专利名称：鱼蛋白水解物的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶处理的鱼蛋白水解物(FPH)的用途。FPH物质降低血浆中胆固醇和肝脏中甘油三酯的浓度。FPH也诱导脂肪酸模式中有利的变化，并降低血浆中同型半胱氨酸的浓度。本发明优选的实施方案涉及FPH物质作为抗动脉粥样化和心脏保护剂的用途，其以药物或以营养组合物，例如功能食品的形式被给予。
背景技术：
近年间，在挪威和世界范围内鱼类养殖业，获得巨大发展，特别是鲑鱼。许多鱼以去除内脏的、整鱼出售给消费者，但以鱼片出售数量巨大。只有50-70％的鲑鱼为鱼片，而其余地作为低价值产品例如鱼粉和鱼青贮饲料出售。
通过酶处理，鱼肉以及鱼骨架可以分解成富含蛋白质的水性部分，其被称为鱼蛋白水解物(FPH)。酶水解过程是高度可控的，并且产物为可再生产的和很好限定的。
令人惊奇的是，本发明人表明根据本发明的鱼蛋白水解物(FPH)具有多种有益的生物学作用，并且这种物质可被用作药物或营养物质。
我们已表明，FPH降低血浆胆固醇和同型半胱氨酸的浓度，并且还降低肝三酰甘油的浓度。基于这些发现，预期FPH对狭窄、动脉粥样硬化、冠心病、血栓形成、心肌梗塞、中风和脂肪肝将具有预防和/或治疗作用。用鱼蛋白物质的治疗代表了治疗这些疾病的一种新方法。
FPH尤其适用作食品中的功能性蛋白质，特别地当用作动物饲料和宠物食物中天然血浆的替代品时。当被用于宠物食物中时，可以向产品中添加另外的成分例如脂肪、糖、盐、调味剂、矿物质等等到。然后可以将产品形成在外观和质地上类似天然肉块的大块。本发明的产品具有进一步的优势，即它容易被配制以包含必需营养物质，容易被动物消化并且对动物来说是可口的。
发明详述
本发明涉及用于制备药物或营养制剂的FPH，该药物或营养制剂用于治疗和/或预防动脉粥样硬化、冠心病、狭窄、血栓形成、心肌梗塞、中风和脂肪肝。
实验数据清楚地显示，根据本发明的FPH降低了血浆中同型半胱氨酸的浓度。同型半胱氨酸是疾病，例如动脉粥样硬化、冠心病、狭窄、血栓形成、心肌梗塞和中风中的危险因素，因此预期本发明的FPH物质在预防和治疗这些疾病中将是有效的。
数据也显示，通过施用FPH，降低了肝脏中三酰甘油的水平，因此预期FPH物质能被用于治疗和预防脂肪肝。
本发明进一步的具体实施方式
涉及用于制备药物或营养组合物的FPH，该药物或营养组合物用于治疗和/或预防高胆固醇血症，因为我们已显示所述物质能降低胆固醇的血浆浓度。
更进一步的具体实施方式
涉及FPH用于制备药物或营养组合物的用途，药物或营养组合物用于降低血浆中同型半胱氨酸浓度。高同型半胱氨酸水平能在表现出上面所示的疾病之前建立。FPH物质的施用具有普遍的降低同型半胱氨酸的作用，因此本发明的物质特别地适合于预防上述疾病的发作，并降低其危险。
结果进一步显示，FPH物质具有普遍的心脏和动脉保护的特征，我们预期可以给予该物质以降低动脉和心脏相关疾病的危险。
本发明的一个目的是施用作为预防剂或药物，或作为功能性饲料或食品材料的FPH物质。该物质可被给予人类或非人类动物。
本发明的优选实施方案涉及包含鱼蛋白水解物的饲料物质。该物质可被用来饲养农业动物，例如家禽(gallinaceous birds)、牛、绵羊、公山羊、猪哺乳动物，家畜或宠物，例如狗或猫，以及鱼或贝类，例如鲑鱼、鳕鱼、罗非鱼(Tilapia)、蛤、牡蛎、龙虾或螃蟹。
本发明优选的实施方案使用通过酶处理鱼肉或骨架生产的FPH物质。优选使用酶组合物ProtamexTM，而且鱼优选鲑鱼。
图1显示酶处理的鱼蛋白水解物(FPH)降低血浆中胆固醇的浓度。
图2显示酶处理的鱼蛋白水解物(FPH)降低肝脏中胆固醇的浓度。
图3显示酶处理的鱼蛋白水解物抑制ACAT酶。
图4显示酶处理的鱼蛋白水解物增加线粒体β-氧化作用。
本申请中使用的定义
动物
在上下文中，术语“动物”包括哺乳动物例如人类和家(农)畜，特别是具有经济重要性的动物例如家禽、牛、绵羊、公山羊和猪哺乳动物，特别是那些产生适合人类消费的产品，例如肉、蛋和奶的动物。进一步地，该术语意指包括鱼和贝，例如鲑鱼、鳕鱼、罗非鱼、蛤和牡蛎。该术语也包括家畜例如狗和猫。
治疗
与本发明的药物应用有关，术语“治疗”指的是疾病严重程度的降低。
预防
术语“预防”指的是预防给定的疾病，即本发明的化合物在所述病况发作前施用。这意味着本发明的化合物可被用作预防剂或用作功能性食品或饲料中的成分，以便预防给定疾病的危险或发作。
FPH-酶处理的鱼蛋白水解物
FPH物质是蛋白水解物，它是由酶处理鱼物质产生的。FPH物质包含高比例的蛋白质和肽。
本发明化合物的施用
