专利名称：表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及能表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒重组体(rAAV-DCN)的构建和制备方法。更具体地说涉及人类核心蛋白聚糖基因的克隆及含核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒重组体的包装制备方法，和所述的重组腺相关病毒重组体的药学用途。
背景技术：
人类核心蛋白聚糖(decorin，DCN)是一种主要存在于结缔组织中与胶原纤维相关的蛋白多糖，是一种富含亮氨酸的小分子硫酸皮肤素蛋白聚糖，由40kDa的核心蛋白和一条硫酸皮肤素侧链组成，属于小分子间质性蛋白多糖家族成员。DCN广泛分布在所有哺乳动物组织的细胞外基质中，具有多种生物活性，如影响血管平滑肌细胞的增殖、脂质沉积、血栓形成及血管通透性；结合、储存、激活、灭活多种细胞因子(TGFβ，aFGF，bFGF，GM-CS F，EGF，IL-3，IFN-γ等)，并调节它们的生物利用度。因此DCN直接参与细胞增殖、分化及基质形成，防止细胞外基质的沉积从而发挥抗纤维化作用，它对防止组织和器官纤维化的发生具有重要意义。而且越来越多的资料显示DCN能抑制多种细胞增殖，使转化的细胞及肿瘤细胞静止，这不仅为纤维性疾病也为肿瘤治疗提供了新的药理学线索。
DCN基因位于12号染色体q23，长约40kb，全部编码区长约1080bp，编码359个氨基酸。我们应用重组腺相关病毒介导人类DCN基因治疗自发性高血压大鼠，结果发现DCN基因的导入明显增加高血压大鼠的心肌收缩和舒张功能，改善高血压所致心脏和血管的胶原沉积。此外DCN基因转染还能明显抑制肿瘤细胞的增殖，新近的研究也发现由质粒介导的DCN基因治疗可明显抑制大鼠胶质瘤的生长。结果提示DCN基因治疗纤维性疾病及肿瘤的可能性。
而新近出现的重组腺相关病毒载体又克服了其他基因表达载体所难以克服的缺点，它可以携带基因转染分裂期和非分裂期细胞(即具有广泛的转基因范围)、无副作用(无免疫源性)、感染效率高、能驱动基因在体内长期表达，而且成功地解决了无腺病毒污染的体外大量复制问题，是目前最有前途的基因治疗载体，将为基因治疗进入临床打下良好的基础。我们将人类核心蛋白聚糖基因(DCN)与重组腺相关病毒载体重组构建，并经检测已获得了可以满足治疗要求的滴度，从而有希望使基因治疗能真正满足临床治疗的需要。DCN基因治疗可能为临床治疗纤维化疾病和肿瘤带来良好前景。
在各种情况下，有重要的原因开发和制备表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒重组体，因为它可以作为治疗各种原因所致的纤维化疾病以及肿瘤治疗的潜在药物。
发明内容
本发明人已经成功从人骨骼肌细胞中克隆出DCN基因，并成功将DCNcDNA插入真核表达载体pXXUF1中构成重组质粒pXXUF1-DCN。之后，将pXX2、pXX6、pXXUF1-DCN用钙磷共转染法转入293细胞包装制备能表达人核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒，采用肝素柱纯化，斑点杂交法测定滴度。另外，将包装制备的重组腺相关病毒经静脉导入高血压大鼠发现DCN基因的导入在保持高血压大鼠的血压平稳的同时，还显著减轻高血压所致心脏和血管的胶原沉积。此外DCN基因转染还能明显抑制肿瘤细胞的增殖，新近的研究也发现由质粒介导的DCN基因治疗可明显抑制大鼠胶质瘤的生长。
所以，本发明的第一个目的是提供含有人类核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒。
本发明的第二个目的是提供含有表达人类核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒的包装和制备过程。
本发明的第三个目的是提供利用含有人类核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒治疗高血压的动物实验方法和结果。
本发明表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒，该载体系统包括包装质粒pXX2，辅助质粒pXX6，真核表达载体pXXUF1，并在真核表达载体pXXUF1内插入了人类核心蛋白聚糖基因编码序列，该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工，再经分子生物学方法包装复制，并经纯化而成。
