专利名称：一种细胞生长营养素、制备方法,及其成品在治疗和预防肿瘤、心脑血管等疾病上的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞生长营养素、其制备方法及其成品在治疗和预防肿瘤、心脑血管疾病、补骨生髓、提高血清生长荷尔蒙(GH)、降低胆固醇、治疗骨折、跌打损伤、骨质疏松症等药物上的用途。
技术背景 随着时代的进步，人类平均寿命均已延长，中国亦为跨入了老龄化的国家。
科学的进步与发展，也无意间消耗了有限的自然资源和养分，产生大量的化学和物理污染，对人类的健康产生了负面影响。其中部分污染是人体心脑血管疾病、肿瘤及骨质疏松症等病状的主要诱因。过去多是50岁以后发生疾病，现在也大大提前了。因此，生命科学技术成为世界各国的重要研究课题。
1873年英国人Koliker首次发现了破骨细胞。破骨细胞由多核巨细胞(multinuclear giant cell，MNGC)组成，直径100μm，含有2～50个核，主要分布在骨质表面、骨内血管通道周围。破骨细胞的数量较少，它是由多个单核细胞融合而成的，胞浆嗜碱性但随着细胞的老化，渐变为嗜酸性。破骨细胞具有特殊的吸收功能，某些局部炎症病灶吸收中，巨噬细胞也参与骨吸收过程。
在破骨细胞吸收骨基质的有机物和矿质的过程中，造成基质表面不规则，形成近似细胞形状的陷窝，称为Howship陷窝。在陷窝内对着骨质的一面，细胞伸出许多毛样突起，很象上皮细胞表面的纵纹缘和刷毛缘。电镜下，贴近骨质的一侧有许多不规则的微绒毛，即细胞突起，称为皱褶缘(ruffled border)。在皱褶缘区的周缘有一环形的胞质区，含多量微丝，但缺乏其它细胞器，称为亮区(clear zone)，此处的细胞膜平整并紧贴在骨质的表面。亮区犹如一道以胞质构成的围墙，将所包围的区域形成一个微环境。破骨细胞向局部释放乳酸及柠檬酸等，在酸性条件下，骨内无机矿物质自皱褶缘吞饮，于皱褶缘基质内形成一些吞饮泡或吞噬泡。于破骨细胞内，无机质被降解，以钙离子的形式排入血流中。无机质的丢失使骨基质内的胶原纤维裸露，破骨细胞分泌多种溶酶体酶，特别是组织蛋白酶B和胶原溶解组织蛋白酶。破骨细胞离开骨表面后，其皱褶缘消失，细胞内发生变化，进入静止期。
血中的单核细胞或组织中的吞噬细胞不能转变成破骨细胞，因为所有这些细胞仅含有成熟的、不能分裂的、晚期的单核吞噬细胞，只有早期未成熟的增殖性单核吞噬细胞才是破骨细胞的前体。
100多年来对破骨细胞的体外研究进展缓慢，直到本世纪80年代初期，英国人Chambers首先建立了破骨细胞体外培养法并获得成功，对破骨细胞的体外研究才得以飞速发展。骨细胞再生早在二十世纪中叶即被世界卫生组织认定为重点科学研究课题，西方各发达国家也纷纷由政府或财团鼎力资助，开展研究。目前可以应用多种方法研究破骨细胞的调控因素，但研究大多集中于各种激素和生长因子，而在中医中药对破骨细胞体外生长的影响作用方面研究的比较少。
中国专利ZL93104876.1公开了一种治骨质疏松症的药丹，是将沉香800～900，西红花860～900，木香600～700，川芎1500～1600，桂枝1500～1600，白芷600～700，三七450～550，川续断1500～1600，土鳖虫1500～1600，骨碎补800～900，制马钱子450～550，牛膝600～700，黄瓜子3300～3400，鸡骨1600～1700，大黄300～400，自然铜650～700，冰片450～550，血竭3300～3400，上述18味中草药先进行称重干燥、粉碎、过筛，按比例混合。该丹药用于治疗骨质疏松效果显著。但是，由于该中药为丹药，没有提取中药中的有效成分，在体内吸收受到限制，影响其疗效及其他方面的用途。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞生长营养素，该营养素含有细胞生长必需的多种阴阳物质及微量元素，可以有效的抑制破骨细胞，促进成骨细胞生长的功效。它能改善人体血清GH浓度，增加血清蛋白中的骨细胞生长微量元素，因而达到促进血液微循环、活血化瘀、消肿止痛、通经活络、补骨生髓的作用。
本发明的另一目的在于提供上述细胞生长营养素的制备方法，该方法有效提取原料中人体必需的有效成分，工艺简单、生产成本低。
本发明的再一目的在于提供细胞生长营养素在制备治疗和预防肿瘤、心脑血管疾病、补骨生髓、提高血清生长荷尔蒙(GH)、降低胆固醇、治疗跌打损伤、骨质疏松等疾病药物上的用途。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种细胞生长营养素，是由沉香800～900重量份，西红花860～900重量份，木香600～700重量份，川芎1500～1600重量份，桂枝1500～1600重量份，白芷600～700重量份，三七450～550重量份，川续断1500～1600重量份，土鳖虫1500～1600重量份，骨碎补800～900重量份，牛膝600～700重量份，鸡骨1600～1700重量份，大黄300～400重量份，自然铜650～700重量份，冰片450～550重量份，血竭3300～3400重量份中药材提取的有效成分，其特征在于相对密度为1.00---1.40的提取物稠膏混合物含有如下成分 Na(钠)660～7000mg/L K(钾)3750～5160mg/L Ca(钙)830～1350mg/L Mg(镁)815～1400mg/L Cu(铜)大于0，＜0.1mg/L Mn(锰)0.4312～0.7mg/L Zn(锌)0.0244～0.5mg/L Fe(铁)22～33mg/L P(磷)550～1020mg/L Co(钴)0.138～0.5mg/L S(硫)100～267.2mg/L Mo(钼)大于0，＜0.1mg/L B(硼)6.3～10.256mg/L Cr(铬)0.1～0.998mg/L 总蛋白15000～40000mg/L 氨基酸1～50mg/L 维生素100～250mg/L 总糖0.05～0.5mg/L 本发明的细胞生长营养素为药物制剂或营养品的添加剂，所述药物制剂为药学上可接受的剂型或口服营养制剂，如口服液、糖浆、煎膏剂、药酒与酊剂、注射液、胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂、以及外用膏药；也可以添加到食品或饮料中。
本发明的细胞生长营养素在药物制剂中的含量为60-90wt％，在营养品中，细胞生长营养素的含量为3.5～6.0wt％。
本发明的细胞生长营养素的制备方法为将自芷在乙醇中渗漉，渗漉液除乙醇后得到的稠膏备用；将沉香、西红花，木香、川芎、桂枝加2～5倍水共煎煮；将三七，川续断、土鳖虫，骨碎补、牛膝、鸡骨、自然铜和大黄在5～8倍水中共煎煮2～5次，每次2～8小时，收集煎煮液，过滤、浓缩；用乙醇沉淀，弃沉淀物，回收乙醇，得到浓缩液；合并上述提取液，将冰片、血竭粉碎，过筛后加入提取液中。根据用途将上述稠膏和半固体混合制为药学上可接受的剂型或口服营养制剂，如口服液、糖浆、煎膏剂、药酒与酊剂、注射液、胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂、以及外用膏药；也可以添加到食品或饮料中。
中医药学认为马钱子能开通经络，透达关节，据现代药理研究证明该药能兴奋脊髓、延髓、大脑皮层，增强骨骼肌紧张度，但是马钱子又是有毒性的药物，专家认为由于该药物里含有产热性的药物，使毛细血管扩张，血液流通快，因此药物吸收较多，容易易产生过敏及其他副反应，对人体造成危害。虽然炮制后可使毒性减低，但如果控制不好，难以达到效果。因此本发明的原料处方中，不选用马钱子，经过科学提取的本发明的处方药物，能够具有更好的治疗效果。
黄瓜子也是传统中药中用于舒筋活络、接骨止痛、治疗骨折挫伤的常用中药成份之一，本专利的发明人经过大量实验发现，经过提取的本发明中药的处方中，加与不加黄瓜子，对于药物的疗效并没有影响，因此，本发明的出访中，不采用黄瓜子。
本发明较现有技术简化了处方，经过科学工艺提取，试验表明，上述细胞生长营养素能够有效治疗和预防肿瘤、心脑血管疾病、补骨生髓、提高血清生长荷尔蒙(GH)、降低胆固醇、治疗跌打损伤、骨折、骨质疏松、等疾病。
