结合补体级联抑制剂的制作方法

专利名称：结合补体级联抑制剂的制作方法
相关申请的交叉引用本申请要求2003年7月3日提交的美国专利临时申请序列号60/484,854和2004年5月14日提交的美国专利临时申请序列号60/571,374的权益，其公开内容通过引用全文结合到本文中。
粉末领域本发明涉及新的化合物及其治疗患者的某些病症的用途。更具体地说，本发明涉及结合补体级联(conjugated complement)抑制剂。
背景技术：
补体级联具有深入研究的意义和作用，包括其在需要的免疫反应中的作用。但是，对补体级联不需要的刺激涉及特征为炎症和组织损伤的某些熟知的病症。因此，已开发出可用于治疗此类病症包括以下病症的补体级联抑制剂遗传性血管性水肿、败血性休克、心肺分流术中人工泵后综合征(post pump syndrome in cardiopulmonarybypass)、阵发性夜间血红蛋白尿、器官排斥、创伤、脑创伤、哮喘、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮性肾小球性肾炎和皮肤损害、其它肾小球性肾炎、大泡型类天疱疮、疱疹样皮炎(dermatitisherpetiformis)、肺出血-肾炎综合征、格雷夫斯氏病、重症肌无力、胰岛素抵抗、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、多发性硬化、急性感染性多神经炎、Miller-Fisher综合征和阿尔茨海默氏病。参见例如美国专利号6,492,403和6,515,002。
对补体级联不需要的刺激涉及与细胞移植和移植物有关的并发症。已知需要细胞移植和移植物治疗疾病例如心力衰竭、糖尿病、中风、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、痴呆、肝病、肾病、烧伤和创伤。但是，在实践中，由于细胞移植和移植物的致免疫性导致激活补体级联，最终产生排斥，该治疗经常无效。因此需要缓解排斥反应的补体级联抑制剂。
但是，始终需要给予用于治疗患者的化合物赋于改善的药物动力学性质。已使用与聚乙二醇(PEG)共价连接的蛋白质药物增加这些药物的体内循环时间、水溶性和减少抗原性。参见例如美国专利号5,711,944。将几个聚合物分子与大分子蛋白例如胰岛素和血红蛋白结合但不防碍与其生物靶标相互作用的残基是可能的。小分子蛋白和肽与聚合物结合后，保留其活性更困难，因为这些生物活性物质通常几乎没有与生物活性有关的连接位点。与非肽小分子药物结合的聚合物主要限于前药策略。参见例如美国专利号5,614,549、美国专利号5,622,986和美国专利号6,127,355。用这些方法，通过代谢不稳定的共价部分例如酯将小分子与非抗原聚合物连接。通过酶水解酯，该药物必须从非抗原聚合物中释放，以使小分子跨越细胞膜转运入细胞。
因为补体级联抑制剂与细胞表面上的受体结合，所以它们无须跨越细胞膜。因此，无须限制使用代谢不稳定的共价键的小分子前药方法。但是，正如蛋白药物和小分子前药的情形，具有调节非跨越细胞膜的小分子补体级联抑制剂的药物动力学性质的技术仍然同等重要性。因此，对调节小分子补体级联抑制剂的药物动力学性质的方法的需求永无止境。
本发明涉及这些和其它重要的目的。
发明概述本发明部分涉及包含结合补体级联抑制剂的化合物。这些化合物可便利地与补体级联成分中的受体结合，因而可抑制补体级联或抑制由该级联形成的蛋白质(例如C3a和C5a)的作用。
在一个实施方案中，本发明提供包含结合补体抑制剂的治疗患者的药物。
在另一个实施方案中，本发明提供抑制补体级联激活的治疗患者的方法，该方法包括给予患者结合补体抑制剂。
通过本方面说明书和权利要求书，本发明的这些和其它方面将更清楚。
附图简述

图1为由药物形成药物连接体(linker)结合物的可能的反应途径示意图。
图2为由药物形成药物连接体结合物的可能的反应途径示意图。
图3为药物连接体结合物与聚合物连接的可能的反应途径示意图。
图4为多个药物连接体结合物与聚合物连接的可能的反应途径示意图。
图5为由药物形成药物连接体结合物的可能的反应途径示意图。
图6为药物连接体结合物与聚合物连接的可能的反应途径示意图。
图7为形成药物-聚合物结合物的可能的反应途径示意图。
图8为形成药物-连接体-聚合物结合物的合成路线示意图。
图9为图8的备选合成路线示意图。
图10为形成具有高平均分子量的单价和多价药物-聚合物结合物的合成路线示意图。
图11为形成三价药物-聚合物结合物的合成路线示意图。
说明性实施方案详述本发明部分涉及包含结合补体级联抑制剂的化合物。这些化合物可便利地与补体级联成分中的受体结合，因而可抑制补体级联或抑制由该级联形成的蛋白质(例如C3a和C5a)的作用。
应理解，本发明公开中所用的“结合”表示聚合物部分与该术语紧随其后的部分共价连接。因此，在本发明公开中，结合补体级联抑制剂是具有共价连接的聚合物部分的补体级联抑制剂。聚合物可选自聚醚、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物和以下定义的“活化”聚合物。
补体级联抑制剂可以是任何抑制补体级联的化合物。此类化合物的实例包括在美国专利号6,492,403、6,515,002、2003年5月28日提交的美国专利申请序列号60/383,130和10/445,817(委托人登记号(under client reference)1420001)中公开的那些，其公开内容通过引用全文结合到本文中。
在本发明的一个实施方案中，提供式(I)化合物(D-L)n-P(I)其中每次出现时，D独立选自补体级联抑制剂化合物；L(每次出现时)是任选的在每次出现时独立选择的连接基团；n是1、2、3、4、5或6；和P是提高D的药物动力学性质的化合物。
在一个优选的的实施方案中，D通过在生理条件下基本上不水解的键与P(包括通过任选的L)连接。
在一个优选的的实施方案中，n是1。
在另一个优选的的实施方案中，n是2。
在另一个优选的的实施方案中，n是4。
应理解，式(I)包括所有可能的组合，例如(D)n-P、(D-L)n-P，包括D-L-D-L-P和D-L-P-L-D，以及(D)n-P-(D-L)n。
补体级联抑制剂本领域中已知有多种小分子补体级联抑制剂，它们可用作本发明结合化合物的成分，包括但不限于与C1s亚成分、C1r亚成分、C1q亚成分、C5a受体、C3、D因子、B因子、C3a受体和MASP-2结合的化合物。适宜的补体级联抑制剂包括与C1s亚成分结合的化合物，例如在美国专利号6,492,403、6,515,002、2003年5月28日提交的美国专利申请序列号60/383,130和10/445,817(委托人登记号1420001)中公开的化合物，其公开内容通过引用全文结合到本文中。
适宜的补体级联抑制剂还包括与C1r亚成分结合的化合物，例如在美国专利号5,652,237中公开的化合物，其公开内容通过引用全文结合到本文中，和在WO 00/61608中公开的那些。
适宜的补体级联抑制剂还包括与C5a受体结合的化合物，例如在WO 02/14265中公开的化合物，其公开内容通过引用全文结合到本文中。
前述实例并不限制本公开内容的范围，如可将D理解是任何抑制补体级联的化合物。可通过将特异性结合机理看成空间相互作用，产生各自用不同连接点连接的几个D-L-P或D-P化合物，用已知方法例如P.Giclas，.Therapeutic Interventions in the Complement System，第225-236页，Lambris J.D.；Holers M.V.编辑筛选这些化合物的生物活性，确定D与L或D直接与P的合适连接点。通常，D具有或可被与互补基团形成键的适宜基团取代，例如氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基和巯基烷基。
在一个实施方案中，D是C5a受体拮抗剂。
在一个实施方案中，D是与C1r亚成分结合的化合物。
在一个实施方案中，D是与C1q亚成分结合的化合物。
在一个优选的实施方案中，D是与MASP-2亚成分结合的化合物。
在一个优选的实施方案中，D是与C1s亚成分结合的化合物。
在一个优选的实施方案中，D是与C1s亚成分和MASP-2亚成分结合的化合物。
在一个优选的实施方案中，D不是肽。
在一个优选的实施方案中，D是分子量为约100分子量单位至约2000分子量单位(和范围和其中的具体分子量的所有组合和次级组合)，优选约400分子量单位至约1200分子量单位，或者约400分子量单位至约2000分子量单位的小分子。
在一个实施方案中，D是非芳族化合物。
在一个实施方案中，D是芳族化合物。
在一个实施方案中，D是芳族胍。
在一个优选的实施方案中，D是芳族和/或杂芳族脒。
在一个优选的实施方案中，D是式(II)化合物 其中R1、R2和R3独立选自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羟基；U是噻吩基-R5、亚苄基、亚苯基、NH或键；R5是SO2、NH或键；Z是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基(cycloheteroene)；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或键；T是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基或硝基；
X是氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基、巯基烷基，或与L或P连接的键；V是甲基、乙基或Cl；和R4是H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2、脲或胍基。
应理解，作为(D-L)n-P化合物的部分的D、L和P具有与其原始“母核”化合物略微不同的式和个体特征。但是，本领域技术人员将会认为无须描述两式之间的差异，例如可以理解D-NH-C(＝O)-L键(“连接”化合物)是D-NH2母核与HOOC-L母核结合的结果。同样容易意识到，当是该化合物的一部分时，NH2-CH2-NH2母核连接体将是HN-CH2-NH。因此，除特指外，为简化的原故，本说明书使用母核和可互换的连接形式。
在一个实施方案中，D是 其中R4是H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2、脲或胍基，和当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)。
在一个实施方案中，D是 其中当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)；R6是C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤代、氨基或硝基；和V是甲基或乙基。
在一个实施方案中，D是 其中当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)；R6是C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤代、氨基、苯基、吡唑基或硝基；和V是甲基或乙基。
任选的连接基团当存在时，L可以是起连接D与P作用的化合物，同时在各部分之间提供空间。应理解，本说明书用术语“间隔基”作为“连接体”的部分的缩写，例如在公开连接体端基的论述中，连接体的基团可由NH2(或其它端基)-间隔基-SH(或其它端基)代表。
L任选每次出现，并且每次出现时被独立选择。因此，例如当n是3时，本发明结合补体抑制剂可不具有连接基团，或具有三个不同的连接基团。
在一个优选的实施方案中，L选自基团


其中AA是氨基酸，而m是1-12， 其中在AA是氨基酸，而m是1-12，
药物动力学改进剂在一个实施方案中，药物动力学改进剂(在式(I)中的P)可以是选自以下的聚合物聚醚(包括聚环氧乙烷、聚环氧丙烷和聚(环氧乙烷-环氧丙烷)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物和“活化”聚合物。
在一个优选的实施方案中，药物动力学改进剂是分子量为约750分子量单位至约60,000分子量单位(和范围和其中的具体分子量的所有组合和次级组合)的一甲基-封端的聚乙二醇，优选约20,000分子量单位至约40,000分子量单位。
还在优选的实施方案中，药物动力学改进剂是活化的式(III)聚合物 其中M是CH3、HC＝CH-C(＝O)、O＝CH-CH2、H2N-CH2-CH2、Cl-H3N+-HN-C(＝O)-CH2、O＝C＝N-CH2CH2、HS-CH2CH2、H2C＝CH-S(＝O)2-CH2CH2， j为约17至约1400(和范围和其中的具体数字的所有组合和次级组合)；和A是O-CH2-CH(＝O)、O-C(＝O)-CH2＝CH2、O-CH2-CH2-NH2、NH2、O-CH2-C(＝O)-NH-NH3+Cl-、SH、N＝C＝O、S(＝O)2-CH＝CH2，
在本发明的备选实施方案中，提供式(IV)化合物D-Ln-Pn’其中每次出现时，D独立选自补体级联抑制剂化合物；L是任选的(每次出现时)，在每次出现时独立选择的连接基团；n是1或2；n′是1、2、3或4；和每次出现时，P独立选自提高D的药物动力学性质的化合物。
应理解，式(IV)包括所有可能的组合，例如(D)n-Pn’、(D-L)n-Pn’包括例如D-L(-P)-P、P-D-P、D-L-P-L-P、D-L-P-L-D、P-D-L-D-L-P、D-L-P-P-L-D和(D)n-Pn’-(D-L)n。
在一个备选的实施方案中，D是式(V)化合物 其中R1、R2和R3独立选自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羟基；U是噻吩基-R5、亚苄基、亚苯基、NH或键；R5是SO2、NH或键；Z是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或键；T是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基或硝基；X是氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基、巯基烷基或与L或P连接的键；当存在时，Y是氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基、巯基烷基、脲、胍基或与L或P连接的键；和V是甲基、乙基或Cl。
在一个优选的实施方案中，D选自基团 其中当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)，
当Y存在时，如果D与L或P连接，则Y是NH、C(＝O)、脲或胍基，V是甲基或乙基，和R6是H、C1-4烷基、OH、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基、苯基、吡唑基或硝基。
任选的连接基团当存在时，L可以是连接D与P的化合物，同时提供各部分之间的空间，基本上同上所述。
药物动力学改进剂在该实施方案中，药物动力学改进剂基本上同上所述。
其中n＝1和n′＝2的式(IV)化合物的一个实例是 其中D是式(V)化合物，和J为约17至约1400(范围和其中的具体数字的所有组合和次级组合)。
赋型剂在一个实施方案中，赋型剂选自在药用组合物中用作活性化合物载体的已知化合物。通常根据所选的给药途径和例如在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA，1980)中所述的标准药学准则选择赋型剂，其公开内容通过引用全文结合到本文中。
在一个备选的实施方案中，将活性化合物溶于磷酸盐缓冲盐水。
使用方法在另一个实施方案中，本发明提供抑制补体级联激活的治疗患者的方法，该方法包括给予患者结合补体抑制剂。
所述化合物可便利地与补体级联成分中的受体结合，因而可抑制补体级联，或抑制由该级联形成的蛋白质(例如C3a和C5a)的作用。抑制补体级联的需要可能是其中发生补体级联激活有害作用的某些病症的结果，或在其中不需要激活补体级联的结果的某些临床方法中(移植、移植物等)需要抑制补体级联。本说明书使用术语“病症”包括其中本领域技术人员认识到应该抑制补体级联的前述情况和任何时间。
本发明化合物可用于治疗多种病症包括遗传性血管性水肿、败血性休克、心肺分流术中人工泵后综合征、阵发性夜间血红蛋白尿、器官排斥、创伤、脑创伤、哮喘、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮性肾小球性肾炎和皮肤损害、其它肾小球性肾炎、大泡型类天疱疮、疱疹样皮炎、肺出血-肾炎综合征、格雷夫斯氏病、重症肌无力、胰岛素抵抗、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、多发性硬化、急性感染性多神经炎、Miller-Fisher综合征和阿尔茨海默氏病。预期的其它病症在美国专利号6,515,002和专利申请系列号60/383,130中公开，其全部公开内容通过引用全文结合到本文中。
在一个实施方案中，本发明包括缓解个体对细胞移植或移植物排斥的方法，该方法包括抑制激活补体级联。
移植物是指在个体内、同种个体之间或不同种个体之间(“异种移植”)的组织转移。
细胞移植是指在个体内、同种个体之间或不同种个体之间的细胞转移。移植的细胞包括干细胞、一种或多种供体动物的初级细胞、源自组织培养物的细胞、胰岛细胞、表达胰岛素的细胞、表达葡萄糖调节激素的细胞或表达治疗糖尿病的因子的细胞。