所述表达人类核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒，1)pXX2为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，并在上游和下游各插入一个p5启动子，使表达效率可以提高15倍，提供rAAV复制所必须Rep蛋白；2)pXXUF1为真核表达载体，含CMV启动子，有较强的表达效率，其含有一多克隆位点，可以连接不同的目的基因，其pXXUF1连接人核心蛋白聚糖基因，该载体含有rAAV转基因表达所必须的末端重复序列，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带目的基因；3)pXX6为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激rAAV基因的转录和翻译，保证rAAV产量；4)以上三种质粒经磷酸钙沉淀法共转染293细胞，即可在293细胞内形成高滴度的含目的基因的rAAV颗粒。
所述表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒，该重组腺相关病毒是表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒，于2004年6月30日，并保藏于中国典型培养物保藏中心，本保藏中心保藏编号CCTCCNOV200412。
所述人类核心蛋白聚糖基因，该基因由RT-PCR法从人骨骼肌细胞基因组中克隆而得。
本发明一种药物组合物，它包括有效量的上述所述的表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。
本发明一种制备表达人类核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒的方法；1)pXX2质粒——提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，和pXX6质粒——提供刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VAI RNA基因；2)含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并插入人类核心蛋白聚糖基因，形成重组质粒pXXUF1-DCN；3)步骤1)中的pXX2、pXX6和步骤2)中的pXXUF1-DCN通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞，适时回收，纯化、斑点杂交法检测其病毒滴度；4)步骤3)中回收纯化的病毒经尾静脉注射入自发性高血压大鼠体内，检测其生物学活性。
在步骤3)中共转染的方法是钙磷DNA共沉淀转染法，真核载体pXXUF1所含启动子为CMV启动子，纯化是用SSCP法，而病毒滴度检测是用斑点杂交法。
从下面给出的说明结合附图，本发明的上面和其他目的和特征将变得明了。其中图1显示了DCN的序列(取自GENEBANK)。
图2是显示pXXUF1-DCN的质粒构成。
图3显示了腺相关病毒的核苷酸序列及具体分区。
图4是显示腺相关病毒的基因组构造图。
图5是显示腺相关病毒的ITR序列及二级结构图。
图6是显示腺相关病毒的转录和翻译(一)。
图7是显示腺相关病毒的转录和翻译(二)。
图8是显示pXX2、pXX6质粒图谱构成。
图9是显示pXXUF1质粒构成(注该质粒构成图只显示质粒的主要部分，实际上这两种质粒已加工为5000-7000bp的环状结构，其余部分无重要性，故不写入)。
图10是显示斑点杂交测定病毒滴度结果图11是显示含人类DCN基因的重组腺相关病毒对自发性高血压大鼠血压的影响结果。
图表12是显示rAAV·DCN转染对SiHa细胞周期及细胞凋亡的影响结果。
本发明的进一步详细描述为了获得人DCN基因，本发明人首先设计了扩增DCN cDNA片段的特异性引物，利用从人骨骼肌细胞分离的总RNA作为模板进行RT-PCR。作为结果，获得了显示阳性反应的DCN cDNA，将获得的片断插入克隆载体，在寄主细胞(大肠杆菌)中导入这样获得的载体。另外为了获得含人DCN基因的重组腺相关病毒，本发明人又将DCN cDNA插入真核表达载体pXXUF1，构成重组质粒pXXUF1-DCN，同样导入寄主细胞即大肠杆菌，获得阳性克隆。
