改进的白介素-2突变蛋白的制作方法

专利名称：改进的白介素-2突变蛋白的制作方法
专利说明改进的白介素-2突变蛋白 发明领域 本发明涉及具有提高的治疗效果的人白介素-2(IL-2)突变蛋白。也提供制备这种新分子和药物制剂用于治疗癌症和刺激哺乳动物免疫系统的方法。

背景技术：
白介素-2(IL-2)是自然杀伤细胞(NK)和T-细胞增殖与功能的强效激活剂(Morgan等，Sience 1931007-11，1976)。已证明这种自然产生的细胞因子单独或与淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)或肿瘤渗出淋巴细胞(TIL)联合时具有抵抗各种恶性疾病的抗肿瘤活性(见例如，Rosenberg等，N.Engl.J.Med.316889-97，1987；Rosenberg，Ann.Surg.208121-35，1988；Topalian等，J.Clin.Oncol.6839-53，1988；Rosenberg等，N.Engl.J.Med.3191676-80，1988；Weber等，J.Clin.Oncol.1033-40，1992)。然而为了对肿瘤生长获得正面治疗结果而采用的高剂量IL-2常常引起严重的副作用，包括发热、寒战、低血压和毛细血管渗漏(血管渗漏综合征或VLS)及神经学变化(见例如，Duggan等，J.Immunotherapy 12115-22，1992；Gisselbrecht等，Blood 832081-85，1994；Sznol和Parkinson，Blood 832020-22，1994)。
虽然IL-2诱导的毒性和VSL的精确机理尚不清楚，但积累的资料提示IL-2诱导的杀伤(NK)细胞触发了剂量限制性毒性(DLT)，结果过度产生了促炎症细胞因子，包括IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-β和IL-6。这些细胞因子激活了单核细胞/巨噬细胞和诱导了一氧化氮的产生，导致随后的内皮细胞损伤(Dubinett等，CellImmunol 157170-80，1994；Samlowski等，J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.18166-78，1995)。这些发现导致其他人根据假说T细胞选择性表达了高亲和力的IL-2受体(IL-2R)而开发了对T细胞而非NK细胞有优先选择性的IL-2突变蛋白(见例如，BAY50-4798，成熟的人IL-2的N88R IL-2突变蛋白，公开于国际专利WO 99/60128和Shanafelt等，Nat.Biotechnol.181197-202，2000)。
多种NK功能，如自然杀伤(NK)、LAK、和依赖于抗体的细胞毒(ADCC)的溶细胞杀伤、及细胞因子的产生和增殖有赖于激活不同NK胞内信号传导通路中的特异性中间产物。重要的是，有证据表明对IL-2-IL-2R相互作用的选择性调节可影响下游NK-和T-细胞介导的效应器功能，如增殖、细胞因子产生和溶细胞杀伤(Sauve等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.884636-40，1991；Heaton等，Cancer Res.532597-2602，1993；Eckenberg等，J.Exp.Med.191529-40，2000)。
Proleukin

IL-2(含有重组的人IL-2突变蛋白阿地白介素；Chiron Corporation，Emeryville，California)已经FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤和肾癌。并正研究用于其它临床适应症，包括非何杰金淋巴瘤、HIV和乳腺癌。然而，由于IL-2的相关毒副作用，需要毒性减低的IL-2突变蛋白以使该白介素具有更好的治疗应用。具有低毒性和/或增强的IL-2介导的NK细胞或T细胞效应器功能的IL-2突变蛋白将会有更广泛的用途，特别适合于癌症治疗和调节免疫应答反应。
发明概述 本发明是关于预计毒性降低和功能提高的人白介素-2(IL-2)突变蛋白。与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2突变蛋白相比，这种突变蛋白诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子，同时保持或增强了NK细胞的增殖，保持了NK细胞介导的NK、LAK和ADCC溶细胞功能及保持了T细胞增殖功能。本发明提供编码人IL-2突变蛋白的分离的核酸分子和分离的含有这些突变的多肽。也阐述了这些改进的人IL-2突变蛋白治疗癌症和调节免疫应答反应的临床用途。
在一方面，本发明提供的分离的核酸分子含有编码人IL-2突变蛋白的核苷酸序列。在某些实施方式中，该核酸分子编码含有选自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344氨基酸序列的人IL-2突变蛋白。
在某些实施方式中，本发明包括编码的IL-2突变蛋白的分离的核酸分子含有选自SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341和343的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明包括的分离的核酸分子含有编码人IL-2突变蛋白的核苷酸序列，其中该突变蛋白的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344序列的残基2-133。
在某些实施方式中，本发明的分离的核酸分子包含含有选自SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341和343序列的核苷酸4-399的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本文所述的核酸分子还可包含取代，其中SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343的核苷酸373-375被编码丙氨酸的三联密码子取代。
在某些实施方式中，本文所述核酸分子还可包含取代，其中SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343的核苷酸373-375被编码半胱氨酸的三联子取代。
在某些实施方式中，本文所述的的核酸分子经修饰而优化了表达。这些核酸包含的核苷酸序列中，为了在感兴趣宿主细胞中表达编码该突变蛋白的一个或多个密码子已经过优化。含有优化密码子的示范性核酸包括但不限于含有选自以下核苷酸序列的核酸SEQ ID NO345、SEQ ID NO345的核苷酸4-399、SEQ ID NO346和SEQID NO346的核苷酸4-399。
本发明还包括用于在所选宿主细胞中表达的载体，所述表达载体含有本发明的一种或多种核酸。在这类表达载体中，所述核酸操作性连接有与在所选宿主细胞中表达相容的调控元件。许多表达调控元件是本领域技术人员已知的，包括但不限于以下转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸序列、优化起动翻译的序列、翻译终止序列。示范性的转录启动子包括但不限于衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40的启动子。
在另一方面，本发明提供的细胞含有本发明的表达载体，其中的核酸序列(如编码人IL-2突变蛋白)操作性连接于与在所选细胞中表达相容的调控元件。在一实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。示范性的哺乳动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞。可用于实施本发明的其它细胞、细胞类型、组织类型等包括但不限于获自以下的细胞昆虫(如粉蚊夜娥(Trichoplusia ni)(Tn5)和Sf9)、细菌、酵母菌、植物、抗原提呈细胞(如巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B-细胞、T-细胞、干细胞和它们的祖细胞)、原代细胞、永生细胞、肿瘤衍生细胞。
在另一方面，本发明供本发明的含有用于重组产生人IL-2突变蛋白的表达载体的组合物和宿主细胞。这种组合物可含有药学上可接受的运载体。
在还有一方面，本发明提供含人IL-2突变蛋白的分离的多肽。在某些实施方式中，本发明包括分离的含有选自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344氨基酸序列的多肽。
在某些实施方式中，本发明包括分离的含有选自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344氨基酸序列的氨基酸残基2-133的多肽。
在某些实施方式中，上述多肽还含有取代。其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在某些实施方式中，上述多肽还含有取代，其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在某些实施方式中，该分离的多肽含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列，在SEQ IDNO4的125位丝氨酸取代了半胱氨酸，SEQ ID NO4中至少有一处其它的氨基酸取代，与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，此突变蛋白1)保持了或增强了自然杀伤(NK)细胞的增殖，和2)诱导NK细胞产生的促炎症细胞因子水平降低。示范性的取代包括但不限于T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、I24L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V。在某些实施方式中，该多肽还包含SEQ ID NO4位置1的丙氨酸缺失。
可用NK-92生物试验检测自然杀伤(NK)细胞增殖的提高和NK细胞产生促炎症细胞因子水平的降低。可在相等试验条件下，将上述多肽对NK细胞增殖和NK细胞产生促炎症细胞因子的作用与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2的作用作比较。在某些实施方式中，可在相等的试验条件下，用NK-92生物试验来证明，与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的相比，上述多肽诱导的促炎症细胞因子TNF-α水平降低。
在某些实施方式中，在相等试验条件下，用NK3.3细胞毒生物试验来证明，与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的相比，上述多肽保持或增强了人NK细胞介导的自然杀伤细胞毒性、淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞毒性、或ADCC介导的细胞毒性。
在某些实施方式中，在相等试验条件下，与用类似量的脱丙氨酰1 C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的相比，上述多肽保持或增强了NK3.3细胞系中磷酸化AKT的诱导。
在某些实施方式中，在相等试验条件下，该突变蛋白诱导的NK细胞增殖比类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的高150％。
在某些实施方式中，该突变蛋白诱导的NK细胞增殖比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的高170％。
在某些实施方式中，该突变蛋白诱导的NK细胞增殖约为脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的200-210％ 在某些实施方式中，在相等试验条件下，该突变蛋白诱导的NK细胞增殖高于类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的至少10％。
在某些实施方式中，该突变蛋白诱导的NK细胞增殖高于脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的至少15％。
在某些实施方式中，在相等试验条件下，该突变蛋白诱导产生的促炎症细胞因子低于类似量脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的100％。
在某些实施方式中，该突变蛋白诱导产生的促炎症细胞因子低于脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的70％。
在某些实施方式中，本发明包括的分离的多肽含有人IL-2突变蛋白，其中该突变蛋白含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列，在SEQ ID NO4的125位半胱氨酸取代了丝氨酸，SEQ ID NO4中至少有一处其它的氨基酸取代，在相等试验条件下，该突变蛋白IL-2诱导的NK细胞与IL-2诱导产生的TNF-α之比率，比类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2突变蛋白观察到的至少高1.5倍。可用NK-92生物试验测定0.1nM突变蛋白的NK细胞增殖和1.0nM突变蛋白的TNF-α产量。在某些实施方式中，上述比率比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少高2.5倍。在某些实施方式中，此比率比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少高3.0倍。
在某些实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其中如用体内温度芯片测量体温、测量血管渗漏或测量患者的最大耐受剂量所确定，当给予患者时该突变蛋白显示了改进的耐受性。
在某些实施方式中，本发明提供了含有人IL-2突变蛋白的分离的多肽，其中与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的相比所述突变蛋白有较高的最大耐受剂量，所述最大耐受剂量可用B16F10黑色素瘤动物模型测定。
在某些实施方式中，本发明提供了含有人IL-2突变蛋白的分离的多肽，在相等治疗条件下，与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2治疗相比所述突变蛋白显示了相当或提高的抗肿瘤活性，所述抗肿瘤活性可用B16F10黑色素瘤动物模型评价。
在某些实施方式中，本发明提供了含有人IL-2突变蛋白的分离的多肽，在相等治疗条件下，与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2治疗相比所述突变蛋白显示了相当或提高的抗肿瘤活性和降低的副作用，所述抗肿瘤活性可用高等级非何杰金淋巴瘤Namalwa动物模型或低等级非何杰金淋巴瘤Daudi动物模型评价。
在某些实施方式中，本发明提供了含有人IL-2突变蛋白的分离的多肽，在相等试验条件下，其中所述突变蛋白当与利妥昔抗体同时给药时相比用脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2处理显示可比或提高的抗肿瘤活性和降低的副作用，其中所述抗肿瘤活性用高度非何杰金淋巴瘤Namalwa动物模型或低等级非何杰金淋巴瘤Daudi动物模型评价。
在某些实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其中与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比所述突变蛋白显示出提高的免疫效应细胞活化作用。活化的免疫细胞可包括，但不限于，T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和噬中性粒细胞。
在某些实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其中与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比所述突变蛋白显示出提高的抗体依赖的细胞毒(ADCC)介导的溶细胞杀伤活性。
在某些实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其中与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比所述突变蛋白在血管渗漏综合征动物模型中造成的血管渗漏减少。
在某些实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其中与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比所述突变蛋白在动物模型中造成较少的体温变化，所述动物体温可用温度芯片监测。
在某些实施方式中，本发明包括的分离的多肽含有人IL-2突变蛋白的氨基酸序列，其中该突变蛋白含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列，SEQ ID NO4的125位丝氨酸取代了半胱氨酸，和至少有一处其它的氨基酸取代，SEQ ID NO4中其它残基取代的位置选自16、36、40、42、61、65、67、72、91、94、95和107位。在某些实施方式中，该多肽在SEQ ID NO4中还含有1位丙氨酸缺失。
在另一方面，本发明提供产生人白介素-2(IL-2)突变蛋白的方法，该方法包括用含有上述核酸分子之一的表达载体转化宿主细胞；在能表达该核酸分子成为多肽的条件下在细胞培养基中培养所述宿主细胞；和分离该多肽。在某些实施方式中，在相似的试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2的参比IL-2突变蛋白相比，该人白介素-2(IL-2)突变蛋白能保持或增强NK细胞的增殖，还能诱导NK细胞产生较低水平的促进炎症细胞因子，其中用NK-92生物试验来测定NK细胞的增殖和产生的促炎症细胞因子。
在另一方面，本发明提供含有治疗有效量的一种或多种上述多肽的组合物，该组合物含有人IL-2突变蛋白。此组合物还可含有药学上可接受的运载体。
在另一方面，本发明提供刺激哺乳动物免疫系统的方法，该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的人IL-2突变蛋白，在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2的参比IL-2突变蛋白相比，所述突变蛋白诱导NK细胞产生低水平的促炎症细胞因子和保持或增强了NK细胞的增殖，其中采用NK-92生物试验测定NK细胞的增殖和产生的促炎症细胞因子。在某些实施方式中，所述哺乳动物是人。
在某些实施方式中，用于刺激免疫系统的人IL-2突变蛋白含有选自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344的氨基酸序列。
在某些实施方式中，用于剌激免疫系统的人IL-2突变蛋白含有的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344氨基酸序列的残基2-133。
在某些实施方式中，用于剌激免疫系统的人IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在某些实施方式中，用于剌激免疫系统的人IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在另一方面，本发明提供治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的人IL-2突变蛋白，在相似试验条件下，与类似浓度的选自脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2的参比IL-2突变蛋白相比，该突变蛋白诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子和保持或增强了NK细胞增殖，其中采用NK-92生物试验来测定所述NK细胞的增殖和所述促炎症细胞因子的产生。在某些实施方式中，所述哺乳动物是人。
在某些实施方式中，用于治疗癌症的人IL-2突变蛋白含有选自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344的氨基酸序列。
在某些实施方式中，用于治疗癌症的人IL-2突变蛋白含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的2-133残基的氨基酸序列。
在某些实施方式中，用于治疗癌症的人IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ IDNO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在某些实施方式中，用于治疗癌症的人IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ IDNO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在另一方面，本发明提供在给予IL-2作为治疗方案的病人中降低白介素-2(IL-2)诱导的毒性症状的方法。该治疗方法包括给予作为IL-2突变蛋白的IL-2。
在某些实施方式中，用于治疗的IL-2突变蛋白含有选自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344的氨基酸序列。
在某些实施方式中，用于治疗的IL-2突变蛋白含有选自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344氨基酸序列的2-133残基。
在某些实施方式中，用于治疗的IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。
在某些实施方式中，用于治疗的IL-2突变蛋白还含有取代，其中在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。
附图简述