本发明(细胞生长营养素)具有可以有效地抑制破骨细胞，促进成骨细胞生长的功效；改善人体血清GH浓度，增加血清蛋白中的骨细胞生长微量元素，因而达到促进血液微循环、活血化瘀、消肿止痛、通经活络、补骨生髓，使骨骼不退化、不老化，儿童发育可达正常值；抑制肿瘤；延年益寿。
具体实施例方式 下面结合附图和实施例详细描述本发明，所述实施利用于理解本发明而不是限制本发明。
图1、不同时期各组TRAP阳性多核细胞计数； 图2、骨细胞生长营养液加药组与对照组ALP含量对照，其中系列1为骨细胞生长营养素组、系列2为对照组； 图3、骨细胞生长营养素加药组和对照组平均ALP含量对照，其中1为骨细胞生长营养素组2为对照组； 图4、骨细胞生长营养素加药组和对照组OGN含量对照，其中系列1为骨细胞生长营养素组、系列2为对照组； 图5.骨细胞生长营养素加药组和对照组平均OGN含量对照，其中1为骨细胞生长营养素组、2为对照组。
实施例1 按照如下方法制备本发明的细胞生长营养素 将620克白芷在2倍的乙醇中渗漉，至其中的有效成分充分提取，弃渣、提取液回收乙醇，得到白芷提取物稠膏备用。沉香、西红花各820克，木香620克，川芎、桂枝各1520克加3倍水共煎煮，收集煎煮液，过滤、浓缩；用乙醇沉淀，弃沉淀物，回收乙醇，得到浓缩提取液；将三七550克，川续断、土鳖虫各1500克，骨碎补800克、牛膝600克，鸡骨1600克，自然铜650克和大黄300克在7倍水中共煎煮3次，第一次2小时，第二次5小时，第三次8小时，收集煎煮液，过滤、浓缩；用乙醇沉淀，弃沉淀物，回收乙醇，得到浓缩稠膏；合并上述提取及浓缩液，将冰片400克，血竭3300克粉碎、过6号筛后加入合并的提取及浓缩稠膏，得到相对密度为1.00---1.20的提取及浓缩稠膏。
作为中药，可以按照中药制剂常用赋型剂或辅料，制备为药剂学上可接受的剂型。例如 (1)颗粒剂上述中药提取物300克，加入蔗糖90克，硬酯酸镁1.5克，搅拌均匀后果14～16目筛，制成颗粒、干燥、分袋，每袋4克。开水冲服，每次1袋，或遵医嘱。
(2)片剂上述中药提取物300克，加入微晶纤维素50克、淀粉15克，硬酯酸镁5克，混合均匀后制粒，过3号筛，压片，每片重0.4～0.5克。
(3)作为营养剂，可以加入酒类、饮料或其他食品中。一般加入量为3.5～6％。
(4)散剂上述中药提取物300克，加入含液体药物的散剂制备常用辅料或赋形剂，按照常规工艺制备散剂。
实施例2 将700克白芷粉碎，在5倍的乙醇中渗漉，至其中的有效成分充分提取，回收乙醇，得到白芷提取物稠膏备用。沉香、西红花各800克，木香700克，川芎、桂枝各1600克加3倍水共煎煮，过滤得到第一煎煮液；将三七450克，川续断、土鳖虫各1550克，骨碎补900克、牛膝700克，鸡骨1700克，自然铜700克和大黄400克在8倍水中共煎煮2次，第一次4小时，第二次6小时，收集和并各次煎煮液，过滤得到第二煎煮液，将第一和第二煎煮液合并；用乙醇沉淀，弃沉淀物，回收乙醇，得到浓缩液；合并上述提取液和浓缩液，将冰片550克，血竭3350克粉碎、过5号筛后加入提取液中，得到相对密度为1.30---1.40的提取及浓缩稠膏。
作为中药，可以按照中药制剂常用赋型剂或辅料，制备为药剂学上可接受的剂型。例如 (1)丸剂上述中药提取物100克，加入淀粉5克，泛丸，低温干燥，每丸重0.6克。口服，一次2～5丸，每日2此或遵医嘱； (2)胶囊上述中药提取物300克，加入中药制备胶囊常用辅料，按照常规工艺制备胶囊。
(3)口服液相对密度为1.30---1.40的提取及浓缩稠膏加入80％的纯净水至提取及浓缩稠膏浓度为20％。按照上述方法制备浓度为2％、10％、30％、40％、50％的口服液。
如果必要，口服液中还可以加入适量的调味剂及其它辅料。
实施例3 将650克白芷粉碎，在3倍的乙醇中渗漉，至其中的有效成分充分提取，回收乙醇，得到白芷提取物稠膏备用。沉香、西红花各850克，木香650克，川芎、桂枝各1550克加5倍水共煎煮，过滤得到第一煎煮液；将三七500克，川续断、土鳖虫各1660克，骨碎补850克、牛膝650克，鸡骨1650克，自然铜680克和大黄350克在3倍水中共煎煮5次，每次4小时，收集合并各次煎煮液，过滤得到第二煎煮液，将第一和第二煎煮液合并；用乙醇沉淀，弃沉淀物，回收乙醇，得到浓缩液；合并上述提取液和浓缩液，将冰片500克，血竭3400克粉碎、过5号筛后加入提取液和浓缩液的混合液中，得到相对密度为1.20---1.30的提取及浓缩稠膏。
参照实施例1、2的组成及方法，或按照中药制剂的一般制备方法，将提取及浓缩稠膏制备为口服液、糖浆、煎膏剂、药酒与酊剂、胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂、以及外用膏药。
实验例1 本发明细胞生长营养素的成分检验 (1)采用原子吸收分光光度分析法(AAS)，等离子体光谱质谱(ICP-MS)法，以及比色法测定微量元素 实施例1-3的提取物配制成浓度为20％的口服液后的检测结果如下(该口服液中不含其他任何辅料及) (2)按照GB7649-87、GB2905-82标准检测本发明产品的氨基酸、总蛋白含量。
采用氨基酸分析仪、核酸蛋白分析仪检测本发明的细胞生长液的氨基酸、总蛋白含量。检测结果如下 (3)本发明(细胞生长营养素)的维生素含量 采用高压液相—多级质谱仪检测本发明(细胞生长营养素)的维生素含量，结果如下 (4)本发明(细胞生长营养素)的总糖含量 采用核酸蛋白分析仪，蒽酮法检测本发明(细胞生长营养素)的总糖含量。检测结果如下 从上述结果可以看出，本发明(细胞生长营养素)富含人体所需的维生素和18种微量元素的绝大多数。
人体所需的六大营养素中的蛋白、糖、脂肪和水，对于生理功能健全的人可以通过正常食物摄取即可满足。但维生素和无机盐(微量元素)作为另外两种营养素，仅依靠饮食的摄取却不能达到维持正常人体生理活动的水平。必须通过其它方式补充。维生素和微量元素在体内的吸收和利用是相辅相成的，缺乏微量元素，可导致调节人体正常生理生化功能的蛋白酶、维生素无法正常工作。
维生素和微量元素不仅对生物体的生长发育、提高免疫力、抗病具有重要生理功能，而且还可以促进核酸合成，细胞再生，防止组织器官老化，延缓衰老；调节神经系统，镇痛作用。因此，在人体发育阶段，适时补充维生素和微量元素是至关重要的。本发明(细胞生长营养素)富含人体所需的维生素和18种微量元素的绝大多数(含量均在正常范围内)。因此，可视该营养液为除食物外供给人体所需维生素和微量元素库，通过这一补充方式，来达到人体所需维生素和微量元素的生理生化指标。
试验例2 本实验例涉及本发明(细胞生长营养素)对鼠破骨细胞体外生长的影响 一、骨磨片的制备 新鲜成年牛皮质骨，磨成100μm厚的骨磨片，超声清洗30分钟，-30℃冻存备用。用时解冻，70％酒精浸泡30min，超净台中紫外线照射1h。取出加入含α-MEM培养基的24孔培养板中，每孔4块4mm×4mm骨片，37℃孵育1h备用。
二、破骨细胞的分离培养 取24小时新生Wistar大鼠，断颈处死后，75％酒精消毒，无菌条件下分离四肢长骨，PBS液冲洗骨干，在α-MEM培养液中纵行切开骨干，用手术刀轻刮骨髓腔，用圆头吸管反复吹打碎骨片，沉淀30秒，吸取细胞悬液离心(250g×5min)，α-MEM培养液清洗两次，调整细胞浓度1×106个/ml均匀接种于预置骨磨片的24孔培养板上。
三、破骨细胞的鉴定 1、形态学观察Olympus倒置相差显微镜观察破骨细胞贴壁情况及其形态。
培养30min后破骨细胞即开始贴壁生长，约2小时后生长的破骨细胞形态清晰，呈圆形、椭圆形、水煎蛋形等多形态。
2、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)此酶是破骨细胞的特异性酶，萘酚AS-BI磷酸盐能和此酶产生特异的不溶性酒红色沉淀。TRAP染色可见TRAP酶活性部位被染成酒红色，核阴性，含多个核，可见到破骨细胞的皱褶缘区，未见到TRAP阴性的多核细胞。
3、透射电镜观察将分离的破骨细胞悬液离心，取沉淀，固定、系列酒精脱水后，包埋切片，电子染色，JEM-1220透射电镜观察。经JEM-1220透射电镜观察，所培养的破骨细胞含多个核，可明显区分出破骨细胞的4个功能区皱褶缘区、小泡区、亮区、基底区。明显区别于多核巨细胞。
