通过序列分析监测状况的方法

专利名称：通过序列分析监测状况的方法
通过序列分析监测状况的方法交叉参考本申请要求2008年11月7日提交的美国专利申请No. 61/112，693的优先权，该美国专利申请在此引入作为参考。
背景技术：
免疫系统包括先天性和适应性免疫系统。先天性免疫系统包括利用一般方法识别外来病原体的细胞和机制。先天性免疫涉及的细胞包括中性白细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和树突细胞。这些细胞发挥吞噬作用以及释放许多可杀死侵入病原体的化学物质。另外，这些细胞参与先天性免疫防御机制，包括补体级联和炎症。最后，这些细胞中的一些参与在适应性免疫系统中起作用的抗原呈递过程。适应性免疫系统发展为攻击它们的靶标上的特定特征。发生对特定靶标的一种应答给宿主提供了它的“记忆”，使其如果再一次出现则引发更强的应答。通常，任何蛋白质或多糖能够作为适应性免疫应答细胞的一些亚群或其产物的靶标，该产物识别靶标上的特异性表位。适应性免疫应答被分为两类体液和细胞介导的免疫应答，B细胞和T细胞分别在这些应答中起特异性作用。由于自身免疫病涉及适应性免疫系统的一些成分对自身靶标的识别，已经研究了适应性免疫系统的方面以帮助诊断和预后。已经使用标准免疫学技术，通过寻找循环自身抗体研究了体液免疫系统。自身抗体如抗核、抗dsDNA和类风湿因子，已经对几种疾病进行了鉴别。这些抗体本身可能不是致病性的，它们在体内识别的靶标也不必然与在体外检测的相同；然而，这些水平的测定有助于诊断，并且在有些情况下具有一定的预后和治疗意义。研究自身免疫病中的适应性免疫系统的另外一种方法是基于对适应性免疫细胞的多样性的分析。适应性免疫细胞的激活导致它们的克隆扩增。这一克隆扩增的证据通常通过从血液RNA或DNA扩增编码抗原识别区的核酸序列的部分来获得。例如，扩增具有T 细胞受体β链(类似于抗体重链)的特异性V区段的序列的PCR引物用来扩增连接至特定V区段的J区段或J和D区段。当存在多样的细胞群时，预期扩增片段，具有大小略微不同的扩增子的分布，但是克隆扩增导致特定大小被富集，因此在凝胶上显示为更强的带。在被称为谱型分析(spectratyping)的技术中，每个V区段与J和D区段一起扩增，以评估这些扩增子中的任一种是否显示克隆扩增。谱型分析方法的一个问题是许多不同的序列可能具有相同的长度，因此无法区分。因此，该技术只能分辨出显著的克隆扩增。需要改进诊断和帮助自身免疫病预后和自身免疫疾病状态以及免疫系统起中心作用的其它疾病的方法。尽管在对免疫系统进行谱型分析中另外的特异性在允许更好地预测它对人类健康的影响方面具有重要的应用，如果开发了允许鉴别疾病过程涉及的特定τ和B细胞的方法，即使这些特定序列以前从未被观察到，仍将具有更大的应用。免疫系统的巨大多样性提供了潜在有用的细胞的巨大储备，而且对试图使用该所有组成成分用于预测目的的研究人员提出了挑战。针对抗原的任何单序列是可能涉及特定个体中的疾病过程和/或与之相关的大量序列之一。鉴别特定个体中的许多细胞中的哪些与疾病过程相关的方法对于人类健康是特别有价值的。

发明内容
在一个方面，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组(recombined)DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，从所述细胞空间上分离基因组DNA的个体分子；对所述空间上分离的基因组DNA的个体分子进行测序，和确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。 在另一方面，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，从所述细胞空间上分离基因组DNA的个体分子，扩增所述基因组DNA的个体分子，对所述扩增的DNA进行测序，以及确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。在另一方面，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，从所述细胞扩增基因组DNA，空间上分离所述扩增的DNA的个体分子，对所述空间上分离的扩增DNA的个体分子进行测序，以及确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。在另一方面，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，从所述细胞扩增基因组DNA，空间上分离所述扩增的DNA的个体分子，再扩增所述扩增的DNA分子，对所述再扩增的DNA分子进行测序，以及确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。在另一方面，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，逆转录来自所述细胞的RNA以形成cDNA，空间上分离所述cDNA的个体分子，任选地再扩增所述空间上分离的个体cDNA的个体分子，对所述 cDNA和/或再扩增的cDNA进行测序；以及确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。在另一方面，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品；空间上分离所述样品中的个体细胞，对来自所述细胞的个体核酸分子进行测序；以及确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。在一个实施方案中，所述扩增和/或再扩增包括PCR、多重PCR、TMA, NASBA或 LAMP。在另一实施方案中，所述空间上分离包括在用来转化细菌的载体中亚克隆所述DNA 或cDNA，在固体支持体上两维地分离所述DNA或cDNA，在含有微团的溶液中三维地分离所述DNA或cDNA，或利用微反应室分离分子。在另一实施方案中，所述扩增和/或再扩增是通过携带亚克隆的DNA或cDNA的细菌的生长，DNA或cDNA在载玻片上的扩增，或DNA或cDNA 在珠上的扩增。在另一实施方案中，所述测序包括双脱氧测序。在另一实施方案中，所述测序包括利用可逆终止的标记核苷酸进行合成测序。在另一实施方案中，所述测序包括检测核苷酸掺入的焦磷酸释放。在另一实施方案中，所述测序包括与标记寡核苷酸探针文库的等位基因特异性杂交。在另一实施方案中，所述测序包括合成测序，该合成测序利用与标记寡核苷酸探针文库的等位基因特异性杂交，随后连接所述探针。在另一实施方案中，所述测序包括实时监测聚合步骤过程中标记核苷酸的引入。在另一实施方案中，所述重组DNA序列包含T细胞受体基因和/或免疫球蛋白基因。在另一实施方案中，所述测序包括对免疫球蛋白和/或T细胞受体基因的全克隆序列的亚群进行测序。在另一实施方案中，所述全克隆序列的亚群包括免疫球蛋白或T细胞受体基因的 V-D连接、D-J连接、免疫球蛋白或T细胞受体基因的完整可变区、抗原识别区、或互补决定区3(CDR3)。在另一实施方案中，所述T细胞受体基因包含T细胞受体β基因。在另一实施方案中，所述免疫球蛋白基因包含免疫球蛋白重链基因。在另一实施方案中，所述扩增或再扩增包含多条互补于V区段的引物和一条互补于C区段的引物。在另一实施方案中，所述扩增或再扩增包含多条互补于V区段的引物和多条互补于C区段的引物。在另一实施方案中，所述多条互补于V区段的引物包含对于各V区段的至少三条不同的引物，所述多条互补于C区段的引物包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6条引物。在另一实施方案中，所述T或B细胞是总T和B细胞的亚群。在另一实施方案中， 所述T细胞的亚群是⑶4+，⑶8+细胞或⑶27 s细胞。在另一实施方案中，所述样品包含至少100，000个、至少500，000个、至少750，000个或至少1，000, 000个T细胞。在另一实施方案中，所述测序包括至少1000阅读/运行、至少10，000阅读/运行、 至少100，000阅读/运行或至少1，000, 000阅读/运行。在另一实施方案中，所述测序包括每阅读产生约30bp、约40bp、约50bp、约60bp、约70bp、约80bp、约90bp、约IOObp、约110 或约120bp。在另一实施方案中，当受试者处于自身免疫病的发作状态(flare state)时采集所述样品。在另一实施方案中，从患有或怀疑患有系统性红斑狼疮的受试者采集所述样品。在另一方面，提供了一种确定受试者的一个或多个相关克隆型的方法，包括通过对来自受试者的至少一个样品的个体、空间上分离的分子进行核酸测序产生一个或多个克隆型谱，其中所述至少一个样品与疾病的第一状态有关，以及基于所述一个或多个克隆型谱确定受试者中的一个或多个相关克隆型。在一个实施方案中，所述至少一个样品来自受疾病影响的组织。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型的确定包括比较来自至少两个样品的克隆型谱。在另一实施方案中，疾病的第一状态是疾病的高峰状态。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型存在于疾病的高峰状态。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态不存在。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时高。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时低。在另一实施方案中，所述样品包含T细胞和/或B细胞。在另一实施方案中，所述 T细胞和/或B细胞包含T细胞和/或B细胞的亚群。在另一实施方案中，所述T细胞和/ 或B细胞的亚群通过与标志物相互作用而富集。在另一实施方案中，所述标志物是T细胞和/或B细胞的亚群上的细胞表面标志物。在另一实施方案中，所述T细胞和/或B细胞的亚群与特异性存在于疾病中的抗原相互作用。在另一实施方案中，所述疾病是系统性红斑狼疮或多发性硬化。
在另一方面，提供了一种开发算法的方法，该算法能够预测来自患病受试者的任何样品中的一个或多个相关克隆型，该方法包括a)从一组样品产生多个克隆型谱，其中该样品与所述疾病有关，b)从这组样品鉴别一个或多个相关克隆型，c)利用来自b)中鉴别的一个或多个相关克隆型的序列参数和/或功能数据来开发能够预测来自患病受试者的任何样品中的相关克隆型的算法。在一个实施方案中，这组样品获自一个或多个受疾病影响的组织。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型的鉴别包括比较来自至少两个样品的克隆型谱。在另一实施方案中，所述功能数据包括T细胞和/或B细胞表面上的标志物的结合能力或T细胞或B细胞与抗原的相互作用。在另一实施方案中，所述序列参数包括核酸序列和预测的氨基酸序列。在另一实施方案中，样品来自一个或多个处于疾病高峰期的个体。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时存在。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态处于高水平。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态处于低水平。在另一实施方案中，一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时不存在。在另一实施方案中，所述疾病是系统性红斑狼疮或多发性硬化。在另一实施方案中，提供了一种发现个体的一个或多个相关克隆型的方法，该方法包括将来自个体样品的克隆型谱输入一种算法，并利用该算法确定个体的一个或多个相关克隆型。在一个实施方案中，所述算法是能够预测来自患病受试者的任何样品中的一个或多个相关克隆型的算法，包括通过以下方式开发所述算法a)从一组样品产生多个克隆型谱，其中该样品与所述疾病有关，b)从这组样品鉴别一个或多个相关克隆型，c)利用 b)中鉴别的一个或多个相关克隆型的序列参数和/或功能数据来开发能够预测患病受试者的任何样品中的相关克隆型的算法。在一个实施方案中，所述样品在疾病的高峰状态时获得。在另一实施方案中，样品取自受疾病影响的组织。在另一方面，提供了产生计算疾病活动性得分的算法的方法，包括开发使用一组因素将相关克隆型水平组合为疾病活动性得分的算法，比较该疾病活动性得分与关于疾病状态的临床数据，以及优化该因素，以最大化临床数据与疾病活动性得分之间的相关性。在一个实施方案中，提供了监测个体疾病状态的方法，包括a)从来自个体的样品确定克隆型谱，b)将来自a)的克隆型谱信息输入到计算疾病活动性得分的算法中，其中，该算法是如下产生的开发使用一组因子将相关克隆型水平组合为疾病活动性得分的算法，比较疾病活动性得分与关于疾病状态的临床数据，以及优化所述因子以最大化临床数据与疾病活动性得分之间的相关性，和c)使用计算疾病活动性得分的算法产生预示个体疾病状态的得分。在另一实施方案中，监测个体疾病状态的方法还包括确定个体中的一个或多个相关克隆型，并将一个或多个相关克隆型信息输入到一种算法中。在另一实施方案中，所述确定个体中的一个或多个相关克隆型包括a)通过对来自受试者的至少一个样品的空间上分离的个体分子进行核酸测序，产生一个或多个克隆型谱，其中所述至少一个样品与疾病的第一状态相关，和b)基于一个或多个克隆型谱确定受试者中的一个或多个相关克隆型。在另一实施方案中，所述确定个体中的一个或多个相关克隆型包括a)将来自个体样品的克隆型谱输入到能够预测一个或多个相关克隆型的算法中，其中所述能够预测一个或多个相关克隆型的算法是通过以下方式开发的i)从一组样品产生多个克隆型谱，其中该样品与所述疾病有关，ii)从这组样品鉴别一个或多个相关克隆型，iii)利用ii)中鉴别的一个或多个相关克隆型的序列参数和/或功能数据来开发能够预测患病受试者的任何样品中的相关克隆型的算法，和c)利用能够预测一个或多个相关克隆型的算法来确定该个体的一个或多个相关克隆型。在另一实施方案中，所述疾病是系统性红斑狼疮或多发性硬化。参考引用本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都在此引入作为参考，如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体且分别地引入作为参考。


本发明的新特征在所附权利要求书中详细阐明。通过参考以下说明应用本发明原理的示例性实施方案的详述和附图，可以更好地理解本发明的特征和优点，在附图中图1是本发明用于确定克隆型谱的方法的一个实施方案的流程图。图2显示用于扩增TCRii基因的PCR方案。图3显示使用图2中的方案扩增的待测序的PCR产物。图4A和4B说明用于扩增同种型序列的PCR方案。图5说明多重扩增的可重复性。图6说明多重扩增具有最小的扩增偏性。图7说明IgH序列的多重扩增的琼脂糖凝胶电泳。图8A显示使用Accuprime和作为输入模板的对应于500ng RNA的cDNA，两个重复样品中每个克隆型的频率的lc^1(l。图8B显示使用作为输入模板的对应于500ng RNA的cDNA和Accuprime (X轴)或高保真Taq (Y轴)，每个克隆型的频率的logl。。图8C显示使用作为输入模板的对应于50ng RNA的cDNA和Accuprime (X轴)或高保真Taq (Y轴)，每个克隆型的频率的logl。。说明通过发现研究确定算法的流程图。图9说明在扩增反应中连接两个序列以形成一个扩增子的方案的一个实施方案。 关于同一样品(例如细胞)中存在这两个序列的信息然后可以保留，即使它们与来自其它样品的一组序列混合。图10说明连接两个序列的扩增方案的另一实施方案。图11说明连接两个序列的扩增方案的另一实施方案。图12A和12B说明使通过PCR连接两个序列的反应多重化的方案。图13A-13D说明将三个序列连接在一起的方案。图14说明使用校准试验发现相关克隆型的流程图。图15说明使用群体研究发现相关克隆型的流程图。