图1概括说明了用IL-2突变蛋白刺激分离自正常供体的人PBMC的增殖/促炎症细胞因子产生联合试验方法。
图2显示了在人PBMC中F42E IL-2突变蛋白介导的增殖和TNF-α的产生。
图3显示了在人PBMC中L94Y IL-2突变蛋白介导的增殖和TNF-α的产生。
图4显示了在人PBMC中E95D IL-2突变蛋白介导的增殖和TNF-α的产生。
图5显示了在人PBMC中E95G IL-2突变蛋白介导的增殖和TNF-α的产生。
图6显示了在人PBMC中Y107R IL-2突变蛋白介导的增殖和TNF-α的产生。
图7显示IL-2激活的分离自正常供体的人PBMC保持了人NK-介导的LAK和ADCC活性。
图8显示的直方图比较了每周三次给予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型


RL-2以及IL-2突变蛋白E95D和Y107R后的效果，见实施例11所述。
图9比较了每周三次给予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型的


RL-2或者IL-2突变蛋白E95D和Y107R治疗的小鼠的平均体重，如实施例11所述。
图10显示的直方图比较了按照“Sleijfer”方案(给药5天/停药2天/给药5天)给予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型


RL-2以及IL-2突变蛋白E95D和Y107R后的效果，如实施例11所述。
图11比较了按照“Sleijfer”方案(给药5天/停药2天/给药5天)给予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型


RL-2或者IL-2突变蛋白E95D和Y107R治疗的小鼠的平均体重，如实施例11所述。
图12显示的直方图比较了按照“Sleijfer”方案(给药5天/停药2天/给药5天)给予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型


RL-2以及IL-2突变蛋白F42E和Y107R后的效果，按实施例11中所述进行的重复研究。
图13比较了按照“Sleijfer”方案(给药5天/停药2天/给药5天)给予C57BL/6小鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型


RL-2或者IL-2突变蛋白F42E和Y107R治疗的小鼠的平均体重，按实施例11所述进行的重复研究。
图14比较了每周三次给予经照射的Balb/c裸鼠侵入性人非何杰金淋巴瘤模型(Namalwa)

和

后的效果，如实施例12所述。图14显示了平均肿瘤体积(mm3)与时间(治疗后天数)作的图。
图15比较了每周三次给予经照射的Balb/c裸鼠侵入性人非何杰金淋巴瘤模型(Namalwa)


和Y107R IL-2突变蛋白后的效果，如实施例12所述。图15显示了平均肿瘤体积(mm3)与时间(治疗后天数)作的图。
图16比较了每周三次给予经照射的Balb/c裸鼠侵入性人非何杰金淋巴瘤模型(Namalwa)的


和E95D IL-2突变蛋白后的效果，如实施例12所述。图16显示了平均肿瘤体积(mm3)与时间(治疗后天数)的绘图。
图17比较了每周三次给予经照射的Balb/c裸鼠低等级Daudi人B细胞非何杰金淋巴瘤模型


和Y107R IL-2突变蛋白单一制剂治疗后的效果，如实施例12所述。图17显示了平均肿瘤体积(mm3)与时间(治疗后天数)作的图，并总结了统计结果％肿瘤生长抑制(TGI)，部分反应/完全反应(PR/CR)，P值，％体重(BW)变化，以及临床观察。
图18比较了每周三次与利妥昔单抗联合给予经照射的Balb/c裸鼠低等级Daudi人B细胞非何杰金淋巴瘤模型


和Y107R IL-2突变蛋白后的效果，如实施例12所述。图18显示了平均肿瘤体积(mm3)与时间(治疗后天数)作的图，并总结了统计结果％肿瘤生长抑制(TGI)，部分反应/完全反应(PR/CR)，P值，％体重(BW)变化，以及临床观察。
图19比较了每周三次与利妥昔单抗联合给予经照射的Balb/c裸鼠低等级Daudi人B细胞非何杰金淋巴瘤模型


或Y107R IL-2突变蛋白治疗的小鼠的条件性存活和抑制肿瘤生长的水平，如实施例12所述。图19显示了条件性存活(％)和肿瘤生长延迟时间(肿瘤发展到1000mm3的天数)作的图以及总结完全反应(CR)标准的表格。
图20比较了在存在或不存在利妥昔单抗时每周三次给予经照射的Balb/c裸鼠低等级Daudi人B细胞非何杰金淋巴瘤模型


或Y107RIL-2突变蛋白治疗的小鼠的平均体重，如实施例12所述。
图21的直方图比较了在示例性C57B1/6小鼠IL-2诱导的急性血管渗漏综合征模型中评价的


以及IL-2突变蛋白E95D和Y107R的药物耐受性。由于按实施例13中所述测定IL-2治疗所造成的血管渗漏增加导致小鼠肺中125I-白蛋白的保留。
图22显示的图说明了小鼠中心体温对IL-2治疗的反应。按照“Sleijfer”方案(给药5天/停药2天/给药5天)给予皮下植入温度芯片以监测给予IL-2后温度变化的C57BL/6小鼠

和

监测给药后9个小时的温度，给予10种剂量，为期2周。最一致的是，温度显著变化发生在治疗第5天给药后4小时。
图23显示的图比较了用


或者IL-2突变蛋白L94Y、F42E或E95G治疗的C57BL/6小鼠的中心体温。如实施例14所述，用皮下植入的温度芯片监测给药后9个小时的温度，给予10种剂量，为期2周，见实施例14中所述。图24显示直方图比较了第5天给予


或者IL-2突变蛋白E95D、L94Y、Y107R或F42E后4小时C57BL/6小鼠的中心体温。按照“Sleijfer”方案(给药5天/停药2天/给药5天)给予皮下植入温度芯片的C57BL/6小鼠IL-2，如实施例14所述。
图25显示了用


