专利名称：甘露聚糖肽注射剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种甘露聚糖肽注射剂及其制备方法，属药物领域。
背景技术：
甘露聚糖肽是一种糖蛋白，它是从a-溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus-α-hemolysis)的发酵产物，可口服、注射等多种服药方式。用于恶性肿瘤放、化疗中改善免疫功能低下的辅助治疗。它能在体外抑制S-180，艾氏腹水癌和人舌麟状细胞癌Tca8113等细胞株的DNA和RNA6的合成葡萄糖代谢。动物体内能抑制艾氏腹水癌和S-180肉瘤、HePA肝癌腹水瘤的生长(抑瘤率63％)，能提升外周白细胞，增强网状内皮系统吞噬功能，活化巨噬细胞及淋巴细胞，诱导胸腺淋巴细胞产生活性物质，改善和增加机体免疫功能和应激能力。
目前，注射用甘露聚糖肽的疗效确切，已有申请号03137070发明名称“注射用甘露聚糖肽冻干粉针制剂”，公开一种注射用甘露聚糖肽冻干粉针制剂，其含有作为活性成分的α-甘露聚糖肽和可药用辅料，其中α-甘露聚糖肽在冻干粉针制剂中的重量百分比可以是1-80％，其在制剂中的含量范围内是1-100mg。申请号03100883，发明名称“甘露聚糖肽注射液及其制备方法和使用方法”，公开了一种甘露聚糖肽注射液，其中含有甘露聚糖肽，等渗物质，其余为水，其中所含甘露聚糖肽的浓度在注射液中为1mg/L～2000mg/L，并且每支或者每瓶中所装注射液的体积为50～1000ml。但是，甘露聚糖肽注射剂的毒副作用的临床报道亦较多，如海峡都市报2003-03-31，题为“慎用“甘露聚糖肽注射剂””，指出“甘露聚糖肽”又名多抗甲素，目前作为免疫增强剂应用于临床。近几个月来，有关甘露聚糖肽注射剂的可疑不良反应有瘙痒、皮疹7例，寒战、发热1例，不同程度胸闷、呼吸困难10例。其中死亡病例5例(包括脑死亡1例)，死亡病例的不良反应表现为胸闷、呼吸困难。国家食品药品监督管理局于二○○三年四月十一日发出“关于修订甘露聚糖肽注射剂说明书的通知”，指出甘露聚糖肽注射剂(曾用名多抗甲素)近来发生了严重的不良反应，其具体的不良反应如下1、过敏反应瘙痒、皮疹、红斑、风团、寒战、发烧，严重时可引起过敏性休克。2、呼吸系统胸闷、呼吸困难，有发生呼吸骤停的报告。3、注射局部疼痛。
引起甘露聚糖肽注射剂不良反应的因素是内毒素(endotoxin)，由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的高分子复合物，亦称热原，存在于细菌的细胞膜和固体膜之间。(《中药药剂学》上海科学技术出版社，范碧亭主编，224页)。除去内毒素的常规方法是高温法、吸附法、离子交换法、凝胶滤过法、超滤法、反渗透法等，其中最常用是吸附法(活性炭吸附，活性炭常用量约为溶液体积的0.1％～0.5％)，但是活性炭在吸附热原的同时，也吸附药液中的有效成分；高温法破坏热原的同时，也易破坏不耐高温的有效成分，其它方法目前均较少用。国家药品监督管理局国家药品标准WS1-XG-056-2000“甘露聚糖肽注射液”，未对内毒素有相应的要求。且目前的甘露聚糖肽注射剂的制备方法，也未能有有效的除去内毒素的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种甘露聚糖肽注射剂，本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物的制备方法。