作为药用药剂，本发明的化合物可以通过任何适当的技术，包括胃肠外、鼻内、口服或通过皮肤吸收，直接对动物施用。它们可以被局部地或全身地施用。每个药剂施用的特定途径将取决于，例如动物的医学史。优选的施用途径为口服。
胃肠外施用的例子包括皮下、肌内、静脉内、动脉内和腹膜内施用。
如果连续给药，每个本发明化合物的典型地通过每天1-4次注射或连续皮下输射，例如使用微型泵而被施用。也可以使用静脉内袋溶液。在选择适当剂量中的关键因素是所获得的结果，如通过减少总体重或脂肪与瘦物质的比例测量的，或者通过其它测量肥胖的控制或预防或肥胖相关病况(如由专业人员认为是合适的)的预防的标准测量的。
对于胃肠外施用，在一个具体实施方式
中，通常通过各以期望的纯度，以单位剂量可注射形式(溶液、悬浮剂或乳剂)，和药物上可接受的载体(即在使用的剂量和浓度下对接受者无毒并且与制剂的其它成分兼容的载体)混合，配制本发明的化合物。
通常，通过使本发明的化合物各自均一和紧密地液体载体或细粉碎的固体载体或它们二者接触，制备所述制剂。然后，如果需要，将产品成形为期望的制剂。优选地载体为胃肠外载体，更优选地为与接受者的血液等渗的溶液。这类载体赋形剂的例子包括水、盐、林格氏溶液和葡萄糖溶液。非水性赋形剂例如不挥发性油和油酸乙酯在本申请中也适用，以及脂质体。
载体可以适当地包含小量的添加剂例如增强等渗性和化学稳定性的物质。这类物质在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其它有机酸或它们的盐类；抗氧化剂例如抗坏血酸；免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；单糖，双糖，和其它碳水化合物包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；反荷离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如聚山梨酯、泊洛沙姆或PEG。
对于口服的药物组合物，可以使用这类载体物质例如，水、明胶、树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、油、聚烯烃二醇(polyalkeneglycol)、凡士林等等。这类药物制剂可以呈单位剂量形式并可以另外包含其它治疗上有价值的物质或常规的药物辅剂例如防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等等。药物制剂可以呈常规的液体形式例如片剂、胶囊、糖衣丸、安瓿等等，呈常规的剂型，例如干燥安瓿(ampulles)，以及栓剂等等。
另外，本发明的化合物与对抗或预防特定疾病的其它治疗联合被适当地施用。
通过参考下面的实施例，将更加充分地理解本发明。然而它们不应解释为限制本发明的范围。
本发明优选的具体实施方式
涉及包含FPH物质的营养组合物，它可以以任何常规方法被配制成饲料或食品。
实验部分
下面的非限制性实施例用来进一步说明本发明。
化学品棕榈酰-L-肉毒碱(54Ci/mmol)购自Amersham。用于实时RT-PCR的化学品来自Applied Biosystems。所有其它化学品来自普通商业来源并为试剂级。
鱼蛋白水解物(FPH)
如在实施例1中所描述，FPH产自在切鱼片后残余在鲑鱼骨架上的鱼肉，Supro 530EX大豆蛋白来自duPont蛋白质技术公司(duPontProtein Technologies)(美国密苏里州圣路易斯)(St.Louise，MO，USA)，而牛酪蛋白钠盐，C-8654来自Sigma-Aldrich。
动物和治疗
4-5周大的雄性肥胖Zucker大鼠，Crl:(ZUC)/faBR来自德国Charles River，在实验开始时平均120±3g，保存于室内，保持在12小时亮-暗循环下，温度20±3℃，相对湿度65±15％。在到达后的第二天，大鼠随机化并隔离放置于代谢笼中，并分为三个实验组，每组6只动物。大鼠适应实验条件及实验膳食4天，然后收集粪便7天。半纯化膳食(表1)，包含以FPH或酪蛋白(对照)形式的20％粗蛋白(N×6.25)。
表1
实验膳食的组成
1豆油的脂肪酸组成(g/100g脂肪)18:2n-6(54.1±0.5)，18:1n-9(21.8±0.2)，16:0(11.2±0.1)，18:3n-3(6.1±0.2)，18:0(3.7±0.1)，18:1n-7(1.5±0.1)，20:0(0.5±0.1)，22:0(0.5±0.1)。