重组腺相关病毒包装需要三种质粒，即(1)pXX2为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列。并在上游和下游各插入一个p5启动子，使表达效率可以提高15倍；(2)pXX6为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1 RNA基因，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激AAV基因的转录和翻译，保证AAV的产量；(3)pXXUF1-DCN连接人核心蛋白聚糖基因(pXXUF1-DCN)的真核表达载体，所用的是CMV启动子，有较强的表达效率。该载体含有rAAV转基因表达所必须的末端重复序列(ITRs)，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带目的基因。我们按摩尔比1∶1∶1将pXX2、pXX6、pXXUF1-DCN用钙磷转染法转入293细胞。转染后48-72小时后，收获293细胞，反复冻溶细胞3次，病毒即释放入上清液中，采用肝素柱纯化，斑点杂交法测定滴度，即获得含人核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒。
另一方面，研究了我们包装制备的含人核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒对高血压大鼠血压和心肌重塑的影响，证明rAAV-DCN经静脉转染高血压大鼠模型后，能有效增加大鼠肌组织的DCN表达，在保持高血压大鼠的血压平稳的同时，还显著减轻高血压所致心脏和血管的胶原沉积，改善心肌的重塑。
显示上面提到的本发明表达人核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒制备方法成功，所制备的重组腺相关病毒滴度高，能驱动目的基因长期有效的表达，可与抗高血压药物联合应用于原发性高血压、慢性肾功能不全及其他相关性疾病的临床治疗。亦可用于其他纤维化疾病以及肿瘤的基因治疗。
具体实施例方式
在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
实施例1 DCN cDNA的克隆为了克隆人DCN cDNA根据图一公开的DCN基因序列首先设计了可扩增DCN cDNA的PCR引物即P1，5′-GATACAGGATCCATGAAGGCCACT-3′的正向引物和P2，5′-GCGCAGCTCGAGAATTACTTATAG-3′的反向引物。然后用自胎儿骨骼肌细胞中提取的总RNA作为模板，进行RT-PCR。逆转录反应在20μl的反应体系中进行，该体系含有10×缓冲液2μl，25nM MgCl24μl，10mmol/L dNTPs2μl，25U/μl的逆转录酶1μl(Gibco BRL)，5μg由胎儿心肌细胞经Trizole试剂提取的总RNA，50pmol/L random 9mers 1μl，30℃ 10min，55℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min，该RT产物用作PCR模板。
PCR反应在50μl的反应体系中进行，上述RT产物10μl，10×PCR缓冲液4μl，终浓度为0.3μmol/L的上、下游引物各1μl，2.5U的Taq DNA聚合酶。在PCR热循环仪中，94℃预变性4min，然后94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 1min，35个循环，最后72℃延伸7min，电泳后回收1080bp目的片段。以限制性内切酶BamH I和Xho I酶切后的DCN及载体pBluscript KS+(pBS)片段经T4DNA连接酶连接。5μl DNA连接产物转化DH5α感受态细菌，挑取克隆接种于5ml含氨苄青霉素(70μg/ml)的LB培养基中，培养16h后小量提取质粒DNA，酶切鉴定DNA目的片段正确构建于pBS载体中(pBS·DCN)，并经大连宝生物公司测序证实。
实施例2 pXXUF1·DCN重组质粒的制备将实施例1中获得的DCN基因产物与pXXUF1相连。测序正确的重组体pBS·DCN经酶切位点的转导，最终使得目的基因DCN两端均含有Not I位点，以限制性内切酶Not I分别对DCN及载体pXXUF1进行单酶切后琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收所要片段，按上述方法制备重组质粒pXXUF1·DCN。DCN cDNA取代pXXUF1中的gfp基因，质粒图如图2。