或者IL-2突变蛋白E95D、L94Y、Y107R或F42E治疗的C57BL/6小鼠体温降低和TNF-α血浆水平间的相关性。直方图显示比较了第5天按照“Sleijfer”方案给予IL-2后4小时的体温变化和血浆TNF-α水平，如实施例14所述。温度变化与TNF-α浓度作的图表面温度降低与TNF-α血浆水平升高呈线性相关。
发明详述 本发明涉及人白介素-2(IL-2)突变蛋白，由于其毒性降低和/或NK或T细胞效应器功能提高而具有改进的治疗效果。上述人IL-2突变蛋白及其生物活性变体与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2的参比IL-2突变蛋白相比，诱导产生的促炎症细胞因子降低同时保持或增强了自然杀伤(NK)细胞的增殖。“促炎症细胞因子”指能刺激免疫系统的细胞因子。这种细胞因子包括但不限于IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-β和IL-6。
术语“突变蛋白”指由于氨基酸缺失、取代或二者而含有与天然产生的蛋白质氨基酸序列不同的突变氨基酸序列的蛋白质。本发明的人IL-2突变蛋白与成熟的人IL-2序列不同处在于，在成熟的人IL-2序列125位丝氨酸残基取代了半胱氨酸残基(即C125S)，和还含有至少一处其它的氨基酸取代，并且相对于成熟的人IL-2序列还含有一处或多处氨基酸缺失，如在成熟的人IL-2蛋白1位N-末端丙氨酸(Ala)的缺失。在另一实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白保留了成熟的人IL-2序列125位的半胱氨酸残基，但至少有一处其它的氨基酸取代，并且相对于成熟的人IL-2序列还含有一处或多处氨基酸缺失，如在成熟的人IL-2蛋白1位N-末端丙氨酸(Ala)的缺失。这些人IL-2突变蛋白可以是糖基化的或非糖基化的，取决于产生它们的宿主表达系统。上述具体的取代所产生的人IL-2突变体保留所需活性，即用上述NK-92细胞试验，与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，其诱导产生的促炎症细胞因子降低同时保持或增强了NK细胞的增殖。鉴定人IL-2序列中导致产生毒性降低和/或NK细胞增殖增强的IL-2变体的位置和这些位置的相关取代，在本领域的技术之内，通过改变人IL-2序列内的其它残基可获得本文所述的也保留了这些所需活性的人IL-2突变蛋白变体。本文所述的这些人IL-2突变蛋白变体也属于本发明，还包括以下定义的。
人IL-2先翻译成SEQ ID NO2所示的前体多肽，其由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列编码。该前体多肽包含SEQ ID NO2的残基1-20为信号序列。术语“成熟的人IL-2”指SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO3所示核苷酸序列编码。术语“C125S人IL-2突变蛋白”或“C125S人IL-2”指成熟的人IL-2突变蛋白，其保留了成熟的人IL-2的1位N-末端丙氨酸残基和成熟的人IL-2序列125位为丝氨酸取代了半胱氨酸。C125S人IL-2突变蛋白具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列，其由SEQ ID NO5所示核苷酸序列编码。术语“脱丙氨酰-1C125S人IL-2”和“脱丙氨酰-1丝氨酸-125人IL-2”指成熟的人IL-2突变蛋白，其在成熟的人IL-2序列125位为丝氨酸取代了半胱氨酸和缺失成熟的人IL-2序列1位(即SEQ ID NO4的1位)的N-末端丝氨酸。脱丙氨酰-1C125S人IL-2具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO7所示核苷酸序列编码。大肠杆菌重组产生的的脱丙氨酰-1C125S人IL-2突变蛋白称为“阿地白介素”，可从市场上购买到的制剂商品名为Proleukin