2维生素(mg/kg膳食)8mg维生素A(4000I.U.)，2mg维生素D3(1000I.U.)，60mg维生素E(30I.U.)，0.1mg维生素K(0.05I.U.)，1000mg酒石酸氢胆碱，4mg硫胺，3mg核黄素，6mg吡哆醇，20mg尼克酸，8mg泛酸钙，1mg folin，5mg维生素B12(0.05I.U.)。
3矿物质(g/kg膳食)8.5g CaCO3，6.2g CaHPO4×2H2O，12.3gKH2PO4，1.4g MgCO3，0.4g NaCO3，0.8g NaCl，0.02g CuSO4×5H2O，0.002g NaF，0.0002g KI，0.2g FeSO4×H2O，0.05g ZnSO4×H2O。
每日提供给动物等量的饲料配给量，对其进行调整以满足生长动物的需要。动物可以自由获得自来水。大鼠在适应环境后饲养22或23天(在第22天每组杀死三只大鼠，其余的在第23天杀死)，并且每周测量体重。在饲养期末，通过1∶1的Hypnorm/Dormicum(芬太尼/氟丁酰酮-咪达唑仑)，0.2mL/100g体重皮下麻醉动物。进行心脏穿刺收集血样(在肝素中)，并且解剖肝脏。部分肝脏立即在液N2中冷冻，而其余的肝脏冷藏于冰上进行匀化。方案得到了挪威国家活动物生物学实验委员会(Norwegian State Board of BiologicalExperiments with Living Animals)的批准。
亚细胞部分的制备
来自大鼠的肝脏在冰冷的蔗糖溶液(0.25mol/L蔗糖于10mmol/LpH7.4 HEPES缓冲液和1mmol/L EDTA中)中使用Potter-Elvehjem匀浆器单个地匀化。亚细胞部分按Berge，R.K.等人(Berge，R.K.，Flatmark，T.& Osmundsen，H.(1984)，Enhancement of Long-chainacyl-CoA hydrolase activity in peroxisomes and mitochondria of ratliver by peroxisomal proliferators.Eur J Biochem 141637-644)所述进行分离。简要地，匀浆以1000×g离心10分钟从核部分分离后核(post-nuclear)。富含线粒体部分以10000×g离心10分钟从后核部分制备。富含过氧化物酶体部分通过以23500×g 30分钟离心后线粒体部分制备。富含微粒体部分以100000×g75分钟从后过氧化物酶体部分分离。收集剩余上清液作为胞质部分。步骤在0-4℃进行，而且各部分储存于-80℃。使用BioRad蛋白质分析试剂盒(加拿大Heraules，BioRad，)分析蛋白质，并且牛血清白蛋白作为标准。
酶分析
肉毒碱棕榈酰转移酶I(CPT-I)活性基本上按照Bremer(Bremer，J.(1981)The effect of fasting on the activity of liver carnitinepalmitoyltransferase and its inhibition by malonyl-CoA.BiochimBiophys Acta 665628-631)所描述进行测量。CPT-I分析包括20mmol/L pH7.5 HEPES，70mmol/L KCl，5mmol/L KCN，100μmol/L棕榈酰-辅酶A，10mgBSA/mL和0.6mg组织蛋白/mL。反应从200μmol/L[甲基-14C]L-肉毒碱(200cpm/nmol)开始。除了省去BSA并包括0.01％Triton X-100之外，CPT-II分析条件相同。组织蛋白浓度为2.5μg/mL。使用130mg蛋白质和14C-油酰基-辅酶A作为底物检测酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)。该产物使用己烷∶二乙醚∶乙酸(80∶20∶1)作为流动相在TLC板上分离，并在闪烁计数器(WinSpectral 1414流体闪烁计数器，华莱士)中计数。使用80mg蛋白和14C-3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)-辅酶A作为底物检测HMG-辅酶A还原酶。使用丙酮∶苯(1∶1)作为流动相在TLC板上分离该产物，而且在闪烁计数器中计数。如Roncari(Roncari，D.A.(1981)Fatty acidsynthase from human liver.Methods Enzymol 71 Pt C73-79)所描述检测脂肪酸合酶，根据Skorve等人(Skorve，J.al-Shurbaji，A.，Asiedu，D.，Bjorkhem，I.，Berglund，L.& Berge，R.K.(1993)On the mechanismof the hypolipidemic effect of sulfur-substituted hexadecanedioic acid(3-thiadicarboxylic acid)in normolipidemic rats.J LipidRes341177-1185)改进，并且通过检测结合到丙二酰辅酶A中NaH14CO3的量测定乙酰辅酶A羧化酶。