本发明提供了一种甘露聚糖肽注射剂，它是由甘露聚糖肽为活性成分，加上药学上可接受的注射用附加剂制备而成的注射剂，其中，每1mg注射剂中含内毒素量应小于30EU。进一步地，每1mg肌内注射剂中含内毒素量应小于30EU；每1mg静脉注射剂中含内毒素量应小于10EU。
本发明的甘露聚糖肽注射剂，它是由下述重量配比的原料制备而成的注射剂甘露聚糖肽1.5～3.5份、氯化钠8～10份。
进一步地，它是由下述重量配比的原料制备而成的注射剂甘露聚糖肽2.5份、氯化钠9份。
其中，其特征在于所述的注射剂为水针剂、粉针剂、静脉注射剂。
本发明还提供了一种制备甘露聚糖肽注射剂的方法，它包括如下步骤a、按处方量称取原料甘露聚糖肽1.5～3.5份、氯化钠8～10份；b、将a步骤称取的甘露聚糖肽、加注射用水，77～83℃保温循环，搅拌使溶解；c、称取氯化钠，加注射用水至全量，77～83℃保温循环，搅拌使全部溶解；d、加入c步骤溶液总重量的2％活性碳，77～83℃保温循环30分钟，过滤，过滤后调pH5.5～7.5、灌封，检查装量；
e、热压灭菌，灯检，成品检验，包装入库。
进一步地，b、c、d步骤所述的保温循环为80℃保温循环。
其中，步骤b所用的注射用水需用0.22μmPPES滤芯过滤。
其中，步骤d所述的过滤是先经0.45μmPPES滤芯过滤，再经0.22μmPPES滤芯过滤。
采用本发明注射剂的制备方法，既保证内毒素含量在控制范围内，同时有效成分无损失；采用内毒素作为安全控制指标，可控性强，临床使用安全性高，不良反应少。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式
实施例1本发明静脉注射液的制备甘露聚糖肽2.5g氯化钠9g，配制成1000ml。
(1)按处方量称取甘露聚糖肽、加注射用水(先用0.22μmPPES滤芯过滤)适量，80℃保温循环，搅拌使溶解。
(2)按处方量称取氯化钠，加注射用水至全量，80℃保温循环，搅拌使全部溶解。
(3)加入2％活性碳，80℃保温循环30分钟，过滤。溶液先经0.45μmPPES滤芯过滤，再经0.22μmPPES滤芯过滤，过滤后检查溶液PH、含量测定、检查澄明度，合格后灌封，检查装量。
(4)115℃热压，灭菌30分钟，灯检，成品检验，包装入库。
实施例2本发明静脉注射液的制备甘露聚糖肽1.5g、氯化钠8g，按实施例1的方法制备成1000ml溶液。
实施例3本发明粉针剂的制备甘露聚糖肽3.5g、氯化钠10g，按实施例1的方法，制备成溶液，按粉针剂制备方法干燥，即得本发明粉针剂。
实施例4本发明注射剂细菌内毒素测定取实施例1制备的注射液，依法检查(中国药典2000年版二部附录XI E)，每1mg中含有内毒素量应小于10EU。
实施例5本发明原料甘露聚糖肽分子量与分子量分布取实施例1制备的注射液80ul进样，照甘露聚糖肽项上的方法测定，重均分子量Mw应为40000～650000，分布宽度(Mw/Mn)应小于2.5。
实施例6本发明甘露聚糖肽生产工艺过程中温度及活性碳应用的筛选实验为了控制甘露聚糖肽注射液的内毒素，对甘露聚糖肽生产过程中配液的温度，是否加入活性碳以及加入活性碳时的温度进行了筛选，以药液中甘露聚糖肽的含量以及细菌内毒素的量作为考察指标。
一、实验方法按甘露聚糖肽注射液的处方称取原辅料，选择在40、50、60、70、80、90、100℃循环的注射水中搅拌使溶解，溶解完全后，分成两份，一份加入活性碳，保温循环30分钟，另一份不加活性碳，取药液测定甘露聚糖肽含量，同时测定药液中细菌内毒素的量，结果见表1。
二、实验结果表1不同药液中甘露聚糖肽含量以及细菌内毒素量测定结果
