专利名称：一种多硫酸化硫酸软骨素及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种多硫酸化硫酸软骨素及其制备方法。
背景技术：
硫酸软骨素为一类硫酸化的糖胺聚糖类化合物，天然产物的分子量一般在10kD～50kD之间，广泛存在于动物软骨组织中。
国内外研究表明，硫酸软骨素具有较强的降低血液中的甘油三酯和胆固醇的作用，能有效地防止动脉粥样硬化的形成。Petitou等人在美国专利“硫酸皮肤素和硫酸软骨素类硫酸化的糖胺聚糖类衍生物的制备”(Sulfated glycosaminoglycanoidderivatives of the dermatan sulfate and chondroitin sulfate type，专利号US5382570)曾报道了硫酸化硫酸软骨素的制备方法，但该法具有工艺复杂、试剂成本高，不利于工业化生产以及所得产物具有不同的结构和活性等缺点，从而限制了它的应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多硫酸化硫酸软骨素及其制备方法，该方法采用一步化学合成法对天然提取的硫酸软骨素进行结构修饰，制备出一种具有较强的抗炎和镇痛作用的多硫酸化硫酸软骨素。
本发明所述的多硫酸化硫酸软骨素，分子中含有葡萄糖醛酸衍生物和乙酰氨基半乳糖衍生物，其特征是分子结构由2-O-硫酸基-葡萄糖醛酸-(1→3)-2-N-乙酰基-2-脱氧-4或6-O-硫酸基半乳糖组成，其化学结构如下 上述的多硫酸化硫酸软骨素结构，R为SO3或H，n为1至30，多硫酸化硫酸软骨素的分子量为1kD～30kD，其分子结构中硫酸根与羧酸根的比值为2～4。
上述多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，包括以下步骤(1)硫酸软骨素的多硫酸化将硫酸软骨素配成质量百分比浓度为15％～30％的溶液，将氯磺酸∶浓硫酸为1∶0.05～0.1的混酸加入到上述溶液中，使硫酸软骨素质量百分比的终浓度为10％～15％，在温度10℃～70℃，搅拌反应2～10小时，然后加入有机溶剂终止反应，得多硫酸化硫酸软骨素沉淀物；(2)分离所需要的多硫酸化硫酸软骨素片段将上述沉淀物配成水溶液，调pH至7±0.2，加入其4～5倍量的有机溶剂使之沉淀；再将沉淀物配成水溶液，用碱调pH至10±0.2，加热至85℃±2℃，并不断进行反应器内的气体交换，保温3±0.5小时，然后用盐酸调pH至7，加入其4～5倍量有机溶剂使之沉淀，实现脱盐和除胺；
(3)收集、制备多硫酸化硫酸软骨素将步骤(2)最终获得的沉淀物配成质量百分比浓度为10％水溶液，进行凝胶层析法分离，以浓度为0.01～1.0mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集多硫酸化硫酸软骨素含量高的部分，用Sephadex G-10脱盐，常规冷冻干燥得多硫酸化硫酸软骨素。
在上述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法中，步骤(1)所述氯磺酸∶浓硫酸优选为1∶0.05～0.07。
在上述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法中，步骤(1)所述反应温度优选是30℃～40℃，搅拌时间优选是4～6小时。
在上述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法中，步骤(1)或(2)所述有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇之一。
其中，上述有机溶剂优选是体积百分比浓度为95％的乙醇。
在上述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法中，步骤(3)所述凝胶层析法中，采用的凝胶为Sephadex G-50、Sephadex G-75、Sephadex G-100、Superdex 200之一。
其中，所述凝胶优选为3.5×120cm的Sephadex G-75凝胶柱。
在上述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法中，步骤(3)所述洗脱液优选是浓度为0.2～0.5mol/L的氯化钠溶液。
