专利名称：川芎有效组分及制备方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体涉及一种从川芎中提取的有效组分及其制备方法。
背景技术：
冠心病和心绞痛是危害人类健康的“第一杀手”，近年来，随着我国人口老年化以及人们工作、生活、饮食结构及环境等的变化，冠心病等心脑血管疾病的发生率也逐年增多，严重威胁着人民的身心健康。天然产物中许多活性物质具有抗心肌缺血、缺氧作用，其中一些已开发成治疗冠心病和心绞痛的新药，如治疗冠心病的药物地奥心血康，它是由从中药中提取的8种甾体皂甙制成的纯中药制剂；心达康是以沙棘为原料提取加工而成的纯天然药物，其有效成分为沙棘总黄酮。因而从天然产物中寻找具有抗心肌缺血、缺氧生理活性的有效物质，是发现、开发新药的有效途径之一。我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发成治疗冠心病、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗心肌缺血，用于治疗冠心病和心绞痛的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。
川芎为伞形科植物Ligusticum chuangxiong Hort的干燥根茎，始载于《神农本草经》，列为上品。《图经本草》指出“以蜀川为胜”，故名川芎。川芎主产于四川灌县、重庆和都江堰市等地，以灌县产为最佳，在江西、湖北及云南等地亦有栽培，其中江西所产也称抚芎，云南所产也称云芎。川芎活血祛瘀，行气开郁，祛风止痛。用于血瘀气滞所致的月经不调，痛经经闭，肝郁气滞而致血行不畅的胸胁疼痛，头痛，风寒湿痹，跌打肿痛。现代功效研究表明川芎不仅能“活血行气，祛风止痛”，而且还具有解表和燥湿的功效。川芎的化学成分主要有生物碱、挥发油等，还有、内酯类、酚类等多种成分。含川芎嗪(chuanxiongzine)，即四甲基吡嗪(tet ramethylpyrazine)，黑麦草碱或川芎哚(perlo lyrine)即1-(5-羟甲基2-呋喃基)-9H-吡啶并(3，4-b)吲哚(1-(5-hydroxymethyl-2-furyl)-9H-pyrido(3，4-b)indo le)等；挥发油中含葶本内酯(ligust ilde)，香草酸(vanillic acid)，香草醛(vanilln)，匙叶桉油烯醇(spathulenol)等(范永春等，时珍国医国药，2003，14(9)574-576)。
川芎的应用非常广泛，以川芎为主药的制剂也枚不胜数，如逐瘀消肿合剂、柏子养心丸、补阳还五丹、川芎注射液等。川芎中阿魏酸可抑制血小板聚集，促进血小板的解聚，抗血栓的形成，解除血管平滑肌痉挛，抗氧化和提高膜稳定性，以及抗炎、镇痛、抗生育、调节免疫功能、利肝保胆等药理作用(杨广德等，中成药，2002，24(6)418-420)。其钠盐阿魏酸钠对家兔脊髓、心肌缺血-再灌注损伤有保护作用(柯奇斌等，临床麻醉学杂志，2002，18(8)425-428。陈莉芬等，重庆医科大学学报，2003，28(1)49-52。)，还具有降低脑毛细血管通透性从而促进炎症的改善(吴大正等，华西药学杂志，2001，16(2)98-100)和延缓及治疗白内障的作用(祁明信等，中国病理生理杂志，2002，18(11)1390-1393)等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种川芎的有效组分。
本发明的另一目的在于提供该川芎有效组分的制备方法，制剂及用途。
本发明一种川芎的有效组分的组成为阿魏酸的含量为45～65％，3-丁基-4，5，6，7-四氢-3，6，7-四羟基-1(3H)异苯并呋喃(3-Butyl-4，5，6，7-tetrahydro-3，6，7-trihydroxy-1(3H)-isobenzofuranone，9CI)的含量为4～18％。
优选地，阿魏酸的含量为50～60％，3-丁基-4，5，6，7-四氢-3，6，7-四羟基-1(3H)异苯并呋喃的含量为6～15％最佳地，阿魏酸的含量为53～57％，3-丁基-4，5，6，7-四氢-3，6，7-四羟基-1(3H)异苯并呋喃的含量为8～12％。
本发明提供了如下技术方案川芎有效组分的制备方法，包括下列步骤将川芎药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。
优选的川芎有效组分制备方法，包括下列步骤将川芎药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(47～53∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(8～13∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温。
最佳的川芎有效组分制备方法，包括下列步骤将川芎药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液；将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为75％的水溶液、流动相B为25％的乙腈溶液；40分钟时，流动相A为5％的水溶液、流动相B为95％的乙腈溶液；50分钟时，流动相A为5％的水溶液、流动相B为95％的乙腈溶液；流速为10ml/min，柱温为室温；样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段3.0～10.0min收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
本发明中，可以将获得的川芎有效组分用来制备任何一种药剂学上所说的制剂。使用该川芎有效组分按照药剂学上记载的制剂的的制备方法制成制剂。
本发明中，该川芎有效组分及其制剂可在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。
本发明提供由川芎中提取分离得到的有效组分，该提取物提取分离工艺显著特点在于使用了正相硅胶柱能有效地除去糖、蛋白质、氨基酸等杂质，提高有效成分的含量，同时在工艺中采用了制备色谱，能快速准确的得到有效成分。
本发明的有益之处是本发明提供的川芎有效组分，对心肌缺血有保护作用，其化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。
图1为本发明川芎有效组分的HPLC分析图。
具体实施例方式
下面将结合本发明的实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。
