD80-CD28相互作用的抑制剂的活性。
在试验中，铕和别藻蓝蛋白(APC)与CD28和CD80间接相连(通过抗体衔接物)形成复合物，该复合物使铕和APC靠近来产生信号。该复合物包括以下6种蛋白荧光标记1，衔接物抗体1，CD28融合蛋白，CD80融合蛋白，衔接物抗体2和荧光标记2。下表更详细地描述了这些试剂。
在复合物的形成中，铕和APC靠近并产生信号。
通过用小鼠Fab片段(C215)替代CD80-小鼠的Fab片段融合蛋白(1.9μg/ml)来测量非特异性相互作用。试验在黑色384孔板中进行，终体积为30μl。试验缓冲液为50mM的Tris-HCl，150mM的NaCl，pH7.8，并含有在使用前加入的0.1％的BSA(w/v)。
浓度为100μM-1.7nM的化合物加入上述试剂。反应于室温孵育4小时。使用Wallac Victor1420多功能计数仪进行双重测量。第一次测量激发340nm，发射665nm，滞后50μs，窗口时间200μs。第二次测量激发340那么，发射615nm，滞后50μs，窗口时间200μs。计数值做荧光交叉、终止和背景的自动校正。所测试的化合物的EC50活性记录为EC50*＝＞10μM，**＝1-10μM，***＝＜1μM.
实施例1-8的化合物在上述HTRF试验中有以下活性
实施例1*实施例2***实施例3***实施例4***实施例5*实施例6***实施例7***实施例8***实施例9**附加试验本发明化合物的其它例子用与上述实施例1-8中的类似的方法合成。合成的化合物的结构和其在上述HTRF试验中的活性列于下表。
表
以下是上述化合物在人类Jurkat T细胞产生白介素-2(IL-2)的抑制试验中的测试结果的例子
权利要求
1.如结构式(I)所示的化合物或其药学或兽医学上可接受的盐、水合物或溶剂化物 其中，R1和R3独立代表H、F、Cl、Br、-NO2和-CN；任选被F或Cl取代的C1-C6烷基；或任选被F取代的C1-C6烷氧基；R4代表羧酸基团(-COOH)或其酯、或-C(＝O)NR6R7、-NR7C(＝O)R6、-NR7C(＝O)OR6、-NHC(＝O)NR7R6或-NHC(＝S)NR7R6，其中R6代表H，或结构式为-(Alk)m-Q的基团，其中m是0或1，Alk是任选取代的二价直链或支链C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基或C2-C12亚炔基或二价的C3-C12碳环基团，这些基团均可含有一个或多个-O-，-S-或-N(R8)-键，其中R8代表H或C1-C4烷基、C3-C4链烯基、C3-C4炔基或C3-C6环烷基；Q代表H、-NR9R10，其中R9和R10独立地代表H、C1-C4烷基、C3-C4链烯基、C3-C4炔基、C3-C6环烷基、、酯基团，可任选取代的碳环或杂环基团；或者，R9和R10与其所连接的N相连时形成一个可任选取代的环；R7代表H或C1-6烷基，或者，R6和R7与它们所连接的一个或几个原子相连时形成具有5、6或7个环原子的可任选取代的单环杂环；X代表一根键或结构式为-(Z)n-(Alk)-或-(Alk)-(Z)n-的二价基团，其中Z代表-O-、-S-或-NH-，Alk见与R6有关的定义，n是0或1。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述基团R4X-是在苯环的4号位置。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中，X是键。
4.如以上权利要求中任一所述的化合物，其中，R3是氢。
5.如以上权利要求中任一所述的化合物，其中，R1是氢或氟。
6.如以上权利要求中任一所述的化合物，其中，R4代表-C(＝O)NR6R7，其中R6和R7如权利要求1所定义。
7.如以上权利要求中任一所述的化合物，其中，R4代表-NHC(＝O)NR7R6，其中R6和R7如权利要求1所定义。
8.如权利要求7所述的化合物，其中，R6是奎宁环基。
9.如以上权利要求中任一所述的化合物，其中，R6代表结构式为-(Alk)m-Q的基团，其中m是0或1，二价基团Alk含有3或4个碳原子并且是未取代的，Q代表-NR9R10，其中R9和R10独立地代表H，C1-C4烷基，C3-C4链烯基，C3-C4炔基，C3-C6的环烷基，酯基团，可任选取代的碳环或杂环基团；或当R9和R10与其所连接的N相连时形成可任选取代的环。
