专利名称：治疗心血管疾病的中药组合物、制剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗心血管疾病的中药组合物，具体地说涉及从丹参中提取的有效组分二氢丹参酮I与丹皮中提取的有效组分芍药酮甙(Paeonidanin)、牡丹皮苷b(Mudanpioside b)的组合，含有该组合物的制剂，及其在制备具有抗心肌细胞缺血作用药物中的应用。
背景技术：
冠心病和心绞痛是危害人类健康的“第一杀手”，近年来，随着我国人口老年化以及人们工作、生活、饮食结构及环境等的变化，冠心病等心脑血管疾病的发生率也逐年增多，严重威胁着人民的身心健康。我国因心脑血管疾病死亡者占总死亡人口的百分比，已由1957年的12.07％上升到2001年的42.6％，每年死于心脑血管疾病者达200万。
目前，有很多中药用于心脑血管疾病的治疗，如血府逐瘀汤，复方丹参滴丸等。
双丹方由丹参和丹皮组成，主治心血瘀阻型胸痹心痛(缺血性心脏病)。缺血性心脏病属中医学胸痹范畴，患者血流表现为凝、粘、聚、滞状态。中医病机以血瘀阻滞心络为主要矛盾，心失所养，不通则痛，故活血化瘀为第一要法。双丹方立足治本，丹参丹皮相须为用，活血化瘀，通络止痛，恰合心血瘀阻型胸痹心痛病机。丹参活血中又兼有养血之功，活血而不伤正，通中有补，相辅相成。双丹颗粒于1996年上市，被列为2000年国家级星火项目计划(00B101D7400035)。药理研究表明双丹方剂能显著改善犬急性心肌缺血范围和缺血程度，减少梗塞面积，显著抑制血清肌酸磷酸激酶活性和乳酸脱氢酶释放，抑制血小板粘附性和聚集性、抑制血栓形成；对垂体后叶素所致冠脉流量减少有明显保护作用。
中药通过多途径、多靶点、整合调节机制发挥药效作用，具有系统性特点。但是，传统中药化学成分复杂，药效物质基础不明确，难于质量控制。治疗心脑血管疾病的各种中药有效部位的功效各有不同和侧重，用有效部位的配伍代替全方，既具备中药整体作用的特点，同时降低了其复杂性，便于药物的质量控制。因此，提供更加方便有效的中药有效部位复方制剂具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗心血管疾病的中药有效组分复方组合物。
本发明的另一目的是提供该组合物的用途。
本发明还提供了含有该组合物的制剂。
本发明是通过以下技术方案予以实施本发明的中药组合物由丹参提取物和丹皮提取物组成，各组分重量百分比为丹参提取物52％～60％；丹皮提取物40％～48％。
优选的，本发明的中药组合物各组分的重量百分比为丹参提取物53％～59％；丹皮提取物41％～47％。
更优选的，本发明的中药组合物各组分的重量百分比为丹参提取物54％～58％；丹皮提取物43％～46％。
最佳的，本发明的中药组合物各组分的重量百分比为丹参提取物55％～57％；丹皮提取物43％～45％。
本发明的中药组合物中，丹参提取物中二氢丹参酮I含量为85.52～97.33％；丹皮提取物中芍药酮甙(Paeonidanin)的含量为20～30％，牡丹皮苷b(Mudanpioside b)的含量为35～45％。
本发明的中药组合物的制备方法包括以下步骤(1)丹参提取物的制备将丹参药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为半制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱；(2)丹皮提取物的制备将丹皮药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液I，弃之。药渣加入乙醇，加热提取得提取液II，将提取液II浓缩成浸膏，用甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用低浓度甲醇作为流动相，得洗脱液I，然后改换高浓度甲醇作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为半制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱；(3)按照处方量将丹参提取物和丹皮提取物混合。
优选的，本发明的中药组合物的制备方法包括以下步骤(1)丹参提取物的制备取丹参药材，将其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(47～53∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(8～13∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为半制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为2.8～3.2ml/min，柱温为室温；(2)丹皮提取物的制备将丹皮药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液I，弃之。在药渣中加入60％～80％乙醇，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，滤液合并得提取液II，将提取液II浓缩成浸膏，用40％～60％甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用3％～8％甲醇作为流动相，得洗脱液I，然后改换50％～70％甲醇作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为半制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为2.8～3.2ml/min，柱温为室温；(3)按照处方量将丹参提取物和丹皮提取物混合。