TRAP酶是破骨细胞的一种标志性酶，萘酚AS-BI磷酸盐能与其结合生成不溶性红色沉淀。电镜下破骨细胞含有丰富的线粒体、溶酶体和大量的粗面内质网。光镜和电镜下均可见破骨细胞的皱褶缘结构，这是多核巨细胞所不具备的。
四、血清药物检测 A、空白血清取成年Wistar大鼠喂5％阿拉伯胶，2天后采血，得血清1ml。
B、服用本发明细胞生长营养素的鼠血清本发明实施例2的口服液，给同一只大鼠按1g/kg.d量灌胃，1消失、2小时、3小时、4小时后采血，各得血清1ml。实验中我们用同一只大鼠喂药前和喂药后的血清作比较，消除了个体间差异。实验结果证实了大鼠血清中确含本发明细胞生长营养素。实验中大鼠灌胃的给药剂量不同，血清中的药物浓度也不同。大量预实验的基础上我们证据，灌胃2小时后采血，有一相对高的吸收峰值。
C、抽提之药物将本发明细胞生长营养素5g溶于50ml色谱纯乙腈中，超声提取30min，离心后取上清。
以上三种样品处理后经美国waters系列液相色谱仪分析，得出三组图谱。从三维图谱可知，200nm～600nm范围有紫外吸收的所有成份，药物血清图与空白血清图比较，产生了许多新的色谱峰，说明有新物质吸收入血，与药物图比较有相同的色谱峰，说明吸收的物质为药物成份，药物血清色谱峰较药物色谱少，说明并不是所有的药物成份都被吸收入血。
五、药物干预及分组 实验分六个组、四个时段，分别于24、48、72、96小时取出骨磨片作TRAP染色，计数TRAP阳性的多核细胞数目。
每24小时取出骨片，2.5％戊二醛固定7min后加入TRAP孵育液中1小时，对整张骨片TRAP阳性的多核细胞计数，实验至少重复两次，因此每个点TRAP阳性多核细胞计数至少8次，采用两人计数，每人重复两次，结果用MEAN±SEM来表示。
参见附图1，M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子，M-CSF组)组即能刺激破骨细胞的增殖又能促进其前体的分化，目前已证实成熟的破骨细胞中有M-CSF受体。本组的破骨细胞在培养期48小时内增长近一倍。降钙素(calcitonin，CT组)能作用于破骨细胞形成的多个阶段，包括抑制破骨细胞的融合和骨吸收能力。本实验在培养72小时后，出现降钙素“逃逸现象”，其原因目前认为是降钙素抑制了降钙素受体的mRNA的表达。
培养期48小时内，本发明的细胞生长营养素(营养素组)TRAP阳性的破骨细胞比对照组少，但无显著差异。培养期72小时后，20％本发明的细胞生长营养素组破骨细胞数目明显低于对照组(P＜0.01但逊于降钙素组＝，96小时后10％本发明的细胞生长营养素)组的破骨细胞数目与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。其中对照组为空白血清，结果证明大鼠空白血清对破骨细胞的体外生长影响不大。
破骨细胞是导致骨质吸收的主要细胞，体外培养破骨细胞是研究骨吸收与抑制骨吸收药物的基本方法。本发明(细胞生长营养素)由三七、西红花、当归、川芎、自然铜等多种中药提取的有效成分组成，具有有活血化淤、续筋接骨之功效。大鼠服用本发明(细胞生长营养素)后引起体内激素的改变，血清中降钙素、1.25(OH)2D3含量的变化可直接影响破骨细胞的数量。本发明(细胞生长营养素)包含的多种微量元素如铜、锌、锰等以离子形式入血，这些微量元素能抑制破骨细胞的生长，促进破骨细胞的凋亡，预示着本发明(细胞生长营养素)在一定程度上会对破骨细胞的生长产生影响。
同时，本发明(细胞生长营养素)对体外培养的大鼠破骨细胞的融合有抑制作用。
本发明本实施例的及其制剂及其他实施例得到的细胞生长营养素及其制剂也具有基本相同的效果。试验例3 本实施例涉及本发明(细胞生长营养素)对体外培养的成人成骨细胞增殖、分化和凋亡的影响。
方法取成人的髂骨松质骨，采用胶原—胰蛋白酶消化法，获得松质骨中的成骨细胞，进行纯化和培养。在此基础上，添加含有骨细胞生长营养素药物的血清，连续加药3天，CO2孵箱中培养，同时作不加药的空白对照。通过倒置相差显微镜和电镜观察增殖和分化情况，检测上清液中的碱性磷酸酶和骨钙素含量，并且对成骨细胞的凋亡情况进行测定。
实验表明，胶原-胰蛋白酶消化法得到的成人成骨细胞生长情况良好，生化指标稳定可靠，细胞纯化效果佳，可以满足相关研究的需要。进一步研究结果显示，在成骨细胞密度为10000/ml的条件下，加入含有细胞生长营养素的血清后，可以使上清液中碱性磷酸酶和骨钙素含量明显增高，骨结节形成加快，与未加药的对照组比较有差异有显著性意义，但成骨细胞的增殖和凋亡情况无明显变化。
本实验直接取材成人的髂骨，采用胶原-胰蛋白酶消化法，释放出松质骨中的大量成骨细胞，并且进行纯化和传代培养。在此基础上，添加含有骨细胞生长营养素的血清，观察其对成骨细胞增殖、分化和凋亡的影响，为筛选促进骨形成药物的研究提供实验依据。
可以看出骨细胞生长营养素对体外培养的成人成骨细胞的分化有明显的促进作用，但对成骨细胞的增殖和凋亡无明显诱导作用，可以作为促进骨形成的药物使用。
材料与方法 1、取材实验材料取自施行颈椎植骨融合术的患者，患者术前检查无代谢性骨骼疾病，其中男6例，女2例，年龄32～46岁，平均38.8岁。手术中行髂骨取骨植骨融合术时，取其植骨块修整时切除的多余松质骨，置入装有DMEM-F12培养液的无菌瓶内，带至实验室。
实验中所用培养液、胎牛血清购于Gibco公司，动物为Wistar纯系大鼠，实验中所用细胞生长营养素，产品配制浓度为90％的口服液。
2、成骨细胞培养 将手术中获得的骨碎片先用无菌Hanks液冲洗3次，骨剪碎约为1～2mm3大小，Hanks液多次冲洗，直至骨碎片变白，置入瓶皿中，倒入胶原-胰蛋白酶细胞消化液，在室温下磁力震荡器中消化45min。去除首次消化所得的悬液，再加入适量细胞消化液，室温下磁力震荡消化30min。静置5min，收集消化液，滤网滤除胶原杂质，去除骨碎片，室温下2200r/min离心10min，弃上清，加入5ml培养液重新悬浮细胞，置入25ml培养瓶中培养，细胞记数。待细胞完全贴壁后，冲洗，换液。以后，隔日换液1次。第7d，胰蛋白酶消化，细胞计数，以10000/ml分别接种于8个培养瓶中，每瓶5ml培养液(含抗生素，12％胎牛血清，DMEM-F12，2mmol/L β甘油磷酸钠和100ug/ml L-抗坏血酸)，并以相应的成纤维细胞作为对照，进行鉴定。
3、成骨细胞的鉴定 通过倒置相差显微镜和透射电镜观察对成骨细胞进行形态学鉴定；通过上清液中ALP和OGN检测，对成骨细胞进行生化指标鉴定；并以成纤维细胞作为对照。
4、细胞生长营养素药物干预 4.1、细胞生长营养素血清的制取 取8只成年Wistar大鼠，雌4，雄4，平均体重340克。首先将本发明实施例1的细胞生长营养素浓缩稠膏溶于5％的阿拉伯胶中，然后将大鼠随机分两组，一组按每日每公斤体重1克细胞生长营养素灌胃；另一组灌5％阿拉伯胶，每次每只鼠灌骨不多于4ml，连续灌骨10天，采血前24小时禁食，采血前2小时再灌胃一次，每只鼠采血4ml，于无菌离心管中离心10分钟(3000rpm)，各取2ml血清放入无菌瓶中备用。
取含细胞生长营养素药物血清2ml加入8ml的DMEM-F12培养液中，制成含20％细胞生长营养素药物血清的培养液。
同样，取2ml空白血清加入8ml的DMEM-F12培养液中，制成含空白血清的培养液。待用。
4.2、血清中药物成分的鉴定 4.2.1、实验动物的处理 取成年Wistar大鼠，喂5％阿拉伯胶，2天后如上述方法采血4ml，离心后得1ml(空白血清)，之后将骨细胞生长营养素溶于5％阿拉伯胶中，同一只Wistar大鼠按1g/kg.d骨细胞生长营养素灌胃， 4.2.2、样品进样前的处理方法 取空白血清，药物血清各0.5ml加入0.5ml色谱纯乙腈，旋涡震荡5min，离心10分钟(3000rpm)取上清液，用0.45nm微孔滤膜过滤后进样50nl，骨细胞生长营养素5g加50ml色谱纯乙腈，超声提取30min，离心(3000rpm)后取上清液，微孔滤膜过滤后进样50nl(本实验重复4次)。
4.2.3、处理后的血清及药物的检测 处理后的血清及药物分别经美国waters系列液相色谱仪分析，得出三组图谱。