IL-2(Chiron Coporation，Emeryville，California)。对于本发明的目的，脱丙氨酰-1C125S人IL-2和C125S人IL-2突变蛋白，是作为人IL-2突变蛋白参比来测定本发明的人IL-2突变蛋白显示的理想活性。因此在类似的试验条件下，测定相对于同等量脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突蛋白或C125S人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生的促炎症细胞因子量，本发明合适的人IL-2突变蛋白的所需活性降低了IL-2诱导NK细胞产生的促炎症细胞因子，特别是产生的TNF-α。与此相似，在类似的试验条件下，测定相对于同等量脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2突变蛋白诱导NK细胞增殖的量，本发明合适的人IL-2突变蛋白的所需活性保持或提高了IL-2诱导的NK细胞增殖。
提供的所述分离核酸所编码的人IL-2突变蛋白的及其生物活性变体含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和至少一处其它的氨基酸取代，当与二种参比IL-2突变蛋白相比时，它能诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子同时保持或增强NK细胞增殖。也提供分离的本发明核酸分子编码的多肽。
本发明的人IL-2突变蛋白包含SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344所示的突变蛋白，也称为“双数SEQ ID NO10-344序列”。本发明也提供编码这些突变蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341和343分别所示的编码序列。这些编码序列本文也称为“单数SEQ ID NO9-343序列”。这些上述氨基酸序列的突变蛋白包含C125S人IL-2氨基酸序列和一处下表1所示的其它取代。
在其它实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白缺失了这些氨基酸序列1位的原始丙氨酸残基，而包含脱丙氨酰-1，C125S人IL-2氨基酸序列和至少一处下表1所示的其它取代。这些突变蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示序列的残基2-133。本发明也提供编码这些突变蛋白的核苷酸序列，例如所述编码序列为SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343所示序列的核苷酸4-399。
也提供本文所述本发明的人IL-2突变蛋白的生物学活性变体，包括其具有所需人IL-2突变蛋白功能的片段和截短形式。例如，可用本领域熟知的和本文上述的重组DNA技术，通过去除全长人IL-2突变蛋白氨基酸序列中的氨基酸残基而产生上述人IL-2突变蛋白的片段或截短形式。本发明的人IL-2突变蛋白的合适变体具有类似于该新型人IL-2突变蛋白本身所显示的生物学活性，即用本文所述的生物试验与参比的IL-2分子，即脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比时，它们具有该新型人IL-2突变蛋白的低毒性(即低的或降低的促炎症细胞因子产生)以及能保持或增强NK细胞增殖。认为本文鉴定的某给定的新型人IL-2突变蛋白的变体与本发明新型人IL-2突变蛋白观察到的相比，可具有水平绝对不同的特定生物学活性，只要当与参比的人IL-2突变蛋白相比时，它保留了所需的毒性减低等生物学活性，即诱导NK细胞产生低水平的促炎症细胞因子，和/或能增强NK细胞增殖。
表1本发明的人IL-2突变蛋白例子，其含有C125S人IL-2(SEQ ID NO6)或脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)的氨基酸序列，和至少一处选自下表的其它取代。
本发明的组合物还包含用于重组产生本发明人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的载体和宿主细胞。此外，也提供含有治疗有效量的本文所述人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体及药学上可接受运载体的药物组合物。
本发明包括与参比IL-2突变蛋白相比，能诱导NK细胞产生较低水平促炎症产物和保持或增强NK细胞增殖的人IL-2突变蛋白的生产方法。这些方法包括用含有编码本发明新型人IL-2突变蛋白或编码其生物学活性变体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞，在允许所编码多肽表达的条件下在细胞培养基中培养该宿主细胞，和分离多肽产物。
也提供刺激动物免疫系统或治疗哺乳动物癌症的方法，该方法包括给予动物治疗有效量的本发明人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体，其中用本文以下所述的生物试验测定，与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，该IL-2突变蛋白或其变体诱导的NK细胞产生较低水平促炎症细胞因子和能保持或增强NK细胞增殖。
对给予IL-2作为治疗方案的病人，本发明也提供降低白介素2(IL-2)所导诱导的毒性症状的方法。该方法包括给予本发明的IL-2突变蛋白，即用本文以下所述的生物试验测定，与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，该IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生较低水平促炎症细胞因子和能保持或增强NK细胞增殖。术语“核酸分子”本文包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)，和用核苷酸同类物产生的DNA或RNA同类物。核酸分子可以是单链或双链，但优选双链DNA。本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质或其生物学活性部分应基本上没有该核酸分子或蛋白质天然存在的环境中通常与其相伴或相互作用的组分。因此当用重组方法产生时，分离的或纯化的核酸分子或蛋白质基本上没有其它细胞物质或培养基成分，或当用化学合成法产生时基本上没有化学前体物或其它化学物质。“分离的”核酸宜不含产生该核酸生物体基因组DNA中天然侧接该核酸的序列(即位于该核酸5’和3’末端的序列)(优选蛋白质编码序列)。例如，在各种实施方式中，分离的核酸分子所含有的产生此核酸的细胞基因组DNA中天然侧接此核酸的少于约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。基本上无细胞物质的蛋白质包含的污染蛋白应不到蛋白制品干重的大约30％、20％、10％、5％或1％。当本发明的蛋白质或其生物学活性变体通过重组产生时，其中培养基的化学前体成分或非蛋白质感兴趣化学成分宜低于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)。
新型人IL-2突变蛋白的生物学活性 与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白相比，或与C125S人IL-2突变蛋白相比，本发明的新型人IL-2突变蛋白具有提高的治疗指数。前两种突变蛋白在本文中称为“参比IL-2突变蛋白”，因为在用类似的蛋白浓度和相等试验条件分类本发明的突变蛋白进行给定的比较中，本发明的新型突变蛋白在生物学性能上比得上这两种先前已特征鉴定过的突变蛋白。本发明突变蛋白治疗指数的提高反映在与这两种参比IL-2突变蛋白之一的毒性及NK和/或T细胞效应器功能相比时，其毒性改善(即该突变蛋白诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子)及NK和/或T细胞效应器功能提高而毒性不提高，或这些突变蛋白的毒性改善及NK和/或T细胞效应器功能均提高。
利用以下三种功能终点来选择治疗指数提高的突变蛋白(1)与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125人IL-2相比，能诱导NK细胞产生降低促炎症细胞因子的水平；(2)与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，能保持或增强IL-2诱导的NK和T细胞增殖但不提高NK细胞产生的促炎症细胞因子；和(3)与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，能保持或改善(即增强)NK-介导的溶细胞杀伤。NK-介导的溶细胞杀伤包括NK介导的、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK)-介导的、和抗体依赖的细胞毒(ADCC)-介导的溶细胞杀伤。
上述新型人IL-2突变蛋白显示的最大治疗指数改进属于预计临床疗效改善的三种功能类型。应注意所有这些突变蛋白都显示能保持或增强T细胞的增殖和NK介导的溶细胞活性。该突变蛋白的第一类功能特征在于，与参比IL-2突变蛋白，即脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，优选的突变蛋白能使IL-2诱导的NK细胞降低促炎症细胞因子的产生，同时保持IL-2诱导的NK细胞增殖。该突变蛋白的第二类功能是增强IL-2诱导的NK细胞增殖比二参比IL-2突变蛋白诱导的更强，但没有二参比IL-2突变蛋白所诱导促炎症细胞因子产生所致的不良作用。该突变蛋白的第三类功能包括该突变蛋白具有“双功能”，即与这两种参比IL-2突变蛋白诱导的活性水平相比，能使IL-2诱导的NK细胞促炎症细胞因子产生降低，同时增强IL-2诱导的NK细胞增殖。
测定新鲜分离NK细胞的IL-2诱导的NK细胞增殖和促炎症细胞因子产生的试验是本领域熟知的。见例如，Perussia，Methods 9370，1996和Baume等，Eur.J.Immunol.221-6，1992。据先前报导NK-92细胞系具有NK细胞的表型和功能特性，包括存在IL-2时的增殖(Gong等，Leukemia平共处8652，1994)，然而在存在IL-2时极少或不产生TNF-α(Nagashima等，Blood 913850，1998)。已开发的筛选人NK和T细胞功能活性的IL-2生物试验在本文以下实施例章节中描述。虽然可采用其它试验来检测NK细胞增殖和促炎症细胞因子产生、及T细胞效应功能，但优选用本文所述的IL-2生物试验来筛选感兴趣的IL-2突变蛋白以确定它们是否保留了本文所述突变蛋白的所需特征。特别感兴趣的是它们能否降低NK细胞诱导TNF-α的产生。因此，在一实施方式中，IL-2诱导的NK细胞增殖和TNF-α因子产生可用本文以下描述的人NK-92细胞系(ATCC CRL-2407，CMCC ID#11925)的IL-2生物试验来测定。对于NK-92细胞系的描述见Gong等，Leukemia 8(4)652-658，1994。为了本发明的目的，此试验称为“NK-92生物试验”。