脂类分析
在Tecnicon Axon系统(纽约州塔利顿(Tarrytown)的迈尔斯(Miles))中，用Bayer甘油三酯和胆固醇酶试剂盒(纽约州塔利顿Bayer)和PAP150磷脂酶试剂盒(法国里昂的bioMérieux)检测全肝脏和肝素化血浆中的脂类。根据Bligh和Dyer(Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(1959)A rapid method of total lipid extraction and purification，Can J Biochem Physiol 37911-91)首先提取肝脏脂类。
粪固醇类
根据Suckling等人(Suckling，K.E.，Beuson，G.M.，Bond，B.，Gee.，A.，Glen，A.，Haynes，C.&Jackson，B.(1991)Cholesterol lowering andbile acid excretion in the hamster with cholestyramine treatment.Atherosclerosis 89183-190)有一些改进来制备粪总胆汁酸。将2mL的乙醇中的NaBH(mg/mL)加到0.1g粉状干粪中。在环境温度下使得该混合物反应1小时，然后加50μl 2mol/L HCl以去除任何过量的NaBH。在样品用200μl 10mol/L NaOH于110℃水解过夜之前，用正己烷(两次连续清洗)从样品中提取中性固醇。将240μl水解物与2.8ml水一起应用于在事先已经用3mL甲醇和3mL水活化的Bond Elut C18柱(Varian，200mg，3mL)。胆汁酸保留在柱中，在胆汁酸用3mL甲醇洗脱之前，用3mL 20％甲醇水溶液洗涤2次。胆汁酸在45℃风干并溶解于1mL异丙醇中。总胆汁酸是在Tecnicon Axon系统上使用总胆汁酸诊断试剂盒(Sigma 450A)酶法测定。
氨基酸
膳食中的氨基酸是根据Cohen和Strydom(34)的方法，在6M HCl中，在110±2℃水解22小时，并用苯异硫氰酸盐预衍生化后测定的。饲料中的总半胱氨酸是在半胱氨酸和胱氨酸用9∶1的过甲酸(88％)∶H2O2(30％)(v/v)氧化产生半胱磺酸后测定的。然后将样品在6M HCl中，在110±2℃水解22小时并且如上面描述的氨基酸分析进一步处理。在肝脏和血浆中的氨基酸是在配备有如前所述(24)带有茚三酮衍生化后柱的锂柱的Biochrom 20 plus氨基酸分析仪(AminoAcid Analyzer)(瑞典Amersham Pharmacia Biotech)中测定的。在分析之前，肝脏样品通过加2体积的5％磺基水杨酸，保持于冰上30分钟并在5000×g离心15分钟来提取并去除蛋白质。上清液与内标物(2.5mmol/L正亮氨酸于0.1mol/L HCl中)以4∶1(v/v)混合。血浆样品与内标物(1mmol/L正亮氨酸于0.1mol/L HCl中)以1∶1混合，10000×g离心5分钟，然后将上清液于滤器管(美国Millipore公司，截止10kDa，Biomax PB聚醚砜膜)中10000×g离心30分钟。
脂肪酸组成
脂肪酸用2∶1的氯仿∶甲醇(v/v)(35)从样品中提取。该样品经过过滤、皂化并于12％BF3的甲醇中(v/v)酯化。使用Lie和Lambertsen(Lie，O.&Lambertsen，G.(1991)Fatty acid composition ofglycerophospholipids in seven tissues of cod(Gadus morhua)，determined by combined high-performance liquid chromatographyand gas chromatography.J Chromatogr 565119-129)描述的方法，分析来自肝脏和血浆的总脂类的脂肪酸组成。