10.如权利要求6到8中任一所述的化合物，其中，R7是氢。
11.如权利要求1所述的化合物，其中，Q代表H、-CF3、-OH、-SH、-NR8R8，其中每个R8独立地代表H、C1-C4烷基、C3-C4链烯基、C3-C4炔基、C3-C6环烷基、酯基团，可任选取代的芳基、芳氧基、环烷基、环链烯基或杂环基团；或当R8和其所连接的N相连时形成环；R7代表H或C1-6烷基，或当R6和R7与它们所连接的一个或几个原子相连时形成具有5、6或7个环原子的单环杂环。
12.如权利要求11所述的化合物，其中，R4是羧酸基团(-COOH)或结构式为-COOR的酯基团，其中R是甲基、乙基、正-或异丙基、正-、仲或叔丁基或苄基。
13.如权利要求11或12所述的化合物，其中，所述R6代表结构式为-(Alk)m-Q的基团，其中m是1，Alk是-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、和-CH2CH(CH3)CH2-，或者是二价的亚环丙基、亚环戊基或亚环己基基团，可被OH、氧代、CF3、甲氧基或乙氧基任选取代，Q基团代表H；-NR8R8其中每个R8可以相同或不同并选自H、甲基、乙基、正-或异丙基或叔丁基；甲酯、乙酯或苄酯；或是可任选取代苯基、苯氧基、环戊基、环己基、呋喃基、噻吩基、哌啶基或哌嗪基。
14.如权利要求11-13中任一所述的化合物，其中，R7代表甲基、乙基、正-或异丙基、正-、仲或叔丁基；或当R6和R7与它们所连接的一个或几个原子相连时形成具有5、6或7个环原子的单环杂环。
15.如权利要求11到14任一所述的化合物，其中，R1是H、F、Cl、甲基、甲氧基或亚甲二氧基。
16.如权利要求11到14任一所述的化合物，其中，R1是氟，并在3-氧代-1，3-二氢-2H-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基环系统中的6号位置上。
17.如权利要求11到16任一所述的化合物，其中，R3是H、F、Cl、甲基、甲氧基或亚甲二氧基。
18.如权利要求11到17任一所述的化合物，其中，X是键，或-CH2-或-CH2CH2-基团。
19.如结构式(IC)所示的化合物或其药学上或兽医学上了接受的盐、水合物或溶剂化物 其中，X和R4如权利要求3、7-10或11-18中任一所述。
20.如权利要求18所述的化合物，其中，所述基团R4X-在苯环的4号位置上。
21.如权利要求19或20所述的化合物，其中，X是键，R4是-C(＝O)NR6R7，其中R6和R7各自如权利要求11，13或14所述。
22.如结构式(A)所示的化合物4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-N-(2，2-二氟-乙基)-苯甲酰胺 或其药学或兽医学可接受的盐，水合物或溶剂化物。
23.如结构式(B)所示的化合物N-[3-(叔丁基-甲基-氨基)-丁基]-4-(6-氟-3-氧代-1，3-二氢-吡唑并[4，3-c]噌啉-2-基)-苯甲酰胺 或其药学或兽医学可接受的盐，水合物或溶剂化物。
24.一种药学或兽医学组合物，其中，所述组合物包含如权利要求1-23中任一项所述的化合物和药学或兽医学上可接受的赋形剂或载体。
25.如权利要求1-23中任一项所述用于治疗从免疫调节中受益的病症的化合物。
26.如权利要求1-23中任一项所述的化合物在生产用于治疗从免疫调节中受益的病症的药物中的用途。
27.在包括人类在内的哺乳动物中进行免疫调节的方法，其中，所述方法包括向需要这种治疗的哺乳动物施加免疫调节有效剂量的如权利要求1到23任一项所述的化合物。
28.如权利要求25所述用途的化合物、如权利要求26所述的用途或如权利要求27所述的方法，其中，所述免疫调节是免疫抑制。
29.如权利要求25所述用途的化合物、如权利要求26所述的用途或如权利要求27所述的方法，其中，所述病症是自身免疫疾病、类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、哮喘、移植、系统性红斑狼疮和银屑病。
全文摘要
结构式(I)所示的化合物是CD80的抑制剂并可用于免疫调节治疗，其中R
文档编号A61P17/00GK1761664SQ200480006886
公开日2006年4月19日 申请日期2004年3月10日 优先权日2003年3月14日
发明者I·R·马修斯 申请人:阿维德克斯有限公司