实验结果(1)不加入活性炭配制的药液，配液温度越高，细菌内毒素量越低，同时配液温度高于90℃后，药液中甘露聚糖肽的含量降低，表明甘露聚糖肽在高温条件下分解，根据以上实验结果，因此注射液的配制温度应定为80℃循环保温。
(2)加入活性炭后药液的细菌内毒素明显降低，因此注射液的配制过程中应加入活性炭。
(3)加入活性炭后，在低温条件下，甘露聚糖肽的含量降低，表明在低温条件下加入活性炭，活性炭不仅吸附了药液中的热原物质同时也吸附了药液中的甘露聚糖肽，实验结果表明温度在80℃加入活性炭，药液中甘露聚糖肽含量测定无变化，同时细菌内毒素也较低，因此在生产工艺过程中，若要达到注射剂中内毒素小于10EU，需在如下条件操作80℃加入活性炭，循环保温30分钟。
三、结论根据以上实验结果，甘露聚糖肽注射液生产工艺最佳条件为80℃循环保温配液，80℃循环保温加入活性炭。
以下毒理试验证明本发明药物的安全性。
试验例1本发明药物静脉注射剂血管刺激性实验一、实验动物日本大耳白兔、豚鼠由四川省医药实验动物质量监测中心提供动物级别一级合格证号码川实动管质第-80号二、实验药物本发明药物静脉注射剂由实施例1制备，规格5mg2ml。
三、实验方法与结果取健康无伤2Kg以上的日本大耳白兔4只，分别于一侧耳缘静脉无菌操作法注射本发明药物静脉注射剂溶液2ml/只，另一侧注射等体积的灭菌生理盐水作对照。每天注射一次，连续3次。72小时后，观察动物耳缘注射部位血管有无充血、红肿等现象，然后处死动物，取注射部位血管，用10％甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，观察血管有无病理变化。
实验结果4只兔子给药部位血管均无充血、红肿等变化，其注射部位血管也无病理变化(病理组织学检查照片附后)。
四、结论本发明药物静脉注射剂对血管无刺激作用。
试验例2本发明药物静脉注射剂全身主动过敏反应试验一、实验材料1、本发明药物静脉注射剂由实施例1制备，规格5mg2ml。
取本发明药物静脉注射剂用生理盐水配制成0.2、2mg/ml药液，动物按体重腹腔注射给药0.1ml/100g(体重)。
2、卵白蛋白上海化学试剂分装厂，批号990601。用注射用生理盐水配制成0.15mg/ml，按体重腹腔注射给药0.1ml/100g体重。
二、实验动物白色豚鼠由四川省医药实验动物质量监测中心提供，动物级别一级，合格证号码川实动管质量-80号三、实验方法取300-400g 色豚鼠24只，随机分为4组，6只/组，雌雄兼用。分组及给药情况为第一组，阴性对照组给以生理盐水，腹腔注射生理盐水0.1ml/100g体重；第二组，阳性对照组给以卵白蛋白0.15mg/Kg，腹腔注射卵白蛋白0.15mg/ml药液，0.1ml/100g体重；第三组，本发明药物静脉注射剂低剂量组腹腔注射本发明药物静脉注射剂0.2mg/ml药液，0.1ml/100g体重；第四组，本发明药物静脉注射剂高剂量组腹腔注射本发明药物注射剂2mg/ml药液，0.1ml/100g体重。
动物分组称体重一次，然后按以上分组剂量腹腔注射给药致敏，隔日一次，共5次。给药后每天观察动物精神状态、行为活动、饮食、排泄等一般症状。第五次致敏当日再称体重一次。
最后一次致敏后第10，动物称体重一次，然后用致敏剂量的5倍量(卵白蛋白0.75mg/Kg，本发明药物注射剂1、10mg/Kg)给豚鼠静脉注射给药激发，激发后立即按表2症状详细观察每只动物的反应，根据症状的出现及消失时间，观察3小时。
表2 过敏反应症状0正常 11呼吸困难1不安 12啰音2竖毛 13紫绀3颤抖 14步态不稳4搔鼻 15跳跃5喷嚏 16喘息6咳嗽 17痉挛