脂肪酸甲酯使用配备有50m CP-sil 88(荷兰Middelburg，Chrompack)熔凝硅石毛细管柱(i.d.0.32mm)的Carlo Erba气相色谱仪(‘柱上冷’注射，69℃20秒，以25℃/分钟增加至160℃并在160℃保持28分钟，以25℃/分钟增加至190℃并在190℃保持17分钟，以25℃/分钟增加至220℃并在220℃保持9分钟)分离。脂肪酸是使用标准的甲酯混合物(美国明尼苏达Elyian，Nu-Chek-Prep)通过保留时间鉴定的。脂肪酸组成(重量百分比)是使用与气液色谱仪(GLC)连接的积分仪(TurbochromNavigator，4.0版本)来计算的。
脂类是使用氯仿和甲醇混合物从血浆富含三酰甘油的脂蛋白部分提取的，并且在硅胶板(0.25mm硅胶60，Merck)上通过薄层层析分离，在己烷-二乙醚-乙酸(80∶20∶1，v/v/v)中展开并使用若丹明6G(0.05％于甲醇中，Sigma)和紫外光显影。将斑点刮下并转移到含有二十一碳烷酸(21∶0)作为内标物的管子中。为了转酯作用，将BF3-甲醇加到样品中。为去除中性固醇以及不可皂化的物质，将脂肪酰基甲酯的提取物在0.5mol/L KOH于乙醇水溶液(9∶1)中加热。然后使用BF3-甲醇再酯化回收的脂肪酸。在GC8000Top气相色谱仪(Carlo Erba Instrument)上分析甲酯，该气相色谱仪配备有火焰电离检测器(FID)，可编程温度的汽化注射器，AS800自动取样器(CarloErba Instrument)和含有高极性SP2340相膜厚度为0.2μm(Supelco)的毛细管柱(60m×0.25mm)。初始温度为130℃，以1.4℃/min加热到最终温度214℃。注射器温度为235℃。检测器温度为235℃，使用氢气(25mL/min)，空气(350mL/min)和氮气作为补充气体(30mL/min)。样品采用恒定流量运行，使用氢气作为载气(1.6mL/min)。分流比为20∶1。甲酯通过与已知的标准物(瑞典马尔摩(Malmo)Larodan精细化学药品(Fine Chemicals)公司)比较来阳性鉴定并通过质谱法来验证。脂肪酸的定量用比色卡(Chrom-Card)A/D 1.0色谱站(Carlo Erba Instruments)，基于二十一碳烷酸作为内标物完成。
酰基辅酶A酯
肝脏中的酰基辅酶A酯是通过反相高效液相色谱法测定的。将100mg冰冻肝脏在冰冷的1.4mol/L HClO4和2mmol/L D-二硫苏糖醇中匀化以获得10％(w/v)匀浆，并以12000×g离心1分钟。将122μl冰冷的3mol/L K2CO3与0.5mol/L三乙醇胺加到500μl上清液中。在冰上10分钟后，溶液在4℃以12000×g离心1分钟。把40μl上清液注到高效液相色谱法柱上，并根据Demoz等人(39)测定酰基辅酶A酯，有以下的改进调整洗脱缓冲液A到pH5.00，梯度洗脱的特征如下0分钟，83.5％A；10分钟，55％A；17分钟，10％A，而且流速为1.0mL/min。
血浆富含三酰甘油的脂蛋白部分的分离
血浆中富含甘油三酯脂蛋白部分是通过在15℃以105000×g，超速离心密度为1.063g/mL的3mL血浆19小时制备的。将管子倾斜(sliced)，而且收获每管顶部1mL的漂浮部分。然后将该部分用pH7.4、氮饱和的150mmol/L氯化钠、16mmol/L磷酸钠和4mmol/L磷酸钾透析。
实时定量RT-PCR
使用Trizol(Gibco BRL)纯化总RNA，并且在100μl总体积中通过使用反转录酶试剂盒(Applied Biosystems)反转录1□g总RNA。其中省略RNA的反应用作阴性对照，而且其中稀释RNA的反应用作标准曲线。
使用Primer Express(Applied Biosystems)设计大鼠Δ9、Δ6和Δ5去饱和酶，过氧化物酶体增殖剂活化受体(PPAR)α和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的引物和Taqman探针。使用GAPDH和18SrRNA作为内源性对照。18S rRNA的引物和Taqman探针购自AppliedBiosystems。