“降低”或“减少”促炎症细胞因子产生指与参比的IL-2突变蛋白，即脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2突变蛋白相比，本发明的人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生炎症细胞因子的水平降低，特别是NK细胞产生的TNF-α降低。虽然在可比试验条件下，本发明的人IL-2突变蛋白可使NK细胞产生最低水平的TNF-α比类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的至少低20％，但本发明突变蛋白诱导NK细胞产生TNF-α的最高水平取决于该突变蛋白所属的功能类型。
因此，例如在某些实施方式中，通常应选择能最大增强NK细胞增殖的诱导而对IL-2诱导NK细胞产生TNF-α无不良作用(即突变蛋白的第二类功能)的突变蛋白。在这些实施方式中，当测定用人NK-92细胞系(ATCC CRL-2407，CMCC ID#11925)(即用上述NK-92生物试验)和0.1nM或100pM(即0.1nM)浓度的各种人IL-2突变蛋白产生的TNF-α时，本发明的人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生TNF-α的水平与参比IL-2突变蛋白诱导的相类似(即±10％)，或优选低于参比IL-2突变蛋白诱导的90％。在本发明其它实施方式中，在可比的试验条件下，当测定用人NK-92细胞系(即用上述NK-92生物试验)和0.1nM浓度的各种人IL-2突变蛋白所产生的TNF-α时，本发明的人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生的TNF-α水平低于类似量脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的90％、优选低于85％，甚至更优选低于80％。在某些实施方式中，当测定用人NK-92细胞系(即用上述NK-92生物试验)和0.1nM浓度的各种人IL-2突变蛋白所产生的TNF-α时，本发明的人IL-2突变蛋白诱导产生的TNF-α比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的至少低20％至60％。与参比IL-2突变蛋白相比，能保持或增强IL-2诱导的NK细胞增殖的这种突变蛋白属于第一类功能的IL-2突变蛋白。
“保持”指在可比试验条件下，本发明的人IL-2突变蛋白诱导的所需生物学活性水平为类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所观察到活性水平的至少70％、优选至少75％、更优选至少80％，最优选至少85％和高至100％(等价)。因此，当所需活性是诱导NK细胞增殖时，当在可比试验条件下用同样的生物试验(即上述NK-92生物试验和类似量的这些IL-2突变蛋白)测定NK细胞增殖时，本发明的IL-2突变蛋白诱导的NK细胞增殖水平为类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的增殖活性的至少70％、优选至少75％、更优选至少80％，最优选至少85％、90％、95％更高包括100％(±5％)。
“增强”或“提高”或“改进”指在可比试验条件下，人IL-2突变蛋白诱导的所需生物学活性水平比类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所观察到的更高。因此，当所需的生物学活性是诱导NK细胞增殖时采用同样的NK细胞增殖试验(如上述NK-92生物试验)，本发明合适的IL-2突变蛋白诱导的NK细胞增殖水平，为类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的NK细胞增殖活性的至少105％、110％、115％，更优选至少120％，甚至更优选至少125％，最优选至少130％、140％或150％。
测定NK细胞增殖的试验是本领域熟知的(见例如，Baume等，Eur.J.Immuno.221-6，1992；Gong等，Leukemia 8(4)652-658，1994和上述NK-92生物试验)。优选采用NK-92细胞来检测IL-2诱导产生的促炎症细胞因子，特别是TNF-α的产生和NK细胞的增殖(即上述NK-92生物试验)。NK细胞增殖试验所用人IL-2突变蛋白的合适浓度包括约0.005nM(5pM)-1.0nM(1000pM)，包括0.005nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM和0.005nM-1.0nM之间的其它数值。在本文下述的优选实施方式中，采用NK-92细胞和约0.1nM-1.0nM浓度的人IL-2突变蛋白进行NK细胞增殖试验。
由于本发明的人IL-2突变蛋白能降低对促炎症细胞因子产生的诱导，和保持或增强IL-2诱导的NK细胞增殖，它们的IL-2诱导的NK细胞增殖，与IL-2诱导NK细胞促炎症细胞因子产生的比率，优于脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的，每种突变蛋白的这些活性测定采用同等的蛋白浓度和生物试验条件。当所测定的促炎症细胞因子是TNF-α时，在类似的生物试验条件和蛋白浓度下，合适的本发明人IL-2突变蛋白在0.1nM突变蛋白时IL-2诱导的NK细胞增殖，与在1.0nM突变蛋白时IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的比率，至少是用脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所获得的1.5倍，更优选是用参比IL-2突变蛋白获得的至少1.75倍、2.0倍、2.25倍、甚至更优选至少2.75倍、3.0倍、3.25倍。在某些实施方式中，在类似的生物试验条件和蛋白浓度下，本发明的人IL-2突变蛋白在0.1nM突变蛋白时IL-2诱导的NK细胞增殖，与在1.0nM突变蛋白时IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的比率，至少是用脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所获得的3.5倍，3.75倍、4.0倍、4.5倍、或甚至5.0倍。
在类似的生物试验条件和蛋白浓度下，相对于用脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所观察到，发明的突变蛋白也能提高(即增加)NK细胞的存活。NK细胞的存活可用本领域已知的试验，包括本文所述试验来测定。例如，在存在感兴趣IL-2突变蛋白时NK细胞的存活可通过检测IL-2突变蛋白能否阻断糖皮质类固醇的程序性细胞死亡和诱导NK细胞表达BCL-2来测定(见例如Armant等，Immunology85331，1995)。
本发明提供监测IL-2对NK细胞存活影响的试验。在一实施方式中，用pAKTELISA检测突变蛋白在NK3.3细胞(CMCC ID#12022，见Kornbluth，J.Immunol.129(6)2831-37，1982)中能否诱导细胞存活信号传导级联反应，来测定感兴趣的人IL-2突变蛋白存在时NK细胞的存活。以此方式，利用感兴趣的IL-2突变蛋白上调NK细胞中的AKT磷酸化作为NK细胞存活的指标。
本发明方法中采用的IL-2突变蛋白将激活和/或扩增自然杀伤(NK)细胞而介导淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)活性和抗体依赖的细胞毒(ADCC)。静止(未活化的)NK细胞可介导对某些称为“NK-细胞敏感性靶标”的靶细胞(如人红白血病K562细胞系)的自发性或天然细胞毒。被IL-2激活后NK细胞获得了LAK活性。例如，可检测IL-2激活的NK细胞能否杀伤各种肿瘤细胞和其它“NK-不敏感”靶细胞，如Daudi B-细胞淋巴瘤系(其通常能抵抗静止(即未激活的)NK细胞的溶解作用)，来测定这种LAK活性。类似地，在存在最适浓度的有关肿瘤细胞特异性抗体时，可通过检测IL-2活化细胞能否溶解“LAK敏感/NK-不敏感的”靶细胞，如Daudi B-细胞淋巴瘤系，或静止(即未活化的)NK细胞不易溶解的其它靶细胞来测定ADCC活性。产生和测定NK/LAK细胞和ADCC细胞毒活性的方法是本领域已知的。见例如《新编免疫学实验方法人类免疫研究》(Current Protocols in ImmunologyImmunologic Studies in Humans)，增刊17，第7.7，7.18和7.27单元(John Wiley & Son，Inc.1996)。在一实施方式中，采用具有外周血NK细胞表型和功能特征的NK3.3的细胞系来检测本发明IL-2突变蛋白的ADCC活性。对于本发明的目的，此试验称为“NK3.3细胞毒生物试验”。
在类似的生物试验条件和蛋白浓度下，与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所观察到的相比，本发明的人IL-2突变蛋白也能保持或增强IL-2诱导的T细胞增殖。细胞增殖试验是本领域熟知的。在一实施方式中，利用人T细胞系Kit225(CMCC ID#11234；Hori等，Blood 70(4)1069-72，1987)与本文下述试验来检测T细胞增殖。
如上所述，本文鉴定的候选先导人IL-2突变蛋白(即具有最佳改进的治疗指数的那些新型突变蛋白)属于三种功能类型。第一种功能类型包括在类似的生物试验条件和蛋白浓度1.0nM测定所有突变蛋白时，诱导NK细胞产生的TNF-α水平较低、约为脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的60％或更低，并且与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比保持或增强了NK细胞增殖的那些突变蛋白。这些突变蛋白可进一步分成二亚类(1)当在类似的生物试验条件和约1.0nM蛋白浓度检测这些突变蛋白时，与参比的人IL-2突变蛋白相比，能增强(即大于100％)IL-2诱导的NK细胞增殖，但在约0.1nM或更低浓度时与参比的人IL-2突变蛋白观察到的相比，NK细胞增殖活性降低(即低于100％)的那些人IL-2突变蛋白；和(2)在类似的条件和蛋白浓度约1.0-0.05(即约50pM)下检测这些突变蛋白时，与参比的人IL-2突变蛋白观察到的相比，能提高(即大于100％)或保持(即至少约70-100％)IL-2诱导NK细胞增殖的那些人IL-2突变蛋白。在一实施方式中，IL-2诱导的NK细胞增殖和TNF-α产生用NK-92细胞(即用NK-92细胞生物试验)检测，其中NK细胞增殖用商品化购得的MTT染料还原试剂盒(CellTiter 96