图16说明使用群体研究和校准试验发现相关克隆型的流程图。图17说明能够预测样品中的相关克隆型的算法。图18说明产生用于计算免疫负荷(Immune Load)的监测算法的流程图。图19说明进行监测试验而不进行校准试验的流程图。图20说明进行采用校准试验的监测试验的流程图。发明详述鍵总体上，本发明包括将核酸测序技术应用于监测适应性免疫细胞的所有组成成分 (repertoire)的任务以对免疫系统进行谱分析(profiling)的方法。产生的免疫系统的谱 (profile)可用于诊断疾病和紊乱，以及用于诊断疾病和紊乱的状态。本发明的免疫谱分析方法可以用于监测疾病和紊乱和评价疾病和紊乱的治疗。可以应用本发明的方法的这些疾病和紊乱包括自身免疫病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MQ、类风湿性关节炎 (RA)和强直性脊柱炎。本发明的方法可以用于诊断、监视和治疗移植排斥和免疫老化。此外，本发明的免疫谱型分析方法可以用于诊断、监视和治疗其它与免疫系统相关的疾病，包括癌症和传染病。对扩增的个体分子进行测序可以区分不同的序列，因此具有检测克隆扩增的量变的灵敏性。总体上，在本发明的一个实施方案中，提供了确定T细胞和/或B细胞中的重组 DNA序列谱的方法。该方法可以包括以下步骤从受试者分离样品，一轮或多轮核酸扩增， 空间上分离个体核酸，和对核酸进行测序。核酸可以是DNA或RNA。T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列可以被称为克隆型(clonotype)。在一个方面，提供了确定受试者或个体中的一个或多个相关克隆型的方法。在另一方面，提供了开发能够预测来自患病受试者的任何样品中的一个或多个相关克隆型的算法的方法。在另一方面，提供了使用能够预测来自受试者的任何样品中的一个或多个相关克隆型的算法发现个体的一个或多个相关克隆型的方法。在另一方面，提供了产生计算疾病活动性得分的算法的方法。在另一方面，提供了监测个体的疾病状态的方法。I.确定克隆型谱的方法A.概述本发明的方法可以用来产生来自受试者的样品中的重组DNA序列谱或克隆型。在一个实施方案中，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，从所述细胞分离基因组DNA的个体分子，对分离的基因组DNA的个体分子进行测序，以及确定来自该样品的不同序列的水平， 以产生所述重组DNA序列谱。在另一实施方案中，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，从所述细胞分离基因组DNA的个体分子，扩增所述基因组DNA的个体分子，对所述扩增的DNA进行测序，以及确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。在另一实施方案中，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，从所述细胞扩增基因组DNA，分离所述扩增的DNA的个体分子，对所述分离的扩增DNA的个体分子进行测序，以及确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。在另一实施方案中，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，从所述细胞扩增基因组DNA，分离所述扩增的DNA的个体分子，再扩增所述扩增的DNA分子，对所述再扩增的DNA分子进行测序，以及确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。在另一实施方案中，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，从所述样品分离RNA，逆转录来自所述细胞的RNA以形成cDNA，分离所述cDNA的个体分子，任选地再扩增所述cDNA，对所述cDNA或再扩增的DNA的所述分离的个体分子进行测序，以及确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。在另一实施方案中，提供了一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品，从所述样品分离RNA的个体分子，对RNA的个体分子进行测序，以及确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。B.警试者和样品1.受试者本发明的方法可以使用来自受试者或个体(例如患者)的样品。受试者可以是患者，例如，自身免疫病患者。受试者可以是传染病或癌症患者。受试者可以是哺乳动物，例如，人类。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是婴儿、儿童或成人。2.样品本发明的方法中使用的样品可包括，例如，来自受试者的体液，包括围绕胎儿的羊水、眼房水、胆汁、血液和血浆、耵聍(耳垢)、Cowper液或射精前液、乳糜、食糜、女性喷射液、间隙液、淋巴、月经、乳汁、粘液(包括鼻涕和痰)、胸水、脓、唾液、皮脂(皮油)、精液、 血清、汗、泪、尿、阴道润滑液、呕吐物、水、粪便、内体液，包括脑和脊髓周围的脑脊液，骨关节周围的滑液，细胞内液是细胞内的流体，和玻璃体液，即眼球内的流体。在一个实施方案中，样品是血液样品。血液样品可以是大约0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0、 1. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5或5. OmL。当受试者患有多发性硬化时，样品可以是脑脊液 (CSF)，当受试者患有类风湿性关节炎时，样品可以是滑液，当受试者患有系统性红斑狼疮时，样品可以是皮肤(或其它器官)活检组织。在一个实施方案中，可以从可获得的最可能反映病理学的体液/组织确定克隆型，随后监测构成不同体液例如血液的克隆型的水平。样品可以在疾病不活动时分析。样品可以由卫生人员获得，例如，内科医生、医生助理、护士、兽医师、皮肤科医生、 风湿科医生、牙科医生、急救医士或外科医生。样品可以由研究技术员获得。可以获得一种以上的来自受试者的样品。样品可以是活检组织，例如，皮肤活检组织。活检组织可以来自，例如，脑、肝、肺、 心脏、结肠、肾或骨髓。本领域技术人员使用的任何活检技术都可以用于从受试者分离样品。例如，活检可以是开放活检，其中使用全身麻醉。活检可以是闭合活检，其中形成比切开活检更小的切口。活检可以是中心活检或切开活检，其中切除组织的一部分。活检可以是切除活检，其中试图切除整个病变(lesion)。活检可以是细针抽吸活检，其中用针头移除组织或流体样品。样品可以包括免疫细胞。免疫细胞可以包括T细胞和/或B细胞。T细胞(T淋巴细胞)包括，例如，表达T细胞受体的细胞。T细胞包括辅助T细胞(效应T细胞或Th细胞)、细胞毒性τ细胞(CTL)、记忆T细胞和调节性T细胞。样品在某些应用(例如，定义相关T细胞的校准试验)中可以包括单个细胞，或者更通常至少1，000个、至少10，000个、至少100，000个、至少250，000个、至少500，000个、至少750，000个或至少1，000, 000个T 细胞。B细胞包括，例如，血浆B细胞、记忆B细胞、Bl细胞、B2细胞、边缘区B细胞和滤泡B细胞。B细胞能够表达免疫球蛋白(抗体、B细胞受体)。样品在某些应用(例如，定义相关B细胞的校准试验)中可以包括单个细胞，或者更通常至少1，000个、至少10，000 个、至少100，000个、至少250，000个、至少500，000个、至少750，000个或至少1，000, 000 个B细胞。样品可以包括核酸，例如，DNA (例如，基因组DNA或线粒体DNA)或RNA (例如，信使RNA或微RNA)。核酸可以是不含细胞的DNA或RNA。在本发明的方法中，来自可以被分析的受试者的RNA或DNA的量包括，例如，在某些应用(例如，校准试验)中低至单个细胞， 以及多至1000万个细胞或更多，转化为6pg-60ug范围的DNA，和大约Ipg-IOug的RNA。C.分离、扩增和再扩增核酸的方法1. TCR和BCR基因的特征由于鉴别的重组存在于每个个体适应性免疫细胞的DNA以及它们的相关RNA转录物中，RNA或DNA可以用本发明的方法测序。来自T细胞或B细胞的重组序列也可以被称为克隆型。DNA或RNA可能对应于来自T细胞受体(TCR)基因或编码抗体的免疫球蛋白(Ig) 基因的序列。例如，DNA和RNA可能对应于编码TCR的α、β、γ或δ链的序列。在大多数T细胞中，TCR是由α-链和β-链组成的异二聚体。TCRa链通过VJ重组产生，β链受体通过V(D)J重组产生。对于TCRii链，在人类中有48个V区段、2个D区段和13个J区段。几个碱基可能缺失，另外一些可以在两个连接的每一个处添加(称为N和P核苷酸)。 在大多数T细胞中，TCR由γ和δ delta链组成。TCRy链通过VJ重组产生，TCR δ链通过 V(D)J重组产生(Kenneth Murphy,Paul TraversJPMark ffalport,Janeway's Immunology 7th edition, Garl 和 Science，2007，在此引入作为参考)。在本发明的方法中分析的DNA和RNA可对应于编码具有恒定区(α，δ，ε，Y或 μ)的重链免疫球蛋白(IgH)或具有恒定区λ或K的轻链免疫球蛋白(IgK或IgL)的序列。每个抗体具有两个相同的轻链和两个相同的重链。每条链由恒定区(C)和可变区组成。对于重链，可变区由可变区段(V)、多样性区段⑶和连接(J)区段组成。基因组中存在几种不同的编码这些区段的每个类型的序列。特定VDJ重组事件在B细胞发育过程中发生，标记该细胞，产生特异性重链。轻链中的多样性以类似的方式产生，除了没有D区因此只存在VJ重组以外。体细胞突变通常靠近重组位点发生，引起几个核苷酸的添加或缺失， 进一步提高了 B细胞产生的重链和轻链的多样性。B细胞产生的抗体的可能的多样性因此是不同重链和轻链的产物。重链和轻链的可变区贡献形成抗原识别(或结合)区或位点。 向该多样性中增加体细胞超突变过程，该过程可能在发生针对某些表位的特异性应答后发生。在该过程中，在能够识别特定表位的那些B细胞中发生突变，导致在可能能够更强地结合特定表位的抗体中具有较大的多样性。所有这些因素都对B细胞产生的抗体的丰富多样性具有贡献。可能产生几十亿种，也许超过万亿种不同的抗体。产生T细胞多样性的基本前提类似于B细胞产生抗体的前提。T细胞和B细胞活化的成分是它们与外来表位的结合。 特定细胞的活化导致产生更多相同类型的细胞，导致克隆扩增。互补决定区(CDR)或超可变区是能够与抗原互补的抗原受体(例如，T细胞受体和免疫球蛋白)的可变域中的序列。每个抗原受体的链含有三个⑶R(⑶Rl、⑶R2和⑶R3)。 形成T细胞(α和β)和免疫球蛋白(IgH和IgK或IgL)的两个多肽贡献了三个CDR的形成。由TCRii编码的⑶Rl和⑶R2的部分位于47个功能性V区段之一内。⑶R的大部分多样性在CDR3中发现，多样性在T淋巴细胞发育过程中通过体细胞重组事件产生。在个体之间和个体之内存在多种多样的BCR。BCR由编码抗体重链和轻链的两个基因IgH和IgK (或IgL)组成。结合抗原和MHC分子的三个互补决定区(OTR)序列在IgH 和IgK(或IgL)中具有最高的多样性。由IgH编码的⑶Rl和⑶R2的部分位于44个功能性V区段之一内。幼稚B细胞中的大部分多样性通过B淋巴细胞发育过程中的体细胞重组事件在⑶R3产生中出现。重组可以产生具有V、D和J区段各一个的分子。在人类中，存在 44个V区段、27个D区段和6个J区段；因此，理论上存在超过7，000种组合的可能性。在小部分BCR(约5%)中，发现了两个D区段。此外，几个碱基可能缺失，其它几个可能在两个连接的每一个处添加(称为N和P核苷酸)，产生高度的多样性。在B细胞激活后，发生通过体细胞超突变的亲和力成熟过程。在该过程中，激活的B细胞的后代细胞在整个基因中积累不同的体细胞突变，在CDR区具有较高的突变浓度，导致产生对抗原具有较高亲和力的抗体。因此，多个引物可以用来在体细胞超突变后扩增序列。除了体细胞超突变以外， 激活的B细胞经历同种异型转换过程。具有相同可变区段的抗体取决于恒定区段可能具有不同的形式(同种型)。所有幼稚B细胞表达IgM (或IgD)，而激活的B细胞主要表达IgG， 但也表达IgM.IgA和IgE0这种从IgM(和/或IgD)到IgG、IgA或IgE的表达转换通过重组事件发生，导致一种细胞专门产生特定的同种型。IgM、IgD和IgE各有一个区段，IgA有两个区段，IgG有四个区段。2.扩增反应聚合酶链反应(PCR)能够用来从细胞集合扩增相关区域。转录介导的扩增(TMA) 可以用来从靶核酸产生RNA扩增子。来自每个细胞的核酸可以分别分析，因为每个细胞携带其自身独特的特征标志(signature)。TCR^或免疫球蛋白序列可以在使用至少一条与C区退火的引物和一条或多条与一个或多个V区段退火的引物的多重反应中从核酸扩增(图2和图4)。在多重反应中与V 区段退火的引物数可以是，例如，至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80。在多重反应中与V区段退火的引物数可以是， 例如，10-60、20-50、30-50、40-50、20-40、30-40或35-40。引物可以与不同的V区段退火。 对于IgH基因，由于V区段中体细胞突变的可能性，可以使用多条与各V区段退火的引物； 例如，每个V区段1、2、3、4或5条引物。在多重反应中与C区段退火的引物数可以包括，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在多重反应中与C区段退火的引物数可以是1-10、2-9、3-8、4-7、3-8或3_6。TCR或免疫球蛋白基因的扩增可以如实施例3和/ 或实施例4所述发生。将要扩增的区域可包括完全克隆序列或克隆序列的一部分，包括免疫球蛋白或T 细胞受体基因的V-D连接、D-J连接，免疫球蛋白或T细胞受体基因的完全可变区，抗原识别区，或⑶R，例如，互补决定区3 (⑶R3)。TCR或免疫球蛋白序列可以利用第一和第二扩增步骤扩增。不同扩增步骤各自可包括不同的引物。不同的引物可引入在免疫基因序列中原始不存在的序列。例如，扩增过程可以向扩增的TCR或免疫球蛋白序列的5’和/或3’末端添加一个或多个标签(图3)。 标签可以是便于扩增DNA的后续测序的序列。标签可以是促进扩增序列与固体支持体结合的序列。其它扩增方法可以不使用V区中的任何引物。而是可能使用来自C区段的特异性引物，另一端(5’ )可以使用通用引物。通用引物可以通过不同方法，包括充分描述的链转换方法，在cDNA合成中附加。类似地，通用引物可以通过包括连接在内的不同的方法附加在cDNA后。本发明方法中可以使用的其它核酸扩增手段包括，例如，反转录PCR、实时PCR、 定量实时PCR、数字PCR (dPCR)、数字乳液PCR (dePCR)、克隆PCR、扩增片段长度多态性 PCR(AFLP PCR)、等位基因特异性PCR、装配PCR、不对称PCR(其中为选择的链使用极大过量的引物)、菌落PCR、解旋酶依赖的扩增(HDA)、热启动PCR、反转PCR(IPCR)、原位PCR、长 PCR(大于大约5千碱基的DNA的延伸)、多重PCR、巢式PCR(使用一对以上的引物)、单细胞？0 、降落？0 、环介导的等温？0 (1^^ 和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其它扩增方案包括连接酶链反应、Branch DNA扩增、滚环扩增、环到环(Circle to Circle)扩增、SPIA 扩增、通过捕获和连接的靶标扩增(TACL)扩增和RACE扩增。样品中的RNA信息可以通过利用逆转录转化为cDNA。逆转录反应中可以使用 PolyA引物、随机引物和/或基因特异性引物。从基因组扩增DNA(或通过逆转录RNA扩增cDNA形式的核酸)后，各核酸分子可以被分离，任选地再扩增，然后分别测序。可以在本发明的方法中用于扩增的聚合酶包括，例如，Taq聚合酶、AccuPrime聚合酶或Pfu。使用的聚合酶的选择可以基于是优选保真度还是效率。在一个实施方案中，分离样品中的个体细胞。来自每个分离的细胞的两个或多个序列可以连接在一起。例如，来自个体细胞的TCRa和TCRii基因或IgH和IgK基因的序列可以例如通过扩增方案(图9-13)或连接方案连接。对于分离的细胞，连接的TCRa和 TCR^或IgH和IgK序列可以任选地再扩增。连接的扩增产物可以任选地在扩增后再合并。3.分离个体核酸的方法从集合体分离核酸的方法包括将核酸亚克隆到DNA载体中，并转化细菌(细菌克隆)，在固体物质(例如，载玻片)上以两维方式空间上分离该分子，在含微团的溶液中以三维方式空间上分离该分子(如可以使用油乳剂实现，在固体表面如珠上固定分子或不固定分子)，或者使用微反应室，例如，在微流体或纳米液体芯片中。可以利用稀释确保在给定体积、空间区域、珠或反应室中平均存在一个分子。