对每个样品，在ABI7900序列检测系统(Applied Biosystems)上进行实时PCR一式三份。对于Δ9、Δ6和Δ5去饱和酶、PPARα和GAPDH，每一个20μl反应包含3μl第一链cDNA，1×Universal MasterMix(Applied Biosystems)，每个正向和反向引物300nmol/L和250nmol/L Taqman探针。对于18S rRNA，反应包含3μl第一链cDNA，1×Universal Master Mix(Applied Biosystems)，和1×18S探针/引物反应混合液。所有反应如通常由Applied Biosystems所推荐的，使用下面循环参数进行50℃2分钟和95℃10分钟，接着40个循环的95℃15秒和60℃1分钟。对每一未知样品，使用C末端(Ct)读数(treshold循环数)以计算去饱和酶、PPARα和GAPDH和18SrRNA的数量。对于每个样品，将结果对GAPDH和18S rRNA标准化。只有对GAPDH标准化的结果被显示，但这与对18S rRNA标准化的结果是相似的。
来自每个试验组中6只动物的结果报告为平均数±平均标准误(SEM)。统计分析通过单因素方差分析Dunett’s检验(Prism，GraphPad)进行。
实施例1
鱼蛋白水解物的制备
FPH产自在切鱼片后残余在鲑鱼骨架上的鱼肉。来自刚切过鱼片的新鲜大西洋鲑鱼(Salmon salar，L)的无头骨架直接取自生产线并冷冻于-20±2℃在一周内在酶水解过程中使用冷冻骨架。
酶水解是用ProtamexTM，在pH大约6.5而且温度55±2℃进行的。ProtamexTM(E.C.3.4.21.62/3.4.24.28)为来自Novozymes AS(丹麦Bagsvaerd)的杆菌蛋白酶复合体并且满足对食物级别酶的纯度需要。鲑鱼骨架对水的比率为1.14。在水解中使用酶对底物比率为11.1AU/kg粗蛋白。在酶处理60分钟后，温度提升到98℃，在105分钟后达到该温度。
大的骨保留在水解池中，而小的骨通过筛网由过滤水解物而去除。此后，在将剩余混合物在三相分离器(德国Westfalia，SB-7-36-+76，4kW，8520rpm)中分离成鲑鱼油、乳液部分和水性部分之前，将不溶解的部分在两相分离器(德国Westfalia，SC.35-26-177，15kW，7200rpm)中去除。将水性部分浓缩(丹麦NitroAtomicer，降膜式蒸发器，EF100)，通过标定分子量极限为100000的超滤膜(英国PCI膜系统，PF100，2,65m2)过滤，并最后将超滤膜过滤的部分(UF部分)喷雾干燥(丹麦NitroAtomizer，P-63塔，Tin＝200℃，Tout＝84℃)。
UF部分称作鱼蛋白水解物(FPH)并在下面显示的实验中使用。基于干重，FPH物质包含大约83％蛋白质，10％灰分和大约2％脂质。氨基酸组成在表2中给出。
表2
通过用ProtamexTM水解鲑鱼骨架获得的UF部分中的全部氨基酸
实施例2
FPH诱导血浆胆固醇降低作用
给肥胖的Zucker大鼠提供包含20％FPH作为唯一蛋白质来源的膳食。FPH为无脂肪酸的鱼蛋白水解物(FPH)，如上面所述生产。
与饲喂酪蛋白作为饲料蛋白质的大鼠相比，饲喂FPH的Zucker大鼠中血浆胆固醇水平减少49％。结果如图1所示。结果清楚地表明FPH减少血浆中的胆固醇水平并能用作胆固醇降低剂。
实施例3
FPH减少肝脏中三酰甘油的浓度
图2显示FPH诱导肝脏中三酰甘油(TG)浓度降低大约50％。这表明本发明的化合物用能作脂类降低剂，并且用来治疗和预防脂肪肝。
实施例4
FPH抑制酰基-辅酶A胆固醇酰基转移酶的活性
酰基-辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)催化其中脂肪酰基-辅酶A被酯化成胆固醇的反应。然后胆固醇酯(cholesteryl ester)可以以脂滴的形式储存于细胞质中或与游离胆固醇一起作为VLDL部分分泌。因此，ACAT在VLDL分泌和随后的胆固醇酯累积以及心血管疾病的危险中发挥主要作用。在本发明的Zucker大鼠实验中，PFH蛋白质改变了富含三酰甘油脂蛋白部分中脂类分类的组成，即与饲喂酪蛋白的大鼠中的相比，胆固醇酯和磷脂含量更低，而三酰甘油含量更高。此外，图3显示饲喂FPH蛋白质大鼠中的ACAT活性比那些饲喂酪蛋白的降低。因为存在有力的证据增加的ACAT活性在动脉粥样硬化的进展中发挥重要作用(46-49)，这个发现显示FPH和大豆蛋白是心脏保护剂。
图3显示在饲喂FPH的大鼠中ACAT活性比饲喂酪蛋白的Zucker大鼠减少约30％。
实施例5
FPH增加线粒体β-氧化作用
图4显示FPH增加线粒体β-氧化作用。增加的脂肪酸氧化作用是FPH脂类降低作用之后的重要因素。增加的脂肪酸分解代谢将减少可用于酯化作用的脂肪酸的量，并且因此减少肝脏产生和分泌VLDL。从图4可以看到与对照比较，FPH显著增加棕榈酰辅酶A的氧化作用。