非放射性细胞增殖试验试剂盒，购自Promega Corp Madison，Wisconsin)检测，根据比色读数计算出刺激指数；用商品化购得的TNF-αELISA试剂盒(BioSource CytoscreenTM人TNF-αELISA试剂盒；Camarillo，California)定量TNF-α。属于第一种功能类型的人IL-2突变蛋白，包括含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自F42E、V91D和L72N的至少一种其它取代的那些突变蛋白，其中的残基位置(即42、91或72)对应于成熟的人IL-2序列(即相对于SEQ ID NO4)。除C125S取代外，人IL-2突变蛋白包含F42E或V91D取代，可包含或不包含人IL-2的1位N-末端丙氨酸，属于突变蛋白第一种功能类型的亚类(1)。见下面的实施例8和表13。除C125S取代外，人IL-2突变蛋白包含L72N取代，可包含或不包含人IL-2的1位N-末端丙氨酸，属于突变蛋白第一种功能类型的亚类(2)。见下面的实施例8和表14。
第二种功能类型的人IL-2突变蛋白包括能强烈增强NK细胞增殖但对IL-2诱导NK细胞产生TNF-α无不良作用的那些突变蛋白。属于此功能类型的突变蛋白要符合三个选择标准(1)在选自0.005nM(即5pM)、0.02nM(即20pM)、0.05nM(即50pM)、0.1nM(即或100pM)或1.0nM(即1000pM)的一种或多种浓度时人IL-2突变蛋白诱导NK细胞增殖的水平大于脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的约200％；(2)当在选自0.005nM(即5pM)、0.02nM(即20pM)、0.05nM(即50pM)、0.1nM(即或100pM)或1.0nM(即1000pM)的至少二种浓度检测时人IL-2突变蛋白诱导NK细胞增殖的水平大于脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2所诱导的约150％；(3)当在1.0nM(即1000pM)或0.1nM(即100pM)浓度突变蛋白检测产生的TNF-α时，IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的水平与参比IL-2突变蛋白诱导的相似(即±10％)，优选低于90％。在一实施方式中，IL-2诱导NK细胞产生TNF-α和IL-2诱导NK细胞增殖采用NK-92细胞(即用上述NK-92细胞生物试验)检测，其中IL-2诱导产生的TNF-α用ELISA检测，IL-2诱导的NK细胞增殖用上述MTT试验检测。属于该第二种功能类型的人IL-2突变蛋白包括含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自L36D和L40D的至少一种其它取代的那些突变蛋白，其中的残基位置(即36或40)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQ ID NO4)。见以下实施例8和表15。
第三种功能类型的人IL-2突变蛋白包括具有“双功能”的那些突变蛋白，与参比的IL-2突变蛋白相比，它们能诱导NK细胞增殖增强和降低NK细胞产生TNF-α。属于该第三种功能类型的突变蛋制品应符合以下标准(1)当用选自0.005nM(即5pM)、0.02nM(即20pM)、0.05nM(即50pM)、0.1nM(即或00pM)或1.0nM(即1000pM)的任何一种浓度突变蛋白检测时，诱导的NK细胞增殖水平是脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少约150％；(2)当用约1.0nM浓度突变蛋白检测时，诱导NK细胞产生TNF-α的水平低于脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的约75％。在一实施方式中，IL-2诱导NK细胞产生TNF-α和IL-2诱导NK细胞增殖采用NK-92细胞(即用上述NK-92细胞生物试验)检测，其中IL-2诱导产生的TNF-α用ELISA检测，IL-2诱导的NK细胞增殖用上述MTT试验检测。属于该第三种功能类型的人IL-2突变蛋白包括含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自L19D、F42R和E61R的至少一种其它取代的那些突变蛋白，其中的残基位置(即19、42或61)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQ ID NO4)。见以下实施例8和表16。
本发明还提供符合其它选择标准，与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比具有改进的治疗指数的人IL-2突变蛋白。因此，例如，在另一实施方式中，当突变蛋白浓度为1.0nM测定时，本发明的人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生TNF-α的水平比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的水平低约100％，优选低约95％或90％，更优选低约85％，并且，当突变蛋白浓度为1.0nM测定时，IL-2诱导的NK细胞增殖比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的NK细胞增殖高约130％。一实施方式中，IL-2诱导的TNF-α产生和IL-2诱导的NK细胞增殖用NK-92细胞(即采用这里所述的NK-92生物试验)测定，其中，IL-2诱导的TNF-α产生采用ELISA测定，IL-2诱导的NK细胞增殖通过上文所述的MTT试验测定。具有这些功能标准的人IL-2突变蛋白含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自H16D、L19D、L36D、L36P、L40D、L40G、P65L、P65Y、E67A、L72N、L80K、L94Y、E95D、E95G、Y107H和Y107R的至少一个其它取代，其中的残基位置(即16、19、36、40、65、67、72、80、94、95和107)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQID NO4)。符合这些功能标准的突变蛋白在0.1nM突变蛋白时IL-2诱导的NK细胞增殖与1.0nM突变蛋白IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的比率，比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少高1.25倍，优选高至少1.5倍、1.75倍或2.0倍，至多高约2.5-2.75倍。也见下面的实施例2和表3，其中列出了脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2突变蛋白中其它合适的取代。
在另一实施方式中，当突变蛋白浓度为1.0nM测定时，本发明的人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生TNF-α的水平比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的水平低约100％，并且，当突变蛋白浓度为0.1nM测定时，IL-2诱导的NK细胞增殖比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的NK细胞增殖高约150％。一实施方式中，IL-2诱导的TNF-α产生和IL-2诱导的NK细胞增殖用NK-92细胞(即采用这里所述的NK-92生物试验)测定，其中，IL-2诱导的TNF-α产生采用ELISA测定，IL-2诱导的NK细胞增殖通过上文所述的MTT试验测定。具有这些功能标准的人IL-2突变蛋白含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自L36G、L36H、L40G和P65F的至少一个其它取代，其中的残基位置(即36、40和65)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQ ID NO4)。符合这些功能标准的突变蛋白在0.1nM突变蛋白时IL-2诱导的NK细胞增殖与在1.0nM突变蛋白时IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的比率，比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的高至少1.5倍，优选至少高2.0倍，和高达2.5倍。见下面的实施例2和表4。
当以1.0nM的浓度测定时，本发明的其它人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生TNF-α的水平比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的水平高，高约100％，并且，当以1.0nM的浓度测定时，IL-2诱导的NK细胞增殖比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的NK细胞增殖高约150％。一实施方式中，IL-2诱导的TNF-α产生和IL-2诱导的NK细胞增殖用NK-92细胞(即采用这里所述的NK-92生物试验)测定，其中，IL-2诱导的TNF-α产生采用ELISA测定，IL-2诱导的NK细胞增殖通过上文所述的MTT试验测定。具有这些功能标准的人IL-2突变蛋白含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自L36R、K64G、K64L、P65E、P65G、P65T和P65V的至少一个其它取代，其中的残基位置(即36、64和65)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQ ID NO4)。符合这些功能标准的突变蛋白在0.1nM突变蛋白时IL-2诱导的NK细胞增殖与1.0nM突变蛋白时IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的比率，比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少高1.5倍，优选至少高1.75倍，和高达2.0-2.5倍。见下面的实施例2和表4。
在其它实施方式中，当以1.0nM的浓度测定时，本发明的人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生TNF-α的水平比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的水平低约90％，优选低约80％，并且，当以0.1nM和1.0nM的浓度测定时，诱导NK细胞增殖是脱丙氨酰-1，C125S人IL-2诱导的NK细胞增殖的至少95％，优选至少105％，更优选至少120％到约200％，或者，在0.1nM时，与C125S人IL-2突变蛋白诱导的NK细胞增殖相比，可保持(即至少70％，优选至少75％、80％或85％，更优选至少90％，至多约100％)IL-2诱导的NK细胞增殖。一实施方式中，IL-2诱导的TNF-α产生和IL-2诱导的NK细胞增殖用NK-92细胞(即采用这里所述的NK-92生物试验)测定，其中，IL-2诱导的TNF-α产生采用ELISA测定，IL-2诱导的NK细胞增殖通过上文所述的MTT试验测定。具有这些功能标准的人IL-2突变蛋白含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自H16D、L19D、L36D、L36P、F42E、F42R、E61R、P65L、P65Y、E67A、L72N、L80V、R81K、N88D、V91D、L94Y、E95D、E95G、Y107H和Y107R的至少一个其它取代，其中的残基位置(即16、19、36、42、61、65、67、72、80、81、88、91、94、95或107)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQ ID NO4)。属于此类的其它合适的突变蛋白示于下面的表5。符合这些功能标准的突变蛋白在0.1nM突变蛋白时IL-2诱导的NK细胞增殖与1.0nM突变蛋白时IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的比率，比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少高1.25倍，优选至少高1.5倍、1.75倍、2.0倍，和高达2.5-2.75倍。见下面的实施例3和表5。
在另一实施方式中，当以1.0nM的浓度测定时，本发明的人IL-2突变蛋白诱导NK细胞产生TNF-α的水平比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的水平低约80％，优选低约70％，并且，当以1.0nM的浓度测定时，诱导NK细胞增殖是脱丙氨酰-1，C125S人IL-2诱导的NK细胞增殖的至少80％，优选至少90％、95％、100％或105％，更优选至少110％到约150％。一实施方式中，IL-2诱导的TNF-α产生和IL-2诱导的NK细胞增殖用NK-92细胞(即采用这里所述的NK-92生物试验)测定，其中，IL-2诱导的TNF-α产生采用ELISA测定，IL-2诱导的NK细胞增殖通过上文所述的MTT试验测定。具有这些功能标准的人IL-2突变蛋白含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80Y、R81E、R81L、R81N、R81P、R81T、N88H和Q126I的至少一个其它取代或者选自E61M、E62T、E62Y、L80G、L80N、L80R、L80W、D84R、N88T、E95M、Y107L、Y107Q和Y107T的至少一个其它取代，其中的残基位置(即61、62、78、79、80、81、84、88、95或107)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQ ID NO4)。见下面的实施例3和表6和7。
再在另一个实施方式中，本发明的IL-2突变蛋白符合以下功能标准(1)当以1.0nM的浓度测定时，诱导NK细胞产生TNF-α的水平比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导NK细胞产生TNF-α的水平低约100％，优选低约95％、90％或85％，更优选低约80％或低约75％；(2)当以0.1nM和1.0nM的浓度测定时，与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比保持(约100％)或提高了(约105％，至约120％)IL-2诱导的NK细胞增殖；和(3)NK-介导的细胞毒活性比C125S人IL-2突变蛋白观察到的高约140％，至约160％，比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2观察到的高约115％，至约130％。一实施方式中，IL-2诱导的TNF-α产生和IL-2诱导的NK细胞增殖用NK-92细胞(即采用这里所述的NK-92生物试验)测定，其中，IL-2诱导的TNF-α产生采用ELISA测定，IL-2诱导的NK细胞增殖通过上文所述的MTT试验测定；而NK-介导的对K562细胞的细胞毒活性例如在这里所述的NK3.3细胞毒生物试验中用NK3.3细胞系测定。具有这些功能标准的人IL-2突变蛋白含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自P34R、P34T、L36A、L36D、L36P、R38P、F42A和L80R的至少一个其它取代，其中的残基位置(即34、36、38、42或80)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQ IDNO4)。见下面的实施例4和表8。
在另一实施方式中，选择能够诱导较低水平促炎症细胞因子的预计其毒性有所改进以及增强的NK细胞增殖活性和增强的LAK介导的细胞毒活性本发明的IL-2突变蛋白。这些突变蛋白符合以下功能标准(1)当以1.0nM的浓度测定时，诱导产生TNF-α的水平比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导产生TNF-α的水平低约100％，优选低约95％、90％、85％或80％；(2)当以0.1nM和1.0nM的浓度测定时，与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比保持(约100％)或提高(约105％，至约140％)IL-2诱导的NK细胞增殖；和(3)LAK-介导的细胞毒活性比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的细胞毒活性高约105％，优选高约110％、115％或120％，至约140％。一实施方式中，IL-2诱导的TNF-α产生和IL-2诱导的NK细胞增殖用NK-92细胞(即采用这里所述的NK-92生物试验)确定，其中，IL-2诱导的TNF-α产生采用ELISA测定，IL-2诱导的NK细胞增殖通过上文所述的MTT试验测定；而LAK-介导的对Daudi细胞的细胞毒活性用NK3.3细胞系和这里所述的NK3.3细胞毒生物试验测定。具有这些功能标准的人IL-2突变蛋白含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自L36P、L36R、F42A、L80R和V91Q的至少一个其它取代，其中的残基位置(即36、42、80或91)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQ ID NO4)。见下面的实施例5和表9。
在其它实施方式中，选择具有改进的毒性、增强的NK细胞增殖活性和增强的ADCC介导的细胞毒活性的本发明的IL-2突变蛋白。这些突变蛋白符合以下功能标准(1)当以1.0nM的浓度测定时，诱导产生TNF-α的水平比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导产生TNF-α的水平低约100％，优选低约95％、90％、85％或80％；(2)当以0.1nM和1.0nM的浓度测定时，与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比维持(至少90％)或提高(约105％，至多约115％)IL-2诱导的NK细胞增殖；和(3)ADCC-介导的细胞毒活性比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的细胞毒活性高约105％，优选约110％或115％，至约120％。一实施方式中，IL-2诱导的TNF-α产生和IL-2诱导的NK细胞增殖用NK-92细胞(即采用这里所述的NK-92生物试验)确定，其中，IL-2诱导的TNF-α产生采用ELISA测定，IL-2诱导的NK细胞增殖通过上文所述的MTT试验测定；而ADCC介导的对Daudi细胞的细胞毒活性在抗体如