最佳的，本发明的中药组合物的制备方法是(1)丹参提取物的制备取丹参药材，将其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为半制备柱(LichrospherC18；10.0mm×250mm，5μm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为50％的水溶液、流动相B为50％的乙腈溶液；35分钟时，流动相A为20％的水溶液、流动相B为80％的乙腈溶液；45分钟时，流动相A为5％的水溶液、流动相B为95％的乙腈溶液；55分钟时，流动相A为5％的水溶液、流动相B为95％的乙腈溶液；流速为3ml/min，柱温为室温；样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段21.7～30.3min收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分；(2)丹皮提取物的制备取丹皮药材，将其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液I。药渣加入70％乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液II，将提取液II浓缩成浸膏，用50％甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5％甲醇作为流动相，得洗脱液I，然后改换60％甲醇作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品制备色谱的分离条件色谱柱为汉邦半制备柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为90％的水溶液、流动相B为10％的乙腈溶液；8分钟时，流动相A为81％的水溶液、流动相B为19％的乙腈溶液；60分钟时，流动相A为65％的水溶液、流动相B为35％的乙腈溶液；流速为3ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段7.7～10.7min收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分；(3)按重量百分比，将丹参提取物55％～57％，丹皮提取物43％～45％混合。
本发明中药组合物可以加入辅料，按照常规制备方法制成药剂学上任何一种形式。
本发明的中药组合物还可以和其他具有相同疗效的药物成分配伍，按照常规方法制成药剂学上接受的任何一种制剂。
本发明提供的中药组合物，可以制成药剂学上任何一种形式，包括针剂和口服制剂。其中针剂包括注射液、滴注液、粉针剂；口服制剂包括颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。
本发明的有益之处是本发明提供的中药组合物是从丹参、丹皮药材中提取出的有效成分的组合物，相比较现有的治疗心脑血管疾病的中药，其化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。
图1为本发明丹参提取物的HPLC分析图；图2为本发明丹皮提取物的HPLC分析图。
具体实施例方式
下面将结合本发明的实施例进一步详细说明本发明的实质内容及有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例一 本发明中药组合物的制备取丹参药材250g，将其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏17.2g，将浸膏和硅胶拌样，用正相硅胶柱进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动相，得洗脱液I，然后改换氯仿和甲醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品2.5g。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件色谱柱为汉邦半制备柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为50％的水溶液、流动相B为50％的乙腈溶液；35分钟时，流动相A为20％的水溶液、流动相B为80％的乙腈溶液；45分钟时，流动相A为5％的水溶液、流动相B为95％的乙腈溶液；55分钟时，流动相A为5％的水溶液、流动相B为95％的乙腈溶液；流速为3ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段21.7～30.3min收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到丹参提取物0.0104g。
取丹皮药材250g，将其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液I。药渣加入70％乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液II，将提取液II浓缩成浸膏55g，用50％甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5％甲醇作为流动相，得洗脱液I，然后改换60％甲醇作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品26.48g。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件色谱柱为汉邦半制备柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，洗脱梯度见表2，流速为3ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段7.7-10.7min收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分1.83g。