实施例一 川芎有效组分的制备工艺将200g川芎药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏18.6g，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品2.5g；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段3.0～10.0min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分0.22g。
实施例二 川芎有效组分的制备工艺将500g川芎药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏36.8g，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(47～53∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(8～13∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品5.8g；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段3.0～10.0min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分0.45g。
实施例三 川芎有效组分的制备工艺取川芎药材250g，将其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏得21g，将浸膏和硅胶拌样，用正相硅胶柱进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动相，得洗脱液I，然后改换氯仿和甲醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得4.3g样品。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件色谱柱为Agient制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，洗脱梯度见表2，流速为10ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段3.0～10.0min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分0.56g。
实施例四 川芎有效组分的分析(1)上述川芎提取物中阿魏酸、3-Butyl-4，5，6，7-tetrahydro-3，6，7-trihydroxy-1(3H)-isobenzofuranone，9CI的含量测定(高效液相色谱法)色谱条件色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；采用梯度洗脱，流动相A相为0.2％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为90％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为10％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；10分钟时，流动相A为50％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为50％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；30分钟时，流动相A为5％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为95％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.5mL·min-1；检测波长全波长；柱温30℃；ELSD条件漂移管温度100℃；氮气流速1.4L/min供试品溶液的制备称取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。
测定方法精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。
(2)上述川芎提取物HPLC-ELSD指纹图谱测定方法参见(1)上述川芎提取物中的阿魏酸、3-Butyl-4，5，6，7-tetrahydro-3，6，7-trihydroxy-1(3H)-isobe nzofuranone，9CI含量测定(高效液相色谱法)。记录色谱时间为30分钟。
分析结果川芎有效组分的HPLC-ELSD分析谱图见图1，图1中的1、2、号峰，分别是阿魏酸、3-Butyl-4，5，6，7-tetrahydro-3，6，7-trihydroxy-1(3H)-isobe nzofuranone，9CI。两个峰的相对保留时间依次为10.6(阿魏酸)，11.3(3-Butyl-4，5，6，7-tetrahydro-3，6，7-trihydroxy-1(3H)-isobe nzofuranone，9CI)。
本发明中，阿魏酸的结构式为 本发明中，3-Butyl-4，5，6，7-tetrahydro-3，6，7-trihydroxy-1(3H)-isobe nzofuranone，9CI的结构式为
实施例五 川芎有效组分制剂取实施例三的川芎有效组分0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。
实施例六 川芎有效组分制剂取实施例三的川芎有效组分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。
实施例七 川芎有效组分制剂取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基β-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤叶低温干燥，的降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基β-环糊精的包合物粉末外，再取实施例三的川芎提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装300支，即得。
实施例八 川芎有效组分的药理实验1药理模型乳鼠心肌细胞缺血缺氧模型原代心肌细胞培养出生1～3天SD乳鼠处死后，取心脏，经PBS液清洗后切成1mm3左右的碎块。用0.125％胰蛋白酶(Sigma，USA)+0.05％胶原酶II(Gibco，USA)于37度消化3～4次。差速贴壁法分离成纤维细胞1.5小时后，细胞悬液转移至48孔板中(每孔约4×105细胞)。经DMEM(Gibco，USA)加10％胎牛血清(Falcon，USA)培养3-6天的细胞供药效筛选。筛选前1天替换为无血清培养液。培养3～6天的心肌细胞，PBS洗涤后加入含药培养液。置于95％N2和5％CO2培养箱中缺氧6小时。然后在CO2培养箱中复氧3小时。取细胞上清液测定LDH含量。