实时PCR、picogreen染色、纳米流体电泳(例如LabChip)或UV吸光度测量可以在开始的步骤中使用，以判断可扩增材料的功能量。重新扩增核酸的方法包括分离的用核酸转化的菌落的细菌生长，在载玻片上扩增 (例如，PCR群落(polonies))，和在珠上扩增。可以利用相同的方法扩增和重新扩增核酸， 或者可以利用不同的方法扩增和重新扩增核酸。在某些实施方案中，亚克隆步骤包括通过扩增或连接步骤将通用引物附着到DNA 或RNA上的步骤。然后利用该引物扩增所述克隆并作为引物杂交识别序列用于测序(图 2)。在其它实施方案中，从细胞亚群分析核酸。可以使用分离细胞的方法，例如通过使用细胞表面标志物。例如，细胞可以通过细胞分选流式细胞术、流动分选、荧光激活细胞分选(FACS)、基于珠的分离如磁性细胞分选(MACS;例如，使用抗体包被的磁性颗粒)、基于大小的分离(例如，筛，障碍阵列，或过滤器)、在微流装置中的分选、基于抗体的分离、 沉降、亲和力吸附、亲和提取或密度梯度离心来分离。细胞可以通过激光捕获显微切割纯化。分选可以基于细胞大小、形态学或细胞内或细胞外标志。分离或分选肿瘤细胞的方法例如记载在 Nagrath S.等人.Q007)Nature 450 :1235-1239 ；美国专利 Nos. 6008002， 7232653 和 7332288 ；PCT 公布 No. W02008157220A1 ；和美国专利申请 Nos. US20080138805A1 和 US20090186065 ；和 Rosenberg R.等人· (2002) Cytometry 49 150-158，每篇文献均在此全文引入作为参考。细胞亚群可以是T细胞和/或B细胞亚群。T细胞亚群可以是⑶4+、⑶8+或⑶27
髙细胞。荧光激活细胞分选(FACQ利用光散射和荧光特征来分选细胞。例如利用核酸探针或偶联至荧光染料的抗体可以将荧光性质赋予细胞。细胞悬浮液可以形成流动液体流。 细胞流形成液滴，每滴含有大约一个细胞。在液流形成液滴前，测量每个细胞的荧光特征。 在荧光强度测量前将电荷置于电荷环上，相反的电荷由从液流破裂的液滴携带。带电荷的液滴通过两个高压偏转板，所述高压偏转板使液滴基于它们的电荷转向到不同容器中。电荷可以直接施加到淮流上，破裂的滴保持与液流相同指标的电荷。该液流然后在液滴破裂后恢复中性。FACS中可以使用直接或间接免疫荧光。在直接免疫荧光中，抗体直接偶联到荧光染料上。在间接免疫荧光中，第一抗体是未标记的，第二抗体偶联到荧光染料上。在一个实施方案中，来自样品的个体细胞可以被分离。来自细胞中两个基因的序列信息可以连接在一起。例如，样品可以来自自身免疫病患者，来自样品的空间上分离细胞的TCRa和TCRii基因的序列信息可以通过例如扩增方案或连接方案物理连接在一起。连接的TCRa和TCRii序列可以任选地被扩增和/或与来自其它细胞的连接的序列合并。连接的序列可替代地可以用于IgH和IgK或用于IgH和IgL。C.测序技术本领域技术人员已知的任何核酸测序技术可以在本发明的方法中使用。DNA测序技术包括使用标记的终止剂或引物和在板或毛细管中凝胶分离的经典双脱氧测序反应 (Sanger法)，使用可逆终止的标记核苷酸的合成测序，焦磷酸测序，454测序，与标记寡核苷酸探针文库的等位基因特异性杂交，使用与标记克隆文库的等位基因特异性杂交随后进行连接的合成测序，在聚合步骤过程中掺入标记的核苷酸的实时监测，聚合酶群落测序，和 SOLiD测序。分离的分子的测序最近已经通过使用聚合酶或连接酶的连续或单延伸反应以及通过与探针文库的单或连续差异杂交得到证实。这些反应已经对许多克隆序列平行进行，包括在超过1亿个平行序列的当前的商业应用中得到证明。这些测序方法因此可以用来研究T细胞受体(TCR)和/或B细胞受体(BCR)的所有组成成分。本发明的方法中使用的测序技术每次运行可以产生至少1000个阅读，每次运行至少10，000个阅读，每次运行至少100，000个阅读，每次运行至少500，000个阅读，或每次运行至少1，000, 000个阅读。本发明的方法中使用的测序技术每次阅读可以产生大约30bp、约40bp、约50bp、 约 60bp、约 70bp、约 80bp、约 90bp、约 lOObp、约 110、约 120bp per read、约 150bp、约 200bp、 约 250bp、约 300bp、约 350bp、约 400bp、约 450bp、约 500bp、约 550bp 或约 600bp。本发明的方法中使用的测序技术每次阅读可以产生至少30、40、50、60、70、80、90、 100、110、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550 或600bp。1. True单分子测序可以在本发明的方法中使用的测序技术包括，例如，Helicos Ture单分子测序 (tSMS) (Harris Τ. D.等人.Q008)kience 320:106-109)。在 tSMS 技术中，DNA 样品被裂解为大约100-200个核苷酸的链，向每个DNA链的3’端添加polyA序列。每条链通过添加荧光标记的腺苷核苷酸进行标记。DNA链然后与流动池表面杂交，流动池表面含有上百万个固定在流动池表面上的寡聚-T捕获位点。模板可以为大约1亿模板/cm2的密度。流动池然后装载在仪器例如HelKcope 测序仪中，激光照射流动池表面，显示每个模板的位置。 CCD相机可以将流动池表面上的模板位置作图。然后切割并洗掉模板荧光标记。通过引入 DNA聚合酶和荧光标记的核苷酸开始测序反应。寡聚-T核酸作为引物。聚合酶以模板指导的方式向引物中掺入标记的核苷酸。除去聚合酶和未掺入的核苷酸。已经指导荧光标记的核苷酸掺入的模板通过流动池表面成像检测。成像后，切割步骤除去荧光标记，使用其它的荧光标记的核苷酸重复该过程，直到达到希望的阅读长度。在每个核苷酸添加步骤收集序列信息。2. 454 测序本发明的方法中可以使用的DNA测序技术的另一个实例是妨4测序(Roche) (Margulies，M等人· 2005，Nature，437，376-380)。妨4测序包括两个步骤。在第一步中， DNA被剪切为大约300-800个碱基对的片段，将这些片段平端化。然后将寡核苷酸衔接子连接到这些片段的末端。衔接子作为片段扩增和测序的引物。这些片段可以使用例如含有 5’_生物素标签的衔接子B连接到DNA捕获珠例如链霉亲和素包被的珠上。在油-水乳液的小滴内PCR扩增附着到珠上的片段。结果是在每个珠上克隆扩增的DNA片段的多个拷贝。 在第二步中，珠捕获在孔中(皮升大小)。对每个DNA片段平行进行焦磷酸测序。添加一个或多个核苷酸产生光信号，光信号被测序仪中的CCD相机记录。信号强度与掺入的核苷酸数成比例。焦磷酸测序利用在核苷酸添加后释放的焦磷酸(PPi)。PPi在腺苷5’磷酸硫酸的存在下被ATP硫酸化酶转化为ATP。萤光素酶利用ATP将萤光素转化为氧萤光素，该反应产生可被检测和分析的光。
3. SOLiD 测序可以在本发明的方法中使用的DNA测序技术的另一个实例是SOLiD技术(Applied Biosystems)。在SOLiD测序中，基因组DNA被剪切为片段，衔接子连接到该片段的5，和3， 端，产生片段文库。或者，可以如下引入内部衔接子将衔接子连接到片段的5’和3’端，环化该片段，消化环化的片段，以产生内部衔接子，并将衔接子连接到得到的片段的5’和3’ 端，以产生配对的文库。然后，在含有珠、引物、模板和PCR成分的微反应器中制备克隆珠群体。PCR后，使模板变性，珠富集，以分离珠与延伸的模板。对选择的珠上的模板进行3’修饰，该修饰允许结合到载玻片上。序列可以通过部分随机寡核苷酸的连续杂交和连接来确定，该寡核苷酸具有通过特定荧光团识别的中心确定的碱基(或碱基对)。记录颜色后，切割并除去连接的寡核苷酸，然后重复该过程。4. SOLEXA 测序能够在本发明的方法中使用的测序技术的另一个实例是SOLEXA测序 (Illumina)。SOLEXA测序基于使用折回PCR和锚定引物在固体表面上扩增DNA。基因组 DNA被片段化，向片段的5’和3’端添加衔接子。附着到流动池通道表面的DNA片段延伸并桥式扩增。片段变为双链，双链分子变性。在多个固相扩增循环后进行变性可在流动池的每个通道中产生相同模板的大约1，000个拷贝的单链DNA分子的几百万个簇。使用引物、 DNA聚合酶和四种荧光团标记的、可逆终止的核苷酸进行连续测序。核苷酸掺入后，利用激光激发荧光团，并捕捉图像，记录第一个碱基的身份。除去3’终止子和来自每个掺入的碱基的荧光团，重复掺入、检测和鉴别步骤。5. SMRT 测序可以在本发明方法中使用的测序技术的另一个实例包括I^acific Biosciences的单分子实时(SMRT )技术。在SMRT中，四个DNA碱基中的每一个连接到四种不同的荧光染料的一种上。这些染料是磷酸连接的(phosphol inked)。单个DNA聚合酶用模板单链DNA 单分子在零模式波导(ZMW)底部固定。ZMW是一种限制结构，它使得能够相对于快速扩散到 SMW之内和之外(微秒)的荧光核苷酸背景观察DNA聚合酶引起的单核苷酸掺入。核苷酸掺入正在延伸的链中需要几毫秒的时间。在该时间中，激发荧光标记，产生荧光信号，并切去荧光标签。染料的相应荧光的检测表明掺入了哪个碱基。重复该过程。6.纳米孔(Nanopore)测序可以在本发明方法中使用的测序技术的另一个实例是纳米孔测序(Soni GV和 Meller A. (2007)Clin Chem 53:1996-2001)。纳米孔是直径数量级为1纳米的小孔。纳米孔浸没在导电流体中并在其上施加电势导致由于离子通过纳米孔传导引起轻微的电流。电流量对纳米孔的大小敏感。当DNA分子通过纳米孔时，DNA分子上的每个核苷酸不同程度地阻塞了纳米孔。因此，当DNA分子通过纳米孔时通过纳米孔的电流的变化代表了 DNA序列的读取。7.化学敏感的场效应晶体管阵列测序可以在本发明方法中使用的测序技术的另一个实例涉及对序列DNA使用化学敏感的场效应晶体管(chemFET)阵列(例如，如美国专利申请公布No. 20090026082所述)。 在该技术的一个实例中，DNA分子可以置于反应室内，模板分子可以与结合到聚合酶的测序引物杂交。一个或多个三磷酸在测序引物3’端向新核酸链的掺入可以通过chemFET根据电流的变化来检测。阵列可以具有多个chemFET传感器。在另一个实例中，单核酸可以附着到珠上，核酸可以在珠上扩增，各个珠可以转移到chemFET阵列上的各个反应室，每个室具有chemFET传感器，核酸可以被测序。8.使用电子显微镜测序可以在本发明方法中使用的测序技术的另一个实例涉及使用电子显微镜 (Moudrianakis E. N.和 Beer M. . Proc Natl Acad Sci USA. 1965 Mar ；53 :564-71)。在该技术的一个实例中，各个DNA分子用能够用电子显微镜区别的金属标签标记。这些分子然后在扁平表面上拉伸，并使用电子显微镜成像以测量序列。此处所述的测序技术中的任一种都可以在本发明的方法中使用。P. TCR和BCR所有组成成分的测序方法可以读取来源于单分子或来源于单分子扩增的序列。可以在固体表面上或在水/ 油乳液的小区室中平行进行单分子的上百万个独立扩增。待测序的DNA样品可以充分稀释和/或分散，以在每个区室中获得一个分子。这种稀释后可以进行DNA扩增，以生成原DNA 序列的拷贝并产生都具有相同序列的分子“簇”。这些簇然后可以进行测序。一个运行中可以产生几百万个阅读。可以从扩增序列特定链的5’末端开始产生序列，和/或可以从互补序列的5’末端开始产生序列。在优选实施方案中，产生来自链的序列，即，配对末端阅读。原DNA序列中特定序列的普遍存在然后可以通过计数多少簇携带该序列来测量。 原样品中更普遍存在的序列导致含有特定序列的更多区室和更多簇。扩增方案中可以使用一些方法来确保测量的DNA序列的频率匹配原样品中DNA序列的频率。这些方法可包括确保PCR引物浓度足够高，以驱动每个循环中的每个杂交反应至饱和，调节各引物浓度以使不同序列的差异扩增最小化，等等。可以使用算法来确定测序仪产生的哪些序列来源于DNA序列。单独测定的序列 (阅读)可以彼此补充，含有通过扩增和/或通过测序引入的错误。可以使用算法将阅读组合在一起，以更精确地确定起始材料中DNA序列的频率。从包含DNA或RNA的血液样品原始扩增的IgH和/或TCRi^可以获得百万个或更多的测序阅读。特定IgH或TCRii序列的阅读数与血液样品中特定克隆型的频率有关。因此，可以确定每个克隆型的量。如果特定患者的致病克隆型已知，它们的水平可以通过这种测序方法精确地确定。在本发明的某些实施方案中，提取DNA分子集合，包括来自一个或多个受试者免疫细胞TCR和BCR区的基因组DNA或逆转录的RNA的代表，任选地以一种方式扩增，使得每个分子可以使用一个或多个上述测序技术测序，以能够检测受试者中序列的存在和频率。可以对免疫球蛋白或T细胞受体基因的不同区域进行测序。在一些实施方案中， 可以对可变区的完整序列进行测序，以鉴别和量化克隆型。可以对完全克隆序列的独特亚群测序。在一些实施方案中，对包含VD和DJ连接的核苷酸测序，以独特地鉴别和量化克隆型。在其它实施方案中，可以被测序的片段是完整可变区。在另一实施方案中，对抗原识别区或互补决定区3(CDR3)测序。可以扩增含有完整⑶R3或完整可变区的片段，以允许对含有V、D和J区段的部分的⑶R3测序。扩增产物上的一个或多个标签可以用于对免疫球蛋白或T细胞受体基因测序。一个或多个与标签退火的引物可以用于测序反应中。扩增的分子的不同部分可以在单独的反应中测序，测序结果可以拼凑在一起，以产生该分子的部分或完整序列。在一个实施方案中，只扩增和测序⑶R3。⑶R3的扩增和测序可以使用对于一个或多个V区段序列特异性的引物(以及C区段中扩增子的另一侧上的一个或多个引物)完成。用于每个V区段的引物可以在一个或多个扩增反应中使用，导致序列的所有组成成分扩增。序列的所有组成成分然后可以混合并在扩增或不扩增的情况下进行分离，并使用所述的任何测序技术测序。当在分开的管中使用各种V引物进行扩增时，由于PCR饱和，携带不同V区段的分子数可以被“标准化”。