实施例3 rAAV-DCN重组病毒的包装、回收与纯化一、天然腺相关病毒(AAV)及重组腺相关病毒(rAAV)载体的特点腺相关病毒是一种动物单链DNA病毒，它属于细小病毒科，细小病毒亚科，依赖病毒属，自然缺陷、无包被和无致病原性。
1、AAV基因组是一个线性、单链(ssDNA)分子，含4680个核苷酸(序列如图3)，其特点在于1)其基因组由4个开放阅读框(ORF)组成，分称rep区、lip区、inf区和cap区(见图3、图4)。位于基因组DNA左端的一个大ORF由于移码突变或缺失会阻止DNA复制，因而被称为rep区，。右端的一个大ORF(cap)编码合成3种外壳蛋白。另有两个小ORF位于基因组DNA的中央区，即inf区和lip区，具体功能尚不清。
2)在分子单链每个末端含有一个145个碱基末端重复序列(ITR)(见图3)。ITR序列折叠成发卡结构作为DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的唯一已知顺式作用元件(见图5)。
3)腺相关病毒的复制和转录调节相当复杂，按有无辅助病毒的共转染分，有增殖性和潜伏性两种表达方式(如图6)。
在AAV的增殖性表达中，可转录生成6种mRNA，分别由启动子P5、P19、P40启动合成(如图7)。在腺病毒(Ad)共转染的情况下，Ad的E1A基因负责AAV基因表达的反式激活；Ad E2A基因编码单链DNA结合蛋白，可刺激AAV启动子所启动的转录，还可促进AAV转录后从胞核向胞质转运；另外AdVA1 RNA可能也有利于AAV蛋白合成的起始。而AAV也能够正调节和负调节自身基因和辅助病毒基因的表达。AAV的rep基因能够正调节和负调节P5、P19、P40启动子所启动的转录，在有Ad的情况下，rep基因产物行使正调节功能，这是AAV基因大量合成所必须的；而在无辅助病毒共转染的情况下，rep基因产物则起负调节作用。
在无辅助病毒的情况下，AAV DNA以双链形式整合到宿主细胞基因组中，在那里以潜伏状态持续存在，形成AAV的潜伏感染。AAV整合的特异位点是在人染色体的19q13.3-19q ter上。Rep基因产物除了负调节作用外，还可识别和结合特异的整合位点，即GGTC序列，并介导了ITR与整合位点的重组。而腺病毒的感染可使其进入增殖感染状态。
2、AAV作为基因克隆的载体。
AAV是目前已知的唯一能够在宿主基因组特异染色体位点整合的真核细胞病毒。这个发现使基因治疗产生了新的希望，AAV基因治疗载体不仅仅能够和非整合载体(如腺病毒为基础的载体)相比更持续稳定地表达转基因，而且能够减少理论上的由于转基因的随机整合导致的插入突变几率。我们使用的这一套载体系统是将天然腺相关病毒和腺病毒用分子生物学方法经一系列剪切和修饰而成，它们保留了腺相关病毒复制和转录所必需的部分，也保留了腺病毒的晚期基因辅助成份，其他多余的部分均已删除，既能实现病毒长期稳定的潜伏感染，又能避免腺病毒的致病危险，而且腺病毒晚期基因的表达可以保证被克隆基因的表达效率。这一载体系统的构成如下pXX2(如图8)保留了AAV的cap基因和rep基因(此时得到pACG-2)，并在下游区域又插入了一个p5启动子(在原来区域用XbaI和PstI切下，再连接到pACG-2的适当位置)。另外我们对照组所使用的报告基因(lacZ)也连在pXX2的下游。方法是先在pXX2下游造一个ClaI的切口，再在其切口上加一个Sse8387I的接头(5′-CGCCTGCAGG-3′)，把两端为PstI切口的lacZ片段连接于其上。
PXX6(如图8)在腺病毒改造质粒pBH10(已切掉了E1、E3基因和包装信号)上用PmeI和SgfI切下一个8kb的片段(得到pXX5)，而pXX6则是由pXX5上用ClaI和SalI切下一段克隆入pBS中得到的，仅仅留下E2A、E4和VA编码区。
pXXUF1(如图9)rAAV包装所用的质粒pXXUF1含有CMV启动子(箭头)所驱动的人gfp基因，它是将腺相关病毒的编码基因全部删除后再由NotI位点导入的。
二、rAAV-DCN重组病毒的包装与回收pXX2、pXX6、pXXUF1-DCN质粒的大量提取，所用大提试剂盒购自Promega公司。方法依说明书所述。
将293细胞(人肾母胚胎肿瘤细胞系)传入数个150mm培养板中，传代培养需要0.25％胰蛋白酶、高糖DMEM培养基、新生小牛血清(购自Gibco公司)。待细胞生长到60％到70％聚集度时，按85μg DNA/150mm培养盘的总量，按摩尔比1∶1∶1(质量比为1.7∶3.8∶1)用钙磷转染法转入293细胞。分别将pXX2、pXX6、pXXUF1-DCN质粒加入一无菌的250ml培养瓶中，然后依次加入2.5MCaCl2溶液(160μl/盘)和无菌去离子水，最后加入2×BBS(pH6.95，1.6ml/盘)，逐滴加入振摇混合液，以形成较小的钙磷颗粒。之后室温下孵育30min。随即吸弃293细胞培养盘中的培养基，加入3ml DNA-钙磷混合液，于35□、3％CO2培养16～24小时后换液，转入37□，5％CO2继续培养36～48小时。转染后48-72小时吸弃所有培养基，加入少量PBS缓冲液，刮取盘中293细胞，后-80□冻存。