4.3、药物的添加 成骨细胞培养第1次传代后，用D-Hank液冲洗四遍培养皿，加入1ml 0.25％胰蛋白酶，消化10分钟，倒置显微镜下观察至细胞分离、脱壁。收集消化所得细胞悬液至离心管中，加入等量培养液，2200r/min离心5min。弃上清，细胞重新悬浮于培养液中，混合均匀，计数，以10000/ml接种到培养瓶，置入CO2孵箱中培养。
接种后的细胞培养12小时(细胞贴壁)，吸弃原培养液，新的培养液中加入含有骨细胞生长营养素的药物血清，同时作不加药剂的空白对照组，如此连续加药3d，并置CO2孵箱中培养。停止加药后，用培养液继续培养，2d更换一次培养液。
5、形态学观察和生化指标检测 5.1、形态学观察 停止加药后，用培养液(含2mmol/L β甘油磷酸钠和100ug/ml L-抗坏血酸等)继续培养，2d更换一次培养液。于加药前后在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况，四环素标记荧光染色，显微摄影。对样本细胞，进行固定、包埋，薄层切片，通过Phillips CM10透射电镜观察。
5.2、成骨细胞上清液碱性磷酸酶含量检测 以10000/ml接种于培养瓶中，每瓶5ml培养液。第14d，取上清液，采用磷酸对硝基苯酯二钠盐为底物，经405nm波长比色，测得吸光度(optical density，OD)值，换算成国际单位，得到碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量。
5.3、成骨细胞上清液骨钙素含量检测 以10000/ml接种于培养瓶中，每瓶5ml培养液.第14d，取上清液，采用BGP放免试剂盒检测。T计数器测定沉淀物每分钟计数值(counts per minute，cpm)，根据标准品曲线得到样品骨钙素(osteocalcin，OGN)含量。
5.4、统计学处理 对每例样本，测出各组相应的ALP和OGN数值，求出平均值和标准误，然后计算出t值，进行t检验，采用statpal软件，进行统计学分析。
6、成骨细胞凋亡检测和分析 6.1、凋亡检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynuc leotidyl transferase，TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TdT-mediated Dutp nick end labeling，TUNEL)技术来检测细胞凋亡情况。具体通过R&D系统(Minneapolis，MN)TdT原位凋亡检测来完成。
主要步骤包括 ①首先用体积分数10％的中性甲醛缓冲液和体积分数70％乙醇，分别对细胞进行固定10min和5min，细胞干燥24h后做进一步检测； ②使用蛋白酶K在37℃，10min条件下进行细胞渗透性步骤； ③采用链卵白素标记的辣根过氧化物酶进行定位检测，定位产物增强； ④在室温下湿化的密闭箱中链卵白素孵育细胞20min； ⑤切片在DAB液中显色10min，然后用质量浓度1％甲基蓝复染10min； ⑥检测细胞时先采用人成纤维细胞的标准记录参数进行优化处理。
6.2、定量分析 使用Cool Cam 2000影像系统(Cool Camera Co，GA)进行细胞的检查和计数。细胞计数后，细胞凋亡的百分率由凋亡细胞数除以凋亡和正常细胞总数计算得出。求出各个样本计数得到的百分率平均值。
结果 1、成骨细胞鉴定 Olympus倒置相差显微镜连续观察，培养的第1d，可见获得的细胞数量较多，呈圆形，细胞核大而圆，位于胞体的一端。72h后，细胞全部贴壁。一周后，细胞呈梭形。
生化指标检测，成骨细胞上清液中ALP平均含量为3.12±0.26U/ml；成纤维细胞为1.86±0.28U/ml；P＜0.01，差异有显著性。成骨细胞上清液中OGN平均含量为2.218±0.246ng/ml；成纤维细胞为0ng/ml。
2、形态学观察 培养的成骨细胞的存活时间可达10周以上，若汇合后及时分瓶，加入骨细胞生长营养素组可传代生长。
与对照组比较，加入骨细胞生长营养素组成骨细胞很快呈扁平梭形，细胞体积增大。但是，细胞的增殖情况无显著差异，汇合时间无明显变化；药物组与对照组细胞均出现多层生长，药物组骨结节生成加快。电镜下观察见药物组细胞浆丰富，有大量粗面内质网出现，呈旺盛分泌相。
3、成骨细胞上清液ALP含量检测 实验数据显示，取材的8例标本，加入骨细胞生长营养素组的培养液中，平均ALP含量为4.06±0.18U/mlU/ml；未加入药组的平均ALP含量是2.58±0.16U/ml。加药组的ALP含量明显高于空白对照组，P＜0.01，差异有显著性意义。参见附图2、3。
4、成骨细胞上清液OGN含量检测 实验数据显示，取材的8例标本，加入骨细胞生长营养素药物组培养液中，平均OGN含量为.016±0.225ng/ml；未加药组的平均OGN含量是1.682±0.257ng/ml。加药组的OGN含量明显高于空白对照组，P＜0.01，差异有显著性意义，参见图4。
5、成骨细胞凋亡检测和分析 凋亡检测结果，样本中加入骨细胞生长营养素药物血清的成骨细胞凋亡百分率平均值为3.2％±0.5，未加入骨细胞生长营养素的成骨细胞凋亡百分率平均值为2.8％±0.3。数据结果表明，加入骨细胞生长营养素药物血清组与未加药物组比较，成骨细胞凋亡百分率的差异无显著性意义，P＞0.05，即加入骨细胞生长营养素药物血清对成骨细胞的凋亡无明显影响。
随着老龄人口的增加，作为老年性疾病之一的骨质疏松症引起了人们极大的关注。骨质疏松症是以骨量减少，骨的微观结构改变为特征，致使骨的脆性增加，以至易于发生骨折的一种全身代谢性骨骼疾病。成年人随着年龄的增加，骨吸收大于骨形成，导致骨量的减少，可引起骨质疏松症。寻找疗效确切，副作用小，作用机理明确的抗骨质疏松药物日益迫切。
通过体外成人成骨细胞培养及其药物干预实验，找到能促进骨形成的物质是开发骨质疏松症治疗药物的重要手段之一。本发明采用体外成人成骨细胞培养的方法，观察骨细胞生长营养素对体外成人成骨细胞增殖、分化和凋亡的影响，筛选出对成骨细胞有促进作用的物质，以提供一种抗骨质疏松症的新药。
本世纪六十年代，Peck等开始使用胶原酶消化骨片，并体外培养成骨细胞成功。1975年，Wong等使用胶原酶多次消化鼠的颅盖骨，使成骨细胞得到一定程度的纯化。1985年，Robey等采用低Ca2+培养液培养骨片获得人的成骨细胞，并且使得到的细胞进一步纯化。目前，我国有关药物对体外成骨细胞影响的研究多是取材胎鼠或成熟大鼠，而直接取材成人成骨细胞进行研究的报道不多。这是由于成人成骨细胞较胎鼠的成骨细胞活性低，耐受性差，体外培养不易成活，必须获得足够数量的细胞，才能保持其活性。在本发明中，我们直接取材成人的髋骨松质骨，采用胶原—胰蛋白酶消化法获得成人成骨细胞。实验时，首先将胶原酶和胰蛋白酶按照一定比例配制成消化液，两次消化松质骨组织，并将所得的成骨细胞用无Ca2+的DMEM/F-12培养液培养。通过倒置相差显微镜观察，可见获得的细胞数量较多，形态正常，细胞核大而圆，位于胞体的一端，细胞膜结构良好。动态连续观察发现，细胞贴壁正常，生长稳定，并且纯化效果佳，表现出成骨细胞的各种特征。电镜下可见，细胞体积较大，长方形，约40μm，细胞浆丰富，内含大量粗面内质网，呈旺盛分泌相；生化指标检测显示，培养的成骨细胞分泌ALP和OGN，表现出旺盛的分泌功能。各项实验表明，采用这种胶原-胰蛋白酶消化法，得到的成骨细胞良好。本发明(细胞生长营养素)有促进骨折愈合的作用。在本发明的实验中，通过倒置相差显微镜观察到，骨细胞生长营养素组加药的第3d，成骨细胞体积明显增大，并且逐渐出现多伪足生长，但是骨结节生成加快。生化指标检测显示，细胞培养的上清液中，加药组ALP含量(4.06±0.18U/ml)明显高于空白组含量(2.58±0.16U/ml)；加药组骨钙素含量(3.016±0.225ng/ml)也明显高于未加药组含量(1.682±0.257ng/ml)。我们知道，细胞的自我复制和细胞分化是细胞生存中的主要生命活动。细胞分化是细胞结构和功能的特化。对成骨细胞而言，ALP是成骨细胞分化的早期指标，其表达随着细胞分化的发展而增强，其作用是水解有机磷酸释放出无机磷而作用于羟磷灰石的形成，是骨形成所必需的酶，它的表达代表着骨形成的状况，表明细胞分化的开始。而本发明(细胞生长营养素)(OGN)作为成骨细胞分化的中期指标，被认为在维持正常骨钙率和抑制软骨的钙化中起作用。当骨形成和骨吸收偶联时，OGN是反映骨转达换的指标；当骨形成和骨吸收解偶联时，其是反映骨形成的特异指标。