例如，如果一个特定V区段具有一次或几次克隆扩增，导致其代表多于其它区段，该信息可以被删除或减少，因为对于每个区段的PCR反应可能趋向饱和或接近饱和。实时PCR可以用来量化各V区段存在多少。可以对全长⑶R3测序，或者可以对序列CDR3的一部分测序。在一个实施方案中，只分析克隆型的亚群。这可以通过使用对克隆型亚群特异性的引物例如V区段特异性引物扩增来完成。独特的克隆型可以通过利用提供完全连接性的长连续阅读测序来鉴别。在一些实施方案中，当存在几个感兴趣的序列时，仅在一个连接上的短阅读长度长度能够产生简并标签，它们对于特定克隆型是独特的，但是在多个克隆型之间共有。例如跨过ν/J连接的测序可以将具有相同V/J的所有序列合计为一个克隆型， 而与D区段无关。关于所有区段的全部连接性的信息允许区别例如可能具有相同的V和J 区段但是连接到不同D区段上的序列。当只存在V和D(例如，抗体的轻链或TCR的α亚基)时可以进行相同的分析。 TCR和BCR的全部多样性结合入这两个亚基。然而，可以对两个亚基的序列进行分析。当产生克隆型谱时可以考虑测序和/或扩增产生的错误。例如，参见实施例5。可以从DNA或RNA进行初始扩增(例如，在转化为cDNA后)。II.石角定湘关克降型、疾病丨舌云M牛得分的方法禾Π用于石角定并一个或两个的算法Α.相关与非相关克隆型T和B细胞受体序列的大量组成成分对于发现与特定人类健康结果相关的个体细胞发出了挑战。在许多情况下，有意义的克隆型的序列对于所研究的个体是独特的。本发明的方法提供用于区别a)相关克隆型(可以是其水平与疾病相关的克隆型)和b)非相关克隆型(可以是其水平与疾病无关的克隆型)的手段。在一个实施方案中，相关克隆型可以显示与疾病正相关或负相关。在另一实施方案中，在疾病的高峰状态存在但是在疾病的非高峰状态不存在的克隆型可以是相关克隆型(与疾病正相关)。在另一实施方案中，在疾病的高峰状态(或阶段)比在疾病非高峰状态更丰富的克隆型(即，以较高分子水平存在)可以是相关克隆型(与疾病正相关)。在另一实施方案中，在疾病的高峰状态不存在但是在疾病的非高峰状态存在的克隆型可以是相关克隆型(与疾病负相关)。在另一实施方案中，在疾病的高峰状态比在疾病的非高峰状态更少的克隆型可以是相关克隆型(与疾病负相关)。在另一实施方案中，个体的相关克隆型通过算法确定。B.准i式验不#用群体研穷.发现才目关禾Π非才目关克降型在本发明的该实施方案中，通过观察某些样品中存在的与疾病状态相关的克隆型来鉴别相关克隆型(例如，参见图14)。这种状态可以是来自疾病高峰状态时的样品的血液(例如来自急性发作期的MS或狼疮患者的血液样品)，或是假定富含与个体疾病相关的T和B细胞的受影响的组织。这些组织的例子可以是具有肾脏炎症的狼疮患者的肾活检组织、发作期MS患者的CSF、类风湿性关节炎患者的滑液、或癌症患者的肿瘤样品。在所有这些实例中，组织可能将含有与疾病有关的相关T和B细胞(虽然不一定是致病因素)。值得注意的是，如果利用该方法鉴别与疾病相关的克隆型，它们将只与检测其样品的个体相关。 结果，将需要特定校准试验，以使用该方法鉴别任何患有疾病的特定个体中的相关克隆型。在一个实施方案中，提供了确定受试者中的一个或多个相关克隆型的方法。该方法可以包括以下步骤a)通过对来自受试者的至少一个样品的空间上分离的个体分子进行核酸测序，产生一个或多个克隆型谱，其中所述至少一个样品与疾病的第一状态有关，和 b)基于所述一个或多个克隆型谱确定受试者中的一个或多个相关克隆型。在一个实施方案中，至少一个样品来自于受疾病影响的组织。在另一实施方案中， 所述确定一个或多个相关克隆型包括比较来自至少两个样品的克隆型谱。在另一实施方案中，疾病的第一状态是疾病的高峰状态。在另一实施方案中，一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时存在。在另一实施方案中，一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时不存在。在另一实施方案中，一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时高。在另一实施方案中，一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时低。在另一实施方案中，样品包含T细胞和 /或B细胞。在另一实施方案中，T细胞和/或B细胞包含T细胞和/或B细胞的亚群。在另一实施方案中，T细胞和/或B细胞的亚群通过与标志物相互作用来富集。在另一实施方案中，所述标志物是位于T细胞和/或B细胞亚群上的细胞表面标志物。在另一实施方案中，T细胞和/或B细胞亚群与疾病中特异性存在的抗原相互作用。在一个实施方案中，所述疾病是自身免疫病。在另一实施方案中，所述自身免疫病是系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎或强直性脊柱炎。C. #用群体研穷.发现力目关禾Π非相关克降型在一个实施方案中，提供了一种使用群体研究鉴别相关克隆型的方法(例如，参见图15)。群体研究的应用在于允许归纳关于具有已知疾病状态后果的个体中已经确定的相关克隆型的具体信息，以允许在将来所有受试者中鉴别这些相关克隆型，而不需要校准试验。可以利用对特定一组相关克隆型的了解来提取关于在将来的受试者中关联的克隆型的相似属性(参数)的规则。在一个实施方案中，本发明包括以下方法，该方法包括在样品的研究中对免疫细胞的所有组成成分进行测序来鉴别相关和非相关克隆型，所述样品来自患病患者和任选的健康对照，来自不同时间，在疾病患者的情况下来自通过临床数据表征的疾病过程的不同的(和已知的)状态。所述疾病可以是，例如，自身免疫病。其水平与这些不同状态的疾病的量度相关的克隆型可以用来开发一种算法，该算法能够预测与疾病相关的一大组序列的身份，在所有个体中这些克隆型不同于与疾病无关的克隆型。不同于校准试验的情况，相关序列不需要存在于发现研究中，而是可以基于这些序列预测。例如，相关序列可以是TCR基因DNA序列，其与在发现研究中鉴别的克隆型的DNA序列编码相同的氨基酸序列。此外，可以预测一个或多个相关克隆型的算法可以用来鉴别来自任何个体的样品中的克隆型，并且对于特定个体绝不是独特的，从而允许在新的样品中预测相关克隆型，而不需要事先知道该个体中存在的克隆型。在一个方面，提供一种开发预测患病受试者的任何样品中一个或多个相关克隆型的算法的方法，包括a)从一组样品产生多个克隆型谱，其中该样品与疾病相关，b)从一组样品鉴别一个或多个相关克隆型，C)利用b)中鉴别的一个或多个相关克隆型的序列参数和/或功能数据开发能够预测来自患病受试者的任何样品中的相关克隆型的算法。在一个实施方案中，这组样品采自一个或多个受疾病影响的组织。在另一实施方案中，鉴别一个或多个相关克隆型包括比较来自至少两个样品的克隆型谱。在另一实施方案中，功能数据包括T细胞和/或B细胞中的标志物的结合能力或T 细胞或B细胞与抗原的相互作用。在另一实施方案中，所述序列参数包含核酸序列和预测的氨基酸序列。在另一实施方案中，样品来自一个或多个处于疾病高峰阶段的个体。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型存在于疾病的高峰状态。在另一实施方案中，所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态处于高水平。在另一实施方案中，一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态处于低水平。在另一实施方案中，一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态不存在。在一个实施方案中，所述疾病是自身免疫病。在另一实施方案中，所述身免疫病是系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎或强直性脊柱炎。在另一方面，提供了一种发现个体的一个或多个相关克隆型的方法，包括a)将来自个体样品的克隆型谱输入到一个算法中，和b)使用该算法确定个体的一个或多个相关克隆型。该算法可以是通过以下方法开发的算法a)从一组样品产生多个克隆型谱，其中所述样品与疾病相关，b)从这组样品鉴别一个或多个相关克隆型，和C)利用b)中鉴别的一个或多个相关克隆型的序列参数和/或功能数据开发能够预测来自患病受试者的任何样品中的相关克隆型的算法。在本发明的一个实施方案中，使用校准试验结合群体研究鉴别相关克隆型(例如，参见图17)。在该实施方案中，群体研究不产生允许预测任何样品中的克隆型的算法，而是可以开发一种算法来预测来自其特定校准克隆型谱已经产生的受试者的任何样品中的相关克隆型(例如，参见图16)。一个实例是开发一种算法，该算法将基于从任何疾病阶段的血液样品测定的克隆型谱预测狼疮患者的相关克隆型，其首先在临床发作期进行血液检验，用来校准该算法。在该实施方案中，本发明包括通过在样品研究中对免疫细胞的所有组成成分进行测序来鉴别相关和非相关克隆型的方法，所述样品来自患病患者和任选的健康对照，来自不同时间，在患病患者的情况下来自以临床数据表征的疾病过程的不同的(和已知的)状态。在第一状态与第二状态时以不同频率(或水平)发现的克隆型然后用于开发一种算法，该算法预测在第一疾病状态下每个个体的所有组成成分中发现的哪些序列与每个个体中的后一疾病状态相关，它们不同于该个体中与疾病无关的序列。不同于单独的校准试验的情况，相关序列可以是发现在疾病状态之间不同的所有序列的亚群。也可能相关克隆型在校准样品中未发现，但是如果它们在未来的样品中出现，则基于该算法预测其相关。作为一个例子，与校准样品中发现的克隆型编码相同的氨基酸序列的克隆型可以基于群体研究得到的算法预测是相关克隆型。不同于以前的实施方案，开发该算法是为了基于校准克隆型谱预测相关克隆型，该校准克隆型谱是个体中产生的克隆型谱，将对于该个体预测该相关克隆型中哪个处于疾病的特定状态。在该实施方案中，该算法不能用于产生特定个体中的相关克隆型，直到已经检测特定校准克隆型谱。在特定受试者中检测该校准谱之后，可以基于该个体中克隆型谱的检测预测所有后续相关克隆型。在另一方面，提供了一种发现个体的一个或多个相关克隆型的方法，该方法包括 a)将个体样品的克隆型谱输入一个算法中，和b)利用该算法确定个体的一个或多个相关克隆型。该算法可以是通过以下方法开发的算法a)从一组样品产生多个克隆型谱，其中所述样品与疾病相关，b)从这组样品鉴别一个或多个相关克隆型，和c)利用b)中鉴别的一个或多个相关克隆型的序列参数和/或功能数据开发能够预测来自患病受试者的任何样品中的相关克隆型的算法。在一个实施方案中，样品在疾病的高峰状态采集。在另一实施方案中，样品采自受疾病影响的组织。E.可以用来予页测丨相关克降型的序歹Il相关的参数为了进行群体研究，可以使用训练组通过检测能够区分相关克隆型与不相关克隆型的各个参数理解相关克隆型的特征。这些参数包括使用的序列或特定V、D和J区段。在一个实施方案中，已知特定V区段更可能与某些疾病相关，如果特定疾病的克隆型可能识别相关表位并因此可能具有序列相似性通常是这样。进一步的实施方案中包括的其它参数包括鉴别的体细胞超突变的程度和处于发作高峰时的克隆型水平及其在疾病相对不活动时的水平。可以预测相关克隆型的其它参数包括但不限于1)包括V或J区、组合VJ、DJ 区中的短序列的序列基序；2)克隆型的序列长度；3)克隆型水平，包括绝对水平(每百万个分子的克隆数)或等级水平；4)与其它克隆型的氨基酸和核酸序列相似性其它高度相关克隆型的频率，包括具有沉默变化的那些(编码相同氨基酸的核苷酸差异)或具有保守氨基酸变化的那些；5)对于BCR，克隆型中的体细胞突变水平和/或由于体细胞突变而与一些种系克隆型不同的独特克隆型的数目；6)其相关蛋白具有类似的三维结构的克隆型。进一步的实施方案将利用功能数据来帮助鉴别相关克隆型。例如，含有某些在含有相关克隆型的细胞中富含的标志物的T细胞和/或B细胞可以通过如FACS或MACS的标准方法捕获。在另一实施方案中，标志物是细胞表面标志物。在另一实施方案中，T细胞和 /或B细胞对与病理学或受影响组织有关的抗原的反应性将是克隆型的病理相关性的良好的证据。在另一实施方案中，可以合成候选克隆型的序列，并置于完整TCR或BCR的背景中，评价相关反应性。或者，不同序列的扩增的片段可以用作噬菌体、核糖体或RNA展示技术的输入。可以为具有相关反应性的序列选择这些技术。选择之前和之后的测序结果的比较可以鉴别那些具有反应性、因此可能是病理性的克隆。在另一实施方案中，特定展示技术 (例如噬菌体、核糖体或RNA展示)可以以阵列形式使用。携带来自TCR或BCR的个体序列(例如⑶R3序列)的个体分子(或这些个体分子的扩增)可以排列为噬菌体、核糖体或 RNA。然后可以研究特定抗原，以确定编码结合它们的肽的序列。结合与疾病相关的抗原的肽可能是病理性的。G.产生免疫负荷算法可以利用算法计算免疫负荷(例如，参见图18)。免疫负荷可以用来作出临床决定。使用实验获得(例如，包含来自第一疾病状态的受试者的样品和来自第二疾病状态的受试者的样品的实验)的数据，可以开发将关于相关和非相关克隆型水平的信息组合为一个得分(免疫负荷)的算法。然后可以调节该算法的参数，以将免疫负荷和临床数据之间的相关性最大化。例如，临床数据可以是疾病严重程度的临床量度(例如，多发性硬化患者的MRI的病变程度)。产生免疫负荷算法中使用的相关克隆型可以利用如上所述的校准试验、群体研究或校准试验和群体研究产生。可以与相关克隆型结合考虑的一些因素有相关克隆型的数目、它们的水平、它们的变化率(速率)和速度的变化率(加速度)。将要评价的其它因素包括发作高峰和不活动的疾病状态时的克隆型水平。在一个实施方案中，产生的免疫负荷与自身免疫病有关。这种负荷可以被称为自身免疫负荷(Autolmm Load)。在一个方面，提供了一种产生计算疾病活动性得分的算法的方法，包括a)开发一种算法，该算法使用一组因素将相关克隆型水平组合为疾病活动性得分，b)比较疾病活动性得分与关于疾病状态的临床数据，和c)优化这些因素，以将临床数据与疾病活动性得分之间的相关性最大化。H.使用负荷算法监测疾病1.不使用校准试验监测疾病在本发明的一个实施方案中，使用群体研究确定克隆型和免疫负荷算法(例如， 参见图19)。免疫负荷可以直接使用，而不需首先校准个体患者。该试验可以在患者处于任何疾病状态时进行。该试验可以用来基于以上开发的算法产生特定相关和非相关克隆型。 然后可以使用群体研究中产生的第二算法计算免疫负荷。该得分然后可以在临床上使用。在另一方面，提供了一种监测个体的疾病状态的方法，包括a)从受试者的样品确定克隆型谱，b)将a)获得的克隆型谱信息输入一种算法，和c)使用该算法产生可预测个体的疾病状态的得分。该算法可以是通过以下方法产生的算法a)开发一种算法，该算法使用一组因素将相关克隆型水平组合为疾病活动性得分，b)比较疾病活动性得分与关于疾病状态的临床数据，和c)优化这些因素，以使临床数据与疾病活动性得分之间的相关性最大化。2.使用校准试验监测疾病在本发明的一个实施方案中，使用校准试验或校准试验和群体研究确定相关克隆型和免疫负荷算法(例如，参见图20)。免疫负荷可以在诊所使用，首先进行校准试验。该试验可以在患者处于类似于产生免疫负荷算法中使用的相关和非相关克隆型的研究中使用的第一状态的状态时进行。例如，该状态可以是自身免疫病的发作状态，如果这是免疫负荷算法如何产生的。该校准试验然后可以用来产生将在后续疾病监测试验中使用的特定相关和非相关克隆型。在治疗该患者的稍后时间点，对患者进行另一个试验，并且可以使用发现研究中产生的算法和该患者的特定校准试验中产生的克隆型水平的列表计算免疫负荷。 该免疫负荷得分然后可以在临床上使用。在另一方面，提供了一种监测个体的疾病状态的方法，包括a)从受试者的样品确定克隆型谱，b)将a)获得的克隆型谱信息输入一种算法，和c)使用该算法产生可预测个体的疾病状态的得分。