已知需要细胞移植和移植物治疗疾病例如心力衰竭、糖尿病、中风、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、痴呆、肝病、肾病、烧伤和创伤。但是，在实践中，由于细胞移植和移植物的致免疫性导致激活补体级联，最终产生排斥，该治疗经常无效。因此，需要抑制补体级联减轻排斥。参见RJ Armstrong等，Porcine Neural Xenografts InThe Immunocompetent RatImmune Response Following Grafting OfExpanded Neural Precursor Cells(在免疫活性大鼠中的猪神经异种移植物移植膨胀的神经前体细胞后的免疫反应)，Neuroscience，2001，106(1)201-16；W Bennet等，Expression Of Complement RegulatoryProteins On Islets Of LangerhansA Comparison Between Human IsletsAnd Islets Isolated From Normal And hDAF Transgenic Pigs(在胰岛上表达补体调节蛋白人胰岛与正常猪和hDAF转基因猪胰岛对比)，Transplantation，2001年7月27日，72(2)312-9；RP Robertson等，IsletTransplantation As A Treatment For Diabetes-A Work In Progress(移植胰岛用于治疗糖尿病-正在进行中的工作)，N Engl J Med.，2004年2月12日，350(7)694-705；T Lundgren等，Soluble Complement Receptor 1(TP 10)Preserves Adult Porcine Islet Morphology After IntraportalTransplantation Into Cynomolgus Monkeys(门静脉内植入猕猴后，可溶性补体受体1(TP10)保存成年猪胰岛形态)，Transplant Proc.2001年2-3月，33(1-2)725；W Bennet等，Damage To Porcine Islets OfLangerhans After Exposure To Human Blood In Vitro，Or AfterIntraportal Transplantation To Cynomologus MonkeysProtective EffectsOf Scr 1 And Heparin(在体外暴露于人血或门静脉内植入猕猴后，猪胰岛损伤Scr 1和肝素的保护作用)，Transplantation，2000年3月15日，69(5)711-9；R Reca等，Functional Receptor For C3a AnaphylatoxinIs Expressed By Normal Hematopoietic Stem/Progenitor Cells，And C3aEnhances Their Homing-Related Responses To SDF-1(通过正常造血干/先祖细胞表达C3a过敏毒素功能受体，和C3a加强它们对SDF-1的归巢相关反应)，Blood，2003年5月15日，101(10)3784-93(Epub 2003年1月2日)；K Teranishi等，Depletion Of Anti-Gal Antibodies By TheIntravenous Infusion Of Gal Type 2 And 6 Glycoconjugates In Baboons(通过给狒狒静脉输注2和6型Gal糖结合物耗竭Anti-Gal抗体)，Xenotransplantation，2003年7月，10(4)357-67；K Teranishi等，Depletion Of Anti-Gal Antibodies In Baboons By Intravenous TherapyWith Bovine Serum Albumin Conjugated To Gal Oligosaccharides(通过用与Gal低聚糖结合的牛血清白蛋白静脉治疗耗竭Anti-Gal抗体)，Transplantation，2002年1月15日，73(1)129-39；JZ Appel等，Modulation Of Platelet Aggregation In BaboonsImplications For MixedChimerism In Xenotransplantation.I.The Roles Of IndividualComponents Of A Transplantation Conditioning Regimen And Of PigPeripheral Blood Progenitor Cells(调节狒狒的血小板凝集提示在异种移植中的混和性嵌合状态。I.移植调控方案和猪外周血始祖细胞的各个成分作用)，Transplantation，2001年10月15日，72(7)1299-305；M Basker 等，Clearance Of Mobilized Porcine Peripheral BloodProgenitor Cells Is Delayed By Depletion Of The PhagocyticReticuloendothelial System In Baboons(通过消耗狒狒的吞噬网状内皮系统延迟清除活动的猪外周血始祖细胞)，Transplantation，2001年10月15日，72(7)1278-85；L Buhler等，High-Dose Porcine HematopoieticCell Transplantation Combined With CD40 Ligand Blockade In BaboonsPrevents An Induced Anti-Pig Humoral Response(给狒狒移植与CD40配体结合的大剂量猪造血细胞形成组塞，防止诱发抗猪体液反应)，Transplantation，2000年1月15日，69(11)2296-304。
在一个实施方案中，本发明包括缓解个体对细胞移植或移植物排斥的方法，该方法包括给予个体结合补体抑制剂抑制激活补体级联。个体可以是具有至少部分补体级联的任何动物，和在一个实施方案中，该个体是哺乳动物。
已发现组织损伤与器官保存有关，因为不需要的补体介导的炎性反应可通过将补体抑制剂加入器官保存液中克服。参见Bergamaschini L等，Cl inhibitor potentiates the protective effect of organpreservation solution on endothelial cells during cold storage(Cl抑制剂在冷藏期间加强器官保存液对内皮细胞的保护作用)，Transplant Proc.2001年2-3月，33(1-2)939-41。
在一个实施方案中，本发明包括在器官保存液中防止激活器官中的补体的方法，该方法包括使器官与结合补体抑制剂结合。
移植可在个体内、同种个体之间或不同种个体之间进行。
在一个实施方案中，本发明包括防止响应异物植入个体而发生补体激活的方法，该方法包括使该异物与结合补体抑制剂接触。个体可以是具有至少部分补体级联的任何动物，和在一个实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一个实施方案中，所述物体是外科植入物、人造器官或人造关节，或不需要补体激活的类似物体。
在一个实施方案中，结合补体抑制剂是具有式(I)或式(IV)的化合物(D-L)n-P D-Ln-Pn’(I) (IV)其中每次出现时，D独立选自补体级联抑制剂化合物；(每次出现时)L是任选的连接基团，每次出现时，所述基团被独立选择；n是1、2、3、4、5或6；n′是1、2、3或4；和P是提高D的药物动力学性质的化合物。
在一个实施方案中，D是式(VI)化合物 其中R1、R2、R3和任选R3’独立选自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羟基，其中当虚线代表双键时，R3’不存在；U是噻吩基-R5、亚苄基、亚苯基、NH或键；R5是SO2、NH或键；Z是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或键；T是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基或硝基；X是氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基、巯基烷基或与L或P连接的键；当存在时，Y′是氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基、巯基烷基、脲、胍基、H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2或与L或P连接的键；和V是甲基、乙基或Cl。
在一个实施方案中，存在L，并选自以下基团

其中AA是氨基酸，和m是1-12， 其中AA是氨基酸，和m是1-12，和 在一个实施方案中，P是具有式(III)的活化聚合物 其中M是CH3、HC＝CH-C(＝O)、O＝CH-CH2、H2N-CH2-CH2、Cl-H3N+-HN-C(＝O)-CH2、O＝C＝N-CH2CH2、HS-CH2CH2、H2C＝CH-S(＝O)2-CH2CH2， j为17-1400；和
A是O-CH2-CH(＝O)、O-C(＝O)-CH2＝CH2、O-CH2-CH2-NH2、NH2、O-CH2-C(＝O)-NH-NH3+Cl-、SH、N＝C＝O、S(＝O)2-CH＝CH2， 待给予的有效剂量和具体的给药模式取决于此类因素如年龄、体重、待治疗的具体区域和药物的具体组成和形式，如同本领域技术人员容易理解的那样。典型地操作是，给予低水平的剂量，增加剂量直至达到需要的治疗效果。活性成分和载体的相对比例可通过例如该化合物的化学性质、所选择的给药途径和标准药学规范确定。
最适宜预防或治疗的本发明化合物的剂量取决于给药形式、所选择的具体化合物和接受治疗的具体患者的生理特性。通常，开始时可使用小剂量，然后酌情少量增加直至在此状况下达到需要的效果。根据用大鼠进行的生理研究，人的治疗剂量通常可以为每日约0.01mg至约600mg/kg体重以及其中范围的所有组合和次级组合。或者，人的治疗剂量可以为约0.4mg至约10g或更高。并且一日可从一次到几次给予几个不同的剂量单位。一般而言，口服可能需要教大剂量。
可通过在患者体内导致活性药物与该药物的作用部位接触的任何方法给予用于本发明方法的化合物，例如口服或肠胃外给药。
肠胃外给药包括通过以下途径给药静脉内、肌肉内、皮下、直肠、眼内、滑膜腔内、经上皮包括透皮、眼、舌下和口含；局部给药包括眼、皮肤、眼、直肠和通过喷射气雾剂的鼻吸入。
作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物溶液可用适宜与表面活性剂例如羟丙基纤维素混和的水制备。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和在油中制备分散液。在普通储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂，防止微生物生长。
适宜注射用的药用形式包括例如无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况中，优选所述形式为无菌和流体以便于注射。优选在制备和储存条件下稳定，优选以防止微生物例如细菌和真菌污染的作用的条件保存。载体可以是含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其适宜的混合物和植物油的溶剂或分散溶媒。可通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散液的情形中，通过保持需要的粒径和使用表面活性剂保持适当的流动性。可通过各种抗细菌和抗真菌剂例如尼泊金酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、柳硫汞等防止微生物作用。在多种情形中，优选包括等渗剂例如糖或氯化钠。可通过使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶实现注射组合物的延长吸收。
可通过在适当的溶剂中，将需要量的活性化合物与需要的以上列举的各种其它成分混和，随后过滤消毒制备无菌注射液。通常，可通过将无菌活性成分加入含有碱性分散介质和以上列举中的必需的其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情形中，优选的制备方法可包括真空干燥和冷冻干燥技术，用这些技术可得到活性成分和其先前无菌过滤溶液中的任何其它需要的成分的粉末。
可通过任何可供利用的单个治疗药物或与其它治疗药物联合的药物使用的常规方法给予所述化合物。其它治疗成分包括但不限于抗生素、抗病毒药、抗真菌剂、抗炎药包括甾体和非载体抗炎药、麻醉药、止吐剂、免疫抑制剂及其混合物。
这样的其它成分包括以下任何药物a.抗菌药-氨基糖苷类例如阿米卡星、安普霉素、阿贝卡星、班贝霉素、布替罗星、地贝卡星、双氢链霉素、福提霉素、新霉素、庆大霉素、Ispamicin、卡那霉素、小诺米星、新霉素、十一烯酸新霉素、奈替米星、巴龙霉素、核糖霉素、西索米星、大观霉素、链霉素、链异烟肼和妥布霉素；Amphenicols、例如叠氮氯霉素、氯霉素、棕榈(Palmirate)氯霉素、氯霉素泛酸酯、氟苯尼考、甲砜霉素；安莎霉素类，例如利福米特、利福平、利福霉素和利福昔明；β-内酰胺；卡巴培南类，例如亚胺培南；头孢菌素，例如1-Carba(dethia)头孢菌素、头孢克洛(Cefactor)、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢曲嗪、头孢西酮、头孢唑啉、头孢克肟、头孢马替林、头孢地秦、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替安、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢泊肟普塞酯、头孢沙定、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢替唑、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢唑南、氰乙酰头孢霉素钠、头孢氨苄、头孢来星、头孢噻啶、头孢硝噻吩、头孢噻吩、头孢匹林钠、头孢拉啶和Pivcefalexin；头孢霉素例如头孢拉宗、头孢美唑、头孢克肟、Cefetan和头孢西定；单菌霉素例如氨曲南、卡卢莫南和替吉莫南；氧头孢烯类例如氟氧头孢和Moxolactam；青霉素类例如Amidinocillin、氮西林、氮脒青霉素匹酯、阿莫西林、氨苄西林、阿帕西林、阿扑西林、叠氮西林、阿洛西林、巴氨西林、苄青霉素酸、苄青霉素、羧苄西林、卡非西林、卡茚西林、氨甲西林、氯唑西林、环青霉素、双氯西林、联苯青霉素、依匹西林、芬贝西林、氟氯西林(Floxicillin)、海他西林、仑氨西林、美坦西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、培他西林、氢碘酸喷沙西林、苯明青霉素G、苄星青霉素G、二苯甲胺青霉素G、青霉素G钙、青霉素G Hydragamine、青霉素G钾、普鲁卡因青霉素G.、青霉素N、青霉素O、青霉素V、苄星青霉素V、海巴明青霉素V、青哌环素、非奈西林、哌拉西林、匹氨西林(Pivapicillin)、丙匹西林、喹那西林、磺苄西林、酞氨西林、替莫西林和替卡西林；林可酰胺类(Lincosumides)例如克林霉素和林可霉素；大环内酯类例如阿奇霉素、卡泊霉素、克拉霉素、红霉素及衍生物、交沙霉素、白霉素、麦迪霉素、美奥卡霉素、竹桃霉素、普利霉素、洛他霉素、罗沙米星、罗红霉素、螺旋霉素和醋竹桃霉素；多酞类例如安福霉素、杆菌肽、卷曲霉素、多粘菌素E、持久霉素、恩维霉素、夫沙芬净、短杆菌肽、短杆菌肽S、米卡霉素、多粘霉素、β-甲磺酸多粘霉素、普那霉素、利托菌素、替考拉宁、硫链丝霉素、结核放线菌素、短杆菌酪酞、短杆菌素、万古霉素、紫霉素、维吉霉素和杆菌肽锌；四环素类例如Spicycline、金霉素、氯莫环素、地美环素、多西环素、胍甲霉素、赖甲环素、甲氯环素、美他霉素、二甲胺四环素、土霉素、青哌环素、匹哌环素、罗利环素、山环素、琥珀酸氯霉素吡甲四环素和四环素；及其它例如环丝氨酸、莫匹罗星和薯球蛋白。
b.合成抗菌素-2，4-二氨基嘧啶类例如溴莫普林、四氧普林和甲氧苄啶；硝基呋喃类例如呋喃他酮、Furazolium、硝呋拉定、硝呋太尔、硝呋复林、硝呋吡醇、硝呋拉嗪、硝呋妥因醇和呋喃妥因；喹诺酮及其类似物类，例如氨氟沙星、西洛沙星、环丙沙星、二氟沙星、依诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、洛美沙星、米洛沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、奥索利酸、Perfloxacin、吡哌酸、吡咯米酸、罗索沙星、替马沙星和托氟沙星；磺胺类例如醋磺胺甲氧嗪、醋磺胺异唑、偶氮磺酰胺、苄磺胺、氯胺-β、氯胺-T、二氯胺-T、甲醛磺胺噻唑、N.sup.2-甲酰基-磺胺索嘧啶、N.sup.4-β-D-葡糖基磺胺、磺胺米隆、4′-(甲基-氨磺酰)sulfanilanilide、对硝基磺胺噻唑、诺丙磺胺、酞磺醋胺、酞磺胺噻唑、柳氮磺嘧啶、琥珀磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺醋酰、磺胺氯达嗪、磺胺柯定、磺胺西汀、磺胺嘧啶、磺胺戊烯、磺胺地索辛、磺胺多辛、磺胺乙二唑、磺胺脒、磺胺胍诺、磺胺林、磺胺洛西酸、磺胺甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺托嘧啶、新诺明、磺胺甲氧嗪、磺胺美曲、磺胺米柯定、磺胺唑、磺胺、磺胺基甲磺酸三乙醇胺盐、4-磺胺基水杨酸、N.sup.4-磺胺酰磺胺、磺胺酰脲、N-磺胺酰-3，4-xylamide、磺胺硝苯、磺胺培林、磺胺苯吡唑、磺胺普罗林、磺胺吡嗪、磺胺吡啶、磺胺异唑、磺胺均三嗪、磺胺噻唑、磺胺硫脲、磺胺托拉米、磺胺索嘧啶和磺胺异唑；砜类，例如醋氨苯砜、醋地砜、磺胺苯砜、氨苯砜、地百里砜、葡胺苯砜、苯丙砜、琥珀氨苯砜、磺胺酸、对-磺胺酰苄胺、对，对′-磺酰基双苯胺-N，N′双半乳糖苷、阿地砜和噻唑砜；及其它例如氯福克酚、海克西定、马加宁(Magainins)、乌洛托品、脱水亚甲枸橼酸乌洛托品、马尿酸乌洛托品、扁桃酸乌洛托品、磺基水杨酸乌洛托品、硝羟喹啉、角鲨胺和Xibomol。
c.抗真菌药(抗生素类)-多烯例如两性霉素-B、克念霉素、制皮霉素、非律平、制霉色基素、曲古霉素、哈霉素、鲁斯霉素、美帕曲星、那他霉素、制霉菌素、培西洛星、表霉素；及其它，例如偶氮丝氨酸、灰黄霉素、寡霉素、吡咯尼群、西卡宁、杀结核菌素和绿色木霉素。
d.抗真菌药(合成类)-烯丙胺例如萘替芬和特比萘芬；咪唑类例如联苯苄唑、布康唑、氯登妥因、氯米达唑、氯康唑、克霉唑、益康唑、恩康唑、Finticonazole、异康唑、酮康唑、咪康唑、奥莫康唑、硝酸奥莫康唑、硫康唑和噻康唑；三唑类例如氟康唑、伊曲康唑、特康唑；及其它例如吖啶琐辛、阿莫罗芬、珍尼柳酯、溴柳氯苯胺、丁氯柳胺、Chlophenesin、环吡酮、氯羟喹(Cloxyquin)、艾索帕尔、地马唑、二盐酸盐、依沙酰胺、氟胞嘧啶、哈利他唑、海克替啶、氯氟卡班、硝呋太尔、碘化钾、丙酸、吡硫翁、水杨苯胺、舒苯汀、替诺尼唑、托西拉酯、妥拉磺脲、托萘酯、3’，4’，5’，5，7-五羟黄酮(Tricetin)、苄硫噻二嗪乙酸和十一烯酸。
e.抗青光眼药物-抗青光眼药，例如达哌唑、双氯非那胺、地匹福林和毛果芸香碱。
f.消炎药-皮质类固醇类、氨基芳基羧酸衍生物例如依托芬那酯、甲氧芬那酸、Mefanamic acid、尼氟酸；芳基乙酸酸衍生物例如阿西美辛、氨芬酸桂美辛、氯吡酸、双氯芬酸、芬氯酸、苯克洛酸、芬克洛酸、芬替酸、葡美辛、Isozepac、氯那唑酸、甲嗪酸、奥沙美星、丙谷美星、舒林酸、噻拉米特和托美丁；芳基丁酸衍生物类例如异丁苯丁酸和芬布芬；芳酸例如环氯茚酸、酮洛酸和替诺立定；芳基丙酸衍生物例如布氯酸、卡洛芳、非诺洛芬、氟诺洛芬、布洛芬、异丁普生、丙嗪、吡酮洛芬、吡洛芬、普拉洛芬、丙替嗪酸和噻洛芬酸；吡唑类例如Mepirizole；吡唑酮类例如氯非宗、非普拉宗、莫非布宗、羟布宗、保泰松、苯基吡唑酮(Phenyl Pyrazolidininones)、琥布宗和噻唑丁炎酮；水杨酸衍生物例如溴水杨醇、芬度柳、乙二醇水杨酸酯、5-氨基水杨酸、水杨酸1-萘酯、奥沙拉嗪和柳氮磺吡啶；噻嗪酰胺例如屈昔康、伊索昔康和吡罗昔康；及其它例如e-乙酰胺基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄达酸、布可隆、卡巴腙、联苯吡胺、地他唑、愈创蓝油烃、麦考酚酸酸和衍生物的杂环氨基烷基酯、萘丁美酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、唑衍生物、瑞尼托林、哌福肟、2-取代-4，6-二叔丁基-s-羟基-1，3-嘧啶、普罗喹宗和替尼达普。