骨结节的形成、成骨细胞的增殖和分化与成骨细胞的凋亡情况密切相关。细胞凋亡(apoptosis)又称细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)，对机体的生长、内环境稳定、病理过程的发展起着重要的作用。它的特征表现为细胞核和细胞质的固缩，出疱，凋亡体的形成和DNA的断裂等。凋亡是细胞死亡的一种重要模式，是凭借环境的或者发育中的刺激，激活一系列特异事件的一个程序，导致细胞的死亡。所有的哺乳动物细胞都有能力启动进行凋亡的通道，并且在凋亡的级联中有许多的调节点。目前有关骨细胞生长营养素对体外成骨细胞增殖、分化和凋亡影响的研究还未见报道。我们通过目前最精确的凋亡检测技术(TUNEL)，对中药细胞生长营养素作用后成骨细胞的凋亡情况进行了研究。结果表明，其对体外培养的成人成骨细胞的凋亡百分率并无影响。整个实验结果表明，骨细胞生长营养素对体外成骨细胞的增殖和凋亡无明显影响，但是对成骨细胞的分化却有显著的促进作用，表现为ALP和OGN分泌增多，粗面内质网增加等等。通过本实验，证实了本发明(细胞生长营养素)能够促进体外成人成骨细胞的分化，从而加快骨形成，并可进行初步的定量表示。研究结果提示，骨细胞生长营养素增加垂体生长素细胞合成生长素是促进骨折愈合的机制之一。其促进生长素分泌的量是有限的，不会导致垂体内分泌紊乱，引起机体的异常生长。
虽然细胞生长营养素对体外成骨细胞的增殖和凋亡无明显影响，但是对成骨细胞的分化却有显著的促进作用，表现为ALP和OGN分泌增多，粗面内质网增加等等。通过本实验，证实了中药细胞生长营养素能够促进体外成人成骨细胞的分化，从而加快骨形成。
类似实验证明，本发明其他实施例得到的细胞生长营养素及其制剂也具有基本相同的效果。
综上所述，本发明细胞生长营养素对体外培养的成人成骨细胞的分化具有明显的促进作用，导致骨形成的加快，因此可作为促进骨形成的药物使用，其确切的影响机制和新的用途有待进一步的研究。 试验例4 本实施例涉及本发明细胞生长营养素(OGN)对骨折鼠血清生长激素和垂体生长激素细胞影响。本实验为探讨该中药促进骨折愈合作用机理，着重研究了骨折愈合早期阶段，本发明细胞生长营养素(OGN)对大鼠生长激素分泌的影响。实验，将Wistar鼠分成服药组(每日服本发明实施例2支被的2％骨细胞生长营养素(OGN)混悬液0.5ml/100g体重)和对照组(每日服5％阿拉伯胶)；每组均经手术制作左胫骨骨折模型，分别于手术后3，7，14及28天断头取血测血清GH浓度，同时取垂体测重量和用图象分析仪观察经免疫组化染色的垂体生长激素细胞面积和灰度。通过骨折鼠血清生长激素和垂体生长激素细胞的观察，研究骨细胞生长营养素(OGN)促进骨折愈合的机制。结果表明血清GH14天时服药与对照组有显著差异，生长激素细胞灰度亦有相同趋势变化，但此变化在骨折愈合后或停药后可以恢复到正常水平。提示本发明细胞生长营养素(OGN)增加血清GH浓度和增加垂体生长激素细胞合成生长激素可能是其促进骨折愈合的机制之一。
动物实验及临床实践已证实中药细胞生长营养素(OGN)有促进骨折愈合的作用。影响骨折愈合的因素是多方面的。
材料及方法 1、实验动物 Wistar成年大鼠(由中国医学科学院实验动物研究所提供)，雄性共54只，体重220～260g。每批12只，试验中同组同笼(每笼6只)饲养，饲养室温度20～24℃，给予颗粒鼠饲料，试验中自由食水及食物，不限量。
2、药品 实施例2的细胞生长营养素(OGN)，样品药液制备用5％阿拉伯胶液制成含2％骨细胞生长营养素(OGN)的溶液。
3、骨折模型制作 大鼠以5％水合氯醛(0.15ml/100g)腹膜腔内注射，麻醉成功后，左后肢小腿剃毛常规碘酒酒精脱碘消毒，选左胫骨粗隆下外侧纵切口，长约2.5cm，切开皮肤至皮下，尽量勿伤皮下浅静脉，切开胫骨肌，钝分离至胫骨，沿胫骨骨膜绕周分离，内侧分开趾侧伸肌，注意勿伤隐动脉、胫前动脉和相应的神经，以小薄锯横断胫骨，横断点在胫骨粗隆下约1cm处。缝合肌膜前骨折复位缝合皮下与皮肤，以石膏(6层)纱布做膝上2cm至足趾尖石膏筒固定，7天后拆除。
4、分组和喂药 上述模型鼠随机分为 A组～服药骨折组按样品0.5ml/100g内服(剂量测算见药理实验方法学第二版中“人和动物间按体表面积折算等效剂量比值表”所规定的方法)，用鼠灌胃器每日喂药一次。麻醉醒后即行第一次喂药，连续至所定日期。
B组～单纯骨折组(对照组)每日用鼠灌胃器喂相应量的5％阿拉伯胶液一次，连续至所定日期。
C组～28天组之一为骨折后服药14天、停药14天组。本组未取血，只做垂体病理检查。
5、取血测血清GH浓度 上述三组试验大鼠，分别于骨折后3，7，14，28天分四批清醒时断头取血(图3)，每只取血10ml，自然凝固，室温下低速离心(2000转/分)15分钟，取血清约2ml，贮存于-20℃备用。采用鼠GH放射免疫分析法(RIA)(试验盒由美国NHPP提供)测定血清GH浓度。
6、垂体生长激素细胞免疫组化染色和测定 大鼠断头后立即取出垂体用Bouin固定液固定24小时，取出用滤纸吸干固定液，用1/100,000电子天秤称垂体重量。垂体常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚度5μm，每例取中部最大横断面，进行生长激素细胞免疫组织化学染色，试剂由美国NHPP提供的猴抗大鼠CH抗体为I抗，以酶标金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)代替II抗的间接法进行染色。I抗最佳稀释度为1∶200，金葡球蛋白A最佳稀释度为1∶40，DAB显色。每例设阴性对照。染色结果用计算机灰度测试软件(灰度分32级)进行垂体前叶生长激素细胞内GH含量测试。同时以像素值计算生长激素细胞面积大小。每例测20个生长激素细胞，求出均数。
7、统计分析 以上所得数据用PRIMER软件进行t检验、方差分析及q检验。
结果 1、大鼠骨折后3天组间血清GH浓度比较(见表1)。表1、大鼠骨折后3天组间血清GH值(ng/ml)比较 由表1知，A组和B组大鼠血清GH浓度B组较A组均数值高，但两组间血清GH值经统计学(t检验)无明显差异 2、大鼠骨折后7天组间血清GH浓度比较(见表2) 表2、大鼠骨折后7天组间血清GH值(ng/ml)比较 由表2知，A组和B组大鼠血清GH浓度B组均数值有明显升高，但经统计学(t检验)处理，两组间无明显差异。
3、大鼠骨折后14天组间血清GH浓度比较，见表3。 表3大鼠骨折后14天组间血清GH值(ng/ml)比较 由表3知，A组和B组大鼠血清GH浓度经统计学(t检验)处理，t＝2.45，P＜0.05，两组间有明显差异。A组大鼠血清GH浓度明显升高。
4.大鼠骨折后28天组间血清GH浓度比较(见表4) 表4、大鼠骨折后28天组间血清GH值(ng/ml)比较 由表4知，A组和B组大鼠血清GH浓度值经统计学(t检验)处理，两组间无明显差异。
5.垂体生长激素细胞免疫组化染色测定结果(见表5)。
表5、GH细胞内GH含量灰度值比较 注A组为服药组B组为服阳拉伯胶组 *表示与实验组相比较P＜0.001细胞内GH含量越高，灰度值越低。
由表5知，3天服药组较对照组垂体生长激素细胞GH含量低，但7，14，28天组垂体细胞内GH含量均高于对照组。
为了检验服本发明(细胞生长营养素)(OGN)停药后，垂体GH细胞变化是否可以复原，于骨折28天实验内另设C组，A、B、C三组比较见表6。
表6、骨折28天垂体GH细胞面积和灰度A、B、C三组比较(x±s) 注*表示与A组比较P＜0.05 结果表明灰度级B、C组与A组比较，分别均高于A组，P＜0.05有显著性差异，但B、C两组比较无显著性差异。GH细胞面积比较，各组均无显著性差异。
讨论 1、生长激素在骨生长和骨折愈合中的作用 骨折发生后通过早期炎症反应、巨噬细胞清扫，即进入骨折愈合的重要阶段，纤维性骨痂、原始性骨痂形成，最后完成骨折愈合。这个复杂的过程是受着多种因素调控。其中生长激素对骨生长及骨折愈合起了重要的作用。