给药方案提取得到的川芎有效组分用无糖Hanks液配成10-4g/mL供试液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO终浓度控制在0.2％以下)。各组分在培养液中的终浓度控制在10-5g/mL。
乳酸脱氢酶含量测定细胞培养液中乳酸脱氢酶含量能够表示细胞损伤程度。漏入上清液中的乳酸脱氢酶含量越高，表明细胞损伤也显著。乳酸脱氢酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。测定方法为取30微升细胞上清液，加入50微升基质缓冲液及10微升乳酸脱氢酶辅酶，37度振荡15分钟，再加入50微升2，4-二硝基苯肼，37度振荡15分钟。平行空白。取反应液50微升加入200微升0.4mol/L氢氧化钠溶液，静置3～4分钟后，用酶标仪于450nm测定光度值。
所有数据用均值±方差表示。采用单边方差分析和T检验进行统计学分析。与模型组相比，P＜0.05认为显著有效。药效结果见表1。根据心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)检测结果，川芎有效组分对降低LDH释放有非常显著效果。
表1
2药理模型脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型原代脐静脉内皮细胞培养取健康新生儿脐带，用30～50mlHanks液洗净静脉血管内的残留血迹。视脐带长度加入相应量的0.1％胶原酶I，转入培养箱消化15～20分钟。随后将脐带内消化液小心收集到烧杯中，并用Hanks液将烧杯润洗两次，一并收集到烧杯中分装于离心管，900rpm离心10分钟。吸去上清液，用M199培养液(含10％胎牛血清，100U/ml双抗，0.15mg/ml Heparin，10uM VC)充分溶解沉淀。将所得细胞悬液分装于5cm2培养瓶，置于培养箱内培养。第二天换成采用含30ug/ml ECGS的M199培养液，之后每三天换一次培养液直至细胞铺满底面。所用细胞均为原代内皮细胞。造模前将培养瓶内细胞接种至96孔板并培养一天，所用细胞量为3.5～4万/孔。造模时，吸弃旧的M199培养液，加入含药无酚红M199培养液，每孔总量为100ul。置于95％N2和5％CO2培养箱中缺氧12小时，然后在CO2培养箱中复氧2小时。取细胞上清液测定LDH含量和NO含量。
给药方案提取得到的川芎有效组分用无糖Hanks液配成10-4g/mL供试液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO终浓度控制在0.2％以下)。各组分在无酚红M199培养液中的终浓度控制在10-5g/mL。
乳酸脱氢酶含量测定细胞培养液中乳酸脱氢酶含量能够表示细胞损伤程度。漏入上清液中的乳酸脱氢酶含量越高，表明细胞损伤也显著。乳酸脱氢酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。测定方法为取30微升细胞上清液，加入50微升基质缓冲液及10微升乳酸脱氢酶辅酶，37度振荡15分钟，再加入50微升2，4-二硝基苯肼，37度振荡15分钟。平行空白。取反应液50微升加入200微升0.4mol/L氢氧化钠溶液，静置3～4分钟后，用酶标仪于450nm测定光度值。
药效结果所有数据用均值±方差表示。采用单边方差分析和T检验进行统计学分析。与模型组相比，P＜0.05认为显著有效。药效结果见表2。根据内皮细胞乳酸脱氢酶检测结果，川芎有效组分对降低LDH释放有非常显著效果。
表2
权利要求
1.一种川芎有效组分，其特征在于其中阿魏酸的含量为45～65％，3-丁基-4，5，6，7-四氢-3，6，7-四羟基-1(3H)异苯并呋喃的含量为4～18％。
2.如权利要求1所述的川芎有效组分，其特征在于该川芎有效组分中，阿魏酸的含量为50～60％，3-丁基-4，5，6，7-四氢-3，6，7-四羟基-1(3H)异苯并呋喃的含量为6～15％。
3.如权利要求1所述的川芎有效组分，其特征在于该川芎有效组分中，阿魏酸的含量为53～57％，3-丁基-4，5，6，7-四氢-3，6，7-四羟基-1(3H)异苯并呋喃的含量为8～12％。
4.权利要求1所述川芎有效组分的制备方法，包括下列步骤将川芎药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。
5.如权利要求书4所述的方法，包括下列步骤将川芎药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(47～53∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(8～13∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温。
6.如权利要求书4所述的方法，包括下列步骤将川芎药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液；将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为75％的水溶液、流动相B为25％的乙腈溶液；40分钟时，流动相A为5％的水溶液、流动相B为95％的乙腈溶液；50分钟时，流动相A为5％的水溶液、流动相B为95％的乙腈溶液；流速为10ml/min，柱温为室温；样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段3.0～10.0min收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
7.根据权利要求1-3任一权利要求所述的川芎有效组分为活性成分制成的药用制剂，其特征是川芎组分加入药用添加剂按照药剂学允许的制备方法制成药用制剂。
8.一种权利要求1所述的川芎有效组分在制备治疗和预防心血管疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种川芎有效组分及其制备方法。该提取物是从川芎中提取的有效组分，主要由活性成分组分。在有效组分中，主要由含量含量为50～65％的阿魏酸，含量为5～18％的3－Butyl－4，5，6，7－tetrahydro－3，6，7－trihydroxy－1(3H)－isobe nzofuranone，9CI组成。本发明同时提供有效组分的制备方法、有效成分含量测定方法。该有效组分适用于心血管疾病的预防和治疗。
文档编号A61P9/00GK1981790SQ20051012235
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月14日 优先权日2005年12月14日
发明者程翼宇, 贺庆, 王毅, 王学伟, 李云飞, 水文波, 葛志伟, 胡兴江 申请人:天津天士力现代中药研究开发有限公司