g.防腐剂-胍类例如阿来西定、安巴腙、氯己定和吡氯定；卤素/卤素化合物类例如保米磷盐酸盐(Bomyl Chloride)、碘酸钙、碘、一氯化碘、三氯化碘、碘仿、聚维酮碘、次氯酸钠、碘酸钠、氯氧三嗪、麝酚碘、三氯卡班、三氯生和曲氯新钾；硝基呋喃类例如呋喃唑酮、2-(甲氧基甲基)-5-硝基呋喃、尼曲昔腙、硝呋醛肟、硝呋肼和呋喃西林；酚类例如醋辛酚汞、氯二甲酚、六氯酚、水杨酸1-萘酯、2，4，6-三溴-间甲酚和3′，4′，5-三氯水杨苯胺；喹诺酮类例如氨喹脲、二氯羟喹、双氯甲喹啉、氯羟喹(Cloxyquin)、乙基氢化叩卜林(Ethylhydrocupreine)、哈喹诺、白毛莨碱、8-羟基喹啉及硫酸盐；及其它，例如硼酸、氯脒佐定、醋酸间-甲苯酯、硫酸铜和鱼石脂。h.抗病毒药-嘌呤/嘧啶酮例如2-乙酰基-吡啶5-((2-吡啶基氨基)硫代羰基)硫代羰基腙(Thiocarbonohydrazone)、阿昔洛韦、二脱氧腺苷、2，3-二脱氧胞苷、二脱氧腺苷、依度尿苷、氟尿苷、更昔洛韦、碘苷、MADU、吡啶酮、曲氟尿苷、阿糖腺苷(Videarbine)和齐多夫定；乙酰亮氨酸一乙醇胺、Acridinamine、烷基异唑、金刚烷胺、脒霉素、枯醛缩氨基硫脲、膦甲酸钠、乙氧丁酮醛、溶菌酶、美替沙腙、吗啉胍、鬼臼毒素、利巴韦林、金刚乙胺、司他霉素、维司托隆、胸腺素、曲金刚胺和珍那佐酸。
i.免疫抑制剂-甲泼尼龙、Atgam、即复宁、OKT3、巴利昔单抗、达珠单抗、雷帕霉素、泼尼松、环胞菌素、他克莫司、麦考酚酸莫酯和硫唑嘌呤。
制备方法在另一个实施方案中，本发明提供制备补体级联抑制剂的方法。
图1说明概括8种方法的示意图，可用这些方法将双官能化连接体(式I中的连接体L)引入关键支架(scaffold)1上(美国专利临时申请60/383130)，为在中间体2-9上进行结合提供适当处理。当X＝NH2或OH时，在碱例如吡啶存在下，通过用氯甲酸对硝基苯基酯处理，可将支架1分别预活化为氨基甲酸对硝基苯基酯或碳酸对硝基苯基酯。在碱，优选三乙胺或二异丙基乙胺的存在下，使原位生成的该中间体立即与适宜的连接体(NH2-间隔基-Y′)反应，生成脲或氨基甲酸酯2(路线a)。当X＝NH2时，可使支架1直接与含活化氨基甲酸酯或异氰酸酯的连接体反应，得到脲4(W′＝NH)。当X＝NH2时，也可用含碳酸酯或活化酸官能团(或酰氯)的连接体处理支架1，分别得到氨基甲酸酯4(W′＝O)或酰胺4(W′＝CH2)。在该路线的另一个变换方式中，可通过在亲核取代反应中置换连接体上的适合的离去基团生成中间体7(路线f)的亲核取代反应，使支架1上的亲核基团(X＝SH或OH)烷基化。或者，可用支架l上的适合的离去基团(优选LG＝Cl、Br、I、对硝基苯酚、磺酸甲酯或对-甲苯磺酸酯)使适宜的双官能化连接体烷基化，得到中间体3或6(如同路线b和e中分别所述的那样)，其中Z＝NH、S或O。或者，当X是酰氯或活化酸时，可路线d所示，用含连接体的胺处理，得到酰胺5。在路线d中，通过用多种标准肽偶联试剂，优选DIC/DMAP处理可原位生成活化酸。最后，可通过用适宜的与X结合的Michael受体共轭加成，完成支架1和连接体的结合。因此，在碱的存在下，具有适宜的亲核基团(Z＝NH或S)的连接体与丙烯酰胺或乙烯砜反应，可生成中间体8或9(如同路线g和h中分别所述的那样)。
图2说明概括8种方法的示意图，可用这些方法将双官能化连接体引入关键支架10上(美国专利临时申请60/383130)，为在中间体11-18上进行结合提供适当处理。当X＝NH2或OH时，在碱例如吡啶存在下，通过用氯甲酸对硝基苯基酯处理，可将支架1分别预活化为氨基甲酸对硝基苯基酯或碳酸对硝基苯基酯。在碱，优选三乙胺或二异丙基乙胺的存在下，使原位生成的该中间体立即与适宜的连接体(NH2-间隔基-Y′)反应，生成脲或氨基甲酸酯11(路线a)。当X＝NH2时，可使支架10直接与含活化氨基甲酸酯或异氰酸酯的连接体反应，得到脲13(W′＝NH)。当X＝NH2时，也可用含碳酸酯或活化酸官能团(或酰氯)的连接体处理支架10，分别得到氨基甲酸酯13(W′＝O)或酰胺13(W＝CH2)。在该路线的另一个变换方式中，可通过在亲核取代反应中置换连接体上的适合的离去基团生成中间体16(路线f)，使支架10上的亲核基团(X＝SH或OH)烷基化。或者，可用支架10上的适合的离去基团(优选LG＝Cl、Br、I、对硝基苯酚、磺酸甲酯或对甲苯磺酸酯)使适宜的双官能化连接体烷基化，得到中间体12或15(如同路线b和e中分别所述的那样)，其中Z＝NH、S或O。或者，当X是酰氯或活化酸时，可如路线d所示，用含连接体的胺处理，得到酰胺14。在路线d中，通过用多种标准肽偶联试剂，优选DIC/DMAP处理可原位生成活化酸。最后，可通过用适宜的与X结合的Michael受体共轭加成，完成支架10和连接体的结合。因此，在碱的存在下，具有适宜的亲核基团(Z＝NH或S)的连接体与丙烯酰胺或乙烯砜反应，可生成所需的中间体17或18(如同路线g和h中分别所述的那样)。
图3说明概括使PEG与连接体-药物复合物例如上述中间体连接的9种策略。
一种通用结合策略涉及药物-连接体19与PEG活性功能基(-NH2或-CO2H)之间形成的酰胺键。例如，当Y′＝CO2H时，在PEG-胺和化学计量的DMAP存在下，碳二亚胺偶合产生20(随后用TFA的DCM溶液脱保护后)。也可使用其它偶联试剂例如HBTU、PyBop或DPPA。当Y′是羧酸酯时，将酯水解可得到可与前述PEG-胺偶合的羧酸。或者，可通过类似的酰胺化试剂，将含胺官能团(Y′＝NH2)的连接体与PEG-羧酸偶联，得到22(单体PEG)或21(多个PEG单位)。市售可获得的PEG-活化酯(例如PEG-CO-N-羟基琥珀酰亚氨基酯)也可具有相同的用途。
第二个将PEG与药物-连接乌复合物连接的通用策略涉及将硫醇亲核加成或取代至合适的亲电体，生成硫键(sulfide bond)。例如，可使含硫醇的PEG与含卤化物(Y′＝Br)或甲磺酸酯(由Y′＝OH合成的)的连接体反应，得到24。或者，可将含硫醇的连接体加至PEG的马来酰亚胺基团上，得到26。在其中的各个情形中，可反转活性配偶体(连接体对PEG)上的功能基。
第三个用于结合的通用策略涉及在PEG与连接体之间形成的脲或氨基甲酸酯。例如，当药物-连接体复合物19含有胺官能团(Y′＝NH2)时，可用试剂例如氯甲酸对硝基苯酯和胺碱形成活化氨基甲酸酯[J.Med.Chem.38，3236-3245(1995)]。可使该活化氨基甲酸酯与PEG-胺反应，得到23。同样，当Y′＝OH时，可用试剂例如氯甲酸对硝基苯酯形成活化碳酸酯。该碳酸酯中间体与PEG-胺反应得到25。再次在其中的各个情形中，可反转活性配偶体(连接体对PEG)上的功能基。
图4描述每PEG单位合成多个药物-连接体部分的某些代表性策略(例如在式(I)中，当n＝2或n＝4时)。在一个实施方案中，可在PEG的每个末端((例如H2NCH2CH2-(OCH2CH2)n-CH2CH2NH2)双官能化PEG)简单地将PEG部分官能化，或可含有连接PEG构造的各种分支(例如四分支的PEG)。所涉及的键化学与图3中所述的那些相似。例如，可使双官能化胺-PEG(PEG-(NH2)2)与过量的19(Y′＝CO2H)偶合，得到双官能化部分27。同样，可使多功能胺-PEG(PEG-(NH2)n)与活化氨基甲酸酯(由19合成Y′＝NH2)或碳酸酯(由19合成Y′＝OH)反应，分别得到29和30。或者，可在碱性条件下，使用活性马来酰亚胺部分官能化的PEG与19(Y′＝SH)反应，得到28。另外，可用标准酰胺键形成条件，使具有多个羧酸基团的分支PEG偶合到19(Y′＝-NHR(R＝H、Me)，得到31。
对有机和肽化学领域技术人员而言，图1-4中所述策略所使用的方法为常规操作。
例如，通常用DIC/DMAP组合(其中外消旋化不是问题)或用其中氨基酸的α-中心外消旋化是潜在的问题的HBTU/HOBT组合，分别完成由胺或醇形成酰胺或酯。这也可用多种其它标准缩合剂(EDC、PyBOP、HATU、TBTU、HOBT/活化酯或DIC/HOBT)完成。(1)Bodanszky，M.；The Practice of Peptide SynthesisSpringer-VerlagNewYork，1984.(2)Bunin，B.；The Combinatorial IndexAcademic PressNew York，1998.(3)J Org Chem.1999，64(22)8063-8075。通常，通过使胺与异氰酸酯反应或用氯甲酸对硝基苯基酯活化，然后与仲胺(1)反应形成脲(J.Med.Chem.1995，38，3236-3245)。按前述(1)进行共轭加成和使硫醇加成到马来酰亚胺上(J.Am.Chem.Soc.1999，121，7967-7968。(2)Bioconjugate Chemistry.2003，14(2)464-72。(3)Nat StructBiol.2000，7(4)309-11.3月(4)，J.Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms，& StructureWileyNew York，1992)。
再看图5，按图2中所述方法，可将苯胺32(在美国专利申请序列号60/383,130中描述的)偶合到连接体62、63或64，得到相应的酰胺33、氨基甲酸酯34和脲35。当化合物33、34和35中的R9是保护的胺，Y′是OH、保护的胺或羧酸时，可除去R9上的保护基团，并可进一步与双-Boc保护的S-甲基异硫脲(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，US)反应，得到胍36、37和38。当R9是硝基时，可将其还原成胺，用相似方式处理，得到化合物36、37和38。
再看图6，可通过几种方法，使与连接体偶合形成化合物39的联芳基噻吩脒(在美国专利申请序列号60/383,130中描述的)连接到PEG分子上。例如，当Y′＝CO2H时，在PEG-胺(PEG-NH2)和化学计量的DMAP的存在下，使碳二亚胺偶合，得到40(随后用TFA的DCM溶液脱保护)。也可使用其它偶联试剂例如HBTU、PyBop或DPPA。当Y′是羧酸酯时，如前所述将该酯水解，得到可与PEG-NH2偶合的羧酸。或者，可通过类似的酰胺化试剂将含胺官能团(Y′＝NH2)的连接体与PEG-CO2H偶合，得到43。市售可获得的PEG-活化酯(例如PEG-CO-N-羟基琥珀酰亚氨基酯)也可用于此用途。
使PEG与药物连接体复合物39连接的第二策略涉及硫醇亲核加成或取代至适当的亲电体上，得到硫键。例如含硫醇的PEG可与含卤化物(Y′＝Br)或甲磺酸酯(由Y′＝OH合成)的连接体反应，得到42。
第三个用于结合的通用策略涉及在PEG与连接体之间形成的脲或氨基甲酸酯。例如，当药物-连接体复合物5含有胺官能团(Y′＝NH2)时，可用试剂例如氯甲酸对硝基苯酯和胺碱形成活化氨基甲酸酯[J.Med.Chem.38，3236-3245(1995)]。可使该活化氨基甲酸酯与PEG-NH2反应，得到41(Y″＝NH。同样，当Y′＝OH时，可用试剂例如氯甲酸对硝基苯酯形成活化碳酸酯。该碳酸酯中间体与PEG-NH2反应生成41(Y″＝O)。
图7说明将PEG部分直接与无连接体的药物分子连接的方法。该方法用于实施例5。
用TBAF处理Teoc保护的联苯胺44(在美国专利申请序列号60/383,130中描述)，用主要与空间位阻较小的胺反应的二-BOC保护的S-甲基异硫脲(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，US)处理得到的联苯胺，得到化合物45。可用氯甲酸对硝基苯酯处理化合物45，随后用图3中所述PEG-胺(PEG-NH2)处理，用TFA脱保护，得到化合物46。
或者，可用用图3中所述PEG-酸(PEG-CO2H)处理45，用TFA脱保护，得到化合物47。
图8说明制备实施例6中所述化合物的备选路线。在二异丙基乙胺的存在下，用乙酸基乙酰氯使苯胺48(在美国专利申请序列号60/383,130中描述)酰化，随后使乙酰基皂化，得到伯醇49。将49的硝基还原，随后用1，3-二(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-假硫脲的乙酸溶液使得到的苯胺胍基化(guanidinylation)，得到醇51。用甲磺酰氯活化该伯醇。使得到的甲磺酸酯52与3-巯基丙酰胺PEG-20kDa(RappPolymere)结合。最后，用TFA/DCM(1∶1)完全脱保护，得到PEG化的-化合物53(实施例6，备选路线)。
图9说明制备实施例6中化合物的备选路线。通过用溴乙酸叔丁基酯使3-巯基丙酸甲酯烷基化，随后用TFA除去叔丁基，用两步制备连接体57。然后用DIC/DMAP使连接体57与中间体58偶合(在美国专利申请序列号60/383,130中描述)。将该甲酯水解，随后用TBAF除去Teoc保护基团，进行前述的胍基化，得到酸60。用标准条件(DIC/DMAP的DCM溶液)完成与该中间体的聚合物结合，随后用TFA脱保护，得到需要的化合物61(实施例6)。
图10说明合成高分子量的PEG-结合物及尤其是高分子量(＞35K)的多价PEG-结合物的方法。可使用试剂例如氯甲酸对硝基苯酯和胺碱将中间体45转化为活化氨基甲酸酯[J.Med.Chem.38，3236-3245(1995)]。可使该活化氨基甲酸酯与双官能化PEG例如化合物62反应，得到具有游离羧酸端基的PEG结合物63。可在单官能PEG例如64存在下，用二异丙基碳二亚胺活化该酸，得到具有较高分子量的65结合物，或在双官能化PEG例如化合物66的存在下，得到二价PEG-结合物67。可用TFA处理化合物67，得到活性化合物68。
再看图11，其为说明合成多价PEG-结合物的方法。可使二-Boc-保护的赖氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯69与双官能化PEG例如66偶合，其用TFA处理，得到四价PEG类70。可用试剂例如氯甲酸对硝基苯酯和胺碱将中间体45转化为活性氨基甲酸酯[J.Med.Chem.38，3236-3245(1995)]。在DIEA的存在下，可使该活化氨基甲酸酯与70反应，得到四价PEG-药物结合物，其用TFA处理，得到活性四价PEG-药物结合物71。
可用本领域技术人员熟知的多种方法制备本发明化合物和结合物。可通过例如下述方法或技术人员意识到的其改进方法合成化合物。与本发明有关的所有公开方法可在任何规模包括毫克、克、克数量级、公斤、公斤数量级或商用工业规模水平上操作。
用于本发明方法的化合物可具有一种或多种不对称取代的碳原子，并可分离为旋光或外消旋体。因此，除具体说明的具体的立体化学或异构体外，包括结构的所有手性、非对映体、外消旋体和所有几何异构体。在本领域中已熟知如何制备和分离旋光体。例如，可通过标准技术包括但不限于拆分外消旋体；正、反相和手性色谱；选择性盐形成；重结晶等或通过由手性原料或通过有方向性合成目标手性中心分离立体异构体混合物。
容易理解，存在的官能团在合成过程中可具有保护基团。已知保护基团是可选择性连接到官能团(例如羟基和羧基)或从所述官能团中除去的化学官能团。这些基团存在于化合物中以提供对化合物暴露的化学反应条件呈惰性的这种官能团。多种保护基团中的任何基团可用于本发明。优选的保护基团包括苄氧基羰基和叔丁氧基羰基。可用于本发明的其它优选的保护基团可在Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.，Protective Groups in Organic Synthesis第2版，Wiley & Sons，1991中阐述。
定义当任何变量在任何取代基或在任何式中出现一次以上时，其在每次出现时的定义独立于其在另一次出现时的定义。因此，例如如果一个基团或多个基团被0-2个Q取代时，那么所述基团可任选被最高达两个Q取代，而且在每个基团中每次出现的Q独立选自可能的Q的定义目录。如果此类组合生成稳定的化合物，才允许取代基和/或变量的组合。当出现取代基的键穿越环中连接两个原子的键时，那么这种取代基可与环上的任何原子结合。
“在生理条件下基本上不水解”是指通常在人体内存在的条件。此类键包括酰胺、脲、碳-碳、氨基甲酸酯、醚、硫醚、硫脲、硫代酰胺、胺、肟、酰肼和酮。
本文中使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和动物组织接触，无过多毒性、刺激、过敏反应和其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
本文中使用的“药学上可接受的盐”是指通过制备酸或碱盐修饰本公开化合物的衍生物。适宜的盐的目录可在Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，第1418页中找到，其公开内容通过引用结合到本文中。
缓冲液包括例如磷酸盐、柠檬酸盐、磺基水杨酸和乙酸盐缓冲液。更完整的目录可在United States Pharmacopoeia中找到，其公开内容通过引用全文结合到本文中。
缩写PEG聚乙二醇TFA三氟乙酸Et3N 三乙胺THF四氢呋喃EtOAc 乙酸乙酯rt 室温NaOH 氢氧化钠MgSO4硫酸镁DCM二氯甲烷CH2Cl2二氯甲烷NaHCO3碳酸氢钠MeOH 甲醇TLC薄层层析AcOH 乙酸H2O 水SiO2二氧化硅ESI-MS 电喷雾离子化质谱Boc叔丁氧基羰基DIC二异丙基碳二亚胺1HNMR 质子核磁共振CDCl3氘氯仿h 小时MW 分子量
mL 毫升MeOD氘甲醇mg 毫克g 克μL 微升min 分钟HPLC高效液相色谱mmol毫摩尔mol 摩尔DIEA二异丙基乙胺EtOAc 乙酸乙酯NH4Cl 氯化铵EtOH乙醇Na2CO3碳酸钠PTLC制备型薄层色谱Et2O 乙醚RP-HPLC 反相高效液相色谱DMAP4-二甲氨基吡啶HBTUO-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐HOBT1-羟基苯并三唑水合物EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐HATUO-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N，′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐TBTU2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐PyBOP 苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-磷鎓六氟磷酸盐DPPA二苯磷酰基叠氮化物DIPC2-二甲氨基异丙基氯盐酸盐Ms-Cl 甲磺酰氯
NaOH氢氧化钠Teoc三甲基甲硅烷基乙氧基羰基DMSO二甲基亚砜H2SO4硫酸HNO3硝酸HCl 盐酸aq 水溶液Hex 己烷CH3CN 己腈KNO3硝酸钾Pd(PPh3)4四(三苯基膦)合钯(O)LCMS液相色谱质谱K2CO3碳酸钾PEG 20K 20,000道尔顿聚乙二醇TBAF氟化四丁铵DTNB5，5′-二硫二(2-硝基苯甲酸)CD3OD 氘甲醇PG 保护基团LG、LG1、LG2离去基团再用以下实施例说明本发明。
实施例实施例1N-(mPEG20k)-11-[3’-(5-氨基甲亚氨酰基(Carbamimidoyl)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-十一烷酰胺二(三氟乙酸)盐 a)8-甲基-1H-苯并[d][1，3]嗪-2，4-二酮 在30分钟内，向2-氨基-3-甲基苯甲酸(9.07g，60mmol)的THF(60mL)溶液中同时加入二异丙基乙胺(20.9mL)和三光气(5.94g，20mmol)的二氯甲烷(60mL)的溶液。加入结束后，在室温下搅拌混合物16小时。过滤固体，用乙醚(2×100mL)和H2O(3×50mL)洗涤，高真空下干燥，得到标题化合物(10.02g，94％收率)，为白色固体。1H NMR(DMSO)δ11.02(s，1H)，7.76(d，1H，J＝7.7Hz)，7.57(d，1H，J＝7.5Hz)，7.17-7.13(m，1H)，2.32(s，3H)。