生长激素(GH)由垂体前叶嗜酸细胞产生，以脉冲式的方式分泌，有明显的种属特异性。
(1)生长激素在肝内可刺激胰岛素样生长因子(IGF-I及IGF-II)形成，该因子可刺激间叶细胞增殖，形成纤维细胞及肌纤维母细胞。同时GH是骨基质胶元形成的一种主要调节剂，肌纤维母细胞、成纤维细胞与各型胶元在骨折局部形成纤维性骨痂。此后在原始及继发性骨痂形成阶段中，起最关键作用的两种细胞-成骨及破骨细胞与GH亦有密切关系。成骨细胞能使骨折部位有足够的骨痂形成，以恢复骨的连续性和坚韧度，IGF-I和IGF-II作为媒介物对成骨细胞都有很强的刺激作用。
成骨细胞能膜上有强亲和力的I型和II型IGF受体，IGF-I和IGF-II可以明显促进骨细胞的有丝分裂，影响成骨细胞的分化，兴奋碱性磷酸酶活性，促进骨钙素合成并增强骨连接素的基因表达。骨折后血清GH浓度增高，同时垂体生长激素细胞(即嗜酸细胞)也处于高机能状态。上述的反应加强，促进骨折愈合。
(2)GH对软骨的直接作用，可促进生长板细胞分化和生长，而骨的生长取决于生长板软骨内骨化，同时已证实GH能引起新骨生成。
(3)GH可以改善肠钙吸收，兴奋肾脏1-α羟化酶活性，使25(OH)2D3转换为1.25(OH)2D3浓度增高，后者活性强，而成骨细胞上有1.25(OH)2D3受体，它增加骨细胞数目。形成骨盐，作用高于前者100倍。
增加骨量，加速骨折愈合及加强骨的抗折强度，同时1.25(OH)2D3在继发骨痂形成阶段，能刺激破骨细胞的前身单核巨噬细胞的分化及融合，以利于骨吸收，恢复骨原来的形态。
此外，尚有许多情况说明生长激素在促进骨折愈合过程中的作用。例如人类从成熟期开始，血清GH浓度开始下降，至65岁以后则大部分或全部消失，老年人GH水平的下降可以视为GHD(即GH缺乏)的一种形式，突出表现的是骨密度下降。同时临床工作中也发现中老年人骨折后愈合、愈合晚，而血清GH浓度较高的儿童阶段，骨折后愈合快、愈合早。
总之，GH对骨生长的骨折愈合各个阶段都有重要的影响，尽管骨折愈合的机理很复杂，有些问题尚未完全清楚，同时也绝非是GH单独起作用，但GH的作用是不容置疑的。骨折后血清GH浓度降低将不利于骨折愈合，升高或维持一定的水平将有利于或促进骨折愈合。
2.试验结果分析 由于血清GH分泌有脉冲式特点，所以检测值波动较大，同时测定每批血清样品时，标定曲线也不相同，因此分析每批血清GH浓度检测值时，本试验不做每批间横向比较，只做组内分析比较。为使每批测定值准确，我们已尽量排除了干扰因素，在取血时间、环境、方法上做到组内条件一致。
结果表明，骨折后服药组与对照组血清GH浓度有一定的差异，骨折后3天两组无明显差异，骨折7天服药后血清GH浓度升高，但经统计学处理，二者无明显差异，至骨折14天时，服药组和对照组比较，两者有明显的差异。
而在骨折后28天时，两组血清GH浓度水平又回到大体相等水平。说明骨细胞生长营养素(OGN)在骨折后一定时间内有促进血清GH浓度升高的作用。
另外，为了更准确地反映GH的分泌状况，本实验还对垂体生长激素细胞的体积和GH含量(用灰度值表示)进行了测定，实验用美国NHPP提供的大鼠GH生长激素免疫试剂，特异性显示垂体细胞，其中细胞体积在7天组、服药组明显高于对照组(P＜0.05)表明细胞内GH含量的灰度级则从7天起服药组一直高于对照组，P值均小于0.05。
由此说明除骨折损伤极早期(3天)外，在开始修复期(7天)以后，骨细胞生长营养素(OGN)均有增加垂体GH分泌的作用，细胞形态学的变化(体积变大)维持的时间短于其机能变化(GH含量)的时间。
但于骨折愈合第7～14日，GH的分泌是处于高峰阶段，此变化与既往病理组织学变化[2]的结果是一致的，支持了骨细胞生长营养素(OGN)可能通过增加GH促进骨折愈合，是其作用机理之一的诊断。
本发明(细胞生长营养素)(OGN)促进GH分泌的量是有限的，由本实验各批动物体重及垂体重，服药组与对照组均无明显差异可证实它不足以引起机体的异常增长。特别通过28天三组方差及q检验结果，亦说明当骨折后服药14天再停药14天后，垂体的变化水平基本恢复到对照组水平。
由此可见骨细胞生长营养素(OGN)是既有促进GH分泌增加，加速骨折愈合的作用，又不会导致垂体内分泌紊乱的一种比较安全的药物。
使用Wistar大鼠制作左胫骨骨折模型，分为服药组和对照组，结果表明骨折后14天服药组与对照组血清GH浓度比较，有显著性差异，垂体生长激素细胞GH含量有相同趋向的改变，提示骨细胞生长营养素(OGN)在骨折后一定时间内有增高，血清GH浓度和增加生长激素细胞含量的作用，可能是细胞生长营养素(OGN)促进骨折愈合机理之一。
类似实验证明，本发明其他实施例得到的细胞生长营养素及其制剂也具有基本相同的效果。
试验例5 本实施例涉及本发明(细胞生长营养素)促进骨折愈合的临床实验研究。
为了进一步论证其功效和作用机理，评价其疗效，安全性，适应性及使用注意事项。我们应用本发明(细胞生长营养素)(OGN)和对照药物对450例骨折患者进行了系统的临床观察研究，现将研究结果报告如下。
本组共450例，其中本发明实施例1-3的骨细胞生长营养素(OGN)(A)试验组300例，骨折挫伤散(B)阳性对照组100例，空白对照(C)组50例。患者年龄在18～60岁之间，具体分布见表1；性别分布情况见表2；骨折多发生在桡骨远端、肱骨、股骨、胫腓骨及尺桡骨等部位，骨折部位分布见表3；药物治疗时间为2～4周；治疗方法以闭合整复小夹板或石膏外固定为主，占395例，手术切开内固定为辅，占55例。
临床资料 1、一般资料 表1年龄分布情况(例％) 表2性别分布情况(例％) 表3骨折部位及治疗方法分布 2、受试对象选择 诊断标准有明确外伤史。一般症状为局部疼痛，肿胀有瘀斑，功能障碍。特殊体征为局部畸形，骨擦音或骨擦感，异常活动。
X线表现X线提示有骨的完整性或连续性遭受破坏，须拍正、侧位片，包括邻关节。
中医症候症见跌打损伤所致肿胀、疼痛、肢体活动受限的筋骨损伤，气滞血瘀，面色苍白，皮肤瘀斑，舌质淡红或有瘀斑，苔薄黄，脉弦速或沉实而涩。
2.2、试验病例标准 2.2.1、纳入病例标准 符合诊断标准，以四肢管状骨闭合性、新鲜骨折(三天以内)，小夹板和(或)石膏外固定为主要观察对象、手术治疗为辅助观察对象。
排除病例标准 (1)年龄在18岁以下或60岁以上；妊娠或哺乳期妇女；对本药物有过敏；病理性骨折； (2)合并有肝、肾和心血管疾病；精神病患者；有不良影响的其他疾病； (3)骨折达不到功能复位标准，复位后无法进行有效固定者； (4)凡不符合纳入标准，未按规定用药，无法判断疗效或资料不全等影响疗效或安全性判断者。材料与方法 1试验样品 试验组本发明实施例1的细胞生长营养素(OGN)颗粒剂或散剂，每袋内装中药5克，有效成分含量90％。
阳性对照组骨折挫伤散，黑龙江省佳木斯市中药厂生产，黑卫药准字(82)1172号散剂胶囊，每粒内装0.4克药粉。
空白对照组为不含任何活性、毒性对照药。取粗红高粱末，文火适当炒炙，放凉后，粉碎，过80目筛，得细粉；用骨细胞生长营养素(OGN)空包装袋，装入5克细粉，密封。
临床试验用药各样品的外观和性状等情况见表4。
表4临床试验药的外观和性状等情况 2、试验方法 本受试对象以住院和专科门诊相结合，其中住院289例，门诊161例，门诊病例定期检查或送药到人，严格控制可变因素。
2.1、分组方法 采用双盲随机配对原则，具体分为试验组、阳性对照组和空白对照组，各研究单位病例分配比例如表5。
2.2、给药方法及疗程 试验组口服本发明细胞生长营养素(OGN)，每次1袋(5克)，1日2次，14天为一疗程，可连续服用两个疗程。
阳性对照组口服骨折挫伤散，每次1袋(4克)，1日3次，14天为一疗程，可连续服用两个疗程。
空白对照组口服，每次1袋(5克)，1日2次，14天为一疗程，连续服用两个疗程。
2.3、观察指标与项目 2.3.1、安全性观测包括一般体检项目、血、尿、便常规化验、心、肝、肾功能检查 2.3.2、疗效性观测包括相关症状和体征肿胀、疼痛和骨折部X线检查。
表5各参加研究单位观察病例数情况 治疗结果 1、疗效标准及其依据。
按照中药新药治疗外伤性骨折的临床研究指导原则。
1.1、骨折的临床愈合标准骨折的部位无疼痛、压痛与纵轴叩击痛；骨折断端无骨擦音与异常活动；X线显示骨折线模糊，有连续性骨痂通过骨折线；解除外固定后，上肢的向前平伸持1公斤重达1分钟，下肢不扶拐在平地连续行走3分钟，并不少于30步者。