本发明所述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，具有工艺简单、试剂成本低，生产环境及设备要求不苛刻，且产品纯度高的特点，极利于工业化生产。
本发明所述方法制得的多硫酸化硫酸软骨素具有较强的抗炎和镇痛作用。经试验验证，其抗凝效价≤10IU/mg，并且还具有明显的抗肿瘤增殖和抑制肿瘤转移、抑制肥大细胞脱颗粒等作用。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明所述内容作进一步阐述。
实施例1(1)硫酸软骨素的多硫酸化将硫酸软骨素精品(市售)100g配成质量百分比浓度为20％的溶液，将氯磺酸∶浓硫酸为1∶0.05的混酸加入到上述溶液中，使硫酸软骨素质量百分比的终浓度为10％，在温度35℃，搅拌反应5小时，然后加入4000ml无水乙醇终止反应，得多硫酸化硫酸软骨素沉淀物；(2)分离所需要的多硫酸化硫酸软骨素片段将上述沉淀物用1000ml蒸馏水溶解，配成水溶液，用20％氢氧化钠调pH至7，加入其4倍量的95％乙醇使之沉淀；再将沉淀物配成10％水溶液，用20％氢氧化钠调pH至10，加热至85℃，并不断进行反应器内的气体交换，保温3小时，然后用6mol/L盐酸调pH至7，加入其4倍量95％7醇使之沉淀，实现脱盐和除胺；(3)收集、制备多硫酸化硫酸软骨素将步骤(2)最终获得的沉淀物配成质量百分比浓度为10％水溶液，上Sephadex G-75凝胶柱(3.5×120cm)分离，以浓度为0.2mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集多硫酸化硫酸软骨素含量高的部分，用Sephadex G-10脱盐，常规冷冻干燥得多硫酸化硫酸软骨素。
将上述所得的多硫酸化硫酸软骨素分别进行分子量测定、结构测定和抗炎活性测定得到一种多硫酸化硫酸软骨素，分子中含有葡萄糖醛酸衍生物和乙酰氨基半乳糖衍生物，分子结构由2-O-硫酸基-葡萄糖醛酸-(1→3)-2-N-乙酰基-2-脱氧-4 or 6-O-硫酸基半乳糖组成，其主要化学结构如下 该多硫酸化硫酸软骨素的相对分子量为1kD～30kD，R为SO3或H，n为1至30，硫酸根与羧酸根的比值为2～4，具有明显的抑制肥大细胞脱颗粒作用，抗凝效价≤10IU/mg。还具有明显的抗肿瘤增殖和抑制肿瘤转移等作用，有较强的抗炎和镇痛作用。
实施例2(1)硫酸软骨素的多硫酸化将硫酸软骨素精品(市售)200g配成质量百分比浓度为30％的溶液，将氯磺酸∶浓硫酸为1∶0.07的混酸加入到上述溶液中，使硫酸软骨素质量百分比的终浓度为10％，在温度40℃，搅拌反应6小时，然后加入4000ml无水乙醇终止反应，得多硫酸化硫酸软骨素沉淀物；(2)分离所需要的多硫酸化硫酸软骨素片段将上述沉淀物用1000ml蒸馏水溶解，配成水溶液，用20％氢氧化钠调pH至7，加入其5倍量的95％甲醇使之沉淀；再将沉淀物配成10％水溶液，用20％氢氧化钠调pH至10，加热至85℃，并不断进行反应器内的气体交换，保温3.5小时，然后用6mol/L盐酸调pH至7，加入其5倍量95％甲醇使之沉淀，实现脱盐和除胺；(3)收集、制备多硫酸化硫酸软骨素将步骤(2)最终获得的沉淀物配成质量百分比浓度为10％水溶液，上Sephadex G-100凝胶柱(3.5×120cm)分离，以浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集多硫酸化硫酸软骨素含量高的部分，用Sephadex G-10脱盐，常规冷冻干燥得多硫酸化硫酸软骨素。
实施例3(1)硫酸软骨素的多硫酸化将硫酸软骨素精品(市售)100g配成质量百分比浓度为25％的溶液，将氯磺酸∶浓硫酸为1∶0.09的混酸加入到上述溶液中，使硫酸软骨素质量百分比的终浓度为10％，在温度30℃，搅拌反应10小时，然后加入4000ml丙酮终止反应，得多硫酸化硫酸软骨素沉淀物；(2)分离所需要的多硫酸化硫酸软骨素片段将上述沉淀物用1000ml蒸馏水溶解，配成水溶液，用20％氢氧化钠调pH至7，加入其4倍量的丙酮使之沉淀；再将沉淀物配成10％水溶液，用20％氢氧化钠调pH至10，加热至85℃，并不断进行反应器内的气体交换，保温3小时，然后用6mol/L盐酸调pH至7，加入其4倍量丙酮使之沉淀，实现脱盐和除胺；(3)收集、制备多硫酸化硫酸软骨素将步骤(2)最终获得的沉淀物配成质量百分比浓度为10％水溶液，上Sephadex G-50凝胶柱(3.5×120cm)分离，以浓度为0.8mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集多硫酸化硫酸软骨素含量高的部分，用Sephadex G-10脱盐，常规冷冻干燥得多硫酸化硫酸软骨素。