b)8-甲基-6-硝基-1H-苯并[d][1，3]嗪-2，4-二酮
在冰水浴中，在5分钟内，向盛有8-甲基-1H-苯并[d][1，3]嗪-2，4-二酮((实施例1步骤a)9.27g，52.4mmol)的烧瓶中加入浓H2SO4(90mL)。搅拌10分钟后，在15分钟内，加入发烟HNO3(2.9mL)。在冰水浴中再搅拌反应混合物30分钟，在室温下搅拌30分钟，然后在搅拌下缓慢倾入冰中。收集固体，用H2O(3×50mL)洗涤，高真空下干燥，得到标题化合物(10.4g，89％收率)，为黄色固体。
1H NMR(DMSO-d6)δ11.65(br s，1H)，8.46-8.43(m，2H)，2.44(s，3H)。
c)2-氨基-3-甲基-5-硝基-苯甲酸甲酯 向8-甲基-6-硝基-1H-苯并[d][1，3]嗪-2，4-二酮((实施例1步骤b)1.04g，4.68mmol)的甲醇(30mL)的悬浮液中加入甲醇钠(0.5M，0.94mL，4.7mmol)的甲醇溶液。在室温下搅拌混合物1小时，加入饱和NH4Cl中和该混合物。减压除去甲醇，过滤得到的混合物。固体用H2O洗涤(两次)，高真空下干燥，得到产物(0.97g，99％收率)，为黄色固体。
1H NMR(DMSO d6)δ8.48(d，1H，J＝2.7Hz)，8.02-8.01(m，1H)，7.75(br s，2H)，3.86(s，3H)，2.20(s，3H)。
d)2-溴-3-甲基-5-硝基-苯甲酸甲酯 在室温下，向盛有溴化铜(II)(7.40g，33.1mmol)的烧瓶中加入亚硝酸叔丁酯(4.50mL，37.9mmol)的MeCN(30mL)溶液。搅拌5分钟后，加入2-氨基-3-甲基-5-硝基-苯甲酸甲酯((实施例1步骤c)4.97g，23.7mmol)的MeCN(50mL)悬浮液。在室温下搅拌该混合物15分钟，在65℃下搅拌20分钟，然后冷却回到室温。过滤反应物，浓缩滤液，得到深棕色固体。该固体用己烷研磨，过滤，用己烷(4×50mL)洗涤。合并所有的己烷层，浓缩，得到标题产物(5.7g，88％收率)，为浅黄色固体。
1H NMR(CDCl3)δ8.35(d，1H，J＝2.5Hz)，8.21(d，1H，J＝2.9Hz)，3.99(s，3H)，2.59(s，3H)。
e)2-溴-3-甲基-5-硝基-苯甲酸 于室温下，向2-溴-3-甲基-5-硝基-苯甲酸甲酯((实施例1步骤d)5.04g)的乙醇(50mL)的溶液中加入NaOH水溶液(4M，10.1mL，40.5mmol)，搅拌16h。浓缩得到的红色溶液至干，使其溶于极少量的H2O中，用1N HCl酸化至pH 3-4。过滤固体，用H2O(3×50mL)洗涤，高真空下干燥，得到标题化合物(4.5g，94％收率)，为浅黄色固体。
1H NMR(DMSO)δ8.36-8.35(m，1H)，8.24-8.23(m，1H)，2.53(s，3H)。
f)(2-溴-3-甲基-5-硝基-苯基)-氨基甲酸叔丁基酯 在室温下，搅拌下，将二苯磷酰基叠氮化物(453μL，2.1mmol)加入2-溴-3-甲基-5-硝基-苯甲酸((实施例1步骤e)520mg，2mmol)和三乙胺(1.4mL，2.1mmol)的叔丁醇(25mL)溶液中。15分钟后，将反应物加热至80℃，保持16h。加入EtOAc(100mL)，溶液用柠檬酸(3×30mL)、NaHCO3(2×30mL)和盐水(50mL)溶液萃取。经柱层析纯化，得到标题化合物，为白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ8.93(d，1H，J＝2.6Hz)，7.77(app dd，1H，J＝0.7，2.8Hz)，7.26(brs，1H)，2.51(s，3H)，1.55(s，9H)。
g)2-溴-3-甲基-5-硝基-苯胺 将2-溴-3-甲基-5-硝基-苯基)-氨基甲酸叔丁酯((实施例1步骤f)435mg，1.32mmol)溶于10mL 1∶1的三氟乙酸和DCM的混合物中(10mL总量)。搅拌1h后，真空除去溶剂，得到黄色固体残留物(306mg)，使用时无须纯化。
1H NMR(CDCl3)δ7.46(d，1H，J＝2.8Hz)，7.42(d，1H J＝2.8Hz)，6.62(br s，2H)，2.42(s，3H)。
h){[4-(6′-氨基-2′-甲基-4′-硝基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯 向配备搅拌棒的烧瓶中加入{[4-(3-二羟基硼烷基-苯磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯(美国专利临时申请60/383130(752mg，1.65mmol)、2-溴-3-甲基-5-硝基-苯胺((实施例1步骤g)306mg，1.32mmol)、Na2CO3水溶液(2M，4mL，8mmol)、乙醇(4mL)和甲苯(8mL)。向溶液中充入氩气持续10min，加入Pd(PPh3)4(294mg，0.25mmol)。在惰性气氛下，在80℃下，剧烈搅拌该两相溶液16h，然后冷却至室温。加入EtOAc(40mL)和水(20mL)，分离各层。有机层用饱和NaHCO3(2×20mL)、盐水(20mL)洗涤，经硫酸钠干燥。真空除去溶剂，随后残留物通过柱层析(10-40％EtOAc/己烷)纯化，得到标题化合物(245mg，33％)，为黄色固体。
1H-NMR(CDCl3)δ8.03(ddd，1H，J＝1.2，2.1，8.1Hz)，7.91(s，1H)，7.90(t，1H，J＝1.6Hz)，7.69(t，1H，J＝7.9Hz)，7.53(app dd，1H，J＝0.7，2.3Hz)，7.50(dt，1H，J＝1.4，7.7Hz)，7.44(app dd，1H，J＝0.5，2.3Hz)，3.70(s，2H)，2.59(s，3H)，2.00(s，3H)，1.51(s，9H).
i)11-{4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酸基}-十一烷酸甲酯 将三乙胺(139μL，1mmol)加入{[4-(6′-氨基-2′-甲基-4′-硝基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯((实施例1步骤h)118mg，0.21mmol)的DCM(10mL)溶液中。在5min内，滴加11-氯羰基-十一烷酸甲酯(73mg，0.26mmol)。搅拌30分钟后，反应不完全。按同样方法另外分次加入酰氯(3×1当量)，直至反应完全。加入EtOAc(40mL)，随后用NaHCO3(2×20mL)和盐水(30mL)进行水溶液后处理，得到粗酰胺(206mg)，为玻璃状物。将残留物溶于EtOH(5mL)，加入4M NH4Cl水溶液(1mL)。加入铁粉(165mg，3mmol)，在75℃下加热反应物1h。通过0.22μm滤器过滤该冷却的混合物，固体用5mL/份的MeOH和EtOAc分别洗涤。再加入EtOAc(80mL)，有机溶液用柠檬酸(2×20mL)、NaHCO3(2×30mL)、水(30mL)和盐水(50mL)洗涤。浓缩溶液，干燥，得到标题化合物(165mg)，其使用时无须纯化。
ESI-MS(m/z)理论值C37H50N4O7S3(M+H)759.3；实测值759.4。
j)11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N-二-(叔丁氧基羰基氨基))胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸 将氢氧化钠(1M，1mL)加入11-{4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸甲酯((实施例1步骤i)122mg，0.16mmol)的MeOH(10mL)溶液中。在室温下搅拌溶液18h，用溶液AcOH(500μL)猝灭，真空除去溶剂。将残留物溶于MeOH(10mL)、AcOH(500μL)中，加入N，N-二(叔丁氧基羰基)-S-甲基-异硫脲(145mg，0.5mmol)。将溶液在40℃下搅拌16h，真空除去溶剂。将残余物在EtOAc(50mL)和水(20mL)之间分配，有机层用盐水(20mL)洗涤。浓缩溶液，干燥，得到残留物，使其经SiO2(6∶4的Hex/EtOAc，然后25∶75∶5的Hex/EtOAc/MeOH)层析。残留物进一步通过RP-HPLC(C-18柱，CH3CN/H2O)纯化，得到115mg产物)。
1H-NMR(CD3OD)δ8.16(s，1H)，8.01(ddd，1H，J＝1.2，1.9，7.9Hz)，7.87(t，1H，J＝1.6Hz)，7.65(t，1H，J＝7.9Hz)，7.53(m，1H)，7.50(dt，1H，J＝1.4，7.7Hz)，7.39(m，1H)，2.66(s，3H)，2.29(t，2H，J＝7.4Hz)，2.05(s，3H)，1.93(m，2H)，1.61(m，2H)，1.53(s，18H)，1.49(s，9H)，1.0-1.40(m，12H)，0.94(m，2H).
k)N-(mPEG20k)-11-[3’-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-十一烷酰胺二(三氟乙酸盐) 将二异丙基碳二亚胺(0.2M的DCM溶液，15μL)滴加到11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N-二-(叔丁氧基羰基氨基))胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸((实施例1步骤j)30mg，0.03mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(4.6mg，0.038mmol)的DCM(15mL)溶液中。在室温下搅拌溶液15min，加入mPEG20k-NH2(327mg，0.015mmol)。在室温下搅拌溶液18h(4h后茚三酮反应阴性)。加入DCM(10mL)和MeOH(1mL)，随后缓慢加入Et2O(～100mL)。冷却溶液，使沉淀完全，过滤收集固体。将一部分固体(127mg)干燥，再溶于1∶1的TFA/DCM。搅拌2h后，真空除去溶剂，高真空下干燥。HPLC纯化(C18柱，10-55％CH3CN/H2O洗脱30min)，得到104mg纯PEG化的-化合物。
1H-NMR PEG在δ3.62(CDCl3)抑制峰形δ9.20(s，1H)，8.5-9.0(H2O峰)，8.37(s，1H)，8.22(s，1H)，8.07(d，1H，J＝7.7Hz)，7.77(s，1H)，7.65(t，1H，J＝7.7Hz)，7.53(d，1H，J＝7.2Hz)，7.41(s，1H)，7.05(s，1H)，7.00(s，3H)，3.82(m，PEG伴线(satellite))，3.62(m，PEG亚甲基)，3.47(m，PEG伴线)，3.39(s，3H，PEG-OMe末端)，2.65(s，3H)，2.26(t，2H，J＝7.2Hz)，2.05(s，3H)，2.04(m，1H)，1.93(m，1H)，1.62(m，2H)，1.02-1.38(m，12H)，0.95(m，2H)。
实施例2N-(mPEG20k)-6-{3-[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基]-脲基}-己酰胺二(三氟乙酸)盐 a)4-溴-5-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯 在室温下，将4-溴-3-甲基苯甲酸甲酯(10.13g，44mmol)溶于H2SO4120mL和TFA(15mL)的混合物中。将该溶液在冰浴上冷却，在30min内，分批加入KNO3(4.65g，46mmol)，在环境温度下搅拌混合物4小时，期间其升温至室温。TLC分析(少量水溶液后处理后)表明原料全部消失(30％EtOAc/Hex)。将溶液倾入冰上，水相淤浆用EtOAc(3×150mL)萃取。有机层用5％Na2CO3(3×75mL)、NaHCO3(3×50mL)、水(2×100mL)、盐水(100mL)洗涤，然后经硫酸钠干燥。浓缩溶液，得到微黄色固体/凝胶物质(11.6g)，TLC表明其为一个点。1H NMR分析表明为比例～2∶1的两个主要产物，对应于邻-和间-硝基苯甲酸酯衍生物。该物质无须纯化即可进入下一步反应。
b)4-溴-5-甲基-3-硝基苯甲酸 在室温下，将4-溴-5-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯(实施例2步骤a(11.6g，42.3mmol))溶于MeOH(400mL)，在30min内，经加料漏斗滴加2N NaOH(43mL)。搅拌溶液12h，期间出现沉淀，而原料消失(TLC表明在30％EtOAc中仅有基线斑点)。用浓HCl将pH调至～2，真空除去甲醇。将EtOAc(300mL)加入水相淤浆，分离各层。水层用EtOAc(2×50mL)萃取，然后弃去。经TLC(40％EtOAc/己烷，4％AcOH)分析表明合并的有机萃取液含有两个产物。合并的有机萃取液用3∶1的0.5N NaH2PO4/0.5N NaOAc(～30×50mL分批)溶液洗涤，直至完全除去邻-硝基苯甲酸(在TLC上的低斑点，40％EtOAc/Hex，4％AcOH)。然后用盐水洗涤有机层，经硫酸钠干燥。浓缩溶液，得到5.4g(47％)白色固体。1H NMR(CD3OD)δ8.10(m，2H)，2.54(s，3H)。
c)4-溴-3-甲基-5-硝基-苯基)-氨基甲酸2-三甲基硅烷基乙基酯 在室温下，搅拌下，将二苯磷酰基叠氮化物(4.31mL，20mmol)加入2-溴-3-甲基-5-硝基-苯甲酸(实施例2步骤b(5.2g，20mmol))和二异丙基乙胺(3.66mL，21mmol)的1，4-二烷(80mL)溶液中。在室温下30分钟后，加热反应物至90℃，保持5min。加入三甲基甲硅烷基乙醇(5.73mL，40mmol)，在95℃下，搅拌该溶液16h。真空除去溶剂，使残留物在EtOAc(100mL)和水(30mL)之间分配。有机层进一步用柠檬酸水溶液(3×30mL)、NaHCO3(2×30mL)和盐水(50mL)洗涤。经柱层析(9∶1 Hex/EtOAc)纯化，得到标题化合物(4.1g)，为黄色固体。1H NMR(CDCl3)δ7.73(d，1H，J＝2.4Hz)，7.41(br d，1H，J＝1.7Hz)，7.01(s，1H)，4.24(m，2H)，2.43(s，3H)，1.02(m，2H)，0.04(s，9H)。
d)(3-氨基-4-溴-5-甲基-苯基)-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯 将铁粉(6.1g，109mmol)加入(4-溴-3-甲基-5-硝基-苯基)-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯(实施例2步骤c(4.1g，10.9mmol))和NH4Cl(5.84g，109mmol)的EtOH(27mL)和水(54mL)悬浮液中。在85℃下加热反应物14h。使冷却的混合物通过硅藻土过滤，固体用1∶1的EtOAc/MeOH(200mL)洗涤。真空浓缩滤液，使残留物在EtOAc(100mL)和H2O(30mL)之间分配。有机溶液用水(30mL)和盐水(50mL)洗涤。浓缩溶液，干燥，得到该苯胺(3.24g，86％)，为棕色固体，其使用时无须进一步纯化。1H NMR(CDCl3)δ6.96(s，1H)，6.54(s，1H)，6.39(s，1H)，4.26(m，2H)，4.16(s，2H)，2.35(s，3H)，1.06(m，2H)，0.08(s，9H)。
e)[3-氨基-5-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂戊环(dioxaborolan)-2-基)-苯基]-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯 将乙酸钯(106mg，0.47mmol)、2-(二环己基膦基)联苯(658mg，1.88mmol)、(3-氨基-4-溴-5-甲基-苯基)-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯((实施例2步骤d)3.24g，9.38mmol)合并到烧瓶中，置于氩气氛下。加入对-二烷(40mL)，随后加入三乙胺(5.23mL，38mmol)和频哪醇硼烷(pinacolborane)(4.08mL，28mmol)。在80℃下搅拌溶液1h，期间出现ppt。真空除去溶剂，使残留物在EtOAc(100mL)和NH4Cl水溶液(50mL)之间分配。再用NH4Cl(2×30mL)、NaHCO3(30mL)和盐水(50mL)洗涤有机层。干燥(MgSO4)有机层，真空浓缩，残留物经SiO2柱层析(8∶2的Hex/EtOAc)纯化，得到产物(2.44g，66％)，为棕色固体。1H NMR(CDCl3)δ6.77(s，1H)，6.38(s，1H)，6.28(d，1H，J＝1.9Hz)，4.91(s，2H)，4.23(m，2H)，2.42(s，3H)，1.32(s，12H)，1.03(m，2H)，0.05(s，9H)。
f){6-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-2-甲基-联苯-4-基}-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯
向配备搅拌棒的烧瓶中加入[3-氨基-5-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂戊环-2-基)-苯基]-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯(实施例2步骤e(2.34g，5.96mmol))、{[4-(3-溴-苯磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯((美国专利临时申请60/383130(2.93g，5.96mmol)、Na2CO3水溶液(2M，11.9mL，23.8mmol)、乙醇(12mL)和甲苯(24mL)。向溶液中充入氩气持续10min，加入Pd(PPh3)4(689mg，0.6mmol)。在惰性气氛下，在80℃下，剧烈搅拌该两相溶液16h，然后冷却至室温。加入EtOAc(80mL)和水(20mL)，分离各层。有机层用饱和NaHCO3(2×20mL)、盐水(20mL)洗涤，经硫酸钠干燥。真空除去溶剂，随后使残留物通过柱层析(85∶15的DCM/EtOAc)纯化，得到标题化合物(2.24g，55％)，为浅棕色固体。
1H-NMR(CDCl3)δ7.98(ddd，1H，J＝1.3，1.9，7.8Hz)，7.89(m，2H)，7.61(t，1H，J＝7.7Hz)，7.5(dt，1H，J＝1.3，7.7Hz)，6.88(s，1H)，6.55(d，1H，J＝1.7Hz)，6.47(s，1H)，4.26(m，2H)，3.42(s，2H)，2.56(s，3H)，1.9(s，3H)，1.52(s，9H)，1.06(m，2H)，0.08(s，9H).