为祛除细胞中的异型蛋白，须用肝素柱纯化，方法如下将收集的含病毒的293细胞反复冻溶三次，加入0.1mg的DNase I及0.1mg的RNase A酶，37℃抚育2小时；再加入0.5％的脱氧胆酸，37℃抚育30分钟；离心数分钟，上清分别经5μm和0.8μm的滤膜过滤；取8ml肝素琼脂糖混悬液加入一直径为2.5cm装有阀门的玻璃柱中；待琼脂糖混悬液流尽后，在形成的琼脂床上放置一滤膜，用25mlPBS(PH7.4)平衡琼脂床；关闭阀门，将上述经过过滤的病毒原液加入玻璃柱中，打开阀门，控制病毒以1滴/秒的速度滴下；待病毒液滴完后，用25mlPBS(PH7.4)+0.1M NaCl洗两次；用15mlPBS(PH7.4)+0.4M NaCl洗脱病毒；用Millipore Biomax-100k NMWL过滤装置(UFV2BHK40)浓缩病毒液至3～5ml。
实施例4 rAAV-DCN病毒滴度的测定-斑点杂交a)DCN cDNA探针的标记和纯化同位素标记的核苷酸α-P32购自北京雅辉公司。用Not I切下pXXUF1-DCN中的DCN片段做为已知序列的探针。随机引物法标记DCN片段并纯化(试剂盒购自QIAGEN公司，方法如说明书)。
b)回收物和定量标准的准备回收物经适量DNAse I和RNAse消化细胞基因组的DNA、RNA后再加ProteinaseK，消化病毒的蛋白质外壳(以上试剂均购自日本TAKARA公司)。酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，祛除沉淀，上清中为病毒中的DNA。将上清按体积比对倍稀释。标准物采用目的基因片段，即DCN片段，测定浓度后按分子数对倍稀释(具体计算方法略)。并作加热和碱变性处理。
c)杂交与放射自显影配好斑点杂交装置，并按装置大小安置一块0.45μm的尼龙膜，将待测病毒样品和标准样品按体积梯度和分子梯度分别上样，上样后将膜80℃干烤2小时，后42℃预杂交1小时(预杂交液购自INTERGEN公司)。再加加热处理的标记探针，45℃杂交12-16小时。洗膜后-80℃放射自显影2-3天。结果如图10此结果说明我们制备的rAAV具备足够的滴度(1×1011pfu/L)，可以用于动物实验和临床治疗。
实施例5 rAAV-DCN抑制自发性高血压大鼠(SHR)血压的升高、减轻心脏和血管的胶原沉积自发性高血压大鼠模型购自上海高血压病研究所，共12只大鼠分两组，分别经尾静脉注射rAAV-DCN与rAAV-GFP病毒，每只所用量为1×1011pfu。注射后每月测血压并留取24小时尿。DCN注射后大鼠血压并无明显下降，但与对照组相比，治疗组动物血压较平稳，无上升趋势。而对照组动物血压持续升高，第4个月时已明显高于治疗组。结果如图十一所示。
此外，研究发现DCN基因治疗在维持血压平衡的情况下，还显著逆转心血管系统的重构取动物心脏、血管固定后切片，均作HE和Van Gieson染色，比较两组动物发现1)对照组动物的心脏从组织切面上看心室壁明显增厚，而心室腔则明显减小2)镜下观察，实验组动物的心室肌肌束增粗，部分被纤维组织取代。3)主动脉的V-G染色初步结果证明，对照组动物血管壁中的胶原纤维分布明显比实验组动物多且广泛。
此结果说明我们制备的rAAV-DCN病毒具有长期高效改善高血压所致肾脏、心脏和血管损害的良好生理和病理生理作用，可与抗高血压药物联合应用于原发性高血压、慢性肾功能不全及其他相关性疾病的临床治疗。亦可用于其他纤维化疾病以及肿瘤的基因治疗。
实施例6 rAAV-DCN对SiHa细胞周期和凋亡的影响rAAV-DCN转染细胞2周后，收集细胞进行流式细胞仪(FACSsort，BectonDickinson)检测分析细胞周期。结果发现SiHa细胞转染1×105pfu和1×106pfurAAV·DCN 2周后，使细胞周期发生明显变化。G1期细胞百分率明显增加，S期和G2期细胞百分率明显降低，对细胞凋亡无影响(见图12)。这些结果提示rAAV介导DCN基因导入可能在肿瘤治疗中起重要作用，如果将其与细胞周期选择性抗肿瘤药物联合使用将能明显提高治疗效果。
权利要求