实施例6
FPH干扰脂类内环境稳定
本发明的数据显示，无脂肪的FPH物质干扰脂类内环境稳定，并可以促进其内源性配体累积。尽管与那些饲喂酪蛋白的大鼠相比，在饲喂FPH大鼠中PPARα的mRNA水平(数据未显示)无变化，但肝脏、血浆和富含三酰甘油脂蛋白部分中的脂肪酸组成被改变，并且在肝脏和血浆中的变化不平行(表3-5)。与那些饲喂酪蛋白的相比，在饲喂FPH的大鼠中，特别是那些饲喂大豆蛋白的动物中，肝脏饱和的14:0和16:0脂肪酸的浓度降低(表3)，而18:0增加。在饲喂FPH的大鼠中，肝脏单不饱和脂肪酸，包括18:1n-9的浓度降低。结果，在饲喂FPH的大鼠中，18:1n-9/18:0比率减少54。然而肝Δ9去饱和酶的mRNA水平没有受到膳食蛋白质的影响(数据未显示)。和肝脏形成对比的是，血浆中在饱和与单不饱和脂肪酸方面发现相反的作用(表4)。通过饲喂FPH，在血浆中，饱和脂肪酸14:0和16:0增加。在饲喂FPH的大鼠中，单不饱和脂肪酸18:1n-9和16:1n-7增加1.3-1.5倍，而且18:1n-9与18:0的比率增加。在饲喂FPH和大豆蛋白的大鼠中，在富含三酰甘油的脂蛋白部分中(表5)，在饱和与单不饱和脂肪酸中只有较小的变化，也就是说磷脂中16:1n-7减少。在富含三酰甘油的脂蛋白部分中，18:1n-9/18:0比率一般不变化。用FPH时，肝脏中的n-6脂肪酸中的18:3n-6不变化，18:2n-6增加小于两倍，而20:3n-6和20:4n-6增加几倍。这导致18:3n-6/18:2n-6比率减少，显示减少的Δ6去饱和作用。肝Δ6去饱和酶mRNA表达确实减少(数据未显示)。此外，20:4n-6/20:3n-6比率减少，显示减少的Δ5去饱和作用，与减少的肝Δ5去饱和酶mRNA水平一致(数据未显示)。可以看到在饲喂FPH的动物中，20:4n-6/18:2n-6比率两倍增加和20:4n-6/18:3n-6比率3到5倍增加。因此预期它们的肝延伸酶(elongase)活性增加。饲喂FPH的动物显示18:2n-6增加的血浆浓度，而它们显示20:4n-6减少的血浆浓度。结果血浆中它们的20:4n-6/18:2n-6比率减少54。另外，在饲喂FPH的动物中，相对于那些饲喂酪蛋白的动物，20:4n-6/20:3n-6比率减少60％。此外在饲喂FPH的动物中存在18:3n-6/18:2n-6和20:4n-6/18:3n-6比率减少的趋势，尽管不显著。在富含三酰甘油的脂蛋白部分中，脂肪酸组成类似血浆特征，也就是说18:2n-6增加而20:4n-6减少，导致在饲喂FPH的动物中减少的20:4n-6/18:2n-6(减少49-68％)，20:4n-6/18:3n-6(减少53-65％)和20:4n-6/20:3n-6(减少35-37％)比率。在两个FPH饲喂的大鼠中，肝脏中测定的所有n-3脂肪酸增加。通过FPH饲喂，血浆中18:3n-3增加1.8。在FPH饲喂的大鼠中，20:5n-3显著增加(44％增加)，而通过FPH饲喂DHA减少(27％减少)。在饲喂FPH的大鼠中，在富含三酰甘油的脂蛋白部分中，n-3脂肪酸模式的组成只有磷脂变化，而20:5n-3和22:5n-3增加。这与在血浆中的发现类似。
表3
饲喂FPH或酪蛋白三周的Zucker大鼠肝脏中脂肪酸组成1
1数值为平均数±平均标准误，n＝6
*与酪蛋白不同，P＜0.05 n.d.未检测
表4
饲喂FPH或酪蛋白三周的Zucker大鼠血浆中脂肪酸组成1
1值为平均数±平均标准误，n＝6
*与酪蛋白不同，P＜0.05
表5
饲喂FPH或酪蛋白三周的Zucker大鼠的富含三酰甘油的脂蛋白部分中不同脂质分类的脂肪酸组成1
1数值为平均数±平均标准误，n＝3(全部6只大鼠，但混合来自两只大鼠的血浆)
*与酪蛋白不同，P＜0.05；n.d.，未检测；大豆，大豆蛋白。
实施例7
FPH降低血浆中同型半胱氨酸的浓度
增加的同型半胱氨酸水平，也就是说已经提出高同型半胱氨酸血症与动脉疾病有联系，因此我们测定来自大鼠血浆样品中的同型半胱氨酸水平。
总血浆同型半胱氨酸是通过全自动荧光分析测定的。用30μlNaBH4/DMSO溶液(6mo1/L)还原30μl血浆。1.5分钟后，加20μl荧光试剂monobromobimane(25mmol/L)的乙腈溶液并允许反应3分钟。然后立即用HPLC通过注射到强阳离子交换柱上分析20μl样品，然后通过柱转换进入环己基硅石柱。无梯度洗脱SCX柱并用线性甲醇梯度(17-35％于5分钟内)于20mmol/L甲酸盐缓冲液中洗脱CH柱。同型半胱氨酸在保留时间4.5分钟时被洗出。结果在表5中给出。
表5.