g)6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基]-脲基}-己酸乙酯 在室温下，用6-异氰酸基(isocyanato)-己酸乙酯(5.30μL，0.030mmol)处理{2-氨基-3′-[5-(亚氨基-甲氧基羰基氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-4-基}-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯((实施例2步骤f)0.020g，0.030mmol)的无水CH2Cl2(3mL)溶液，搅拌40min。反应混合物用CH2Cl2稀释，用水(1×15mL)洗涤。有机层经MgSO4干燥，真空浓缩，得到产物6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基]-脲基}-己酸乙酯(0.025g，98％)，为灰白色固体。
1H NMR(CD3OD)δ8.22(s，1H)，8.06(d，1H，J＝8.0Hz)，7.92(t，1H，J＝1.6Hz)，7.72(t，1H，J＝8.0Hz)，7.65(d，1H，J＝1.6Hz)，7.56(d，1H，J＝7.6Hz)，7.28(s，1H)，4.29(m，2H)，3.06-3.00(m，2H)，2.70(s，3H)，2.33(t，2H，J＝7.2Hz)，2.01(s，3H)，1.60(quint，2H，J＝7.2Hz)，1.54(s，9H)，1.40-1.36(t，2H)，1.12(m，2H)，1.28(t，3H，J＝7.2Hz)，0.09(s，9H).
ESI-MS(m/z)理论值C39H55N5O9S3Si(M+H)862.3；实测值861.9。
h)6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基]-脲基}-己酸 在室温下，用固体LiOH(0.097g，4.06mmol)处理6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基]-脲基}-己酸乙酯((实施例2步骤g)0.437g，0.507mmol)的THF∶水(2∶1，15mL)溶液，搅拌18.5h。真空除去THF，用冰乙酸将残余水溶液酸化至pH 5。溶液用CH2Cl2(3×50mL)萃取。合并的有机层经MgSO4干燥，真空浓缩，得到产物6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基]-脲基}-己酸-(0.4222g，99％)，为灰白色固体。ESI-MS(m/z)理论值C37H51N5O9S3Si(M+H)834.3；实测值834.2。
i)6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N-二-(叔丁氧基羰基氨基))胍基-6-甲基-联苯-2-基}-脲基)-己酸 用氟化四丁铵(1M的THF溶液，3.39mL，3.39mmol)处理6-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基]-脲基}-己酸((实施例2步骤h)0.422g，0.506mmol)的无水THF(20mL)溶液，在40℃下搅拌4h。真空蒸发溶剂。将残留物溶于CH2Cl2中，用水(4×50mL)洗涤。有机层经MgSO4干燥，真空浓缩。经硅胶层析(4％MeOH/CH2Cl2)纯化，得到产物6-(3-{4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基}-脲基)-己酸(0.200g，57％)，为灰白色固体。将该物质与1，3-二(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-假硫脲(0.252g，0.870mmol)和乙酸(0.5mL)的MeOH(10mL)溶液合并，在40℃下搅拌2h。真空蒸发溶剂。经硅胶层析(4％MeOH/CH2Cl2，然后～10％MeOH/CH2Cl2)纯化，得到标题化合物(0.215g，80％)，为白色固体。
1H-NMR(CD3OD)δ8.22(s，1H)，8.06(m，1H)，7.89(m，1H)，7.72(m，1H)，7.69(m，1H)，7.53(m，1H)，7.32(m，1H)，3.01(m，2H)，2.66(s，3H)，2.27(t，2H，7.4Hz)，1.97(s，3H)，1.57(m，2H)，1.54(s，18H)，1.51(s，9H)，1.37(m，2H)，1.27(m，2H).
j)N-(mPEG20k)-6-{3-[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基]-脲基}-己酰胺二(三氟乙酸)盐 在0℃下，将二异丙基碳二亚胺(0.2M的DCM溶液，1.125mL)滴加到6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基}-脲基)-己酸(实施例2步骤i(210mg，0.23mmol))和N，N-二甲氨基吡啶(32mg，0.26mmol)的DCM(23mL)溶液中。在0℃下搅拌溶液30min，加入mPEG20k-NH2(3.25g，0.15mmol)。将溶液升温至室温，搅拌6h(在TLC上茚三酮反应阴性)。加入DCM(10mL)，随后缓慢加入Et2O，诱导缓慢沉淀。再加入少量乙醚以确保全部沉淀，过滤收集固体，用DCM/Et2O洗涤，得到～3.3g粗PEG化的-化合物。将该固体物质再溶于20％MeOH/DCM，缓慢加入Et2O，诱导沉淀。过滤收集固体，高真空下干燥固体滤饼。HPLC分析该“粗”物质表明纯度～98％，不含小分子原料杂质(根据滤液HPLC分析)。将干PEG化的化合物再溶于DCM(8mL)，加入H2O(0.1mL)，随后加入TFA(8mL)。搅拌1.5h后，加入MeOH(4mL)，随后缓慢加入Et2O，诱导逐步沉淀。使部分该物质经历HPLC(C18柱，10-55％CH3CN/H2O(0.1％TFA)洗脱30min)纯化，得到120mg PEG化的-化合物。两批PEG(HPLC纯化的与仅沉淀的)相同1H-NMR分析和分析型HPLC表明两者之间的纯度差异＜0.5％。测得PEG化的-化合物沉淀的纯度＞99.2％(HPLC，λ＝214，254)，其中所含的单一杂质不超过总面积的0.3％。1H-NMR(CDCl3/CD3OD)(PEG在δ3.62抑制峰形)δ8.24(s，1H)，8.03(ddd，1H，J＝1.2，1.9，7.9Hz)，7.82(t，1H，J＝1.2Hz)，7.69(t，1H，J＝7.7Hz)，7. 58(d，1H，J＝1.9Hz)7.49(dt，1H，J＝1.3，7.9Hz)，6.88(d，1H，J＝1.9Hz)，4.22(s，DOH)，3.81(m，PEG伴线)，3.62(m，PEG亚甲基)，3.45(m，PEG伴线)，3.36(s，3H，PEG-OMe端基)，3.03(t，1H，J＝6.7Hz)2.67(s，3H)，2.15(t，2H，J＝7.4Hz)，1.97(s，3H)，1.55(m，2H)，1.37(m，2H)，1.22(m，2H)。
实施例3N-(mPEG20k)-11-[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-十一酰胺三氟乙酸盐 a)11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一酸乙酯 在室温下，将11-氯羰基-十一烷酸乙酯(0.08g，0.29mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液滴加到{[4-(2′-氨基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯(美国专利临时申请60/383130(0.10g，0.19mmol))和三乙胺(0.04mL，0.29mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中，搅拌1小时。然后蒸发反应混合物，使粗混合物经柱层析(己烷∶乙酸乙酯(2∶1))纯化，得到0.060g 11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸乙酯。
1H NMR(CDCl3)δ7.99(d，1H，J＝8.4Hz)，7.95(s，1H)，7.86(s，1H)，7.67(d，1H，J＝7.2Hz)，7.61(t，1H，J＝7.2Hz)，7.44(d，1H，J＝8.0Hz)，7.33(t，1H，J＝7.2Hz)，7.16(d，1H，J＝7.6Hz)，6.69(s，1H)，6.60-6.40(bs，1H)，4.12(q，2H，J＝6.4Hz)，2.60(s，3H)，2.31(t，2H，J＝7.6Hz)，2.05-1.93(m，5H)，1.62(m，4H)，1.52(s，9H)，1.32-1.03(m，15H).
质谱(LCMS，ESI)理论值C38H51N3O7S3757.29(M+1)；实测值757.92。
b)11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸 在室温下，将1M氢氧化钠溶液(0.24mL)滴加到11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸乙酯(实施例3步骤a(0.06g，0.08mmol))的甲醇(1mL)溶液中，保持几小时。然后蒸发反应混合物，滴加1N HCl直至pH为1。产物用乙酸乙酯萃取，经硫酸钠干燥，真空蒸发，得到0.05g 11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸。
1H NMR(CDCl3)δ7.99(d，1H，J＝8.4Hz)，7.95(s，1H)，7.89(s，1H)，7.68(d，1H，J＝8.4Hz)，7.62(t，1H，J＝7.6Hz)，7.45(d，1H，J＝8.0Hz)，7.33(t，1H，J＝6.8Hz)，7.16(d，1H，J＝6.8Hz)，6.71(s，1H)，2.60(s，3H)，2.37(t，2H，J＝6.8Hz)，2.03(s，3H)，2.05-1.94(m，2H)，1.64(m，4H)，1.53(s，9H)，1.32-1.04(m，12H).
质谱(LCMS，ESI)C36H47N3O7S3理论值729.26(M+1)；实测值729.90。
c)N-(mPEG20k)-11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一酰胺 在室温下，将二异丙基碳二亚胺(0.005g，0.0411mmol)滴加至11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一烷酸((实施例3步骤b)0.030g，0.0411mmol)和二甲氨基吡啶(0.008g，0.0616mmol)的二氯甲烷(4.0mL)溶液中，搅拌10分钟。将mPEG20K-NH2(0.412g，0.0206mmol)溶于极少量的二氯甲烷，将其滴加到反应物中，搅拌过夜。然后蒸发反应混合物，使产物在异丙醇中重结晶两次，随后经反相HPLC(己腈/水(0.1％TFA)纯化，得到0.370g PEG-产物。
1H NMR(CDCl3)δ8.13(s，1H)，7.97(m，2H)，7.71(d，1H，J＝7.2Hz)，7.62(t，1H，J＝8.0Hz)，7.46(d，1H，J＝7.6Hz)，7.31(t， 1H，J＝7.6Hz)，7.13(d，1H，J＝7.2Hz)，6.98(s，1H)，6.25(s，1H)，2.59(s，3H)，2.30(m，2H)，2.02(s，3H)，2.07-1.97(m，2H)，1.64(m，4H)，1.53(s，9H)，1.36-1.06(m，12H).
d)N-(mPEG20k)-11-[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-十一酰胺三氟乙酸盐 将三氟乙酸(3.0mL)滴加到N-(mPEG20k)-11-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-十一酰胺(实施例3步骤c(0.370g，0.018mmol))的二氯甲烷(3.0mL)溶液中，搅拌1小时。然后蒸发反应物，经反相HPLC纯化，得到0.200g PEG-产物，为三氟乙酸盐。1H NMR(PEG在δ3.62抑制峰形)(CDCl3)δ10.1(s，2H)，8.65(s，1H)，8.20(s，1H)，7.93(d，1H，J＝8.0Hz)，7.89(s，1H)，7.55(t，1H，J＝7.6Hz)，7.47(d，1H，J＝8.0Hz)，7.42(d，1H，J＝8.0Hz)，7.25(t，1H，J＝7.6Hz)，7.10(d，1H，J＝7.6Hz)，6.36(s，1H)，2.58(s，3H)，2.12(m，2H)，1.99(s，3H)，1.98-1.92(m，2H)，1.55(m，4H)，1.26-0.95(m，12H).
实施例4N-(mPEG20k)-4-(5-{3-[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酰胺二(三氟乙酸盐)
a)4-[5-(1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-戊氧基]-苯甲酸甲酯 将4-羟基-苯甲酸甲酯(3.01g，19.8mmol)、2-(5-溴-戊基)-异吲哚-1，3-二酮(3.9g，13.2mmol)和K2CO3(1.82g，13.2mmol)在丙酮(150mL)中的混合物加热至回流24h。将反应混合物冷却至室温，真空除去溶剂。该粗产物用EtOAc稀释，用1N NaOH和盐水洗涤。有机层经硫酸钠干燥。真空除去溶剂。使粗产物在EtOAc中重结晶，得到标题化合物，为白色固体(4g，83％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.95-7.98(m，2H)，7.83-7.86(m，2H)，7.70-7.73(m，2H)，6.86-6.89(m，2H)，4.00(t，2H，J＝6.22Hz)，3.88(s，3H)，3.73(t，2H，J＝7.29Hz)，1.82-1.89(m，2H)，1.73-1.81(m，2H)，1.50-1.57(m，2H).
b)4-(5-氨基-戊氧基)-苯甲酸甲酯 将4-[5-(1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-戊氧基]-苯甲酸甲酯(1g，2.72mmol，实施例4步骤a)和肼(98.4μL，3.13mmol)的MeOH∶H2O(10mL，4∶1)悬浮液加热至65℃，保持2h。在室温下，将另外的肼(171μL，5.44mmol)加入到反应混合物中。将反应混合物加热至70℃，保持2h，然后在室温下搅拌过夜。将碳酸钾(30mL，1N水溶液)和二氯甲烷(200mL)加入反应物中。有机层经硫酸镁干燥。真空除去溶剂，得到标题化合物，为白色固体(500mg，77％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.95-8.00(m，2H)，6.88-6.92(m，2H)，4.02(t，2H，J＝6.43Hz)，3.88(s，3H)，2.71-2.76(m，2H)，1.79-1.86(m，2H)，1.49-1.56(m，4H)。
c)4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸甲酯 在室温下，将4-硝基苯基氯甲酸酯(99.2mg，0.49mmol)加入到{2-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-4-基}-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯(303mg，0.45mmol，实施例2步骤f)和吡啶(39.8μL 0.49mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中。在室温下搅拌反应混合物2h。将4-(5-氨基-戊氧基)-苯甲酸甲酯(117mg，0.49mmol，实施例4步骤b)和三乙胺加入反应混合物中，在室温下搅拌2h。反应混合物用EtOAc稀释，用水和盐水洗涤，经硫酸镁干燥。真空除去溶剂，随后经快速层析(50-60％EtOAc/己烷)纯化，得到标题化合物，为黄色固体(280mg，66.5％)。ESI-MS(m/z)C44H57N5O10S3Si理论值940.3(M+1)；实测值939.9。
d)4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸 在室温下，将氢氧化锂(45.8mg，2.08mmol)加入到4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸甲酯((实施例4步骤c)280mg，0.298mmol)的1，4-二烷/水(2∶1，10mL)溶液中，保持2天。真空除去溶剂。残留物用水稀释，用乙酸酸化至pH～5，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥。真空除去溶剂，得到标题化合物，为黄色固体(276mg，100％)。
1H-NMR(CDCl3/CD3OD)δ7.93-7.99(m，3H)，7.83-7.86(m，2H)，7.52-7.59(m，2H)，7.15-7.20(m，2H)，6.85-6.89(m，2H)，4.21-4.26(m，2H)，3.99(t，2H，J＝6.43Hz)，3.13-3.24(m，2H)，2.61(s，3H)，2.02(s，3H)，1.75-1.83(m，2H)，1.43-1.56(m，13H)，1.02-1.08(m，2H)，0.07(s，9H).