1.一种表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒，该载体系统包括包装质粒pXX2，辅助质粒pXX6，真核表达载体pXXUF1，并在真核表达载体pXXUF1内插入了人类核心蛋白聚糖基因编码序列，该重组腺相关病毒由天然状态的腺相关病毒经分子生物学方法人工剪切、修饰和加工，再经分子生物学方法包装复制，并经纯化而成。
2.如权利要求1所述表达人类核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒，其特征在于1)pXX2为包装质粒，含有编码腺相关病毒Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，并在上游和下游各插入一个p5启动子，使表达效率可以提高15倍，提供rAAV复制所必须Rep蛋白；2)pXXUF1为真核表达载体，含CMV启动子，有较强的表达效率，其含有一多克隆位点，可以连接不同的目的基因，其pXXUF1连接人核心蛋白聚糖基因，该载体含有rAAV转基因表达所必须的末端重复序列，负责病毒的复制和病毒外壳的包被并携带目的基因；3)pXX6为辅助质粒，删除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因，它们表达的蛋白质可发挥辅助作用以刺激rAAV基因的转录和翻译，保证rAAV产量；4)以上三种质粒经磷酸钙沉淀法共转染293细胞，即可在293细胞内形成高滴度的含目的基因的rAAV颗粒。
3.如权利要求1、2所述表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒，其特征在于该重组腺相关病毒是表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒，于2004年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，本保藏中心保藏编号CCTCCNOV200412。
4.如权利要求1所述人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒，其特征在于该人尖核心蛋白基因由RT-PCR法从人骨骼肌细胞基因组中克隆而得。
5.一种药物组合物，其特征在于，它包括有效量的权利要求1所述的表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒和药学上所接受的载体或赋形剂。
6.一种制备表达人类核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒的方法；其特征在于1)pXX2质粒——提供腺相关病毒包装所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的编码序列，和pXX6质粒——提供刺激腺相关病毒复制和转录所必需的腺病毒E1A、E2A和VAI RNA基因；2)含腺相关病毒基因组的真核表达载体pXXUF1，在该真核载体中腺相关病毒缺失cap蛋白和rep蛋白编码区，并插入人类核心蛋白聚糖基因，形成重组质粒pXXUF1-DCN；3)步骤1)中的pXX2、pXX6和步骤2)中的pXXUF1-DCN通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞，适时回收，纯化、斑点杂交法检测其病毒滴度；4)步骤3)中回收纯化的病毒经尾静脉注射入自发性高血压大鼠体内，检测其生物学活性。
7.如权利要求6所述的一种制备表达人类核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒方法，其特征在于，在步骤3)中共转染的方法是钙磷DNA共沉淀转染法，真核载体pXXUF1所含启动子为CMV启动子，纯化是用SSCP法，而病毒滴度检测是用斑点杂交法。
全文摘要
表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒及其制备方法，更具体地说涉及人类核心蛋白聚糖基因的克隆及含核心蛋白聚糖基因的重组腺相关病毒重组体的包装制备方法和所述的重组腺相关病毒重组体的药学用途，本发明已经成功从人骨骼肌细胞中克隆出DCN基因，并成功将DCN cDNA插入真核表达载体pXXUF
文档编号A61K48/00GK1804041SQ20051012051
公开日2006年7月19日 申请日期2005年12月22日 优先权日2005年12月22日
发明者汪道文, 赵春霞, 肖啸 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院