权利要求
1.一种多硫酸化硫酸软骨素，分子中含有葡萄糖醛酸衍生物和乙酰氨基半乳糖衍生物，其特征是分子结构由2-O-硫酸基-葡萄糖醛酸-(1→3)-2-N-乙酰基-2-脱氧-4或6-O-硫酸基半乳糖组成，其化学结构如下 其中R为SO3或H，n为1至30。
2.根据权利要求1所述的多硫酸化硫酸软骨素，其特征是所述多硫酸化硫酸软骨素的分子量为1kD～30kD，其分子结构中硫酸根与羧酸根的比值为2～4。
3.权利要求1或2所述多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，包括以下步骤(1)硫酸软骨素的多硫酸化将硫酸软骨素配成质量百分比浓度为15％～30％的溶液，将氯磺酸∶浓硫酸为1∶0.05～0.1的混酸加入到上述溶液中，使硫酸软骨素质量百分比的终浓度为10％～15％，在温度10℃～70℃，搅拌反应2～10小时，然后加入有机溶剂终止反应，得多硫酸化硫酸软骨素沉淀物；(2)分离所需要的多硫酸化硫酸软骨素片段将上述沉淀物配成水溶液，调pH至7±0.2，加入其4～5倍量的有机溶剂使之沉淀；再将沉淀物配成水溶液，用碱调pH至10±0.2，加热至85℃±2℃，并不断进行反应器内的气体交换，保温3±0.5小时，然后用盐酸调pH至7，加入其4～5倍量有机溶剂使之沉淀，实现脱盐和除胺；(3)收集、制备多硫酸化硫酸软骨素将步骤(2)最终获得的沉淀物配成质量百分比浓度为10％水溶液，进行凝胶层析法分离，以浓度为0.01～1.0mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集多硫酸化硫酸软骨素含量高的部分，用Sephadex G-10脱盐，常规冷冻干燥得多硫酸化硫酸软骨素。
4.根据权利要求3所述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征是步骤(1)所述氯磺酸∶浓硫酸为1∶0.05～0.07。
5.根据权利要求3所述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征是步骤(1)所述反应温度是30℃～40℃，搅拌时间是4～6小时。
6.根据权利要求3所述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征是步骤(1)或(2)所述有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇之一。
7.根据权利要求6所述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征是所述有机溶剂是体积百分比浓度为95％的乙醇。
8.根据权利要求3所述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征是步骤(3)所述凝胶层析法中，采用的凝胶为Sephadex G-50、Sephadex G-75、Sephadex G-100、Superdex200之一。
9.根据权利要求8所述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征是所述凝胶为3.5×120cm的Sephadex G-75凝胶柱。
10.根据权利要求3所述的多硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征是步骤(3)所述洗脱液是浓度为0.2～0.5mol/L的氯化钠溶液。
全文摘要
本发明公开了一种多硫酸化硫酸软骨素，其分子中含有葡萄糖醛酸衍生物和乙酰氨基半乳糖衍生物，其特征是分子结构由2－O－硫酸基－葡萄糖醛酸－(1→3)－2－N－乙酰基－2－脱氧－4或6－O－硫酸基半乳糖组成，分子量为1kD～30kD，硫酸根与羧酸根的比值为2～4。本发明还公开了该多硫酸化硫酸软骨素制备方法，是将硫酸软骨素磺化得到。本发明的多硫酸化硫酸软骨素具有明显的抗肿瘤增殖和抑制肿瘤转移、抑制肥大细胞脱颗粒等作用，抗凝效价≤10IU/mg，并且还具有较强的抗炎和镇痛作用。
文档编号A61K31/737GK1789287SQ20051004539
公开日2006年6月21日 申请日期2005年12月20日 优先权日2005年12月20日
发明者姬胜利, 崔慧斐, 迟延青, 曹吉超, 王凤山 申请人:山东大学