该算法可以是通过以下方法产生的算法a)开发一种算法，该算法使用一组因素将相关克隆型水平组合为疾病活动性得分，b)比较疾病活动性得分与关于疾病状态的临床数据，和C)优化这些因素，以使临床数据与疾病活动性得分之间的相关性最大化。在另一实施方案中，该方法还可包括通过本发明的任何方法确定个体中的一个或多个相关克隆型，和将一个或多个相关克隆型的信息输入该算法中。在一个实施方案中，所述疾病是自身免疫病。在另一实施方案中，所述自身免疫病是系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎或强直性脊柱炎。3.站斿储舰捕白姐P贿对于不同的患者，相同的免疫负荷可能意味着不同的含义。举例来说，需要考虑患者的全部临床现象。从检验角度，在作出临床决定时除免疫负荷水平以外还可以考虑速率 (免疫负荷随时间的变化率)和加速度(速率随时间的变化率)。例如，如果自身免疫负荷得分升高(高速率)，则可以预测自身免疫病的初期发作。可以集成到负荷得分例如自身免疫负荷得分中的其它检验包括，例如，红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)水平、抗-ds DNA、其它自身抗体滴度、补体水平、尿蛋白水平、尿蛋白/肌酸酐比值、肌酸酐水平、血尿素氮(BUN)水平、血小板水平、WBC计数、血细胞比容(Hct)、Hb、尿分析结果。可以集成的与SLE相关的其它检验包括，例如，CD27水平、 CD27++ 细胞水平、INF-反应性基因(Baechler，EC 等人.Q003)Proc. Natl. Acad. Sci. 100 2610-2615)和趋化因子得分(Bauer JW 等人.Q009) Arthritis Rheum. 60 :3098-3107)。 与狼疮无关的其它检验包括，例如，促甲状腺激素(TSH)检验、三碘甲腺原氨酸CH)检验、 甲状腺素(T4)检验、肝功能试验(LFT)、其它自身抗体、钙网蛋白检验、乳铁蛋白检验和滑液分析。其它检验可以包括成像试验，包括，例如，MRI, CT-扫描、X-射线和超声。III.确定疾病状态因为免疫系统是人类健康的中心，检测免疫应答的能力在医学中具有广泛应用。 本发明教导了使用免疫系统理解当被免疫系统介导时的基础疾病状态的能力。这允许一组非常有效的诊断和预后应用，这些应用使用免疫谱提示多种临床后果的风险，并且允许医生更有效地干预。A.t^^m^^mmm本发明的方法可以用来诊断和治疗受试者的自身免疫病。自身免疫病涉及逃脱提供自身免疫性的普通过程和攻击身体组织某些靶标的适应性免疫细胞。自身免疫病包括， 例如，急性播散性脑脊髓炎、阿狄森病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、贝赛特病、大疱性类天疱疮、乳糜泻、美洲锥虫病、慢性阻塞性肺疾病、皮肌炎、1型糖尿病、肺出血肾炎综合征、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、化脓性汗腺炎、特发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎，多发性硬化、重症肌无力、神经性肌强直、寻常型天疱疮、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬变、类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征和脉管炎综合征。这些自身免疫病的阶段可以用本发明的方法诊断。可以根据自身免疫病的阶段建议对受试者的治疗。关于患有自身免疫病或怀疑患有自身免疫病的受试者的临床信息可以用来确定疾病状态(或自身免疫负荷)。临床信息可以用来鉴别与疾病状态相关的克隆型谱的模式。 临床信息可以包括，例如，身高、体重、虹膜色、年龄、性别、种族、血压、LDL胆固醇水平、HDL 胆固醇水平、家族史和分子标志物信息。临床信息可以包括一个或多个自身免疫的症状。对于自身免疫性肝炎，症状可以包括疲劳、肝大、黄疸、瘙痒、皮疹、关节痛、腹部不适、蜘蛛痣、恶心、呕吐、食欲减退、黑尿、 大便苍白或灰色。对于皮肌炎(DM)，症状可以包括疹(面、颈、肩、胸上部、肘、膝、指关节和后背上的斑驳的、蓝紫色的变色)伴随的或以前的肌无力、吞咽困难、肌痛、疲劳、体重减轻和低热。对于格雷夫斯病，症状可以包括能量消耗引起的体重减轻、食欲增加、心率和血压和震颤、神经质和出汗。对于桥本甲状腺炎，症状可以包括精神和身体上的迟缓、对冷的较高敏感性、体重增加、皮肤粗糙、甲状腺肿。对于混合性结缔组织病(MCTD)，症状可以包括系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病和硬皮病的特征。对于大疱性类天疱疮(BP)，症状可以包括轻度的搔痒性风团到严重水疱和感染、口或食道大疱。对于天疱疮，症状可以包括皮肤和粘膜起疱。对于恶性贫血，症状可以包括呼吸短促、疲劳、苍白、心动过速、食欲不振、腹泻、手足发麻和麻木、口疮和不稳定步态。对于多肌炎(PM)，症状可以包括肌无力、吞咽困难和肌痛。对于原发性胆汁性肝硬变(PBC)，症状可以包括疲劳和瘙痒。对于硬皮病(系统性硬化病)、症状可以包括手指和手肿胀和浮肿、皮肤增厚、手指上的皮肤溃疡、手部关节强直、疼痛、咽喉痛和腹泻。对于舍格伦综合征，症状可以包括眼口干燥、血管性甲状腺肿、吞咽或说话困难、不正常的味觉或嗅觉、口渴和舌溃疡。对于系统性红斑狼疮(SLE))，症状可以包括发热、体重减轻、脱发、口鼻疮、不适、疲劳、精神病发作和症状、类似于RA的关节炎症、鼻和颊上的蝶形皮疹、手足对冷的极度敏感。对于脉管炎综合征，例如，韦格纳肉芽肿、特发性新月体性肾小球肾炎(ICGN)、显微多动脉炎(MPA)、肺-肾综合征(PRS)，症状可以包括疲劳、 虚弱、发热、关节痛、腹痛、肾脏问题和神经系统问题。临床信息可以来自于一个或多个时间点的一个或多个受试者。临床信息可以包括关于自身免疫病患者对该患者接受的一个或多个治疗的应答的信息。以下对具体自身免疫病讨论了自身免疫负荷的临床应用。本发明的另一实施方案涉及免疫谱分析试验与其它已经用于检测这些疾病的疾病活动性的标志物的组合，以使试验具有更高的灵敏度和特异性。其它分子标识物或标志物可以用于计算负荷算法或用于确定疾病状态。分子标识物可以包括核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质，核酸或蛋白质的表达谱。分子标识物可以是人或非人来源的(例如，细菌)。标识物或标志物可以通过包括以下的技术确定，例如，比较基因组杂交(CGH)、染色体微阵列分析(CMA)、表达谱分析、 DNA微阵列、高密度寡核苷酸微阵列、全基因组RNA表达阵列、肽微阵列、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、基因组测序、拷贝数(CNV)分析、小核苷酸多态性(SNP)分析、免疫组织化学、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、PCR、Western印迹分析、Southern印迹分析、SDS-PAGE、凝胶电泳和Northern印迹分析。对于系统性红斑狼疮，标志物可以包括红细胞沉降率(ESR)水平、C反应蛋白 (CRP)水平、抗-ds DNA、其它自身抗体滴度、补体水平、尿蛋白水平、尿蛋白/肌酸酐比值、 肌酸酐水平、血尿素氮(BUN)水平、血小板水平、WBC计数、血细胞比容(Hct)、Hb和尿分析结果。可以集成的例如与SLE有关的其它检验包括，例如，CD27水平、CD27++细胞水平、 INF-反应性基因和趋化因子得分。1.系统性红斑狼疮(SLE)本发明的方法可以用来确定系统性红斑狼疮(SLE或狼疮)的状态或阶段。SLE是严重的自身免疫病，通常影响年轻成人(大多为女性)。其特征在于可能影响许多器官的炎性过程，包括皮肤、关节、肾、肺、心脏和中枢神经系统，导致频繁的失能和有时死亡。该疾病遵循非常不可预测的过程，其标志为发作期后的缓解静止期。然而，被诊断为SLE的患者由风湿科医生定期观察，并用多种正式药物治疗。这些药物包括胆固醇如泼尼松和其它免疫抑制剂，如Cellc印t (骁悉)(吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil))。这些药物可以减轻器官损伤，但是它们具有明显的副作用，包括感染和不育的风险。一些症状的不可靠性 (例如，疼痛和疲劳)和不可预测的疾病过程使得调整用药剂量变得困难，导致一些患者的过度治疗和另一些患者的治疗不足。结果，SLE的治疗对医生提出了明显的治疗挑战。有大量标准方法可供临床医生使用，以评价SLE的活动性。疾病状态可以通过观察疾病的临床症状来测量。这些方法包括评价体征(例如，皮疹)和症状(例如，关节痛和疲劳)以及实验室结果(例如，尿蛋白/肌酸酐比、抗-ds DNA抗体和血细胞计数)。然而，这些临床标志可能是疾病状态的滞后的指标，这些患者可能只在治疗数周或数月后应答。此外，在一些情况中，症状可能难以精确评价(例如，疼痛和疲劳)。其它炎症标志，例如抗-ds DNA抗体、补体水平(例如，C3)、C反应蛋白(CRP)和红细胞沉降率(ESR)通常缺乏特异性和/或灵敏性。侵入性方法如肾活检对于常规使用来说不实用。结果临床医生对其患者进行非常频繁的检验，不需对疾病状态有完全的测量。临床症状和实验室评价集成在如系统性红斑狼疮疾病活动性指数(SLEDAI)和医生总体评价(PGA)的测量中。这些测量在临床实践中不常规进行，在几个临床情况中通常不足。自身免疫负荷在对SLE进行治疗性干预中的应用的具体实例在实施例部分更详细地讨论，同时有确定自身免疫负荷的具体研究。2.多发件硬化(MS)本发明的方法也可以用来确定多发性硬化(MS)的状态或阶段。MS是影响脑和脊髓(中枢神经系统)的自身免疫病。其症状不同，因为每个攻击的位置和严重程度可能不同。发作可能持续数天、数周或数月。这些发作与症状减轻或无症状期(缓解)交替。该疾病通常复原(复发)。但是，该疾病可能继续恶化，而没有缓解期。因为脑或脊髓任何部分中的神经可能被损伤，多发性硬化患者可能在身体的许多部位具有症状。肌肉症状包括，例如，平衡缺失、麻木或许多区域的感觉异常、肌肉痉挛引起的疼痛、臂或腿的疼痛、运动臂或腿的问题、步行问题、协调和进行小移动的问题、言语急促不清或难以理解、一条或多条臂或腿的震颤、不受控制的肌肉群痉挛(肌痉挛状态)和一条或多条臂或腿的虚弱。眼症状包括，例如，复视、眼不适、不受控制的眼快速运动和视力丧失(在一个时间通常影响一只眼)。其它脑和神经症状包括，例如，注意广度缩小、判断力下降、记忆减退、抑郁或沮丧感、头晕和平衡问题、面部疼痛、听觉丧失和疲劳。肠和膀胱症状包括，例如，便秘、排尿开始困难、尿频、大便泄漏、强排尿冲动和尿泄漏(失禁)。现在还没有已知的多发性硬化的治愈。但是，有一些疗法可以延缓该疾病。治疗的目的是控制症状和帮助患者维持正常的生活质量。用来延缓多发性硬化进展的药物包括，例如，帮助控制免疫系统的免疫调节剂，包括干扰素(Avonex，Betaseron或Rebif)、单克隆抗体(Tysabri)、格拉默醋酸盐(glatiramer acetate) (Copaxone)、米托蒽醌(Novantrone)、米托蒽醌、硫唑嘌呤 (Imuran)、环磷酰胺(Cytoxan)和那他珠单抗(Tysabri)。类固醇类可以用来降低攻击的严
重程度。控制症状的药物可包括，例如，减轻肌肉痉挛的药物如力奥来素(Baclofen)、替扎尼定(Zanaflex)或苯二氮杂￥，减少泌尿问题的胆碱能药物，用于心情和行为症状的抗抑郁药，和用于疲劳的金刚烷胺。MS影响女性超过男性。该疾病最常在20到40岁之间开始，但是在任何年龄可见。 MS由髓鞘的损伤引起，髓鞘是围绕神经细胞的保护套。当该神经套受损时，神经冲动减慢或停止。MS是一种进行性疾病，意味着神经损伤(神经变性)随时间变得恶化。MS多快恶化因人而异。神经损伤由炎症引起。炎症在自身的免疫细胞攻击神经系统时发生。炎症的反复发作可以沿脑和脊髓任何区域发生。研究人员没有确定是什么引发了炎症。最常见的理论指向病毒或遗传缺陷，或者两者的组合。MS在北欧、北美、南澳大利亚和新西兰(New Zeal)比在其它地区更可能发生，地理学研究表明可能涉及环境因素。具有MS家族史的人和生活在较高发病率地理区域的人具有较高的患病风险。MS的症状可能模拟许多其它神经系统疾病的症状。该疾病的诊断是通过排除其它疾病进行的。被称为复发缓解型(relapsing-remitting)的MS形式的患者可能具有至少两次攻击的历史，这两次攻击间为一段缓解或无症状期。如果中枢神经系统的两个不同部分的功能(如异常反射)在不同时间降低，医疗保健提供者可能怀疑MS。神经学检查可显示在身体一个区域降低的或在身体许多部分扩散的神经功能。诊断多发性硬化的试验包括，例如，脑脊液检验，包括CSF寡克隆带分析、头部MRI 扫描、腰椎穿刺术(脊髓穿刺)、神经功能研究(诱发电位试验)和脊柱MRI。象其它自身免疫病一样，MS遵循不可预测的病程，具有急性发作和缓解期。有越来越多的治疗，每一个都具有从严重(体重增加和抑郁)到危及生命(全血细胞减少症和 PML感染)的副作用、在不同患者中可变的有效性和高成本。同时，MS疾病活动性缺乏高度精确的和特异性的常规检测使得有效施用治疗的挑战变得复杂。临床发作可以由长时间期限(在早期疾病中最多数年)隔开，甚至没有治疗。另外，可以应用的药物治疗降低了复发的可能性，但是没有完全预防。因此，疾病活动性难以评价，因此没有足够的疾病活动性短期检测用来通过测量复发的次数或严重程度检测特定治疗在特定患者中是否显示效力。仅有的可用于监测疾病活动性的其它试验是借助造影增强剂和钆显示的跟踪病变状态的脑 MRL·然而，这种成像只是提供了脑部损伤的综合检查，缺乏特异性和时间分辨率。试图在短于一年的时间尺度上使用MRI成像追踪病程是不实际的，这是由于成本、缺乏特异性和过度造影剂暴露的危险。结果，患者通常以高成本长时间治疗，没有任何有效的反馈能使医生改变给药和/或增加治疗的转换。3.类风湿性关节炎(RA)这些方法可以用来检测类风湿性关节炎患者的疾病状态。类风湿性关节炎(RA)
是一种慢性的、全身性的炎性疾病，它可以影响许多组织和器官，但是主要攻击关节，导致
炎性滑膜炎，炎性滑膜炎通常进展为关节软骨破坏和关节强直。类风湿性关节炎也可以产
生肺、心包、侧甲和巩膜的弥散性炎症，也导致结节性病变，最常发生在皮肤下的皮下组织。
尽管类风湿性关节炎的原因未知，但是自身免疫在慢性和进展中起关键作用。