实施例二 本发明中药组合物的制备按实施例一的方法提取得到丹参提取物和丹皮提取物，将5.2×10-6克丹参提取物与4.8×10-6克丹皮提取物混合得混合物A。
实施例三 本发明中药组合物的制备按实施例一的方法提取得到丹参提取物和丹皮提取物，将4.2×10-6克丹参提取物与5.8×10-6克丹皮提取物混合得混合物B。
实施例四 本发明中药组合物的制备按实施例一的方法提取得到丹参提取物和丹皮提取物，将5.9×10-6克丹参提取物与4.1×10-6克丹皮提取物混合得混合物C。
实施例五 本发明中药组合物的制备按实施例一的方法提取得到丹参提取物和丹皮提取物，将5.4×10-6克丹参提取物与4.6×10-6克丹皮提取物混合得混合物D。
实施例六 本发明中药组合物的制备按实施例一的方法提取得到丹参提取物和丹皮提取物，将5.6×10-6克丹参提取物与4.4×10-6克丹皮提取物混合得混合物E。
实施例七 本发明中药组合物的制备按实施例一的方法提取得到丹参提取物和丹皮提取物，将5.2×10-6～6×10-6克丹参提取物与4×10-6～4.8×10-6克丹皮提取物混合物F，使混合中丹参提取物占总重的52％～60％与丹皮提取物占总重的40％～4.8％。
实施例八 本发明中药组合物的制备按实施例一的方法提取得到丹参提取物和丹皮提取物，将5.3×10-6～5.9×10-6克丹参提取物与4.1×10-6～4.7×10-6克丹皮提取物混合物G，使混合中丹参提取物占总重的53％～59％与丹皮提取物占总重的41％～47％。
实施例九 本发明中药组合物的制备按实施例一的方法提取得到丹参提取物和丹皮提取物，将5.4×10-6～5.8×10-6克丹参提取物与4.2×10-6～4.6×10-6克丹皮提取物混合物H，使混合中丹参提取物占总重的54％～58％与丹皮提取物占总重的42％～46％。
实施例十 本发明中药组合物的制备按实施例一的方法提取得到丹参提取物和丹皮提取物，将5.3×10-6～5.7×10-6克丹参提取物与4.3×10-6～4.5×10-6克丹皮提取物混合物I，使混合中丹参提取物占总重的53％～57％与丹皮提取物占总重的43％～45％。
实施例十一 本发明的丹参提取物中有效成分含量测定(1)丹参提取物中的二氢丹参酮I的含量测定(高效液相色谱法)色谱条件色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；采用梯度洗脱，流动相A相为0.2％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为90％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为10％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；10分钟时，流动相A为30％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为70％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；30分钟时，流动相A为5％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为95％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.5mL·min-1；检测波长全波长；柱温30℃；供试品溶液的制备称取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。
测定方法精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。
(2)上述丹参提取物HPLC-ELSD指纹图谱测定方法参见(1)上述丹参提取物中二氢丹参酮I的含量测定(高效液相色谱法)。记录色谱时间为30分钟。
分析结果丹参有效组分的HPLC-ELSD分析谱图见图1。
本发明提供的丹参提取物中二氢丹参酮I的含量为85.52～97.33％。
实施例十二 本发明的丹皮提取物中有效成分含量测定(1)丹皮提取物中芍药酮甙(Paeonidanin)、牡丹皮苷b(Mudanpioside b)的含量测定(高效液相色谱法)色谱条件 色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；采用梯度洗脱，流动相A相为0.2％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为90％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为10％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；10分钟时，流动相A为70％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为30％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；30分钟时，流动相A为50％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为50％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.5mL·min-1；检测波长全波长；柱温30℃；ELSD条件漂移管温度105℃；氮气流速1.8L/min供试品溶液的制备 称取本品约1.83mg，用甲醇溶液溶解1ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。
测定方法 精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
(2)上述丹皮提取物HPLC-ELSD指纹图谱测定方法 参见(1)上述丹皮提取物中的芍药酮甙(Paeonidanin)、牡丹皮苷b(Mudanpioside b)含量测定(高效液相色谱法)。记录色谱时间为30分钟。