(利妥昔单抗；IDEC-C2B8；IDEC PhannaceuticalsCorp.，San Diego，California)存在时用NK3.3细胞系和这里所述的NK3.3细胞毒生物试验测定。具有这些功能标准的人IL-2突变蛋白含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自D20E或E67A的至少一个其它取代，其中的残基位置(即20或67)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQ ID NO4)。见下面的实施例6和表10。
在另一实施方式中，如通过采用NK3.3细胞的pAKT ELISA试验所测定的，相对参比IL-2突变蛋白观察到的，IL-2突变蛋白能维持或增强NK细胞存活。具有这些功能标准的人IL-2突变蛋白含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和选自L40D、L40G、L80K、R81K、L94Y和E95D的至少一个其它取代，其中的残基位置(即40、80、81、94或95)对应于成熟的人IL-2序列(即对应于SEQ ID NO4)。见下面的实施例7和表11，其中显示了符合这些功能标准的其它合适的突变蛋白。
新型人IL-2突变蛋白的生物学活性变体 本发明也提供上述新型人IL-2突变蛋白的生物学性能比参比IL-2分子性能提高的变体，即用本文所述生物试验，当与参比的IL-2分子，即脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，能诱导NK细胞降低或减少促炎症细胞因子的产生，和能保持可或增强NK细胞增殖的生物学活性变体。如前所述，认为与本发明的新型人IL-2突变蛋白观察到的相比，本文鉴定的给定的新型人IL-2突变蛋白可具有绝对不同的特定生物活性，只要与参比人IL-2突变蛋白相比具有所需特性，即诱导促炎症细胞因子产生的毒性降低，和/或能增强NK细胞的增殖。
“变体”指基本上相似的序列。上述新型人IL-2突变蛋白可以是天然产生的(如IL-2基因座的等位基因变体)或重组产生的(如突变蛋白)核酸或氨基酸序列。多肽变体可以是上述新型人IL-2突变蛋白的片段，或它们与该新型人IL-2突变蛋白不同之处在于具有一处或多处其它的氨基酸取代或缺失或氨基酸插入，只要变体多肽保留了上述新型人IL-2突变蛋白中存在的感兴趣特定氨基酸取代。因此，合适的多肽变体包括对应于成熟的人IL-2序列(即SEQ ID NO4)125位含有C125S取代的那些多肽，本文鉴定了可使本发明的新型人IL-2突变蛋白治疗指数改进的第二处氨基酸取代(即上表1所示的取代，优选下表12所示的取代)，和一处或多处其它的氨基酸取代或缺失或氨基酸插入。因此例如，如表1所示，当新型人IL-2突变蛋白含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)或C125S人IL-2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列和至少一处选自表1所示基团的其它取代，这些新型人IL-2突变蛋白的合适生物学活性变体也含有C125S取代以及表1所示那些突变代表的其它取代，但与各种新型人IL-2突变蛋白不同之处在于有一处或多处其它的取代、插入或缺失，只要当与参比的IL-2分子相比，该变体多肽具有比参比IL-2分子(即参比的IL-2突变蛋白C125S人IL-2或脱丙氨酰-1，C125S人IL-2)毒性低、促炎症细胞因子产生减少、和/或NK细胞增殖增强的所需特性。
当如下文所述测定序列相同性百分比时，这种变体的氨基酸序列与各新型人IL-2突变蛋白，例如SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的人IL-2突变蛋白的氨基酸序列至少有70％相同，通常至少75％、80％、85％、90％相同，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。在其它实施方式中，当如下文所述测定序列相同性百分比时，该生物学活性变体的氨基酸序列与SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的残基2-133所示氨基酸序列至少有70％相同，通常至少75％、80％、85％、90％相同，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
在本发明的某些实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白生物学活性变体含有其它天然氨基酸如丙氨酸的C125S取代，这不影响所需的人IL-2突变蛋白的功能特性。因此例如，这种变体在SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。在另一实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白生物学活性变体含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的残基2-133，和在这些序列的125位丙氨酸残基取代了丝氨酸残基。
发明的其它实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白生物学活性变体含有SEQ IDNO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的氨基酸序列，和这些序列的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。在其它实施方式中，本发明的人IL-2突变蛋白生物学活性变体含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的残基2-133，和这些序列的125位半胱氨酸残基取代了丝氨酸残基。
核酸“变体”指编码本发明的新型人IL-2突变蛋白的多聚核苷酸，但由于基因密码子的简并性其核苷酸序列不同于上述新型突变蛋白的序列。天然氨基酸的密码子是本领域熟知的，包括特定宿主生物用于表达重组蛋白最常用的那些密码子。编码上述IL-2突变蛋白的核苷酸序列包括本文附属序列表中所示的那些序列，及由于基因密码子简并性而不同于上述序列的核苷酸序列。
因此例如，当本发明的IL-2突变蛋白含有丙氨酸残基(即A)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有T7A、K9A、Q11A、E15A、K32A、L36A、F42A、L66A、E67A、V91A或L94A取代时，编码取代的丙氨酸残基的核苷酸序列可选自丙氨酸的四种通用三联密码子，即GCA、GCC、GCG和GCT。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有天冬氨酸(即D)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有T7D、K9D、H16D、L19D、K35D、L36D、R38D、L40D、K64D、P65D、N88D、V91D或E95D取代时，编码取代的天冬氨酸残基的核苷酸序列可选自天冬氨酸的两种通用三联密码子，即GAC和GAT。当本发明的IL-2突变蛋白含有精氨酸(即R)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有T7R、K9R、Q11R、P34R、L36R、F42R、E61R、K64R、P65R、L80R、D84R或Y107R取代时，编码取代的精氨酸残基的核苷酸序列可选自精氨酸的四种通用三联密码子，即CGT、CGC、CGA和CGG。当本发明的IL-2突变蛋白含有亮氨酸(即L)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有K8L、I24L、K35L、K64L、P65L、R81L或Y107L取代时，编码取代的亮氨酸残基的核苷酸序列可选自亮氨酸的六种通用三联密码子，即TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG。
当本发明的IL-2突变蛋白含有丝氨酸(即S)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有K9S、P34S、L36S、R38S、L40S、P65S、F78S、H79S、T102S或T123S取代时，编码取代的丝氨酸残基的核苷酸序列可选自丝氨酸的两种通用三联密码子，即AGT和AGC。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有缬氨酸(即V)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有K9V、P34V、F42V、P65V、H79V、L80V、L94V、T102V或Q126V取代时，编码取代的缬氨酸残基的核苷酸序列可选自缬氨酸的四种通用三联密码子，即GTT、GTC、GTA和GTG。当本发明的IL-2突变蛋白含有赖氨酸(即K)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有T10K、L36K、F44K、E61K、P65K、L80K、R81K、E106K或Y107K取代时，编码取代的赖氨酸残基的核苷酸序列可选自赖氨酸的两种通用三联密码子，即AAA和AAG。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有天冬酰胺(即N)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有T10N、K35N、L36N、L38N、L40N、P65N、L72N、H79N、L80N、R81N或V91N取代时，编码取代的天冬酰胺残基的核苷酸序列可选自天冬酰胺的两种通用三联密码子，即GAT和GAC。
当本发明的IL-2突变蛋白含有苏氨酸(即T)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有Q11T、P34T、K35T、F42T、E62T、P65T、L72T、L80T、R81T、S87T、N88T、L94T或Y107T取代时，编码取代的苏氨酸残基的核苷酸序列可选自苏氨酸的四种通用三联密码子，即ACT、ACC和ACA、ACG。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有谷氨酸(即E)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有H16E、L19E、D20E、N33E、P34E、L36E、T41E、F42E、K64E、P65E、L80E、R81E或V91E取代时，编码取代的谷氨酸残基的核苷酸序列可选自谷氨酸的两种通用三联密码子，即GAA和GAG。当本发明的IL-2突变蛋白含有异亮氨酸(即I)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有K35I、L36I、M46I、P65I、L94I或Q126I取代时，编码取代的异亮氨酸残基的核苷酸序列可选自异亮氨酸的三种通用三联密码子，即ATT、ATC和ATA。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有脯氨酸(即P)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有K35P、L36P、R38P、H79P或R81P取代时，编码取代的脯氨酸残基的核苷酸序列可选自脯氨酸的四种通用三联密码子，即CCT、CCC、CCA和CCG。
当本发明的IL-2突变蛋白含有谷氨酰胺(即Q)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有K35Q、K64Q、P65Q、H79Q、V91Q、Y107Q或N119Q取代时，编码取代的谷氨酰胺残基的核苷酸序列可选自谷氨酰胺的两种通用三联密码子，即CAA和CAG。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有苯丙氨酸(即F)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有L36F、P65F、L66F、H79F、L80F或V91F取代时，编码取代的苯丙氨酸残基的核苷酸序列可选自苯丙氨酸的两种通用三联密码子，即TTT和TTC。当本发明的IL-2突变蛋白含有甘氨酸(即G)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有L36G、R38G、L40G、T41G、K64G、P65G、L72G、L80G、V91G、E95G、M104G或E116G取代，编码取代的甘氨酸残基的核苷酸序列可选自甘氨酸的四种通用三联密码子，即GGT、GGC、GGA和GGG。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有组氨酸(即H)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有L36H、K43H、P65H、N88H或Y107H取代时，编码取代的组氨酸残基的核苷酸序列可选自组氨酸的两种通用是四联密码子，即CAT和CAC。
当本发明的IL-2突变蛋白含有酪氨酸(即Y)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有L36Y、E62Y、P65Y、L80Y或L94Y取代时，编码取代的酪氨酸残基的核苷酸序列可选自酪氨酸的两种通用三联密码子，即TAT和TAC。类似地，当本发明的IL-2突变蛋白含有半胱氨酸(即C)取代时，例如在C125S或脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白中含有T123C取代时，编码取代的半胱氨酸残基的核苷酸序列可选自半胱氨酸的两种通用三联密码子，即TGT和TGC。
虽然上述核酸变体名单已描述了可用来编码本文所鉴定的特定残基取代的通用密码子，但应认为本发明包括编码本文所述人IL-2突变蛋白的由于基因密码子简并性而致的所有核酸变体。
天然的人IL-2的自然产生的等位基因变体可用熟知的分子生物学技术鉴定，如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术，加入突变时可用作指南将其加入到本文所人IL-2突变蛋白中而不影响这些新型人IL-2突变蛋白所需的治疗指数。变体核苷酸序列也包括衍生自合成的核苷酸的突变蛋白，例如，如下所述，通过定点诱变产生的编码上述新型人IL-2的突变蛋白。
通常，当如下文所述测定序列相同性百分比时，本发明的核苷酸序列变体与它们各自的新型人IL-2突变蛋白的核苷酸序列，例如SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343所示的新型人IL-2突变蛋白编码序列至少有70％相同，通常至少75％、80％、85％、90％相同，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。在其它实施方式中，当如下文所述测定序列相同性百分比时，本发明的核苷酸序列变体与SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343所示的编码序列的核苷酸4-399有至少70％，通常有至少75％、80％、85％、90％序列相同，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同。
术语“基因”和“重组基因”本文用于指含有编码本发明IL-2突变蛋白开放读框的核酸分子。短语“等位基因变体”指位于IL-2基因座的核苷酸序列或指该核苷酸序列编码的多肽。这种天然等位基因变体通常可导致IL-2基因的核苷酸序列发生1-5％变异。任何和所有的核苷酸变体和所产生的IL-2序列的氨基酸多态性或变体是天然等位基因变异所至，不会改变本发明新型人IL-2突变蛋白的功能活性，包括按本发明突变产生的序列，所有这些产生的序列均属于本发明的范围。
例如，可在编码新型IL-2突变蛋白的克隆DNA序列中制造突变来制备上述新型人IL-2突变蛋白的氨基酸序列变体，只要这些突变不改变表1鉴定的其它取代。诱变和改变核苷酸序列的方法是本领域熟知的，见例如，Walker和Gaasta编，(1983)《分子生物学技术》Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，NewYork)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-92；Kunkel等，(1987)MethodsEnzymol.154267-82；Sambrook等(1989)《分子克隆实验手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork)、美国专利4,873,192和本文引用的参考文献。关于不影响IL-2突变蛋白的所需生物学活性(即降低NK细胞产生促炎症细胞因子、预计会减少毒性和保持或增强NK细胞增殖)的适当氨基酸取代指南可在Dayhoff等，《多肽序列和结构图集》Atlas ofPolypeptide Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D C)的模型中找到。
当设计上述人IL-2突变蛋白的生物学活性变体时，优选保守性取代，如一个氨基酸用另一个具有相似性能的氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基取代。该领域已确定了具有相似侧链的氨基酸家族。这些家族包括含碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。见例如，Bowie等，Science 2471306，1990。保守性取代的例子包括但不限于