血浆同型半胱氨酸的浓度
权利要求
1.酶处理的鱼蛋白水解物(FPH)物质在制备药物或营养制剂中的用途，该药物或营养制剂用于治疗和/或预防动物中动脉粥样硬化、冠心病、狭窄、血栓形成、心肌梗塞、中风和脂肪肝。
2.FPH物质在制备用于治疗和/或预防高胆固醇血症的药物或营养组合物中的用途。
3.FPH物质在制备用于降低血浆中同型半胱氨酸浓度的药物或营养组合物中的用途。
4.FPH物质在制备药物或营养心脏保护组合物中的用途。
5.根据前面权利要求之一的FPH物质的用途，其中所述动物为人类。
6.根据前面权利要求之一的FPH物质的用途，其中所述动物为农业动物，例如家禽、牛、绵羊、公山羊或猪哺乳动物。
7.根据前面权利要求之一的FPH物质的用途，其中所述动物为家畜或宠物，例如狗或猫。
8.根据前面权利要求之一的FPH物质的用途，其中所述动物为鱼或贝类，例如鲑鱼、鳕鱼、罗非鱼、蛤、牡蛎、龙虾或螃蟹。
9.根据权利要求1的用途，其中所述鱼物质为切鱼片后在鲑鱼骨架上的鱼肉残余物。
10.根据权利要求1的用途，其中所述水解是通过酶物质杆菌蛋白酶复合体(ProtamexTM)进行的。
11.根据权利要求1的用途，其中所述酶水解是在5,0-8,0，优选6,0-7,0的范围内，最优选大约6,5的pH下进行的。
12.根据权利要求1的用途，其中所述酶水解是在40-70℃，更优选50-60℃的范围内，最优选在大约65℃的温度下进行的。
13.根据权利要求1-12之一的用途，其中所述组合物为食物级别产品或添加剂，例如动物饲料或宠物食品。
14.生产酶处理的鱼蛋白水解物(FPH)的方法，其特征在于该方法包括下面的步骤
a)用蛋白酶在5,0-8,0，优选6,0-7,0的范围内，最优选在大约6,5的pH下，和在40-70℃，更优选50-60℃的范围内，最优选在大约65℃的温度下，水解鱼肉残余物，
b)将温度升高到大约90-99℃
c)通过倾析和过滤去除不溶解的部分，并且在三相分离器中将剩余的混合物分离为油部分、乳液部分和水性部分，并且
d)分离水性部分，然后通过标定分子量极限为100000的超滤膜过滤，并且此后喷雾干燥。
15.根据权利要求14的方法，其中所述PFH物质包含70-90％，优选80-85％，最优选大约83％的蛋白质。
16.根据权利要求14的方法，其中所述PFH物质的氨基酸含量在表2中给出。
全文摘要
本发明涉及酶处理的鱼蛋白水解物(FPH)的用途。FPH物质降低血浆中胆固醇和肝脏中甘油三酯的浓度。FPH也诱导脂肪酸模式中有利的变化，并且降低血浆中同型半胱氨酸的浓度。本发明优选的实施方案涉及FPH作为抗动脉粥样化和心脏保护剂的用途，其以药物或功能食品的形式被给予。
文档编号A61P9/10GK1845748SQ200480024880
公开日2006年10月11日 申请日期2004年7月2日 优先权日2003年7月4日
发明者R·伯格 申请人:伯格生物医药有限公司