世界上大约的人口受到类风湿性关节炎的困扰，女性三倍于男性。发病在40 和50岁之间最常见，但是任何年龄的人都可能患病。它可能是失能性的和疼痛的疾病，可能导致机能和运动性大大受损。RA主要根据症状和体重诊断，但是也可以通过血液检验 (特别是被称为类风湿因子的检验)和X射线诊断。诊断和长期控制一般由擅长于关节和结缔组织疾病的风湿科医生进行。可以使用各种治疗。非药物治疗包括物理治疗、矫形器和职业疗法。镇痛(止痛药)和消炎药，包括类固醇类，可以用来抑制症状，而疾病改善抗风湿药(DMARD)可以用来抑制或中止免疫过程和预防长期损伤。最近，新的生物制品组增加了治疗选项。当临床上怀疑RA时，可以进行免疫学研究，如检测类风湿因子(RF，一种特异性抗体)的存在。阴性RF不排除RA;而关节炎被称为血清阴性的。在大约15%的患者中是这样。在疾病的第一年，类风湿因子更可能是阴性的，某些个体随时间转变为血清阳性的。RF 也见于其它疾病，例如舍格伦综合征，并且见于健康人口的大约10 %中，因此该试验不是非常特异的。由于这种低特异性，已知开发了新的血清学检验，其检测所谓的抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)的存在。象RF—样，这些试验只在所有RA病例中的一部分(67%)中是阳性的， 但是如果不存在RA则极少阳性，其特异性大约为95%。对于RF，在许多病例中存在ACPA 的证据，甚至在临床疾病开始之前。最常见的ACPA试验是抗-CCP (环瓜氨酸肽)检测和抗MCV试验(抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体)。最近，已经发展了用于早期检测RA的血清学重点照护检验(POCT)。该试验结合了类风湿因子的检测和用于诊断类风湿性关节炎的抗MCV，显示72%的灵敏性99. 7% 的特异性。也可以进行几种其它血液检验来考虑关节炎的其它原因，如全身性红斑狼疮。红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白、全血计数、肾功能、肝酶和其它免疫学试验(例如，抗核抗体 /ANA)全都在此阶段进行。升高的铁蛋白水平可以揭示血色沉着病、模拟RA，或者是斯蒂尔病的体征，该病是一种血清阴性的、通常为青少年的、类风湿的变型。术语疾病改善抗风湿药(DMARD)最初的意思是一种影响生物学指标如ESR和血红蛋白和自身抗体水平的药物，但是现在通常用来指降低骨和软骨损伤率的药物。已经发现 DMARD产生持久的有症状的缓解，并且延迟或中止进展。这是有意义的，因为这样的损伤通常是不可逆的。消炎药和镇痛药改善疼痛和强直，但是不会阻止关节损伤或减缓疾病进展。在风湿科医生之间越来越认为在疾病的极早期阶段发生关节的永久性损伤。过去，经常只使用消炎药开始治疗，并在临床上和使用X射线评价进展。如果有开始发生关节损伤的证据，则开出更强的DMARD。超声和MRI是更灵敏的关节成像方法，并且已经证明关节损伤比以前所认为的更早地在更多患者中发生。X射线检查正常者通常具有通过超声检查能够检测到、X射线检查无法证明的病变。现在的目的是在发生损伤前治疗。关于早期开始DMARD为什么有益于防止结构关节损伤可能有其它原因。从疾病的最早阶段，关节被免疫系统细胞浸润，免疫系统细胞彼此发出信号，这种方式可能涉及多种正反馈回路(长期以来观察到单皮质类固醇注射可能长期消除特定关节的滑膜炎)。用有效的DMARD (如氨甲喋呤)尽可能早地中断该过程在以后数年似乎改善了 RA的后果。症状发生后延迟治疗短至数个月可能导致长期的较差的后果。因此，当患者对治疗响应最强并且收益最大时，在建立早期关节炎的最有效的治疗方面特别有意义。用来治疗关节炎的传统小分子药物包括，例如，化学合成的DMARD 硫唑嘌呤、环孢菌素(环孢菌素A)、D-青霉胺、金盐、羟氯喹、来氟米特、氨甲喋呤(MTX)、米诺环素和柳氮磺吡啶(SSZ)。细胞毒性药物包括环磷酰胺。最常见的不良反应涉及肝脏和骨髓毒性(MTX、SSZ、来氟米特、硫唑嘌呤、金化合物、D-青霉胺)、肾毒性(环孢菌素A、肠胃外金盐、D-青霉胺)、肺炎(MTX)、变应性皮肤反应(金化合物，SSZ)、自身免疫性(D-青霉胺、SSZ、米诺环素)和感染(硫唑嘌呤、环孢菌素 A)。羟氯喹可能导致眼毒性，尽管极为少见，并且因为羟氯喹不影响骨髓或肝脏，它通常被认为是毒性最小的DMARD。遗憾的是，羟氯喹不是非常有效，并且其本身通常不足以控制症状。生物制剂(biologies)可以通过遗传工程生产，包括，例如，肿瘤坏死因子 α (TNF α )阻断剂一依那西普(Enbrel)、英利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、白介素1 (IL-I)阻断剂一阿那白滞素(Kineret)、B细胞单克隆抗体一利妥昔单抗(Rituxan)、 T细胞共刺激阻断剂一阿巴西普(Orencia)、白介素6 (IL-6)阻断剂一托珠单抗(一种抗-IL-6 受体抗体)(RoActemra, Actemra)。抗炎剂包括，例如，糖皮质激素类，非留体抗炎药(NSAID，大多数也用作镇痛药)。 镇痛药包括，例如，局部应用对乙酰氨基酚(在美国和加拿大为醋氨酚)、阿片类、地普喹酮和利多卡因。治疗RA的挑战在于以下事实该疾病是长期慢性疾病，可导致攻击性的失能，对此现有大量治疗，其中每一种都具有明显的缺点。许多DMARD使患者具有明显的副作用，包括严重感染、癌症或甚至自身免疫病的风险升高。此外，生物学来源的药物非常昂贵，并且患者遭受频繁的感染。对患者开始治疗的医生面临许多可能的选择。一旦患者开始治疗就希望得到快速的反馈，以理解患者是否响应在临床表现出现以前选择的该治疗。成像不灵敏，并且昂贵， 许多血液标志物如CRP缺乏足够的灵敏度。使医生能够快速确定疾病状态的检验将使他或她能够将治疗快速调整至更有效的治疗，使患者避免另外的关节损伤，并更有效地使用可以采用的昂贵的治疗。没有经历任何急性发作的患者从开始治疗起实际上可能仍然经历进行性的关节炎性损伤，在临床上没有表现出来。使医生能够区别该状态与背景的试验将允许调整治疗以尝试使患者更接近没有经历进行性关节损伤的状态。在控制MS患者中如何使用自身免疫负荷的具体实例在本文实施例部分进一步详细描述。4.强肓性脊柱炎所述方法可以用来检测强直性脊柱炎的疾病活动性。强直性脊柱炎(AS，来自希腊语ankylos，弯曲；spondylos，脊柱)，以前被称为别赫捷列夫病和Marie Strumpell病，是脊椎关节炎的一种形式，是一种慢性的、炎性的关节炎和自身免疫病。它主要影响脊柱的关节和骨盆中的骶髂(sacroilium)，引起脊柱的最终融合。它是具有强遗传倾向的脊椎关节病的成员。完全融合导致脊柱完全强直，这种情况被称为竹节样脊柱。典型的患者是年轻男性，年龄为18-30，此时疾病的症状首先出现，脊柱下部、有时整个脊柱具有慢性疼痛和僵硬，通常疼痛涉及骶髂关节的臀部一侧或另一侧或大腿背侧。 受影响的男性多于女性，比例大约为3 1，疾病在男性中比在女性中通常有更疼痛的过程。在病例的40%中，强直性脊柱炎与眼部炎症有关(虹膜睫状体炎和葡萄膜炎)，引起变红、眼痛、视力损失、飞蚊症和畏光。另外一种常见的症状是全身疲劳，有时恶心。可能发生较少见的主动脉炎、顶端肺纤维化和骶神经根鞘的膨胀。对于所有血清阴性脊柱关节病，可能发生指甲的翘起(甲松离)。没有直接的试验能够诊断AS。脊柱的临床检查和X射线研究，显示特征性的脊柱变化和骶髂关节炎，是主要的诊断工具。X-射线诊断的缺点是在平片X射线发现X射线明显变化之前AS的体征和症状通常已经出现了长达8-10年，这意味着在可以引入充分的治疗之前已经有长达10年的延迟。早期诊断的选择是骶髂关节的X线断层照相术和磁共振成像，但是这些检查的可靠性仍不清楚。Schober检查是在检查过程中进行的一种有用的腰椎弯曲的临床测量。在急性炎症期间，AS患者有时显示血液C反应蛋白(CRP)浓度升高和红细胞沉降率(ESR)升高，但是有许多AS患者的CRP和ESR率不升高，因此正常的CRP和ESR结果不总是对应于一个人实际存在的炎症程度。有时AS患者具有正常水平结果，然而在其体内存在明显的炎症。强直性脊柱炎(AS，来自希腊语ankylos，弯曲，弯曲；spondylos，脊柱)，以前被称为别赫捷列夫病、别赫捷列夫综合征和Marie Strumpell病，是脊椎关节炎的一种形式，是一种慢性的、炎性的关节炎和自身免疫病。它主要影响脊柱的关节和骨盆中的骶髂，引起脊柱的最终融合。它是具有强遗传倾向的脊椎关节病的成员。完全融合导致脊柱完全强直，这种情况被称为竹节样脊柱。有三种主要类型的药物用于治疗强直性脊柱炎1)消炎药，包括NSAID如布洛芬、 保泰松、吲哚美辛、萘普生和C0X-2抑制剂，它们减轻炎症和疼痛。临床证据也已证明阿片类镇痛药在减轻AS患者经常经历的慢性疼痛类型中非常有效，特别是随时间释放的制齐IJ。 2)DMARD如环孢菌素、氨甲喋呤、柳氮磺吡啶和皮质类固醇，用来通过免疫抑制减轻免疫系统应答；3) TNF α阻断剂(拮抗剂)如依那西普、英利昔单抗和阿达木单抗(也被称为生物制剂)，用于治疗AS并且是AS中的有效的免疫抑制剂，如其它自身免疫病中一样。已经证明TNF α阻断剂是最有前途的治疗药物，延缓大多数临床病例的AS进展， 帮助许多患者获得炎症和疼痛的显著的减轻，尽管不是根除。也证明它们不仅在治疗关节关节炎而且在治疗与AS有关的脊柱关节炎中非常有效。它的缺点除了通常费用较高以外， 还包括提高了感染的风险。由于这个原因，用于任何TNF-α阻断剂的方案包括在开始治疗前检查结核病(如Mantoux或Heaf)。在复发性感染，甚至复发性喉咙痛的情况中，由于涉及免疫抑制，可能对治疗产生怀疑。建议施用TNF药物的患者限制他们接触携带或可能携带病毒(如感冒或流感病毒)或可能具有细胞或真菌感染的他人。AS产生在健康人群中非常常见的症状。例如，主诉严重背痛的患者不一定经历AS 发作，而是可能仅具有普通的背痛。医生被迫在没有非常准确地判断疾病状态的情况下作出是否用具有潜在严重副作用的昂贵的药物治疗这些症状的决定。CRP和ESR无法非常准确地判断疾病状态。同时，未治疗的疾病的过程可能导致使人虚弱的长期脊柱损伤。这种状态导致困难的临床挑战和使用明显的过度治疗。反映疾病活动性的客观测量的可用性可能对AS患者的控制具有很大帮助。B.免疫谱分析在癌症检测中的应用这些方法可以用来检测癌症风险。癌症已经成为工业化国家中首要的死亡原因。 因此，癌症的治疗方法有非常大的需求。正在尝试许多癌症治疗方法，包括开发新的小分子药物以及针对肿瘤的抗体。已经提出的一组方法是免疫疗法。肿瘤监视是免疫系统细胞的功能之一。有几种类型的肿瘤抗原能被免疫系统识别。第一类包括通过肿瘤中的体细胞突变(点突变或易位)新产生的抗原。另一类包括来自只在不表达MHC分子的雄性生殖细胞中表达的蛋白质的抗原。许多肿瘤中基因表达的失调可能使这些抗原中的某一些被表达。第三类包括来自只在特定组织中表达的蛋白质的抗原。第四类包括在肿瘤组织中显著过度表达的抗原。最后，第五类包括由异常翻译后修饰产生的抗原。肿瘤的一种性质是它们逃脱免疫系统的有效清除的能力。据认为肿瘤中获得的新的突变使其从平衡期(其中肿瘤未完全消除，但是其生长被抑制)转至逃脱期，此时肿瘤生长而不受免疫系统的有效控制。肿瘤利用许多机制来逃脱免疫系统。这些机制包括缺乏特异性抗原性肽，或者能够激活T细胞的共刺激分子。其它机制包括肿瘤分泌抑制T细胞的因子和通过产生分隔肿瘤与淋巴细胞的物理屏障产生肿瘤诱导的特殊部位。正在研究并以多种方式测试诱导免疫系统以更好地对抗肿瘤作为治疗癌症的策略。一种方法是过继性T 细胞治疗。该方法集中在通过分离浸润肿瘤和/或与特定肿瘤抗原反应的细胞鉴别靶向肿瘤抗原的T细胞。这些T细胞可以在增强其有效性的条件下在体外生长，例如使用IL-2和 /或抗原呈递细胞。扩增的细胞然后回输到患者血液中。另外一种方法是使用含有肿瘤特异性TCR的逆转录病毒。这些逆转录病毒可能输注到患者的特定细胞中，这些细胞后来分泌逆转录病毒，使其感染T细胞，然后T细胞开始表达肿瘤特异性TCR。最后，一种常用的方法是采用疫苗接种。该治疗方法的前提是用一种或多种肿瘤抗原免疫患者，该肿瘤抗原将刺激免疫系统对抗肿瘤的能力。免疫通常使用如卡介苗(BCG)等佐剂进行。该方法已经成功用于预防病毒诱导的癌症，如通过预防由HPV-16和HPV-18诱导的宫颈癌的能力所显现的。但是，很少成功用于治疗其它肿瘤。癌症死亡率已经发生了较大的改善，这是由于可以获得更好的早期检测方法，例如导致乳腺癌和宫颈癌的死亡率降低。肿瘤的可突变性使得它们的早期治疗比晚期检测时更加有效。传统上，寻找癌症检测生物标志物通常包括寻找在癌症中高度表达并且在正常组织中低水平表达或不存在的标志物。这导致鉴定了几种肿瘤标志物，如PSA。癌症早期检测的一个问题是当生物标志物的检测最困难时，即，肿瘤非常小时，发生癌症检测的最大价值。因此，为了有能够区别具有小肿瘤的患者与没有肿瘤的受试者的有效癌症检测生物标志物，需要肿瘤和正常组织之间的表达有巨大差异，这是由于肿瘤和正常组织之间的大小有大的差异。另外，标志物需要有效地“溢出”至血液或其它体液，以允许使用非创伤性技术进行检测。本发明教导了一种新的利用免疫细胞应答的癌症检测机制。在这点上，通过检测肿瘤本身产生的标志物无法实现癌症的检测，但是通过对肿瘤的免疫系统应答可以检测到。特别是，TCR和/或BCR谱可以提供关于身体是否对肿瘤具有应答的了解。这可以改善使用现有的生物标志物的一些问题。首先，免疫应答是一种扩增信号，它可以被较早地检测到。其次，淋巴细胞经常地通过血液，因此相关生物标志物可能比传统肿瘤生物标志物更容易地存在于外周血中并可被检测到。最后，正常组织产生的“背景”生物标志物的问题大大减少。T和/或B细胞的高度多样性提供了一种高灵敏度和特异性的检测相关生物标志物的方法，特别是最近可获得高通量DNA测序方法。利用对癌症的免疫系统应答的检测方法通过免疫治疗的保证调节了归于该领域的基础。但是，两种应用的风险可能非常不同。利用对癌症的免疫应答进行检测不需要特异性克隆型在治疗肿瘤中有效，而是需要与对肿瘤的免疫应答相关。本发明的另一实施方案涉及免疫谱分析试验与其它已经用于检测癌症的标志物的组合，以使试验具有更高的灵敏度和特异性。其它分子标识物或标志物可以用于计算负荷算法或用于确定疾病状态。分子标识物可以包括核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质，核酸或蛋白质的表达谱。分子标识物可以是人或非人来源的(例如，细菌)。标识物或标志物可以通过包括以下的技术确定，例如，比较基因组杂交(CGH)、染色体微阵列分析(CMA)、表达概况分析、DNA微阵列、高密度寡核苷酸微阵列、全基因组RNA表达阵列、肽微阵列、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基因组测序、拷贝数(CNV)分析、小核苷酸多态性(SNP)分析、免疫组织化学、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、PCR、Western印迹分析、Southern印迹分析、 SDS-PAGE、凝胶电泳和Northern印迹分析。C.免疫谱分析在移棺医学中的应用这些方法可以用来检测移植器官的免疫排斥。器官移植已经成为美国每年进行的超过25，000例实体器官(肾、肝、心脏、胰和肺)移植和超过15，000例骨髓移植的医疗的不可或缺的部分。这些通常是在三级护理中心进行的复杂的手术。为了最小化移植排斥的风险，患者通常被长期置于免疫抑制下，使得他们具有癌症和感染的危险。此外，许多移植物被急性排斥或在移植数年后排斥。尽管存在这些问题，器官移植仍然是重要的治疗方式， 因为器官衰竭患者几乎没有其它选择。实体器官移植排斥的发生主要是由于适应性免疫系统对移植的器官的应答。这是由于移植物中存在被宿主免疫系统识别的同种异体抗原。排斥可以在三个不同的阶段发生。第一个是在移植几分钟内的超急性期，其中预先形成的抗体引起对移植物的应答。第二个是在移植后前几周或前几个月发生的急性排斥。最后一个是可以在移植后数年发生的慢性排斥。考虑到这些危险，已经小心使供体和接受体之间的免疫原性差异最小化。例如， 当供体和接受体的ABO亚型匹配以及检测交叉匹配(确定接受者是否具有与供体的白细胞反应的抗体)时，超急性反应的危险大大降低。类似地，进行主要组织相容性(MHC)的仔细匹配以减少急性排斥。但是，由于MHC分子具有非常高的多态性，非常难以发现确定完美的匹配。单卵双胎具有完美的MHC匹配。类似地，1/4同胞预期具有完美的MHC匹配。根据临床试验具有可检测到的相同的等位基因的无关个体通常由于在常规临床实践中检测不到的其它多态性位点具有差异。但是，甚至来自同胞的完美的MHC匹配，仍然存在明显的排斥风险，这是因为存在次要组织相容性抗原，实际上超过一半的移植物非常常见地发生急性排斥。人们可以想象更具攻击性的MHC基因座检测以及鉴定和匹配次要组织相容性抗原将显著改善移植排斥和可能的存活率。可以获得的供体器官数量有限的事实使得该任务不切实际，因为更具攻击性的测试可能显著延迟用于每名患者的适当移植物的鉴定。因此，在移植领域发生的许多进展为使用免疫抑制剂预防和治疗排斥。