7呼吸急促 18侧卧8排尿 19潮式呼吸9排粪 20死亡10流泪四、实验结果实验结果评价反应分类见表3表3 反应分类0-过敏反应阴性1-4症状 + 过敏反应弱阳性1-10症状++过敏反应阳性1-19症状+++ 过敏反应强阳性20症状 ++++ 过敏反应极强阳性实验结果见表4表4本发明药物注射剂对豚鼠全身主动过敏反应试验
由表4可见，本发明药物注射剂高、低剂量组及阴性对照组动物均未出现全身主动过敏反应。
五、结论本发明药物注射剂未引起动物全身主动过敏反应。
试验例3本发明药物注射剂皮肤过敏反应试验一、实验材料1、本发明药物注射剂由实施例1制备，规格5mg2ml。
用注射用生理盐水将药品配制成0.2、2mg/ml药液，动物按体重腹腔注射给药0.1ml/100g(体重)。
2、卵白蛋白上海化学试剂分装厂，批号990601。用生理盐水配制成0.15mg/ml，按体重腹腔注射给药0.1ml/100g体重。
二、实验动物白色豚鼠由四川省医药实验动物质量监测中心提供，动物级别一级，合格证号码川实动管质第-80号三、实验方法取300-400g白色豚鼠24只，随机分为4组，6只/组，雌雄兼用。分组及给药情况为第一组，阴性对照组给以生理盐水，腹腔注射生理盐水0.1ml/100g体重；第二组，阳性对照组给以卵白蛋白0.15mg/Kg，腹腔注射卵白蛋白0.15mg/ml药液，0.1ml/100g体重；第三组，本发明药物注射剂低剂量组腹腔注射本发明药物注射剂0.2mg/ml药液，0.1ml/100g体重；第四组，本发明药物注射剂高剂量组腹腔注射本发明药物注射剂2mg/ml药液，0.1ml/100g体重。
动物分组称体重一次，然后按以上分组剂量腹腔注射给药致敏，隔日一次，共5次。
最后一次致敏后10天，豚鼠分组心脏采血，2000转/分离心10分钟分离血清，在豚鼠两侧背部剪出三个3×4cm2的皮肤，将上述各组抗血清用生理盐水稀释成1∶2、1∶8、1∶32，在三块皮肤上皮内注射三个浓度的各对应组抗血清0.1ml，24小时后，各组动物静脉注射与致敏剂量相同的药液加等量的0.5％伊文斯兰染料1ml。30分钟后麻醉处死各组动物，剪出背部皮肤，测量皮肤里层的斑点大小，斑点直径大于5mm者判断为阳性，斑点直径小于5mm者判断为阴性。
四、实验结果实验结果见表5表5本发明药物注射剂对豚鼠被动皮肤过敏反应试验结果
由表5可见阴性对照组及本发明药物注射剂高、低剂量组动物均未出现阳性反应。
五、结论本发明药物注射剂未引起动物被动皮肤过敏反应。
试验例4本发明药物注射剂溶血实验一、实验材料本发明药物注射剂由实施例1制备，规格5mg2ml。
绵羊红细胞悬液(自备)取绵羊血30ml，放入盛有玻璃珠的三角瓶中振摇10分钟，除去纤维蛋白原，使脱纤成血液，然后血液加入生理盐水，摇匀，离心，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水如法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红血球用生理盐水配成2％的悬液，供试验用。
二、试验方法取试管7只，按表6配比量依次加入2％红细胞悬液和生理盐水，混匀后，于37℃恒温箱放置半小时，然后分别加入不同量的药液(第6、7管为对照管)，摇匀后，置37℃恒温箱中。开始每隔15分钟观察一次，1小时后，每隔1小时观察一次，观察4小时，如溶液呈透明红色，即表示溶血，如溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，表示有红细胞凝聚作用。如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振摇后又能均匀分散，或将凝集物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴生理盐水，在显微镜下观察，凝聚物若能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不能被摇散或在玻片上不能被冲散者为真凝聚。