连续观察2周，一般练功活动骨不变形者。则观察的第1天即临床愈合日期。
1.2、常见骨折临床愈合时间 锁骨骨折3～5周；肱骨外科颈骨折3～5周；肱骨干骨折4～6周；肱骨髁上骨折3～4周；尺桡骨干双骨折4～6周；桡骨远端骨折3～5周；掌骨骨折4～6周；股骨粗隆间骨折6～8周；股骨干骨折6～8周；胫腓骨骨折6～8周；跖骨骨折4～8周。
1.3、疗效判断标准 (1)临床治愈临床用药时间比同类骨折愈合时间提前1/3以上达到临床愈合标准者。
(2)显效临床用药时间比同类骨折愈合时间提前1/3～1/4，达到临床愈合标准者。
(3)有效临床用药时间比同类骨折愈合时间提前1/4～1/5，达到临床愈合标准者。
(4)无效临床用药时间与同类骨折正常愈合时间相同。
2、疗效分析 2.1、疗效判定 表6非手术试验组265例疗效与性别情况比较 试验组本发明细胞生长营养素(OGN)配合小夹板外固定265例中性别与疗效关系经Ridit统计学处理x2＝0.420，P＜0.05，差别无统计学意义。经Ridit检验u＝0.648＜1.96，P＞0.05亦显示差别无统计学意义。说明性别因素对疗效无影响。
表7试验组265例各年龄段与疗效关系 试验组配合手法整复，小夹板外固定265例中，各年龄组与疗效关系经Ridit统计学处理x2＝2.891＜7.815，P＞0.05差别无统计学意义，说明年龄对疗效无影响。再经Ridit检验，分别计算出u1＝1.568 u2＝0.328 u3＝0.408均＜1.96，P＞0.05亦显示差别无统计学意义。
表8395例(经非手术疗法患者)各组间药效比较 在395例经手术治疗手法(手法整复+小夹板固定)的骨折患者中，经Ridit统计方法分析，本发明细胞生长营养素(OGN)用药组(试验组)，骨折挫伤散用药组(阳性药物对照组)和非用药组(空白对照组)间药效，显示三组间存在非常显著性差异，x2＝166.07，P＜0.01。
再经Ridit法分别比较试验组与空白对照组u1＝9.77，P＜0.01有非常显著性差异，阳性药物对照组与空白对照组间药效，u2＝2.074，P＜0.05，有显著性差异。试验组与阳性对照组比较u3＝10.048，P＜0.01差别非常显著意义。说明试验组明显优于对照组和空白组。 表9主要骨折部位与疗效关系分析 主要骨折部位与疗效关系经Ridit统计学处理x2＝0.349，P＞0.05差别无统计学意义。再经Ridit统计方法比较各组间疗效u1＝0.132，u2＝0.129，u3＝0.506，u4＝0.252，u5＝0.225，均＜1.96，差别无统计学意义。说明应用骨细胞生长营养素(OGN)治疗不同部位骨折对疗效没影响。表1055例手术治疗各组间疗效比较 55例配合手术治疗组间疗效比较经Ridit统计学处理x2＝27.30，P＜0.01差别有显著性意义。再经Ridit检验，试验组与空白组比较u1＝2.796，P＜0.01差别有非显著性差异，阳性对照组与空白对照组比较u2＝1.424，P＜0.05差别无统计学意义。
表11手术治疗组265例疗效与性别情况比较 试验组300例中应用骨细胞生长营养素(OGN)配合小夹板固定治疗265例，配合手术治疗35例，两种方法对疗效影响Ridit统计学处理x2＝55.15，P＜0.01差别有非常显著意义，再经Ridit检验u＝3.613＞2.58，P＜0.01，差别有非常显著性意义，说明应用骨细胞生长营养素(OGN)配合小夹板外固定方法优于配合手术治疗方法 表12三组间疗效综合比较 表12中经Ridit统计学处理x2＝174.62，差别有非常显著性意义，再经Ridit检验试验组与空白对照组比较u1＝10.29，P＜0.01有非常显著性差异，阳性对照组与空白对照组比较u2＝2.632，P＜0.05差别有显著性意义。
试验组与阳性对照组比较u3＝10.08，P＜0.01差别有非常显著性意义。从而说明本发明骨细胞生长营养素(OGN)组优于阳性对照组与空白对照组。
2.2、促进骨折愈合情况分析 三组450例治疗过程中均在14天或21天、28天拍X线片；如14天或21天已发现骨折愈合者就不再拍片，根据骨折线模糊，连续骨痂生长情况，进行打分。骨折线依旧甚至加宽，无内外骨痂打0分，骨折线变模糊，有内外轻度骨痂打1分，骨折线几乎消失，有连续骨痂生长打2分。其结果见表13。
表13治疗结果X线骨痂评分比较 从表13可见细胞生长营养素(OGN)明显优于骨折挫伤散组和空白对照组，具有较好的促进骨折愈合作用。
2.3、消肿情况分析 按骨折肿胀程度分为无、轻、中、重4个等级，分别为0、1、2、3。按用药时间分别在3、7、10、14天进行观察，其结果见表14。
表14消肿情况比较 注**试验组与阳性对照和空白对照组比较均P＜0.01，有非常显著意义。
*试验组与阳性对照组比较P＞0.05无差异，与空白组比较P＜0.01有非常显著差异。
△阳性对照组与空白对照组比较P＜0.05有显著差异。从而说明，骨细胞生长营养素(OGN)有较好的消肿作用。
2.4、止痛情况分析 疼痛的观察主要是病人主诉情况打分，疼痛完全消失或可忽略打1分，轻度，偶发疼痛打2分，常自觉有疼痛者打3分。其结果见表15。
表15疼痛情况比较分析 注*P＜0.01，△P＜0.05，▲P＞0.05 从表15说明试验组在第3天镇痛作用与阳性对照组比较有非常显著差异，优于阳性对照组，第7天有显著差异，而第1、5天无差异，阳性对照组与空白对照组之间无明显差异。
2.5、不良反应分析 三组在规定治疗时间内尚未发生明显不良反应，有5例女性病人因不能耐受骨细胞生长营养素(OGN)气味，服药时呕吐恶心，拒绝治疗，而改用它药，不纳入验证内。多数病人反映，服用骨细胞生长营养素(OGN)后大便变稀。但无明显腹泻情况。
3、OGN止痛和接骨临床观察与分析 选择肢体各部骨折患者30例(除外长骨中远段骨折)，在创伤后服用本发明实施例？的细胞生长营养素(OGN)。同期选择同等病例在创伤后服用七厘散、杜冷丁、强痛定等中西药物对照观察，其观察结果列表如下
从上表中可以看出，骨细胞生长营养素(OGN)的止痛强度与强痛定相似，仅次于杜冷丁，优于七厘散。其骨细胞生长营养素(OGN)的止痛维持时间比强痛定和杜冷丁较长。其活血化瘀接骨作用优于七厘散药物，骨细胞生长营养素(OGN)一般18天左右可以出现骨痂，比七厘散等其它活血化於中成药平均提前8～9天，比不用活血化瘀药，单用止痛药的骨痂出现提前17天左右，缩短病程近一倍时间。
本发明细胞生长营养素(OGN)临床观察过程中未发现有明显不适合过敏等不良反应，且不产生成瘾，这可打消杜冷丁和强痛定等麻醉药品易成瘾之忧患。从整体效果来看，“骨细胞生长营养素(OGN)”是一种既能止痛又能提高接骨效率、且副作用小的骨伤科新药。
4、典型病例 例1潘某，女性，46岁，工人，住院号0084006。
因跌伤右腕部、肿痛、活动功能受限入院。查体神清，生命体征正常，右腕部肿胀，压痛，活动功能受限，可扪及骨擦音。拍片复查，对位对线良好。即给予服用本发明骨细胞生长营养素(OGN)，每天2次，每次5克，患者服用细胞生长营养素(OGN)后当天，局部肿胀明显消退，疼痛明显减轻，经服药2周拍片复查，X线示骨折线模糊，有连续骨痂生长，拆除外固定，右手活动功能正常，痊愈出院。
例2王某，男，25岁，群众，住院号124576。
因车祸致伤右小腿致肿痛，活动受限入院。检体生命体征正常，右小腿明显肿胀、青紫、局部压痛，可扪及骨擦音和异常活动，X线片示右胫腓骨下1/3粉碎性骨折，移位。
临床诊断右胫腓骨粉碎性骨折，给予手术恩得氏针内固定石膏外固定治疗，当天即口服本发明细胞生长营养素(OGN)，第二天查诊，患者局部肿胀、疼痛明显减轻，服用3周后X线检查示右胫骨下段骨折处骨折线模糊，有连续骨痂生长。4周后痊愈出院。