分析结果 丹皮有效组分的HPLC-ELSD分析谱图见图2，图2中的1、2号分别是芍药酮甙(Paeonidanin)、牡丹皮苷b(Mudanpioside b)。两个峰的相对保留时间依次为3.82(芍药酮甙(Paeonidanin))，4.78(牡丹皮苷b(Mudanpioside b))。
本发明提供丹皮有效组分中芍药酮甙(Paeonidanin)的含量为20～30％，牡丹皮苷b(Mudanpioside b)的含量为35～45％。
本发明中，二氢丹参酮I的结构式为
本发明的芍药酮甙(Paeonidanin，9-O-methyl-4-one-albiflorin)的结构特式为 本发明的牡丹皮苷b(Mudanpioside b)的结构特式为 实施例十三 药理实验原代心肌细胞培养出生1～3天SD乳鼠处死后，取心脏，经PBS液清洗后减成1mm3左右的碎块。用0.125％胰蛋白酶(Sigma，USA)+0.05％胶原酶II(Gibco，USA)于37度消化3～4次。差速贴壁法分离成纤维细胞1.5小时后，细胞悬液转移至48孔板中(每孔约4×105细胞)。经DMEM(Gibco，USA)加10％胎牛血清(Falcon，USA)培养3～6天的细胞供药效筛选。筛选前1天替换为无血清培养液。培养3～6天的心肌细胞，PBS洗涤后加入含药培养液。置于95％N2和5％CO2培养箱中缺氧6小时。然后在CO2培养箱中复氧3小时。取细胞上清液测定LDH含量。
乳酸脱氢酶含量测定细胞培养液中乳酸脱氢酶含量能够表示细胞损伤程度。漏入上清液中的乳酸脱氢酶含量越高，表明细胞损伤也显著。乳酸脱氢酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。测定方法为取30微升细胞上清液，加入50微升基质缓冲液及10微升乳酸脱氢酶辅酶，37度振荡15分钟，再加入50微升2，4-二硝基苯肼，37度振荡15分钟。平行空白。取反应液50微升加入200微升0.4mol/L氢氧化钠溶液，静置3～4分钟后，用酶标仪于450nm测定光度值。
给药方案实施例1中的丹参、丹皮提取物组合物A、B、C、D、E分别用无糖Hanks液配成10-4g/mL供试液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO终浓度控制在0.2％以下)。各组分在培养液中的终浓度控制在10-5g/mL。
结果所有数据用均值±方差表示，采用单边方差分析和T检验进行统计学分析。与模型组相比，P＜0.05认为显著有效。实验结果见表1。
表1. 丹参、丹皮提取物组合物对乳鼠心肌细胞乳酸脱氢酶的影响
本发明采用乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型，通过对乳酸脱氢酶的测定，检验本发明中药组合物的抗心肌细胞缺血作用。结果显示，丹参、丹皮提取物的组合物对降低乳酸脱氢酶释放有非常显著效果，说明本发明中药组合物具有明显的抗心肌细胞缺血作用。
实施例十四 滴丸的制备取实施例一的丹参有效组分1g，丹皮有效组分0.9g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸600粒。
实施例十五 冻干粉针剂的制备取实施例一的丹参有效组分1g，丹皮有效组分0.9g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装800支，即得。
实施例十六 冻干粉针剂的制备取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基β-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤液低温干燥得降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基β-环糊精的包合物粉末外，再取实施例一的丹参有效组分1g，丹皮提取物0.9g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。
权利要求
1.一种治疗心血管疾病的中药组合物，由丹参提取物和丹皮提取物组成，其特征是，各组分的重量百分比为丹参提取物52％～60％丹皮提取物40％～48％。
2.权利要求1所述的中药组合物，其特征是，各组分的重量百分比为丹参提取物53％～59％；丹皮提取物41％～47％。
3.权利要求1所述的中药组合物，其特征是，各组分的重量百分比为丹参提取物54％～58％；丹皮提取物43％～46％。
4.权利要求1所述的中药组合物，其特征是，各组分的重量百分比为丹参提取物55％～57％；丹皮提取物43％～45％。
5.权利要求1-4任一所述的中药组合物，其特征是，丹参提取物中二氢丹参酮I含量为85.52～97.33％；丹皮提取物中芍药酮甙(Paeonidanin)的含量为20～30％，牡丹皮苷b(Mudanpioside b)的含量为35～45％。
6.含有权利要求1-4任一权利要求所述的中药组合物的药用制剂，其特征是，按照药剂学允许的制备方法制成药剂学接受的任一药用制剂。
7.权利要求1-4任一权利要求所述的中药组合物在制备具有抗心肌细胞缺血作用药物中的应用。
全文摘要
本发明一种治疗心血管疾病的中药有效组分复方组合物，由丹参提取物、丹皮提取物组成的，其重量百分比为丹参提取物52％～60％，丹皮提取物40％～48％。本发明提供的组合物加入药用辅料，按照药剂学允许的制备方法可制成各种药用制剂。本发明的中药组合物所含化合物数目少，化合物结构明确，且含量高。药理实验表明，本发明的中药组合物能显著的抑制乳鼠心肌细胞中乳酸脱氢酶的释放，具有明显的抗心肌缺血作用。
文档编号A61P9/10GK1981818SQ20051012234
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月14日 优先权日2005年12月14日
发明者程翼宇, 贺庆, 王毅, 王学伟, 李云飞, 胡兴江, 葛志伟 申请人:天津天士力现代中药研究开发有限公司