e)4-[5-(3-{4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基}-脲基)-戊氧基]-苯甲酸 将氟化四丁铵溶液(2.38mL，1M的THF溶液)加入4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸((实施例4步骤d)276mg，0.298mmol)的THF(10mL)溶液，在35℃下保持2日。真空除去溶剂。将残留物溶于EtOAc，用水和盐水洗涤，经硫酸镁干燥。真空除去溶剂，得到标题化合物，为棕色固体(300mg，100％)。ESI-MS(m/z)C37H44N5O8S3理论值782.2(M+1)；实测值781.8。
f)4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N’N″-二(叔丁氧基羰基)-胍基)-6-甲基-联苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸 将1，3-二(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-假硫脲(433mg，1.49mmol)加入4-[5-(3-{4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基}-脲基)-戊氧基]-苯甲酸(233mg，0.298mmol，实施例4步骤e)的5％AcOH/MeOH(10mL)溶液中，在35℃下保持2天。真空除去溶剂，残留物经快速层析(1-6％MeOH/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物，为黄色固体(70mg，23％)。
ESI-MS(m/z)C48H61N7O12S3理论值1024.4(M+1)；实测值1024.0。g)N-(mPEG20k)-4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N’，N″-二(丁氧基羰基)-胍基)-6-甲基-联苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酰胺 按照实施例2步骤j中偶合方法，使用4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N′，N″-二(叔丁氧基羰基)-胍基)-6-甲基-联苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酸(实施例4步骤f(42.7mg，41.7μmol))、二异丙基碳二亚胺(5.26mg，41.7μmol)、4-(二甲基氨基)吡啶(9.8mg，41.7μmol)和mPEG20k-NH2(673mg，32μmol)的DCM(2mL，无水溶液)。同样，经Et2O沉淀纯化，得到标题化合物，为白色固体(650mg，92％)。1H-NMR PEG在δ3.62(CDCl3)抑制峰形δ3.62(CDCl3)δ8.03-7.97(m，2H)，7.84-7.76(m，3H)，7.64-7.54(m，1H)，7.46-7.39(m，1H)，7.33-7.31(m，1H)，7.10-7.02(m，2H)，6.87-6.83(m，2H)，4.02-3.96(m，2H)，3.25-3.19(m，2H)，2.63(s，3H)，2.03(s，3H)，1.82-1.75(m，2H)，1.56(s，9H)，1.52(s，9H)，1.49(s，9H)，1.48-1.45(m，4H).
h)N-(mPEG20k)-4-(5-{3-[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酰胺二(三氟乙酸盐) 按实施例2步骤j，用TFA的DCM溶液处理N-(mPEG20k)-4-(5-{3-[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N′，N″-二(叔丁氧基羰基)-胍基)-6-甲基-联苯-2-基]-脲基}-戊氧基)-苯甲酰胺(实施例4步骤g(650mg，29.5μmol))。同样，用Et2O沉淀并经RP-HPLC纯化，得到标题化合物，为白色固体(268mg，41.3％)。1H-NMR PEG在δ3.59(CDCl3/CD3OD)抑制峰形8.29-8.26(m，1H)，8.05-8.00(m，1H)，7.85-7.82(m，1H)，7.78-7.74(m，2H)，7.71-7.65(m，1H)，7.59-7.55(m，1H)，7.52-7.47(m，1H)，6.92-6.87(m，3H)，4.03-3.97(m，2H)，3.13-3.07(m，2H)，2.67(s，3H)，1.97(s，3H)，1.82-1.75(m，2H)，1.51-1.42(m，4H).
实施例54-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒的mPEG20k2′-脲二(三氟乙酸盐)
a){[4-(2′，4′-二氨基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯 将{2-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-4-基}-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯(实施例2步骤f(1g，1.48mmol))溶于THF(25mL)。向其中加入TBAF(1M，1.62mL，1.62mmol)，使反应物升温至40℃，搅拌3小时。另加入TBAF(1.48mL，1.48mmol)，在室温下搅拌反应物过夜。真空除去溶剂，将残留物溶于EtOAc，用水洗涤几次(5次)。干燥(MgSO4)合并的有机层，真空除去溶剂，得到标题化合物，为黄色固体(800mg，100％)。1H-NMR(CDCl3)δ8.03(s，1H)，7.95-7.93(m，1H)，7.89-7.88(m，1H)，7.59-7.53(m，2H)，6.08(m，1H)，5.99(m，1H)，2.55(s，3H)，1.85(s，3H)，1.52(s，9H)。
b)4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯
将{[4-(2′，4′-二氨基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯((实施例5步骤a)342mg，0.64mmol)溶于MeOH(4mL)和乙酸(200μL)。向该溶液中缓慢加入1，3-二(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-假硫脲(203mg，0.70mmol)的MeOH悬浮液，于室温下搅拌反应物过夜。真空除去溶剂，随后经SiO2快速柱层析纯化(40％EtOAc的己烷液)，得到标题化合物(235mg，47％)，为白色固体。ESI-MS(m/z)C35H46N6O8S3理论值775.3(M+1)；实测值774.8。
c)4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯的mPEG20k2′-脲 将4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基酯(实施例5步骤b(67mg，0.09mmol))和吡啶(7.2μL，0.09mmol)溶于DCM(1.5mL)。将反应冷却至0℃，随后加入二异丙基乙胺(16μL，0.18mmol)和氯甲酸对硝基苯酯(15.7mg，0.08mmol)，在0℃下搅拌反应物30分钟。向该溶液中加入mPEG20k-NH2(250mg，0.0125mmol)。在室温下搅拌反应物2小时。向该溶液中加入二异丙基乙胺(32μL，0.36mmol)和DMAP(催化量)，在室温下搅拌反应物过夜。真空除去溶剂，将残留物溶于DCM/MeOH。将乙醚(4×体积)缓慢加入到DCM/MeOH溶液中，使PEG化的-化合物沉淀。1H-NMR(PEG在δ3.61抑制峰形)(CDCl3/CD3OD)δ8.11(s，1H)，8.02-8.01(m，1H)，7.85(s，1H)，7.68-7.62(m，2H)，7.45(s，1H)，2.63(s，3H)，1.96(s，1H)，1.55，(s，9H)，1.49(s，9H)，1.43(s，9H)。
d)4-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒的mPEG20k2′-脲二(三氟乙酸盐) 在室温下，将4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁基的mPEG20k2′-脲(实施例5步骤c)溶于DCM(5mL)和TFA(5mL)，搅拌反应物1小时。真空除去溶剂，然后将残留物溶于DCM/MeOH，加入乙醚使产物沉淀，过滤收集产物。经RP-HPLC(10-100％CH3CN/H2O，λ＝245nm，40分钟)纯化，得到标题化合物，为白色固体(190mg，步骤c和d的总收率76％)。1H-NMR(PEG在δ3.60抑制峰形)(CDCl3/CD3OD)δ8.27(s，1H)，8.06-8.03(m，1H)，7.85(s，1H)，7.71(t，1H，J＝7.91Hz，J＝7.67Hz)，7.58(s，1H)，7.53-7.50(m，2H)，2.69(s，3H)，1.98(s，1H)。
实施例6路线aN-(mPEG20k)-3-{[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酰胺二(三氟乙酸盐) a)3-叔丁氧基羰基甲硫基-丙酸甲酯 将3-巯基-丙酸甲酯(3.4mL，30.7mmol)加入溴-乙酸叔丁酯(1.5mL，10.2mmol)和Et3N(3.4mL，30.7mmol)的THF溶液中。在室温下搅拌反应物3h，然后浓缩，使残留物在EtOAc和1N NaOH之间分配。有机层用1N NaOH洗涤2×，除去所有过量的游离硫醇(用Ellman试剂监测)。将有机层干燥(MgSO4)，浓缩，得到需要的产物，为澄清油状物(2.1g，88％)。1H NMR(CDCl3)δ3.45(s，3H)，2.91(s，2H)，2.66(t，2H，J＝7.2Hz)，2.42(t，2H，J＝7.2Hz)，1.23(s，9H)。
b)3-羧基甲硫基-丙酸甲酯 用50％TFA的DCM处理3-叔丁氧基羰基甲硫基-丙酸甲酯(2.1g，按实施例6，路线a，步骤a制备)4h。真空浓缩混合物，得到固体产物，使用时无须纯化。
1H NMR(CDCl3)δ3.73(s，3H)，3.31(s，2H)，2.95(t，2H，J＝7.2Hz)，2.74(t，2H，J＝7.2Hz)。
c)3-{[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酸 用N，N-二甲氨基吡啶(232mg，1.9mmol)和二异丙基碳二亚胺(172μL，1.1mmol)处理3-羧基甲硫基-丙酸甲酯(192mg，1.1mmol，按实施例6，步骤b制备)的CH2Cl2(10mL)溶液，在室温下搅拌10min。向反应混合物中加入{6-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-2-甲基-联苯-4-基}-氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯(248mg，0.37mmol，按实施例2，步骤f制备)，在室温下搅拌得到的混合物6h。用DCM稀释反应混合物，然后用饱和NaHCO3萃取。有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，浓缩，得到250mg油状物，为粗品3-{[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酸甲酯。ESI-MS(m/z)C36H48N4O9S4Si理论值837.21(M+H)；实测值836.9、737.1。LC-MS表明该粗物质为～90纯，使用时无须进一步纯化。因此，将该油溶于MeOH(10mL)，剧烈搅拌下，缓慢加入1N NaOH(10mL)。混合物变混浊，升温至50℃。约4h后，经TLC表明反应完全。反应物用AcOH酸化，然后真空浓缩。使残留物在DCM和H2O之间分配，用盐水洗涤有机层，干燥(MgSO4)，再次浓缩。在SiO2上层析(快速层析，洗脱液100％DCM至10％MeOH/DCM)残留物，得到160mg标题化合物，为棕褐色半固体。ESI-MS(m/z)C35H46N4O9S4Si理论值823.2(M+H)；实测值822.9、723.2d)3-({4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-甲硫基)-丙酸 用氟化四丁铵(1M的THF溶液，3.20mL，3.16mmol)处理3-{[3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-4-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-联苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酸(0.650g，0.790mmol，按实施例6，路线a，步骤c制备)的THF(60mL)溶液，升温至40℃，保持4.5h。真空除去溶剂，将残留物溶于EtOAc，用水(4×75mL)洗涤。合并的有机层经MgSO4干燥，真空浓缩，得到产物3-({4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-甲硫基)-丙酸(0.340g，63％)，为白色玻璃状固体。
ESI-MS(m/z)C29H34N4O7S4理论值679.13(M+1)实测值678.80。
e)3-({3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-甲硫基)-丙酸 用1，3-二(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-假硫脲处理3-({4-氨基-3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-甲硫基)-丙酸(0.340g，0.501mmol，按实施例6，路线a，步骤d制备)的MeOH和5％AcOH(15mL)溶液，升温至40℃保持4h。真空除去溶剂。经硅胶层析(2-4％MeOH/CH2Cl2按0.5％增量增加)纯化，得到标题化合物(0.194g，42％)，为白色玻璃状固体。
1H NMR(CDCl3)8.385(s，1H)，8.031(d，1H，J＝7.6Hz)，8.008(s，1H)，7.887(s，1H)，7.624(t，1H，J＝8.0Hz)，7.430(d，1H，J＝7.2Hz)，7.340(s，1H)，3.008(dd，2H，J＝50Hz，J＝17.2Hz)，2.599(s，3H)，2.538(d，1H，J＝8.4Hz)，2.483(s，1H)，2.548(s，2H)，2.006(s，3H)，1.549(s，9H)，1.514(s，9H)，1.492(s，9H).
f)N-(mPEG20k)-3-({3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-甲硫基)-丙酰胺 在室温下，用N，N-二甲氨基吡啶(30.6mg，0.251mmol)和二异丙基碳二亚胺(DIC，20.4μL，0.130mmol)处理3-({3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-甲硫基)-丙酸(0.120g，0.130mmol，按实施例6，路线a，步骤e制备)的CH2Cl2(5mL)溶液，搅拌10min。加入mPEG20k-NH2固体(2.104g，0.100mmol，Rapp PolymereGMBH，Tübingen，Germany)，在室温下搅拌混合物18h。用茚三酮染色检查样品中是否存有任何残留的mPEG20k-NH2。真空除去溶剂。将残留物转移至含有极少量10％MeOH的CH2Cl2(10mL)溶液的大Erlenmeyer烧瓶中，缓慢加入无水乙醚直至溶液变混浊并有产物开始沉淀。搅拌悬浮液20min，然后冷却至4℃，保持30min确保沉淀完全。将固体过滤，在真空干燥器中干燥。得到标题化合物(2.08g，98％)，为白色固体。1H NMR(CDCl3，1滴CD3OD)δ8.203(s，1H)，8.040(d，1H，J＝7.6Hz)，8.030(s，1H)，7.816(t，1H，J＝1.6Hz)，7.660(t，1H，J＝7.6Hz)，7.540(d，1H，J＝1.6Hz)，7.458(d，1H，J＝8.0Hz)，3.080(dd，2H，J＝28Hz，J＝11Hz)，2.617(s，3H)，2.287(m，4H)，1.996(s，3H)，1.548(s，9H)，1.518(s，9H)，1.502(s，9H).
g)N-(mPEG20k)-3-{[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酰胺二(三氟乙酸盐) 将N-(mPEG20k)-3-({3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-甲硫基)-丙酰胺(2.06g，0.001mmol，按实施例6，路线a，步骤f制备)的CH2Cl2(20mL)溶液冷却至0℃，用三氟乙酸(10.00mL)处理。使溶液升温至室温，搅拌4.5h。真空蒸发溶剂。将残留物转移至含有极少量10％MeOH的CH2Cl2(13mL)溶液的大Erlenmeyer烧瓶中。加入乙醚直至溶液变混浊并开始形成沉淀(～110mL Et2O)。将混合物在室温下搅拌10min，然后冷却至4℃保持30min，确保沉淀完全。过滤固体，在真空干燥器中干燥。经制备HPLC(20-60％己腈/1％TFA/水洗脱40min)纯化，得到产物(1.60g，77％)，为白色固体。1H NMR(CDCl3，1滴CD3OD)δ8.241(s，1H)，8.102(d，1H，J＝8.8Hz)，7.836(t，1H，J＝1.6Hz)，7.684(t，1H，J＝8.0Hz)，7.566(s，1H)，7.502(d，1H，J＝8.0Hz)，7.090(s，1H)，3.078(dd，2H，J＝28，11Hz)，2.687(s，3H)，2.244(m，4H)，2.048(s，3H).