讨论 1、骨折是临床常见多发疾病，中医骨伤科在我国已有几千年的历史，在骨折治疗方面积累了丰富的经验。《内经》曰“气伤痛，形伤肿”。王冰注“气无形故伤痛，血有形则伤肿”。骨折损伤气血，致血脉离经妄行，恶血留滞，形成血瘀，以致气血运行失常，瘀积不散，为肿为痛。“血不活者瘀不去，瘀不去则不能接”故治当活血化瘀，消肿止痛，接骨续筋，本发明(细胞生长营养素)(OGN)具有以上功效，其中三七甘微苦温，为伤科止血化瘀，消肿定痛之圣药，有止血不留瘀特点，为君药；川芎、当归、西红花行气、和血、养血；桂枝、大黄、地龙温经通脉，清湿热、消肿止痛；血竭、土鳖虫、马钱子散血通经，消结止痛，诸药为臣。佐以川续断、自然铜益肝补肾、续筋接骨；冰片、干姜、白芷、沉香辛香走窜，除行气止痛外，尚可引诸药达病伤之所，为使药。纵观全方君臣佐使，相得益彰，相辅相成，合为化瘀生新，消肿定痛，续筋接骨之功效。
2.骨折愈合(fracture healing)是一个复杂的生理病理过程，骨膜中成骨细胞的再生是骨折愈合的基础，其愈合过程可分为血肿形成，纤维性骨痂形成，骨性骨痂形成及骨痂的改建几个依次交替演进的过程，骨折愈合分为膜内骨化和软骨内骨化，骨折后24小时内，骨折端处的骨外膜开始增生肥厚，骨外膜的内层细胞增生，产生骨样组织，形成新生骨，即膜内骨化，其过程迅速，而且连接牢固。
软骨内化骨是骨折时骨膜骨皮质以及邻近软组织遭受损伤，血管破裂出血，在骨折部形成血肿，由于血球破坏，纤维蛋白渗出，肉芽组织形成，血肿开始机化，位于血肿周围的纤维组织增生将血肿包围，并伸入其中，通过吞噬细胞和异物巨细胞的作用而被吸收代替。
血肿的吸收代替，常需要2～3周或更长的时间才能完成。血肿吸收替代后，骨折断端间幼稚纤维组织，大部分转变为软骨，嵌插在两骨折断端的外骨痂之间，软骨细胞经过增生、变性、钙化而骨化，这常需1～3月时间。
本发明(细胞生长营养素)(OGN)的基础实验证明具有活血化瘀、消肿止痛，接骨续筋的功效。同时又有抗炎、镇痛、改善微循环和促进骨折愈合的作用。我们认为可能是细胞生长营养素(OGN)早期促进血肿的吸收以及减少血肿形成，阻断软骨内骨化，另外，刺激骨膜内成骨细胞生长，有利于骨膜内成骨，从而促进骨折的早期愈合。
3.骨细胞生长营养素(OGN)临床实验观察结果在消肿止痛、促进骨折早期愈合方面都明显优于骨折挫伤散。是骨伤科临床理想用药。 试验例6 本实施例涉及本发明的细胞生长素在治疗癌症、心脑血管疾病及抑制衰老方面的用途。
生长激素HGH是由脑下垂体前叶所分泌，HGH可以增强身体的免疫系统、消除皱纹、使毛发再生、预防心脏病及中风、降低血压。但生长激素HGH分泌量随着年龄而减少，从21到31岁以后，每十年减少14％，因此60岁时只有年轻人的一半；80岁时只有年轻时的五分之一。
实验例4已经证明，本发明(细胞生长营养素)(OGN)能够增加血清HGH浓度和增加垂体生长激素细胞合成生长激素，因此，本发明(细胞生长营养素)(OGN)能够增强身体的免疫系统、消除皱纹、使毛发再生、预防心脏病及中风、降低血压、预防和治疗癌症。
病例 一、家桢院士(男)年龄93岁。93岁高龄的谈老因严重的骨质疏松症和脊椎压缩性骨折，住进上海华东医院，卧床6个月，经服用本发明实施例1的细胞再生素片剂20天后，即可下床开始功能练习，30天后恢复正常。其它类似病例服用本发明各实施例的制剂均得到类似效果。
二、韩昌熙教授(男)67岁，中风高血压急诊入院。服用本发明实施例1细胞再生素1个月出院，没有留下后遗症。如今一切正常，并可生活自理。其它类似病例服用本发明各实施例的制剂均得到类似效果。
三、李司祺(女)患晚期子宫癌，放化疗造成骨质松症，分别于香港、上海、德国就医，经各方医治均无明显效果，后服用本发明实施例2细胞再生素，1个月下地，4个月自理，半年恢复正常工作，并参与拍摄100集电视剧。其它类似病例服用本发明各实施例的制剂均得到类似效果。
四、朱先生(男)57岁，患脑肿瘤，恶性。手术后服用细胞再生素，三个月复查，现一切正常。其它类似病例服用本发明各实施例的制剂均得到类似效果。
五、周业因(男)63岁，患有腰椎陈旧性疾病，腰椎突出症，痔疮体质十分虚弱，经服用细胞生长营养素3个月后，体质恢复正常。现查一切正常，并回到治疗前20年的健康状态。其它类似病例服用本发明各实施例的制剂均得到类似效果。
六、唐祥珍(女)心血管疾病，心脏病。多年来，靠救心药品，经常发病到医院，经手术治疗也未能治愈。服用细胞再生素后，恢复正常，二年来没有复发。其它类似病例服用本发明各实施例的制剂均得到类似效果。
诸如上述病例，可证明疗效，并说明本发明的细胞再生素有很宝贵的临床应用及科学价值。
权利要求
1.一种细胞生长营养素，是由沉香800～900重量份，西红花860～900重量份，木香600～700重量份，川芎1500～1600重量份，桂枝1500～1600重量份，白芷600～700重量份，三七450～550重量份，川续断1500～1600重量份，土鳖虫1500～1600重量份，骨碎补800～900重量份，牛膝600～700重量份，鸡骨1600～1700重量份，大黄300～400重量份，自然铜650～700重量份，冰片450～550重量份，血竭3300～3400重量份中药材提取的有效成分，其特征在于相对密度为1.00---1.40的提取物稠膏混合物含有如下成分
Na(钠) 660～7000mg/L
K(钾) 3750～5160mg/L
Ca(钙) 830～1350mg/L
Mg(镁) 815～1400mg/L
Cu(铜) 大于0，＜0.1mg/L
Mn(锰) 0.4312～0.7mg/L
Zn(锌) 0.0244～0.5mg/L
Fe(铁) 22～33mg/L
P(磷) 550～1020mg/L
Co(钴) 0.138～0.5mg/L
S(硫) 100～267.2mg/L
Mo(钼) 大于0，＜0.1mg/L
B(硼) 6.3～10.256mg/L
Cr(铬) 0.1～0.998mg/L
总蛋白15000～40000mg/L
氨基酸1～50mg/L
维生素100～250mg/L
总糖 0.05～0.5mg/L
2.根据权利要求1所述的细胞生长营养素，其特征在于所述细胞生长营养素为药剂学上可接受的药物制剂。
3.根据权利要求2所述的细胞生长营养素，其特征在于所述药物制剂为口服液、糖浆、煎膏剂、药酒与酊剂、胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂、以及外用膏药。
4.根据权利要求2或3所述的细胞生长营养素，其特征在于所述药物制剂中，细胞生长营养素的含量为60-90wt％
5.根据权利要求1所述的细胞生长营养素，其特征在于所述细胞生长营养素为营养品的添加剂。
6.根据权利要求5所述的细胞生长营养素，其特征在于所述营养品中，细胞生长营养素的含量为3.5～6.0wt％。
7.权利要求1所述的细胞生长营养素，其制备方法为将白芷在乙醇中渗漉，渗漉液除乙醇后得到的稠膏备用；将沉香、西红花，木香、川芎、桂枝加2～5倍水共煎煮；将三七，川续断、土鳖虫，骨碎补、牛膝，鸡骨，自然铜和大黄在5～8倍水中共煎煮2～5次，每次2～8小时，收集煎煮液，过滤、浓缩；用乙醇沉淀，弃沉淀物，回收乙醇，得到浓缩液；合并上述提取液，将冰片，血竭粉碎、过筛后加入提取液中。
8.权利要求1所述的细胞生长营养素在制备治疗和预防肿瘤、心脑血管疾病、补骨生髓、提高血清生长荷尔蒙(GH)、降低胆固醇、治疗骨折、跌打损伤、骨质疏松药物或保健食品上的用途。
全文摘要
本发明公开了一种细胞生长营养素、制备方法及其在制备、治疗和预防肿瘤、心脑血管疾病、补骨生髓、提高血清生长荷尔蒙(GH)、降低胆固醇、治疗骨折、跌打损伤、骨质疏松等药物上的用途，是由沉香、西红花、木香、川芎、桂枝、白芷、三七、川续断、土鳖虫、骨碎补、制马钱子、牛膝、黄瓜子、鸡骨、大黄、自然铜、冰片、血竭等中药提取的有效成分，根据用途将上述稠膏和半固体混合制为药学上可接受的剂型或口服营养制剂，如口服液、糖浆、煎膏剂、药酒与酊剂、注射液、胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂、以及外用膏药；也可以添加到食物或饮料中。本发明(细胞生长营养素)可以有效的抑制破骨细胞，促进成骨细胞生长的功效。改善人体血清GH浓度，增加血清蛋白中的骨细胞生长微量元素，从而达到促进血液微循环、活血化瘀、消肿止痛、通经活络、补骨生髓，使骨骼不退化、不老化，儿童发育可达正常值；抑制肿瘤；延年益寿。
文档编号A61P3/06GK1915344SQ20051009044
公开日2007年2月21日 申请日期2005年8月15日 优先权日2005年8月15日
发明者柳海峰 申请人:柳海峰