当前有许多药物用于该目的，包括硫唑嘌呤、皮质类固醇类、环孢菌素、他克莫司、麦考酚酸、西罗莫司、莫罗单抗-CD3、单克隆抗CD25抗体、单克隆抗CD20抗体和钙神经素抑制剂。骨髓移植最常用于白血病和淋巴瘤的治疗。一般而言，接受者经历攻击性的放射和/或化学治疗方案，以在移植之前降低肿瘤的负荷。来自供体的成熟T细胞可以在被称为移植物抗宿主病(GVHD)的相反排斥中攻击一些宿主组织。这通常表现为疹、腹泻和肝病。 MHC的仔细匹配可以改善但不能消除该问题。一种方案是在体外排除供体骨髓中最终引起 GVHD的成熟T细胞。一个问题是引起GVHD的相同的现象可能通过移植物抗白血病效应引起骨髓移植的一些治疗效果，其中供体T细胞攻击剩余的癌细胞。另外，供体T细胞的排除可以使患者暴露于免疫缺陷的风险。因此，当考虑这些方法时，需要平衡风险和利益。因此通常用免疫抑制剂治疗患者以预防以及治疗GVHD。现有的骨髓控制，对于实体器官移植更是如此，严重依赖于使用强免疫抑制剂的治疗。然而，由于这些药物具有明显的危险，它们以平衡风险和利益的方式使用。但是，由于特定患者在特定时间的危险没有很好地理解，用对平均患者平衡了风险和收益的剂量治疗患者。可以预测未来排斥事件的试验可能潜在地非常有助于在它们需要的适当时间调整对患者的治疗。这可导致免疫抑制剂量的减少，或者某些患者同时改善了排斥率和有希望的移植物存活。本发明的另一实施方案涉及免疫谱分析试验与其它已经用于检测移植排斥的标志物的组合，以使试验具有更高的灵敏度和特异性。其它分子标识物或标志物可以用于计算负荷算法或用于确定疾病状态。分子标识物可以包括核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质， 核酸或蛋白质的表达谱。分子标识物可以是人或非人来源的(例如，细菌)。标识物或标志物可以通过包括以下的技术确定，例如，比较基因组杂交(CGH)、染色体微阵列分析(CMA)、 表达概况分析、DNA微阵列、高密度寡核苷酸微阵列、全基因组RNA表达阵列、肽微阵列、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基因组测序、拷贝数(CNV)分析、小核苷酸多态性(SNP)分析、免疫组织化学、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、PCR、WeStern印迹分析、Southern印迹分析、 SDS-PAGE、凝胶电泳和Northern印迹分析。P.免疫谱分析在治疗感染中的应用这些方法已经用于指导感染的治疗，特别是在这些感染可能以活动和潜伏状态存在时。过去一个世纪用于治疗传染病的抗生素的出现对预期寿命产生了极大的影响。在过去十年中，分子诊断学技术已经在传染病的诊断和控制中发挥了快速提高的作用。核酸扩增提供的出色的灵敏性和特异性使得能够将这些技术应用到越来越多的应用中。许多应用用于诊断评价传染原的存在或不存在。例如，性传播疾病的检测通常由采用核酸扩增技术的分子检测进行。另一组应用涉及评价已经诊断的传染原感染患者的“载量”。一个例子是评估已经诊断为AIDS的患者中的HIV病毒载量。该检查帮助医生确定患者的疾病状态，因此可以对使用的治疗方案的有效性提供指导。有时不仅有助于考虑传染原的水平，而且有助于考虑对传染原的免疫应答。在临床实践中常规使用对感染的免疫应答的一个例子是乙型肝炎。乙型肝炎检测的一个方面依赖于通过检测乙型肝炎抗原或者通过核酸扩增试验检测传染原。另外，常规临床实践中通常检测针对乙型肝炎病毒的不同抗体的存在。抗-HBc IgM的存在通常在急性感染条件下发生，抗-HBc IgG的出现表明感染是慢性的。类似地，抗-HBs抗体的出现表示清除了感染。在本发明的一个实施方案中，评价对感染的免疫应答的价值同时具有分子检测的灵敏性和特异性。这特别可用于其中传染原在体内保持潜伏的慢性传染病。TCR和/或BCR 谱可以用来评价对感染的免疫应答。测序可以用来获得TCR和/或BCR谱，以允许高灵敏性和特异性地检测特定克隆型。为了确定与疾病相关的特异性的克隆型，设想了几种方法。本发明的另一实施方案涉及免疫谱分析试验与其它已经用于检测传染物的标志物的组合，以使试验具有更高的灵敏度和特异性。其它分子标识物或标志物可以用于计算负荷算法或用于确定疾病状态。分子标识物可以包括核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质，核酸或蛋白质的表达谱。分子标识物可以是人或非人来源的(例如，细菌)。标识物或标志物可以通过包括以下的技术确定，例如，比较基因组杂交(CGH)、染色体微阵列分析(CMA)、 表达概况分析、DNA微阵列、高密度寡核苷酸微阵列、全基因组RNA表达阵列、肽微阵列、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基因组测序、拷贝数(CNV)分析、小核苷酸多态性(SNP)分析、免疫组织化学、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、PCR、WeStern印迹分析、Southern印迹分析、 SDS-PAGE、凝胶电泳和Northern印迹分析。E.免渐細刷台赫龙患糾白摘ffl这些方法已经用于监测老年人的免疫系统的状态。老年人的免疫系统减弱，被称为免疫衰老，这影响他们对感染应答和对疫苗产生有效应答的能力(Weinberger等人.， 2008)。从老年人中肺炎引起的高死亡率(Office for National Statistics, 2005)和他们对医源性感染如艰难梭菌(Clostridium difficile)和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的易感性(Health Protection Agency, 2008)可以清楚地看出这一点。此外，免疫系统能力的下降被认为解释了老年人中升高的癌症比例。另外，免疫衰老可能导致具有显著炎性过程成分的老年人的其它主要疾病，如阿尔茨海默病和心脏病。预测哪些个体最可能处于这些致死性后果的危险中的能力在老年科医生做出关于接种、攻击性感染治疗和住院的临床决定时是有用的。先天性和适应性免疫系统的许多方面在免疫衰老中改变。T细胞丧失反应性，巨噬细胞具有降低的抗原呈递能力和改变的细胞因子分泌，自然杀伤细胞具有降低的毒性，滤泡树突细胞不能有效地呈递抗原，中性白细胞失去吞噬细胞能力。较小的幼稚T和B细胞集合和记忆和效应细胞集合导致T和B细胞所有组成成分的多样性降低，导致适应性免疫系统对新抗原应答的能力降低。特别是，与巨细胞病毒(CMV)有关的T细胞所有组成成分大大增加，并且总T细胞所有组成成分中的多达45%可能与它有关。已经注意到这些扩增在百岁以上老人中较不明显。研究提示免疫标志物可能预测老年人中的存活率。已经证明B细胞所有组成成分的多样性程度预测至少一个群体中的老年人的存活率。即使TCR和BCR多样性的这些总体差异表明预测临床结果，但是这些标志物缺乏特异性。所有组成成分数据的更深入的分析可以提供显著更高的预测精确性。例如，对CMV具有反应性的扩增可能具有与其它扩增不同的显著性。在本发明的一个实施方案中，来自在外周血中发现的T和B细胞的RNA可以从其病历已随访数年的衰老患者的纵向组群中采集。可以对这些组群中的每一个在他们的病历中的几个时间点扩增TCR和TCR基因和IgH、IgK和IgL基因。长期存活患者的谱与短期存在的患者进行比较。首先，可以获得多样性的全面测量。这不仅包括鉴别的不同的克隆型的数目，而且包括它们的多样性。例如，V、D、J区段的使用在两组中是相同还是一组在其使用方面更有限制？例如，两个样品可以具有相同的独立克隆型数目，但是两个样品之一的克隆型不覆盖许多V区段。逻辑上预测与其克隆型分布在所有V区段之间的其它样品相比，该样品在响应新抗原方面多能性更差。除了整体多样性以外，将确定是否可以根据一些序列参数与短期存活患者的克隆型比较来区别长期存活患者中扩增的克隆型。通过观察响应于特定抗原的克隆型可以补充该方法。例如，由于可以获得的证据，CMV响应性克隆型的鉴别可能具有预测能力。在发现研究中捕获CMV反应性T细胞克隆型可以从一组老年健康患者进行。可以研究这些克隆型的序列以鉴别能够区别它们与其它克隆型的参数。使用上述纵向群组通过使用CMV克隆型的该预测算法，可以评价添加该信息是否能够提高从非长期存活患者中预测长期存活患者的能力。本发明的另一实施方案涉及免疫谱分析试验与其它已经用于检测老年人群健康的标志物的组合，以使试验具有更高的灵敏度和特异性。其它分子标识物或标志物可以用于计算负荷算法或用于确定疾病状态。分子标识物可以包括核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质，核酸或蛋白质的表达谱。分子标识物可以是人或非人来源的(例如，细菌)。标识物或标志物可以通过包括以下的技术确定，例如，比较基因组杂交(CGH)、染色体微阵列分析 (CMA)、表达概况分析、DNA微阵列、高密度寡核苷酸微阵列、全基因组RNA表达阵列、肽微阵列、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基因组测序、拷贝数(CNV)分析、小核苷酸多态性(SNP)分析、免疫组织化学、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、PCR、WeStern印迹分析、Southern印迹分析、SDS-PAGE、凝胶电泳和Northern印迹分析。F.免疫谱分析在给予疫苗中的应用这些方法已经用于给予疫苗。疫苗接种的应用导致多种生物的感染率极大降低。 一种具有显著的健康影响，在美国每年导致超过30，000例死亡的传染病是流感。流感疫苗接种每年都要进行，因为毒株快速突变。该疾病的大多数严重后遗症发生在老年人中。遗憾的是，老年人通常经历免疫衰老，这使得他们对疫苗接种的反应性不足。为了区别对疫苗接种具有反应性的患者与对疫苗接种没有反应性的患者，需要进行发现研究。在该人群中，可以从一组具有已知流感后果的流感疫苗接种患者(即，他们是否后来被预防感染)中获得接种前和接种后(在一组或多组时间)血液样品。TCR和/或 BCR序列可以从这些样品中获得。确定在每名患者中疫苗接种后富集的克隆型。在对疫苗接种有反应的患者中富含的克隆型然后与一组对照克隆型(例如，同一组患者中的其余克隆型)进行比较，以区别相关克隆型与其它克隆型。然后利用预测这些克隆型的算法来预测对疫苗接种没有应答的患者之间的相关克隆型。没有应答的患者可能与有应答的患者产生类型相同但水平较低的克隆型。或者，可能无应答者产生不同类别的克隆型。在无应答者中鉴别的相关克隆型的数目可以区别这两个可能性。使用鉴别的相关克隆型，然后建立一种算法，以产生用于预测免疫可能性的得分。 来自疫苗应答者和无应答者的谱的数据用来产生该算法。该算法然后可以用来利用从免疫后获得的样品预测的相关克隆型预测下一患者中免疫的可能性。通过应用也是在发现研究中产生的另一算法进行预测。它可以任选地由来自预先校准的数据进行辅助(或代替)，以将对相关克隆型的搜索限制为免疫后富集的那些。本发明的另一实施方案涉及免疫谱分析试验与其它已经用于检测对疫苗接种的应答的标志物的组合，以使试验具有更高的灵敏度和特异性。其它分子标识物或标志物可以用于计算负荷算法或用于确定疾病状态。分子标识物可以包括核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质，核酸或蛋白质的表达谱。分子标识物可以是人或非人来源的(例如，细菌)。标识物或标志物可以通过包括以下的技术确定，例如，比较基因组杂交(CGH)、染色体微阵列分析(CMA)、表达概况分析、DNA微阵列、高密度寡核苷酸微阵列、全基因组RNA表达阵列、肽微阵列、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基因组测序、拷贝数(CNV)分析、小核苷酸多态性(SNP) 分析、免疫组织化学、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、PCR、WeStern印迹分析、Southern印迹分析、SDS-PAGE、凝胶电泳和Northern印迹分析。G.躺丨免■細(械舰)Φ白摘ffl适应性免疫系统已经进展为响应与病原体有关的抗原。如同自身免疫病中一样， 免疫系统有时可能具有错误的靶标。在自身免疫病中，免疫系统针对自身抗原，而在超敏反应中，它产生对有害的刺激物如药物、粉尘和食物的应答。超敏反应非常常见，多达50%的美国人口对环境刺激物具有变态反应，并且它是由药物引起的。超敏反应分为4类。I型超敏反应是速发型超敏反应，由IgE介导。II型超敏反应通常是由于IgG抗体与细胞表面结合的抗原结合引起的。例如，与细胞表面结合的无害的药物可以使细胞成为碰巧具有这些抗体的患者中的抗药物IgG的靶标。III型超敏反应是由抗原-抗体复合物在组织上的沉积引起的。这发生在例如抗原量大导致小免疫复合物不能被有效清除、而是沉积在血管壁上时。IV型超敏反应是由T细胞介导的迟发型超敏反应。I型和IV型超敏反应对人类健康具有最大的影响。在I型超敏反应中，患者通过产生抗无害抗原(变应原)的IgE抗体而对该抗原致敏。后来暴露于变应原诱导IgE-结合细胞如肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化。一旦被活化，这些细胞就通过分泌储存的化学物质和合成细胞因子、白三烯和前列腺素诱导炎性过程而引起变应性反应。变应原的剂量和进入途径决定了变态反应的程度，其程度可能从变应性鼻炎的症状到过敏反应中的危害生命的循环衰竭。通常急性I型反应之后为另一个晚期阶段，该晚期阶段在产生的许多病理性过程中起作用。T辅助细胞和其它炎性细胞的募集的晚期基本上是IV型超敏反应。一些I型变态反应包括季节性鼻炎结膜炎(花粉症)、 食物变态反应、药物诱导的过敏反应、特应性皮炎(湿疹)和哮喘。这些是具有流行性升高的非常常见的病症，引起高成本以及发病率和死亡率。例如，哮喘是一种慢性疾病，它影响到美国人口的大约7%，每年导致约4，000例死亡。这些疾病中的一些具有一些相关的方面。例如，特应性皮炎患者具有显著提高的患哮喘的危险。食物变态反应可以引起呕吐和腹泻，但是也可以在相当数目的患者-30，000名一中导致过敏反应，在美国每年导致约200 例死亡。激活鼻中粘膜下肥大细胞引起变应性鼻炎症状的的某些相同变应原也可以激活下呼吸道中的肥大细胞，引起支气管紧缩，这是哮喘的一种典型的症状。一些IV型超敏反应是接触性皮炎(例如，毒葛)、慢性鼻炎、慢性哮喘和乳糜泻。乳糜泻是一种由非IgE介导的食物变态反应引起的慢性病。它是由针对谷蛋白的变应性应答引起的小肠疾病，谷蛋白是小麦和其它食物中存在的一种成分。超过95%的乳糜泻患者具有特定的MHC II类等位基因，HLA-DQ2。超敏反应的治疗不同，但是它们通常具有两个方面急性治疗和慢性控制或预防。 这些病症中的一些可能是危害生命的(过敏反应和急性哮喘)并且引起直接医学关注。慢性控制通常包括试图避免特定变应原。当变应原能够清楚地鉴别时(例如，对坚果过敏)， 这可能是有效的，但是当变应原广泛存在于环境中时，如花粉或粉尘，这可能是困难的。因此，药物慢性治疗通常用于这些疾病中的一些疾病(例如，哮喘和变应性鼻炎)。当患者重新暴露于变应原时，最终测试治疗控制的有效性水平。因此一些患者可能过度治疗或治疗不足。理想地，可以采用评价疾病活动性和患者倾向于发生超敏反应的程度的试验。这种试验将允许根据个体患者需要调整治疗。