路线bN-(mPEG20k)-3-{[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酰胺二(三氟乙酸盐) a)({4-[6′-(2-羟基-乙酰基氨基)-2′-甲基-4′-硝基-联苯基-3-磺酰基]-5-甲硫基-噻吩-2-基}-亚氨基-甲基)-氨基甲酸叔丁酯 向{[4-(6′-氨基-2′-甲基-4’-硝基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯(216mg，0.384mmol，按实施例1，步骤h制备)的DCM(2mL)溶液中加入DIEA(212μL，1.15mmol)和乙酸基乙酰氯(54mL，0.5mmol)。将溶液在室温下搅拌3h。反应混合物用EtOAc稀释，用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。有机层经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到256mg粗油状物，其使用时无须纯化。
ESI-MS(m/z)C28H30N4O9S3理论值663.1(M+H)；实测值662.7、563.0(M-Boc)。向以上得到的粗中间体的MeOH(2.5mL)溶液中加入1N NaOH(2.5mL)，在室温下搅拌混合物45min，此时，TLC表明乙酰基完全水解。反应混合物用乙酸中和，真空浓缩，将残留物在EtOAc和饱和NaHCO3之间分配。有机层用水和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到220mg(92％，两步的毛收率)标题化合物，其使用时无须进一步纯化。ESI-MS(m/z)C26H28N4O8S3理论值621.1(M+H)；实测值620.7、521.0(M-Boc)。
b)({4-[4′-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6′-(2-羟基-乙酰基氨基)-2′-甲基-联苯基-3-磺酰基]-5-甲硫基-噻吩-2-基}-亚氨基-甲基)-氨基甲酸叔丁酯 向({4-[6′-(2-羟基-乙酰基氨基)-2′-甲基-4′-硝基-联苯基-3-磺酰基]-5-甲硫基-噻吩-2-基}-亚氨基-甲基)-氨基甲酸叔丁酯(220mg，0.354mmol，按实施例6，路线b，步骤a制备)的EtOH(2.2mL)溶液中加入NH4Cl(1.1mL，3.2M，3.54mmol)。将混合物在50℃下剧烈搅拌30min。加入铁粉(100mg，1.77mmol)，加热混合物至80℃，保持3.5h。过滤(0.2μ，Wheaton针筒过滤器)反应混合物，浓缩滤液至固体，使其在EtOAc和1N Na2CO3之间分配。有机层用另一份Na2CO3洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到需要的粗产物。用PTLC(4×1500μ板，5％MeOH的DCM溶液)纯化，得到58mg需要的苯胺。ESI-MS(m/z)C26H30N4O6S3理论值591.1(M+H)；实测值591.0、491.0(M-Boc)。向该苯胺(55mg，0.09mmol)的MeOH/AcOH(10∶1，5mL)溶液中加入N，N′-二(叔丁氧基羰基)-S-甲基异硫脲(78mg，0.27mmol，Aldrich Chemical Company)。使反应混合物升温至40℃，搅拌3h。真空浓缩混合物至固体，使其在PTLC(2×1000μ板，1∶1的EtOAc/己烷)上纯化，得到45mg(60％)标题化合物，为澄清油状物。1H-NMR(CDCl3；400MHz)δ11.60(s，1H，10.27(s，1H)，8.20(m，2H)，8.04(d，1H，J＝6.7Hz)，7.90(br s，1H)，7.64(t，1H，J＝7.8Hz)，7.40-7.45(m，2H)，4.42(br s，1H)，3.84和3.99(AB四重峰，2H，J＝15.4Hz)，2.55(s，3H)，1.93(s，3H)，1.57(s，9H)，1.53(s，9H)，1.48(s，9H)。ESI-MS(m/z)C37H48N6O10S3理论值833.2(M+H)；实测值832.8、732.8、632.9、533.1。
c)甲磺酸{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-甲酯 在0℃下，向({4-[4′-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6′-(2-羟基-乙酰基氨基)-2′-甲基-联苯基-3-磺酰基]-5-甲硫基-噻吩-2-基}-亚氨基-甲基)-氨基甲酸叔丁酯(40mg，48μmmol，按实施例6，路线b，步骤b制备)和二异丙基乙胺(100μL，192μmol)的DCM(1mL)溶液中加入甲磺酰氯(10μL，130μmol)。在0℃下搅拌溶液30min，然后升温，在室温下搅拌5h。真空浓缩反应混合物，残留物经层析(PTLC，1∶1EtOAc/己烷，1000μSiO2板)纯化，得到40mg(97％)需要的标题化合物，为玻璃状固体。ESI-MS(m/z)C38H50N6O12S4理论值911.2(M+H)；实测值910.7、810.8、710.8、611.1。
d)N-(mPEG20k)-3-{[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酰胺二(三氟乙酸) 向甲磺酸{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基}-甲酯(21mg，0.023mmol，按实施例6，路线b，步骤c制备)和二异丙基乙胺(100μL 192μmol)的DCM(1.5mL)溶液中加入mPEG20k-NHC(O)(CH2)2-SH(350mg，16.7μmol，Rapp Polymere GMBH，Tübingen，Germany)。在室温下搅拌得到的溶液，在TLC上，用Ellman′s试剂(DTNB)监测反应进程。所有的游离硫醇耗尽后(～2h)，反应混合物用MeOH(3mL)稀释，然后缓慢加入乙醚使沉淀。一旦反应混合物变混浊，使其在4℃静置，诱导沉淀完全。在Buchner漏斗上收集固体，经抽真空干燥。将该固体移入反应容器中，用1∶1的TFA/DCM处理2h。真空浓缩反应混合物，使粗产物再溶于水，用C-18 RP-HPLC(λ＝214、254；梯度20-60％CH3CN/H2O(0.1％TFA)纯化30分钟，得到标题化合物(220mg，63％)，为白色固体。1H NMR(CDCl3PEG在δ3.62抑制峰形)δ8.24(s，1H)，8.10(d，1H，J＝8.8Hz)，7.84(t，1H，J＝1.6Hz)，7.68(t，1H，J＝8.0Hz)，7.57(s，1H)，7.50(d，1H，J＝8.0Hz)，7.09(s，1H)，3.62(m，PEG CH2)，3.36(s，3H，PEG-OCH3)3.08(dd，2H，J＝28，11Hz)，2.69(s，3H)，2.24(m，4H)，2.05(s，3H).
实施例7N-(mPEG30k)-6-[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-己酰胺二(三氟乙酸盐) 用描述实施例2，步骤j的类似方法合成标题化合物。因此，将二异丙基碳二亚胺(6.2μl，0.0399mmol)加入6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基}-脲基)-己酸(40mg，0.0426mmol，按实施例2，步骤i制备)和N，N-二甲氨基吡啶(9.1mg，0.074mmol)的DCM(2.5mL)溶液中。搅拌溶液10min，然后加入mPEG30k-NH2(800mg，0.0266mmol，NOF Corporation，Japan)。在室温下搅拌反应物6h(在TLC上茚三酮反应阴性)。加入DCM(10mL)，随后缓慢加入Et2O，诱导缓慢沉淀。再加入少量乙醚，确保沉淀完全，过滤收集固体，用DCM/Et2O洗涤，得到～700mg粗PEG化的-化合物。重复沉淀过程。HPLC分析该粗物质表明纯度为～98％。用TFA(50％的DCM溶液，6mL)处理干燥的PEG化的-化合物。搅拌2h后，加入MeOH(4mL)，随后缓慢加入Et2O诱导逐步沉淀。收集固体，按上述方法重复沉淀。过滤收集并真空干燥固体，得到纯标题化合物，为白色固体(640mg)。分析型RP-HPLC(C18柱，10-80％CH3CN/H2O(0.1％TFA，λ＝214、254)洗脱10min)表明纯度＞99％。1H-NMR(CD3OD)(PEG在δ3.62抑制峰形)δ8.45(s，1H)，8.11(m，1H)，7.93(t，1H，J＝1.5Hz)，7.83(t，1H，J＝7.8Hz)，7.73(m，1H)7.61(dt，1H，J＝1.2，7.6Hz)，7.04(m，1H)，3.62(m，PEG亚甲基)，3.28(t，2H，J＝6.9Hz，PEG-CH2N)，3.10(t，2H，J＝7.7Hz)，2.76(s，3H)，2.19(t，2H，J＝7.4Hz)，2.03(s，3H)，1.62(m，2H)，1.45(m，2H)，1.32(m，2H)。
实施例8与6-[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-己酸的二取代的-PEG20k-(NH2)2四(三氟乙酸盐)结合
用实施例7中使用的方法合成标题化合物。因此，使二异丙基碳二亚胺(5.6μL，0.036mmol)、6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基}-脲基)-己酸(34mg，0.0365mmol，按实施例2，步骤i制备)与N，N-二甲氨基吡啶(8mg，0.066mmol)和PEG20k-(NH2)2(255mg，0.0122mmol，Rapp Polymere GMBH，Tübingen，Germany)的DCM(1mL)溶液反应，随后用TFA处理，按实施例7方法进行相同后处理和纯化，得到～200mg标题化合物，为白色固体。1H-NMR(CD3OD)(PEG在δ3.6抑制峰形)δ8.45(s，1H)，8.12(m，1H)，7.92(t，1H，J＝1.5Hz)，7.83(t，1H，J＝7.8Hz)，7.73(m，1H)7.61(dt，1H，J＝1.2，7.6Hz)，7.035(m，1H)，3.62(m，PEG亚甲基)，3.36(t，2H，J＝5.5Hz，PEG-CH2N)，3.10(t，1H，J＝6.7Hz)，2.76(s，3H)，2.22(t，2H，J＝7.3Hz)，2.02(s，3H)，1.62(m，2H)，1.45(m，2H)，1.32(m，2H)。
实施例9N-(mPEG20k)-3-{[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-2-甲基-联苯-4-基氨基甲酰基]-甲硫基}-丙酰胺三氟乙酸盐
向({4-[4′-(2-溴-乙酰基氨基)-2′-甲基-联苯基-3-磺酰基]-5-甲硫基-噻吩-12-基}-亚氨基-甲基)-氨基甲酸叔丁酯(45mg，0.07mmol，按实施例234，步骤a，WO-03099805制备)和Et3N(15μL)的DCM(5mL)溶液中加入mPEG20k-NHCO(CH2)2SH(1.13g，0.056mmol，Rapp Polymere，GMBH，Tübingen，Germany)。在Ar下，在室温下，搅拌反应物1h。用Ellman试剂监测反应的完成。真空浓缩反应混合物，用Et2O研磨剩余残留物，然后用TFA(25％的DCM溶液)处理40min。除去TFA/DCM，残留物在RP-HPLC(C18柱，20-60％CH3CN/H2O(0.1％TFA，λ＝214、254)上纯化残留物30min，得到纯标题化合物的TFA盐。分析型RP-HPLC(C18柱，10-80％CH3CN/H2O(0.1％TFA，λ＝214、254)洗脱10min)显示单一峰。1H-NMR(CD3OD)(PEG在δ3.62抑制峰形)δ8.38(s，1H)，8.03-8.06(m，1H)，7.97(m，1H)，7.71(m，2H)，7.56-7.61(m，2H)，7.21(d，1H，J＝9.1Hz)，3.62(m，PEG亚甲基)，3.37-3.4(m，5H)，3.36(s，3H，PEG-OMe)，2.97(t，2H，J＝7.2Hz)，2.75(s，3H)，2.60(t，2H，J＝7.2Hz)，2.26(s，3H)。
实施例104-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒八(三氟乙酸盐)的四价(4-Arm)PEG 2′-脲结合物(五赤藓醇母核)
用实施例5，步骤c和d中所述类似方法合成标题化合物。将4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯(实施例5步骤b(155mg，0.2mmol))和吡啶(19μL，0.02mmol)溶于DCM(1.5mL)。将反应物冷却至0℃，随后加入二异丙基乙胺(16μL，0.18mmol)和氯甲酸对硝基苯酯(35mg，0.17mmol)，在0℃下搅拌反应物，然后在室温下搅拌30分钟。向该混合物中加入四价4-arm PEG20k-NH2(500mg，0.025mmol)和二异丙基乙胺(300μL)。在室温下搅拌反应物14h。真空除去溶剂，将残留物溶于DCM。将乙醚(4×体积)缓慢加入DCM/MeOH溶液中，使PEG化的-化合物沉淀。收集固体，再重复沉淀2次。在室温下，用TFA(50％的DCM溶液，5mL)处理该固体1h。真空除去溶剂，将残留物溶于MeOH/DCM，用Et2O沉淀3次。在RP-HPLC HPLC(C18柱，20-60％CH3CN/H2O(0.1％TFA，λ＝214、254)上纯化收集的固体30min，得到400mg标题化合物，为棕褐色固体。1H-NMR(PEG在δ3.62抑制峰形)(CD3OD)δ8.44(s，1H)，8.12(d，1H，J＝7.2Hz)，7.92(br s，1H)，7.82(t，1H，J＝7.8Hz)，7.71(s，1H)，7.61(d，1H，J＝7.7Hz)，7.04(s，1H)，3.62(m，PEG亚甲基)，3.27(t，2H，J＝4.7Hz)，2.76(s，3H)，2.02(s，1H)。
实施例114-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒二(三氟乙酸盐)的HOOC-PEG5k2′-脲 按实施例10中所述，用以下量合成标题化合物4-{4′-[N′，N″-二(叔丁氧基羰基)]-}-{[4-(2′-氨基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-基]-亚氨基-甲基}-氨基甲酸叔丁酯(实施例5步骤b(30mg，0.039mmol))、吡啶(24μL，0.3mmol)、氯甲酸对硝基苯酯(7.3mg，0.036mmol)、二异丙基乙胺(200μL)和H2N-PEG5k-COOH(100mg，0.02mmol，NOF，Japan)的DCM(1mL)溶液。进行同样的后处理和纯化(沉淀和RP-HPLC)，得到35mg纯Boc-保护的中间体。用TFA处理，随后通过前述MeOH/DCM/Et2O沉淀，得到标题化合物，为白色固体。1H-NMR(PEG在δ3.62抑制峰形)(CD3OD)δ8.43(s，1H)，8.09-8.14(m，1H)，7.92(t，1H，J＝1.6Hz)，7.82(t，1H，J＝7.8Hz)，7.60-7.66(m，2H)，7.06(d，1H，J＝1.6Hz)，3.62(m，PEG亚甲基)，3.18(t，2H，J＝6.8Hz)，2.76(s，3H)，2.31(t，2H，J＝7.4Hz)，2.04(s，1H)，1.56-1.68(m，6H)，1.37-1.46(m，2H)。
实施例124-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒四(三氟乙酸盐)的二价45k PEG结合物 向4-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒的三-Boc-保护的HOOC-PEG5k2′-脲(33mg，0.0065mmol，按实施例11制备)和DMAP(3mg，0.018mmol)的DCM(1mL)溶液中加入二异丙基碳二亚胺(10μL 10％的DCM溶液，0.0064mmol)。在室温下搅拌反应物10min，然后一次性加入PEG35k-(NH2)2(81mg，0.0023mmol，NOF，Japan)。在室温下搅拌反应物过夜。真空除去溶剂，按实施例7中所述，在DCM/Et2O中沉淀残留物。在RP-HPLC上纯化收集的固体，用恒溶剂梯度(35％CH3CN/H2O(0.1％TFA)洗脱30min)除去产物(后流分)中的过量HOOC-PEG5k-小分子结合物(前流分)。用TFA(50％的DCM溶液，2mL)处理后流分4h，真空浓缩反应混合物。再次在RP-HPLC上层析纯化残留物，得到标题化合物，经分析型RP-HPLC和1H-NMR证实为纯化合物。1H-NMR(PEG在δ3.62抑制峰形)(CD3OD)δ8.42(s，1H)，8.09-8.11(m，1H)，7.91(t，1H，J＝1.7Hz)，7.81(t，1H，J＝7.8Hz)，7.71(s，1H)，7.60-7.62(m，1H)，7.04(d，1H，J＝1.6Hz)，3.62(m，PEG亚甲基)，3.25(t，2H，J＝6.8Hz)，3.17(t，4H，J＝6.0Hz)，2.75(s，3H)，2.18(t，2H，J＝7.5Hz)，2.02(s，1H)，1.90-1.98(m，2H)，1.72-1.79(m，2H)，1.56-1.67(m，6H)。
实施例134-(2′-氨基-4′-胍基-6′-甲基-联苯基-3-磺酰基)-5-甲硫基-噻吩-2-甲脒(八)-三氟盐酸盐的四价PEG 2′-脲结合物(末端分支为赖氨酸) 在室温下，向PEG35k-(NH2)2(1g，28.6mmol，NOF，Japan)和DMAP(0.035mg，0.286mmol)的DCM(3.5mL)溶液中加入Boc-N-Lys(Boc)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(102mg，0.229mmol，Novabiochem)。剧烈搅拌该粘性反应混合物24h，然后用DCM稀释，缓慢加入Et2O至混浊。使混合物在4℃下静置直至沉淀完全。过滤收集固体，再重复该过程3次。收集白色固体，在室温下用TFA(50％的DCM溶液)处理4h。浓缩反应混合物至干，加入过量DIEA中和残留物，真空蒸发，得到需要的固体中间体。按实施例7中所述类似的方法，使部分回收的固体(300mg，0.0086mmol)与6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基}-脲基)-己酸(64mg，0.0686mmol，按实施例2，步骤i制备)、二异丙基碳二亚胺(10.6μL，0.068mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(16mg，0.129mmol)的DCM(2mL)溶液反应。浓缩反应混合物，将残留物溶于DCM/MeOH混合物中，用Et2O沉淀(3×)。在室温下，用TFA(50％的DCM溶液)处理过滤的固体6h。真空除去挥发性物质，在MeOH/DCM/Et2O中沉淀残留物两次，得到白色固体，经分析型RP-HPLC和1H-NMR确证为纯标题化合物。1H-NMR(PEG在δ3.62抑制峰形)(CD3OD)δ8.44(s，1H)，8.09-8.11(m，1H)，7.92(s，1H)，7.82(t，1H，J＝7.8Hz)，7.73(m，1H)，7.60(d，1H，J＝8.0Hz)，7.03(s，1H)，3.62(m，PEG亚甲基)，3.05-3.12(t，2H，J＝6.8Hz)，2.75(s，3H)，2.19(t，2H，J＝7.7Hz)，2.01(s，1H)，1.70-1.90(m，2H)，1.24-164(m，10H)。