表6
三、实验结果实验结果见表7
表7本发明药物注射剂溶血实验结果
注“-”未出现溶血现象“+”出现溶血现象由表7可见本发明药物注射剂有红细胞假凝聚现象，未出现溶血现象。
四、结论本发明药物注射剂无溶血作用。
通过上述毒理试验说明，通过对本发明注射剂(肌内注射、静脉注射)中内毒素的控制(每1mg肌内注射剂中含内毒素量应小于30EU；每1mg静脉注射剂中含内毒素量应小于10EU)，通过注射剂全身主动过敏反应试验，被动皮肤过敏反应试验，溶血性试验及血管刺激性实验，结果表明本发明药物静脉注射剂无溶血作用，对动物血管无刺激性作用，未引起动物全身主动过敏反应和被动皮肤过敏反应，安全性高，可控性强。
权利要求
1.甘露聚糖肽注射剂，它是由甘露聚糖肽为活性成分，加上药学上可接受的注射用附加剂制备而成的注射剂，其特征在于每1mg注射剂中含内毒素量应小于30EU。
2.根据权利要求1所述的甘露聚糖肽注射剂，其特征在于每1mg肌内注射剂中含内毒素量应小于30EU。
3.根据权利要求1所述的甘露聚糖肽注射剂，其特征在于每1mg静脉注射剂中含内毒素量应小于10EU。
4.根据权利要求1、2或3所述的甘露聚糖肽注射剂，其特征在于它是由下述重量配比的原料制备而成的注射剂甘露聚糖肽1.5～3.5份、氯化钠8～10份。
5.根据权利要求4所述的甘露聚糖肽注射剂，其特征在于它是由下述重量配比的原料制备而成的注射剂甘露聚糖肽2.5份、氯化钠9份。
6.根据权利要求1～5任一项所述的甘露聚糖肽注射剂，其特征在于所述的注射剂为水针剂、粉针剂、静脉注射剂。
7.一种制备权利要求1所述的甘露聚糖肽注射剂的方法，它包括如下步骤a、按处方量称取原料甘露聚糖肽1.5～3.5份、氯化钠8～10份；b、将a步骤称取的甘露聚糖肽、加注射用水，77～83℃保温循环，搅拌使溶解；c、称取氯化钠，加注射用水至全量，77～83℃保温循环，搅拌使全部溶解；d、加入c步骤溶液总重量的2％活性碳，77～83℃保温循环30分钟，过滤，过滤后调pH5.5～7.5、灌封，检查装量；e、热压灭菌，灯检，成品检验，包装入库。
8.根据权利要求7所述的甘露聚糖肽注射剂的制备方法，其特征在于b、c、d步骤所述的保温循环为80℃保温循环。
9.根据权利要求7所述的甘露聚糖肽注射剂的制备方法，其特征在于步骤b所用的注射用水需用0.22μmPPES滤芯过滤。
10.根据权利要求7所述的甘露聚糖肽注射剂的制备方法，其特征在于步骤d所述的过滤是先经0.45μmPPES滤芯过滤，再经0.22μmPPES滤芯过滤。
全文摘要
本发明提供了甘露聚糖肽注射剂，它是由甘露聚糖肽为活性成分，加上药学上可接受的注射用附加剂制备而成的注射剂，其中，每1mg注射剂中含内毒素量应小于30EU。本发明还提供了甘露聚糖肽注射剂的制备方法，采用本发明注射剂的制备方法，既保证内毒素含量在控制范围内，同时有效成分无损失；采用内毒素作为安全控制指标，可控性强，临床使用安全性高，不良反应少。
文档编号A61P37/04GK1799554SQ20051002010
公开日2006年7月12日 申请日期2005年1月5日 优先权日2005年1月5日
发明者刘波, 骆俊清, 吴刚, 李军, 刘艳 申请人:成都利尔药业有限公司