实施例实施例1m^^^^mm^nm dna 的序歹U血液样品采自自身免疫病患者。⑶4+和⑶8+细胞使用抗体包被的磁珠从血液样品中分离。PCR用来扩增T细胞受体β基因的完整可变区。将扩增的片段亚克隆到载体中，并转化细菌，以分离DNA片段。培养细菌，以扩增DNA，利用双脱氧测序对T细胞受体β 基因的可变区测序，以鉴别克隆型。测序信息用来产生患者的克隆型谱。一种类似的方法显示在图1中。实施例2确定自身免疫病的状杰脑脊液(CSF)和血液样品采自多发性硬化发作高峰的患者。⑶4+细胞从CSF和血液中分离，T细胞受体β基因的CDR3通过PCR扩增。将扩增的片段亚克隆到载体中，并转化细菌，以分离DNA片段。培养细菌，以扩增DNA，利用双脱氧测序对T细胞受体β基因的可变区进行测序，以鉴别克隆型。测序信息用来产生患者的克隆型谱。另一份血液样品在患者处于多发性硬化的相对不活动状态时采集。重复如上所述的相同程序以产生克隆型谱。病理性克隆型被确定为在高峰发作时高而在不活动状态时明显下降的克隆型。另一份血液样品采自处于稍后状态的患者。在此时，只有一部分T细胞受体β基因CDR3区被扩增，然后测序。该亚群含有病理性克隆型。确定各种克隆型的水平以评估患者的疾病状态。实施例3TCRg所有组成成分分析扩增和测序策略为了研究TCR所有组成成分的扩增，分析TCRii链。该分析包括扩增、测序和分析 TCR^序列。一个引物为六606六01^^^^^^^^六0六，互补于(3 1和CP 2中的共同序列，有34 个V引物(表1)能够扩增全部48个V区段。Ci31或Ci32在自J/C连接的位置10和14 彼此不同。用于C β 1和C β 2的引物将在位置16bp终止，并且对于C β 1或C β 2应当没有偏性。34个V引物从BI0MED-2小组发表的一组原始引物修饰而来，以扩增全部48个 V区段和他们发表的国际ImMimoGeneTics信息系统定义的全部等位基因(http//imgt. cines. fr/) 0
BI0MED-2引物已经多重使用以鉴别淋巴细胞增生性疾病中的克隆形成能力。表1.互补于不同V家族的引物序列
权利要求
1.一种确定τ细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括a.从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品；b.从所述细胞空间上分离基因组DNA的个体分子；c.对所述空间上分离的基因组DNA的个体分子进行测序；d.确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。
2.一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括a.从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品；b.从所述细胞空间上分离基因组DNA的个体分子；c.扩增所述基因组DNA的个体分子；d.对所述扩增的DNA进行测序；和e.确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列。
3.一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括a.从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品；b.从所述细胞扩增基因组DNA;c.空间上分离所述扩增的DNA的个体分子；d.对所述空间上分离的扩增DNA的个体分子进行测序；和e.确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。
4.一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括a.从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品；b.从所述细胞扩增基因组DNA;c.空间上分离所述扩增的DNA的个体分子；d.再扩增所述扩增的DNA分子；e.对所述再扩增的DNA分子进行测序；和f.确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。
5.一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括a.从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品；b.逆转录所述细胞的RNA以形成cDNA；c.空间上分离所述cDNA的个体分子；d.任选地再扩增所述空间上分离的个体cDNA分子；e.对所述cDNA和/或再扩增的cDNA进行测序；和f.确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。
6.一种确定T细胞和/或B细胞中的重组DNA序列谱的方法，包括a.从受试者获得包含T细胞和/或B细胞的样品；b.空间上分离所述样品中的个体细胞；c.对来自所述细胞的个体核酸分子进行测序；和d.确定来自所述样品的不同序列的水平，以产生所述重组DNA序列谱。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述扩增和/或再扩增包括PCR、多重PCR、TMA、 NASBA 或 LAMP。
8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述空间上分离包括将所述DNA或cDNA亚克隆到用来转化细菌的载体中，在固体支持体上二维分离所述DNA或cDNA，在含微团的溶液中三维分离所述DNA或cDNA，或使用微反应室分离分子。
9.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述扩增和/或再扩增是通过携带亚克隆的 DNA或cDNA的细菌的生长，DNA或cDNA在载玻片上的扩增，或DNA或cDNA在珠上的扩增。
10.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述测序包括双脱氧测序。
11.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述测序包括使用可逆终止的标记核苷酸合成测序。
12.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述测序包括检测核苷酸掺入的焦磷酸释放。
13.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述测序包括与标记的寡核苷酸探针文库的等位基因特异性杂交。
14.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述测序包括合成测序，该合成测序是利用与标记寡核苷酸探针文库的等位基因特异性杂交，随后连接所述探针。
15.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述测序包括实时监测聚合步骤过程中标记核苷酸的引入。
16.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述重组DNA序列包含T细胞受体基因和/或免疫球蛋白基因。
17.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述测序包括对免疫球蛋白和/或T细胞受体基因的全克隆序列的亚群进行测序。
18.权利要求17的方法，其中所述全克隆序列的亚群包括免疫球蛋白或T细胞受体基因的V-D连接、D-J连接、免疫球蛋白或T细胞受体基因的完整可变区、抗原识别区、或互补决定区3(CDR3)。
19.权利要求17的方法，其中所述T细胞受体基因包含T细胞受体β基因。
20.权利要求17的方法，其中所述免疫球蛋白基因包含免疫球蛋白重链基因。
21.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述扩增或再扩增包含多个互补于V区段的引物和一个互补于C区段的引物。
22.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述扩增或再扩增包含多个互补于V区段的引物和多个互补于C区段的引物。
23.权利要求22的方法，其中所述多个互补于V区段的引物包含至少三个不同的用于每个V区段的引物，多个互补于C区段的引物包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、 至少5个或至少6个引物。
24.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述T细胞和/或B细胞是总T细胞和/或B 细胞的亚群。
25.权利要求M的方法，其中所述T细胞的亚群是⑶4+，⑶8+细胞或⑶27s细胞。
26.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述样品包含至少100，000个、至少500，000 个、至少750，000个或至少1，000，000个T细胞。
27.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述测序包括至少1000阅读/运行、至少 10，000阅读/运行、至少100，000阅读/运行或至少1，000, 000阅读/运行。
28.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述测序包括每个阅读产生约30bp、约40bp、 约 50bp、约 60bp、约 70bp、约 80bp、约 90bp、约 IOObp、约 110 或约 120bp。
29.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述样品当受试者处于自身免疫病的发作状态时采集。
30.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述样品从患有或怀疑患有系统性红斑狼疮的受试者采集。
31.一种确定受试者的一个或多个相关克隆型的方法，包括a.通过对来自受试者的至少一个样品的空间上分离的个体分子进行核酸测序，产生一个或多个克隆型谱，其中所述至少一个样品与疾病的第一状态有关，和b.基于所述一个或多个克隆型谱确定受试者中的一个或多个相关克隆型。
32.权利要求31的方法，其中所述至少一个样品来自受疾病影响的组织。
33.权利要求31的方法，其中所述确定一个或多个相关克隆型包括比较来自至少两个样品的克隆型谱。
34.权利要求31的方法，其中所述疾病的第一状态是疾病的高峰状态。
35.权利要求34的方法，其中所述一个或多个相关克隆型存在于疾病的高峰状态。
36.权利要求34的方法，其中所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态不存在。
37.权利要求34的方法，其中所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时高。
38.权利要求34的方法，其中所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时低。
39.权利要求31的方法，其中所述样品包含T细胞和/或B细胞。
40.权利要求39的方法，其中所述T细胞和/或B细胞包含T细胞和/或B细胞的亚群。
41.权利要求40的方法，其中所述T细胞和/或B细胞的亚群通过与标志物相互作用而富集。
42.权利要求41的方法，其中所述标志物是T细胞和/或B细胞的亚群上的细胞表面标志物。
43.权利要求39的方法，其中所述T细胞和/或B细胞的亚群与特异性存在于疾病中的抗原相互作用。
44.权利要求31的方法，其中所述疾病是系统性红斑狼疮或多发性硬化。
45.一种开发算法的方法，该算法能够预测患病患者的任何样品中的一个或多个相关克隆型，该方法包括a.从一组样品产生多个克隆型谱，其中该样品与所述疾病有关，b.从这组样品鉴别一个或多个相关克隆型，c.利用来自b)中鉴别的一个或多个相关克隆型的序列参数和/或功能数据来开发能够预测患病患者的任何样品中的相关克隆型的算法。
46.权利要求45的方法，其中所述一组样品获自一个或多个受疾病影响的组织。
47.权利要求45的方法，其中所述一个或多个相关克隆型的鉴别包括比较来自至少两个样品的克隆型谱。
48.权利要求45的方法，其中所述功能数据包括T细胞和/或B细胞表面上的标志物的结合能力或T细胞或B细胞与抗原的相互作用。
49.权利要求45的方法，其中所述序列参数包括核酸序列和预测的氨基酸序列。
50.权利要求45的方法，其中所述样品来自一个或多个处于疾病高峰期的个体。
51.权利要求50的方法，其中所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时存在。
52.权利要求50的方法，其中所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时处于高水平。
53.权利要求50的方法，其中所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时处于低水平。
54.权利要求50的方法，其中所述一个或多个相关克隆型在疾病的高峰状态时不存在。
55.权利要求45的方法，其中所述疾病是系统性红斑狼疮或多发性硬化。
56.一种发现个体的一个或多个相关克隆型的方法，该方法包括a.将来自个体的样品的克隆型谱输入权利要求45的算法中，和b.利用该算法确定对于该个体的一个或多个相关克隆型。
57.权利要求56的方法，其中所述样品在疾病的高峰状态时采集。
58.权利要求56的方法，其中所述样品采自受疾病影响的组织。
59.一种产生计算疾病活动性得分的算法的方法，包括a.开发一种算法，该算法使用一组因素将相关克隆型的水平组合为疾病活动性得分，b.比较所述疾病活动性得分与关于疾病状态的临床数据，和c.优化这些因素，以将临床数据与疾病活动性得分之间的相关性最大化。
60.监测个体的疾病状态的方法，包括a.从来自个体的样品确定克隆型谱，b.将来自a)的克隆型谱信息输入到算法中，该算法计算权利要求59中产生的疾病活动性得分，和c.使用计算疾病活动性得分的算法产生预示个体疾病状态的得分。
61.权利要求60的方法，还包括确定个体中的一个或多个相关克隆型，并将一个或多个相关克隆型的信息输入到算法中。
62.权利要求61的方法，其中所述确定个体中的一个或多个相关克隆型包括a.通过对来自受试者的至少一个样品的各个空间上分离的分子进行核酸测序，产生一个或多个克隆型谱，其中所述至少一个样品与疾病的第一状态相关，和b.基于所述一个或多个克隆型谱确定受试者中的一个或多个相关克隆型。
63.权利要求61的方法，其中所述确定个体中的一个或多个相关克隆型包括a.将来自个体的样品的克隆型谱输入到能够预测一个或多个相关克隆型的算法中，其中所述能够预测一个或多个相关克隆型的算法是通过以下方式开发的i.从一组样品产生多个克隆型谱，其中该样品与疾病有关， .从这组样品鉴别一个或多个相关克隆型，iii.利用来自ii)中鉴别的一个或多个相关克隆型的序列参数和/或功能数据来开发能够预测患病患者的任何样品中的相关克隆型的算法，和b.利用能够预测一个或多个相关克隆型的算法确定对于该个体的一个或多个相关克隆型。
64.权利要求61的方法，其中所述疾病是系统性红斑狼疮或多发性硬化。
全文摘要
需要用于确定患病(包括自身免疫病和癌症)患者的诊断和预后的改进的方法。本发明提供利用DNA测序鉴别自身免疫病和其它疾病患者的个体化生物标志物的方法。鉴别的生物标志物可以用来确定患有自身免疫病或其它疾病的受试者的疾病状态。
文档编号C12Q1/68GK102272327SQ200980153756
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月9日 优先权日2008年11月7日
发明者M·法哈姆, T·威利斯 申请人:赛昆塔公司