实施例14N-(PEG40k)-6-[3′-(5-氨基甲亚氨酰基-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基)-4-胍基-6-甲基-联苯-2-基氨基甲酰基]-己酰胺二(三氟盐酸盐) 用实施例7中所述方法，通过使6-(3-{3′-[5-(叔丁氧基羰基氨基-亚氨基-甲基)-2-甲硫基-噻吩-3-磺酰基]-4-(N，N′-二-叔丁氧基羰基)-胍基-6-甲基-联苯-2-基}-脲基)-己酸(25mg，0.027mmol，按实施例2，步骤i制备)、二异丙基碳二亚胺(4.3μL，0.027mmol)、N，N-二甲氨基吡啶(6.4mg，0.05mmol)和Y-PEG40k-NH2(700mg，0.0175mmol，Sunbio，South Korea)在DCM(3mL)溶液中反应合成标题化合物。经同样后处理，TFA处理和最后沉淀得到标题化合物，为白色固体。1H-NMR(CD3OD)(PEG在δ3.62抑制峰形)δ8.45(s，1H)，8.11(m，1H)，7.91(s，1H)，7.66-7.84(m，2H)，7.61(d，1H，J＝7.7Hz)，7.04(s，1H)，3.62(m，PEG亚甲基)，2.77(s，3H)，2.60(m，2H)，2.25(t，2H，J＝6.7Hz)，2.01(s，3H)，1.60(m，2H)，1.42(m，2H)，1.25-1.35(m，2H)。
实施例15体外抑制C1s试剂所有缓冲液得自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，且具有现有的最高纯度。DTNB购自Pierce(Rockford，IL)。Z-Gly-Arg-S-Bzl购自Enzyme Systems Products(Livermore，CA)。激活的人C1s购自Calbiochem(La Jolla，CA)。
Ki测定根据测试化合物抑制C1s-催化水解Z-Gly-Arg-S-Bzl底物的能力建立所有测定方法，通过与5，5′-二硫代-二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的次级反应，观察该能力。在典型的Ki测定中，用DMSO制备底物，稀释到由50mM HEPES、200mM NaCl、pH 7.5，0.05％正辛基-β-D-吡喃葡糖苷组成的测定缓冲液中。用200μM DTNB的测定缓冲液配制45μM(Km＝78μM)底物溶液。在测定缓冲液中，将测试化合物终浓度配制为10μM。在测定缓冲液中，配制测试化合物的稀释系列浓度，得到浓度范围为700倍的至少7个终浓度。将纯激活的C1s稀释到测定缓冲液中，测定用浓度为50nM。
在典型的Ki测定中，向96孔板的各孔中加入280μL底物溶液和10μL测试化合物溶液，在37℃下，将板热平衡10分钟。加入10μL等份酶试样起动反应，在Molecular Devices板读出器中，在405nm处连续记录吸收度的增加15分钟。终试剂浓度为[C1s]＝1.7nM，[Z-Gly-Arg-S-Bzl]＝45μM，[DTNB]＝200μM。不含测试化合物样品的速率(吸收度变化的速率作为时间的函数)除以含测试化合物样品的速率的比率，作为测试化合物浓度的函数作图。将数据拟合到线性回归中，计算该直线的斜率值。该斜率的倒数是实验测得的表观Ki值(Kiapp)。通过底物浓度[S]与底物Km之间的关系，将Kiapp校正为准确的Ki，其中Ki＝Kiapp×(1/(1+[S]/Km))。
实施例16体外抑制MASP-2试剂所有缓冲盐水得自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，且具有现有的最高纯度。DTNB购自Pierce(Rockford，IL)。Z-Gly-Arg-S-Bzl购自Enzyme Systems Products(Livermore，CA)。由昆虫细胞中的杆状病毒表达系统内部制备自动激活的2-链人MASP-2(His-tag，Cys300-Phe686)。
Ki测定根据测试化合物抑制MASP-2-催化水解Z-Gly-Arg-S-Bzl底物的能力建立所有测定方法，通过与5，5′-二硫代-二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的次级反应，观察该能力。在典型的Ki测定中，用DMSO制备底物，稀释到由50mM HEPES、200mM NaCl、pH 7.5，0.05％正辛基-β-D-吡喃葡糖苷组成的测定缓冲液中。用200μMDTNB的测定缓冲液配制45μM(Km＝8.6μM)底物溶液。在测定缓冲液中，将测试化合物终浓度配制为10μM。在测定缓冲液中，配制测试化合物的稀释系列浓度，得到浓度范围为700倍的至少7个终浓度。将纯激活的MASP-2稀释到测定缓冲液中，测定用浓度为30nM。
在典型的Ki测定中，向96孔板的各孔中加入280μL底物溶液和10μL测试化合物溶液，在37℃下，将板热平衡10分钟。加入10μL等份酶试样起动反应，在Molecular Devices板读出器中，在405nm处连续记录吸收度的增加15分钟。终试剂浓度为[MASP-2]＝1.0nM，[Z-Gly-Arg-S-Bzl]＝45μM，[DTNB]＝200μM。不含测试化合物样品的速率(吸收度变化的速率作为时间的函数)除以含测试化合物样品的速率的比率，作为测试化合物浓度的函数作图。将数据拟合到线性回归中，计算该直线的斜率值。该斜率的倒数是实验测得的表观Ki值(Kiapp)。通过底物浓度[S]与底物Km之间的关系，将Kiapp校正为准确的Ki，其中Ki＝Kiapp×(1/(1+[S]/Km))。
实施例17抑制补体数据按实施例15和16中所述方法测得的由列在表1中的各个实施例制备的下列化合物的Ki值。
表1
对于C1s亚成分，实施例的Ki值在0.018-0.4微摩尔(μM)范围。表1列出代表性实施例组抑制C1s和MASP-2的Ki值。结果表明本发明化合物为补体抑制剂。
引用的每件专利、专利申请和出版物或文献所述通过引用全文结合到本文中。
据信，本文中使用的化学式和化学名正确和准确反映所代表的化合物。但是，无论完全或部分，本发明的特性和价值不取决于这些式的理论正确性。因此，应理解本文中使用的式和化学名归属于相应表示化合物，但它们绝不限制本发明，除这种立体化学明确定义之外，包括不能将其限制在任何具体的互变异构体或任何具体的旋光体；或几何异构体。
除本文中所述的那些外，本领域技术人员由前述会明了本发明的各种改进。此类改进也包括在附属的权利要求的范围内。
权利要求
1.一种含有结合补体抑制剂的组合物。
2.权利要求1的组合物，所述组合物具有式(I)或式(IV)(D-L)n-PD-Ln-Pn’，(I)(IV)其中D在每次出现时独立选自为补体级联抑制剂的化合物；L在每次出现时是任选的(每次出现时)独立选择的连接基团；n是1、2、3、4、5或6；n’是1、2、3或4；和P在每次出现时独立选自提高D的药物动力学性质的化合物。
3.权利要求2的组合物，其中所述组合物具有式(I)，而n是1、2、4或6。
4.权利要求2的组合物，其中连接D与P的键在生理条件下是基本上不水解的。
5.权利要求2的组合物，其中D与C1s亚成分、C1r亚成分、MASP-2亚成分结合，或是C5a受体拮抗剂。
6.权利要求2的组合物，其中D与至少一个C1s亚成分或MASP-2亚成分结合。
7.权利要求2的组合物，其中D是芳族化合物。
8.权利要求2的组合物，其中D不是肽。
9.权利要求2的组合物，其中D是分子量在约100分子量单位至约2000分子量单位范围的小分子。
10.权利要求2的组合物，其中D是分子量在约400分子量单位至约1200分子量单位范围的小分子。
11.权利要求2的组合物，其中D是分子量在约400分子量单位至约2000分子量单位范围的小分子。
12.权利要求2的组合物，其中D是非芳族化合物。
13.权利要求2的组合物，其中D是芳族胍。
14.权利要求2的组合物，其中D是芳族化合物或杂芳族脒。
15.权利要求2的组合物，其中D是式(II)化合物 其中R1、R2和R3独立选自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羟基；U是噻吩基-R5、亚苄基、亚苯基、NH或键；R5是SO2、NH或键；Z是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或键；T是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基或硝基；X是氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基、巯基烷基或与L或P连接的键；V是甲基、乙基或Cl，和R4是H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2、脲或胍基。
16.权利要求2的组合物，其中D是 其中当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)，和R4是H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2、脲或胍基。
17.权利要求2的组合物，其中D是 其中当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)；R6是C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基、苯基、吡唑基或硝基；和V是甲基或乙基。
18.权利要求2的组合物，其中D是 其中当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)；R6是C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基、苯基、吡唑基或硝基；和V是甲基或乙基。
19.权利要求2的组合物，其中D是式(V)化合物 其中R1、R2和R3独立选自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羟基；U是噻吩基-R5、亚苄基、亚苯基、NH或键；R5是SO2、NH或键；Z是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或键；T是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基或硝基；X是氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基、巯基烷基或与L或P连接的键；当存在时，Y是氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基、巯基烷基、脲、胍基或与L或P连接的键；和V是甲基、乙基或Cl。
20.权利要求19的组合物，其中D选自 其中当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)，当Y存在时，如果D与L或P连接，则Y是NH、C(＝O)、胍基或脲，V是甲基、乙基或Cl，和R6是H、C1-4烷基、OH、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基、苯基、吡唑基或硝基。
21.权利要求19的组合物，其中D是 其中当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)，当Y存在时，如果D与L或P连接，则Y是NH、C(＝O)、脲或胍基，和V是甲基或乙基。
22.权利要求19的组合物，其中D是 其中当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)，当Y存在时，如果D与L或P连接，则Y是NH、C(＝O)、脲或胍基，V是甲基或乙基，和R6是H、C1-4烷基、OH、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基或硝基。
23.权利要求19的组合物，其中D是 其中当D与L或P连接时，X是NH或C(＝O)，当Y存在时，如果D与L或P连接，则Y是NH、C(＝O)、脲或胍基，V是甲基或乙基，和R6是H、C1-4烷基、OH、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基、苯基、吡唑基或硝基。
24.权利要求2的组合物，其中L选自以下基团 其中AA是氨基酸，而m是1-12， 其中AA是氨基酸，而m是1-12，和
25.权利要求2的组合物，其中P是选自以下的聚合物聚醚、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物和活化聚合物。
26.权利要求25的组合物，其中P是分子量为约750分子量单位至约60,000分子量单位的一甲基端基聚乙二醇。
27.权利要求25的组合物，其中P是分子量为约750分子量单位的一甲基端基聚乙二醇。
28.权利要求25的组合物，其中P是分子量为约10,000分子量单位的一甲基端基聚乙二醇。
29.权利要求25的组合物，其中P是分子量为约20,000分子量单位的一甲基端基聚乙二醇。
30.权利要求25的组合物，其中P是分子量为约40,000分子量单位的一甲基端基聚乙二醇。
31.权利要求25的组合物，其中P是分子量为约60,000分子量单位的一甲基端基聚乙二醇。
32.权利要求25的组合物，其中P是具有式(III)的活化聚合物 其中M是CH3、HC＝CH-C(＝O)、O＝CH-CH2、H2N-CH2-CH2、Cl-H3N+-HN-C(＝O)-CH2、O＝C＝N-CH2CH2、HS-CH2CH2、H2C＝CH-S(＝O)2-CH2CH2， J是17-1400；和A是O-CH2-CH(＝O)、O-C(＝O)-CH2＝CH2、O-CH2-CH2-NH2、NH2、O-CH2-C(＝O)-NH-NH3+Cl-、SH、N＝C＝O、S(＝O)2-CH＝CH2，
33.权利要求2的组合物，其中D是式(II)或式(V)化合物 其中R1、R2和R3独立选自H、C1-4烷基、氨基、C1-4烷氧基或羟基；U是噻吩基-R5、亚苄基、亚苯基、NH或键；R5是SO2、NH或键；Z是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基；W是C(＝O)-O、HC(CH3)-NH-C(＝O)、O、NH、S、CH2、C(＝O)或键；T是亚芳基、亚杂芳基、亚芳烷基、亚环烷基、亚环杂烷基、C1-4烷基、O、S、C1-4烷氧基、C1-4链烯氧基、苯氧基、苄氧基、卤素、氨基或硝基；X是氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基、巯基烷基，或与L或P连接的键；当存在时，Y是氨基、羧基、羟基、硫醇、卤素、烯烃、肼、羟胺、氨基烷基、羧基烷基、卤代烷基、羟烷基、巯基烷基、脲、胍基或与L或P连接的键；和V是甲基、乙基或Cl；和R4是H、C1-4烷基、C1-4烷氧基、脒基、氨基甲基、NH2、脲或胍基；L在每次出现时是任选的独立选自以下的连接基团； 其中AA是氨基酸，而m是1-12， 其中AA是氨基酸，m是1-12，和 P是具有式(III)的活化聚合物 其中M是CH3、HC＝CH-C(＝O)、O＝CH-CH2、H2N-CH2-CH2、Cl-H3N+-HN-C(＝O)-CH2、O＝C＝N-CH2CH2、HS-CH2CH2、H2C＝CH-S(＝O)2-CH2CH2， J是17-1400；和A是O-CH2-CH(＝O)、O-C(＝O)-CH2＝CH2、O-CH2-CH2-NH2、NH2、O-CH2-C(＝O)-NH-NH3+Cl-、SH、N＝C＝O、S(＝O)2-CH＝CH2，
34.一种抑制激活补体级联治疗患者的方法，所述方法包括给予所述患者权利要求2的结合补体抑制剂。
35.权利要求34的方法，其中所述患者的病症选自遗传性血管性水肿、败血性休克、心肺分流术中人工泵后综合征、阵发性夜间血红蛋白尿、器官排斥、创伤、脑创伤、哮喘、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮性肾小球性肾炎和皮肤损害、其它肾小球性肾炎、大泡型类天疱疮、疱疹样皮炎、肺出血-肾炎综合征、格雷夫斯氏病、重症肌无力、胰岛素抵抗、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、多发性硬化、急性感染性多神经炎、Miller-Fisher综合征和阿尔茨海默氏病。
36.一种治疗由传统途径或补体级联的MBL途径介导的急性或慢性疾病的症状的方法，所述方法包括给予有这种治疗需要的哺乳动物治疗有效量的权利要求2的结合补体抑制剂。
37.权利要求36的方法，其中所述急性或慢性疾病是炎症、组织损伤或自身免疫性疾病。
38.权利要求36的方法，其中所述化合物给予需要治疗补体介导的疾病的哺乳动物，所述疾病选自炎症、组织损伤及其组合。
39.权利要求38的方法，其中所述炎症或组织损伤发生在中风、心肌梗死、出血性休克或手术或其组合之后。
40.权利要求36的方法，其中所述化合物给予需要治疗Crohn’s病的肠炎、再狭窄或银屑病。
41.权利要求36的方法，其中所述化合物在器官或移植物移植之前、期间或之后给予哺乳动物，以缓解哺乳动物对这种器官或移植物的排斥。
42.权利要求41的方法，其中所述移植在个体内、同种个体之间或不同种个体之间进行。
43.权利要求41的方法，其中所述器官选自肾、心、肺和肝。
44.权利要求36的方法，其中所述化合物按有效减少IL-2治疗、骨髓移植或胰腺炎的毒性和副作用的量给予在(1)接受IL-2治疗之前、期间和之后的所述哺乳动物；接受骨髓移植的所述哺乳动物或(3)胰腺炎发生的所述哺乳动物。
45.权利要求36的方法，其中所述化合物给予已诊断为患有自身免疫性疾病的哺乳动物。
46.权利要求36的方法，其中所述化合物给予已诊断为患有阿狄森氏病、I型糖尿病、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮性肾小球性肾炎和皮肤损害、其它肾小球性肾炎、大泡型类天疱疮、疱疹样皮炎、肺出血-肾炎综合征、格雷夫斯氏病、重症肌无力、胰岛素抵抗、自身免疫性出血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、免疫复合物引起的脉管炎肾小球性肾炎、胶原-引起的II型关节炎、类风湿性关节炎或过敏性神经炎。
47.权利要求36的方法，其中所述化合物被给予已诊断为患有重症肌无力(MG)、类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮的哺乳动物。
48.权利要求36的方法，其中所述化合物被给予已诊断为患有神经变性疾病的哺乳动物。
49.权利要求48的方法，其中所述神经变性疾病是多发性硬化(MS)、急性感染性多神经炎(GBS)、Miller-Fisher综合征(MFS)、阿尔茨海默氏病(AD)或变型克罗伊茨费尔特-雅各布综合征(vCJD)。
50.权利要求36的方法，其中所述化合物被给予患有成年呼吸窘迫综合征的症状的哺乳动物。
51.权利要求36的方法，其中所述化合物被给予患有败血性休克的哺乳动物。
52.权利要求36的方法，其中所述化合物被给予需要治疗患有以下疾病的哺乳动物遗传性血管性水肿、阵发性夜间血红蛋白尿、创伤愈合、脑创伤、哮喘、血液透析、感染、皮肤病、炎性肠道疾病、骨质疏松症、骨关节炎、灼伤(烧伤和冻伤)、出血性贫血或心肺分流术中人工泵后综合征。
53.一种缓解个体排斥细胞移植或移植物的方法，所述方法包括通过给予所述个体权利要求2的结合补体抑制剂抑制补体级联激活。
54.权利要求53的方法，其中所述个体的病症选自心力衰竭、糖尿病、中风、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、痴呆、肝病、肾病、烧伤和创伤。
55.权利要求53的方法，其中所述移植物是个体内、同种个体之间或不同种个体之间的组织转移。
56.权利要求53的方法，其中所述细胞移植在个体内、同种个体之间或不同种个体之间进行。
57.权利要求53的方法，其中所述细胞移植的细胞是干细胞、原代细胞、来自组织培养的细胞、胰岛细胞、表达胰岛素的细胞、表达调节葡萄糖激素的细胞或表达用于治疗糖尿病的因子的细胞。
58.权利要求53的方法，其中所述个体是哺乳动物。
59.一种在器官保存溶液中预防器官中的补体激活的方法，所述方法包括使器官与权利要求2的结合补体抑制剂接触。
60.一种预防异物进入个体内引起补体激活的方法，所述方法包括使所述异物与权利要求2的结合补体抑制剂接触。
61.权利要求60的方法，其中所述异物是外科移植物、人造器官或人造关节。
全文摘要
本发明涉及结合补体级联抑制剂和用结合补体级联抑制剂治疗患者的方法。本发明部分涉及含结合补体级联抑制剂的化合物。所述化合物可便利地与补体级联组合物中的受体结合，因此，可抑制补体级联，或抑制由级联形成的蛋白质(例如C3a和C5a)的作用。在一个实施方案中，本发明提供治疗患者的包含结合补体抑制剂的药物。在另一个实施方案中，本发明提供通过抑制补体级联激活治疗患者的方法，所述方法包括给予患者结合补体抑制剂。通过本发明的说明书和权利要求书中的阐述，本发明的这些和其它方面会更为清楚。
文档编号A61P7/00GK101065148SQ200480024455
公开日2007年10月31日 申请日期2004年6月18日 优先权日2003年7月3日
发明者N·苏巴辛赫, E·哈利尔, F·阿利, H·R·哈夫纳格尔, S·K·巴伦蒂恩, J·M·特拉文斯, K·A·莱昂纳, R·F·博恩 申请人:奥索-麦克尼尔药品公司