和

对保守的半胱氨酸残基，如氨基末端毗连的半胱氨酸残基不宜进行这种取代。
关于人IL-2蛋白中可通过取代、缺失或插入本文鉴定的所需取代而改变的区域是本领域知道的。见例如，Bazan，Science 257410-12，1992；McKay，Science 257412；Theze等，Immunol.Today 17481-86，1996；Buchli和Ciardelli，Biochem.Biophys307411-15，1993；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.857709-13，1988；Kunkel等，J.Immunol.1505731，1993；Eckenberg等，Cytokine 9488-98，1997。
在构建本发明新型人IL-2突变蛋白变体时，将对编码该变体的核苷酸序列进行修饰，使变体多肽可继续拥有所需活性。显然，在编码变体多肽的DNA中进行的任何突变必须不将该序列置于读框外、优选不会产生可能导致二级mRNA结构的互补区。多肽变体可有少至1-15个氨基酸的不同，如6-10个、少至5个，少至4、3、2个，甚至1个氨基酸残基不同。核苷酸序列变体可有少至1-30个核苷酸不同，如6-25个，少至5个，少至4、3、2个，甚至1个核苷酸不同。
本发明人IL-2突变蛋白的生物学活性变体包括这些突变蛋白的片段。“片段”指编码核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分。就编码序列而言，人IL-2突变蛋白核苷酸序列的片段可编码保留了新型人IL-2突变蛋白所需生物学活性的突变蛋白片段。上述新型人IL-2突变蛋白的片段可以长15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130个氨基酸或长达该新型人IL-2多肽的全长。编码核苷酸序列的片段可以至少是45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、195、210、225、240、255、270、285、300、315、330、345、360、375、390个核苷酸，和长达编码该新型人IL-2突变蛋白的整个核苷酸序列。
可进一步修饰上述人IL-2突变蛋白及其生物学活性变体，只要它们与C125S人IL-2突变蛋白或脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白相比具有所需特性，即毒性降低和/或增强NK细胞增殖。其它修饰包括但不限于磷酸化、非天然氨基酸同类物的取代等。可导致其体内表达延长，因此提高了IL-2突变蛋白药物制剂效力的IL-2突变蛋白的修饰包括蛋白分子的糖基化或PEG化。天然是非糖基化的蛋白质的糖基化常通过在分子中插入N-连接的糖基位点来进行。可用这种方法来延长蛋白质如IL-2突变蛋白的半寿期。此外，可用此方法掩盖免疫原性表位，提高蛋白质的稳定性、减少凝聚和提高表达和纯度产量。
一旦获得上述人IL-2突变蛋白的变体，预计该人IL-2突变蛋白序列中的缺失、插入和取代不会使具体的人IL-2突变蛋白的特性产生根本改变。然而当预先这样做难以预计这种取代、缺失或插入的确切影响时，本领域技术人员知道可用常规筛选试验来评价这种作用。即用本领域技术人员已知的标准细胞增殖试验，包括上述试验来评价IL-2诱导的NK细胞或T细胞增殖活性。可用细胞因子特异性ELISA，例如上述TNF-α特异性ELISA，来检测IL-2诱导产生的促炎症细胞因子。NK细胞存活信号可用pAKT ELISA检测(见例如，以下描述的试验)。NK细胞介导的溶细胞活性(即细胞毒)可用本领域已知的试验检测(例如，本文所述的NK-介导的、LAK介导的、或ADCC介导的溶细胞活性)。
可将上述人IL-2突变蛋白及其生物学活性变体构建成含有IL-2突变蛋白(或上述生物学活性变体)的融合或偶联蛋白，其含IL-2突变蛋白融合于第二蛋白或共价偶联于聚脯氨酸或水溶性聚合物以减少给药次数或进一步提高IL-2的耐受性能。例如，可用本领域已知方法将人IL-2突变蛋白(或其上述生物学活性变体)融合于人白蛋白或白蛋白片段(见例如WO 01/79258)。或者，可采用本领域已知方法，将人IL-2突变蛋白(或其上述生物学活性变体)共价偶联于聚脯氨酸或聚乙二醇均聚物和聚氧乙烯化的多元醇，其中所述均聚物一端可用烷基和多元醇不取代或取代。(见例如美国专利4,766,106；5,206,344和4,894,226)。
“序列相同性”指当排列对比变体的核苷酸序列或氨基酸序列的特定连续区段，与参比序列的核苷酸序列或氨基酸序列时，变体序列和参比序列中所找到的相同核苷酸或氨基酸残基。序列排列对比和测定序列之间相同性的方法是本本领域熟知的。见例如，Ausubel等编著，(1995)《新编分子生物学实验指南》(Current Protocol inMolecular Biology)，第9章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff，1978，见《多肽序列和结构图集5》增刊3(National BiomedicalResearch Foundation，Washington，D.C)。对于二条核苷酸序列的最佳排列对比，该变体核苷酸序列的连续区段与参比核苷酸序列相比时，可以加入一些核苷酸或缺失一些核苷酸。同样，为了最佳排列对比二条氨基酸序列，将该变体氨基酸序列的毗连区段与参比氨基酸序列相比，可以加入一些氨基酸残基或缺失一些氨基酸残基。用于与参比核苷酸序列或参比氨基酸序列作比较的毗连区段应含至少20个毗连核苷酸或氨基酸残基，可以是30、40、50、100个或更多的核苷酸或氨基酸残基。为提高序列相同性可在该变体核苷酸序列或氨基酸序列中加入空格，这可通过设置空格罚分来纠正。序列排列对比的方法是本领域熟知的。
可用数学算法来进行二序列之间相同性百分比的测定。对于本发明的目的，采用Smith-Waterman的同源检索算法测定氨基酸序列的序列相同性百分比，采用仿射6空格检索，空格罚分12，空格延伸罚分2，BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman的同源检索算法在Smith-Waterman(1981)Adv.Appl.Math 2482-89中讲解。或者，用Smith-Waterman的同源检索算法，采用空格罚分25，空格延伸罚分5，测定核苷酸序列的同源性百分比。因此，可用例如Time Logic的DeCyoher Hardware Accelerator进行序列相同性的测定。
进一步认识到当考虑氨基酸相同性百分比时，某些氨基酸可能因保守性氨基酸取代(不会影响多核苷酸功能特性)而不同。此时，可考虑保守性取代的氨基酸类似性来校正序列相同性百分比。这种校正方法是本领域熟知的。见例如，Meyers等，ComputerApplic.Biol.Sci.411-17，1988。
重组表达载体和宿主细胞 通常，本发明的人IL-2突变蛋白用载体，优选表达载体表达。可将用于在宿主细胞中自身复制的载体导入宿主细胞而整合入宿主细胞基因组中(如非游离体哺乳动物载体)。表达载体能指导与其操作性相连的编码序列表达。通常重组DNA技术中用的表达载体为质粒(载体)形式。然而，本发明包括其它类型的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本发明的表达构建物或载体含编码本发明人IL-2突变蛋白的核酸分子，其形式适合于在宿主细胞中表达该核酸分子。感兴趣的编码序列可通过下述重组DNA技术，如Taniguchi等，Nature 302305-310，1983和Devos，Nucleic Acids Research 114307-4323或采用Wang等，Science 2241431-1433，1984所述的突变改变的IL-2来制备。认识到单数SEQ ID NOS9-343所示编码序列开始于成熟的人IL-2序列SEQID NO4第一个残基的密码子(即1位丙氨酸密码子)，而不是甲硫氨酸密码子，其通常是信使RNA中的翻译起始密码子ATG。这些公开的核苷酸序列也缺乏单数SEQ IDNOS9-343的399位核苷酸之后的翻译终止密码子。当采用这些序列或含单数SEQID NOS9-343的4-399位核苷酸序列来表达本发明人IL-2突变蛋白时，应知道含这些人IL-2突变蛋白编码序列的表达构建物还应在上游和含人IL-2突变蛋白编码序列的正确读框内包含一个翻译起始密码子，如ATG密码子。翻译起始密码子可在人IL-2突变蛋白编码序列起始密码子的上游位置提供，所用的翻译起始密码子如ATG可能已存在于包含人IL-2突变蛋白编码序列的序列中，或可由外源，如用于表达的质粒提供，只要翻译起始密码子在含人IL-2突变蛋白编码序列起始密码子的正确读框中位于人IL-2突变蛋白编码序列的起始密码子之前。类似地，上述人IL-2突变蛋白编码序列之后为一个或多个翻译终止密码子，如TGA，使人IL-2突变蛋白产物末端为双数SEQ ID NOS10-344所示序列的最后一个氨基酸。
该重组表达载体可含有根据用于表达的宿主细胞所选择的一个或多个调节序列操作性连接于被表达的核酸序列。“操作性相连”指感兴趣的核苷酸序列(即编码本发明人IL-2突变蛋白的序列)连接于所述调节序列，其方式能使该核苷酸序列(如在体外转录/翻译系统中或当该载体被导入宿主细胞中时在宿主细胞中)表达。“调控序列”包括启动子、增强子和其它表达控制元件(如聚腺苷酸信号)。见例如，Goeddel(1990)，《基因表达技术酶学方法》(Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology)185(Academic Press，San Diego，California)。调控序列包括能在许多类型宿主细胞中指导核苷酸序列组成性表达和只在某种宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些序列(如组织特异性调控序列)。本领域技术人员知道表达载体的设计取决于许多因素，如所选择的待转化宿主细胞的选择、蛋白质表达的所需水平等。可将本发明的表达构建物导入宿主细胞中来产生上述人IL-2突变蛋白，或产生其生物学活性变体。
可将本发明的表达构建物或载体设计成用于在原核或真核宿主细胞中表达人IL-2突变蛋白或其变体。最常用含组成型或可诱导性启动子的载体在原核大肠杆菌细胞中表达蛋白质。在大肠杆菌中最大程度表达重组蛋白质的方法可参见例如，Gottesman(1990)，《基因表达技术酶学方法》185(Academic Press，San Diego，CA)119-128页和Wada等，Nucleic Acid Res 202111-18，1992。培养、收集、破裂或从细胞提取人IL-2突变蛋白或其变体的方法基本描述可见，例如美国专利4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,798；4,748,234和4,931,543。
重组人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体也可在真核细胞，如酵母菌或人细胞中制备。合适的真核宿主细胞包括昆虫细胞(例子为可利用杆状病毒载体在培养的昆虫细胞，如sf9细胞，包括pAc系列(Smith等，Mol.Cell.Biol.32156-65，1983)和pVL系列(Lucklow和Summers，Virology 17031-39，1989)中表达蛋白质)；酵母细胞(酿酒酵母菌中表达载体的例子包括pYepSec1(Baldari等，EMBO J.6229-234，1987)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，Cell 30933-43，1982)，pJRY88(Schultz，Gene 54113-123，1987)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)，和pPicZ(Invitrogen Corporation，San Diego，CA))；或哺乳动物细胞(哺乳动物表达载体包括pCDM8(Seed，Nature 329840，1987)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J.6187-195，1987))。合适的哺乳动物细胞包括中国仑鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞。哺乳动物细胞中，常通过病毒调控元件提供表达载体的控制功能。例如，常用的启动子得自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和仙台病毒40。真核和原核细胞的其它合适表达系统可参见Sambrook等(1989)，《分子克隆实验手册》(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)的16和17章，见Goeddel(1990)，《基因表达技术酶学方法》185(AcademicPress，San Diego，California)。
可优化在感兴趣宿主细胞中表达本发明的人IL-2突变蛋白的编码序列。对某给定细胞宿主，可参考在该宿主细胞中表达的已知基因经计算将该序列中的G-C含量调节至平均水平。密码子优化方法是本领域熟知的。可优化个别密码子，例如已进行的密码子残基取代，如C125S取代、C125A取代、和/或表1所示的其它取代的密码子。或者，可优化人IL-2突变蛋白编码序列中的其它密码子以提高宿主细胞表达，如已为在特定宿主细胞中表达优化了该序列中的1％、5％、10％、25％、50％、75％或高达100％密码子。见例如，SEQ ID NO345和346公开的人IL-2突变蛋白序列。其中为在大肠杆菌中表达，已分别优化了E61R和Y107R取代的密码子。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解此术语不仅指具体的对象细胞而且指这些细胞的子代或可能的子代细胞。因为突变或环境影响其后代可能发生某些变化。这些子代实际上与亲代细胞不相同，但这仍属于此术语的范畴。
可用常规转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞中。术语“转化”和“转染”本文用于指各种将外源核酸(如DNA)导入宿主细胞中的本领域已知技术，包括磷酸钙-氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染、颗粒枪或电穿孔。转化或转染细胞的合适方法可见Sambrook等(1989)，《分子克隆实验手册》(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)和其它标准的分子生物学实验手册。
在合适的培养基中培养用于产生本发明IL-2突变蛋白和其生物学活性变体的原核和真核细胞一般可见Sambrook等(l989)，《分子克隆实验手册》(第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中的描述。
药物组合物 产生和纯化人IL-2突变蛋白或其变体后，可将它们掺入到用于人和兽医治疗，如癌症治疗或预防、免疫治疗和传染病治疗或预防的药物组合物中。因此，可将人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体配制成药物组合物用于各种治疗。作为组合物，人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体用该领域已知方法经胃肠道外给予对象。所述对象包括哺乳动物如；灵长动物、人、狗、牛、马等。这些药物组合物可含有能提高本发明人IL-2突变蛋白药效或提高所需质量的其它化合物。该药物组合物通过所选途径给药时必须安全，它们必须灭菌、保留生物活性、它们必须能稳定地溶解人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体。取决于制备工艺，本发明的IL-2突变蛋白药物组合物可以液体形式，在大气环境、冷藏、或冷冻、或干燥制剂形式，如冻干粉末保存，给药前可重建为液体溶液、悬浮液或乳液，再以各种方法之一，包括口服或胃肠道外给药途径给予。
这种药物组合物通常含有至少一种人IL-2突变蛋白、其生物学活性变体、或其组合，和药学上可接受的运载体。配制用于给药的本发明人IL-2突变蛋白的方法是该领域技术人员知道的。见例如，Gennaro(编)(1995)《雷明顿药物科学与实践》(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)(第19版，Mack PublishingCompany，Easton，PA)。
语句“药学上可接受的运载体”本文用于指包括与给药相容的任何和所有的溶剂、分散剂、包衣剂、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。可用于药学活性物质的这种媒介和制剂是该领域熟知的。除了迄今已知与该活性化合物不相容的任何常规媒介和制剂外，这类介质均可用于本发明的人IL-2突变蛋白药物制剂中。也可在该组合物中加入添加的活性化合物。
可将含有本发明人IL-2突变蛋白的IL-2突变蛋白药物组合物配制成与其给药途径相容。根据所需结果给药途径可以不同。可用药团剂型、连续输注或恒量输注(短时，如1-6小时输注)给予人IL-2突变蛋白药物组合物。可经口服、鼻内、胃肠道外包括静脉内、皮下、腹腔内、肌肉内等，皮内、透皮(局部)、透粘膜和直肠给药，或肺吸入给予人IL-2突变蛋白药物组合物。
胃肠道外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包含以下成分灭菌稀释液如注射用水、盐水、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苄醇或甲基对羟基苯甲酸酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸钠；螯合剂如EDTA；表面活性剂如聚山梨酯80；SDS；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和调节张力的制剂如氯化钠或葡聚糖。可用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。胃肠道外制品可封装在玻璃或塑料制的安瓿、一次性针筒或多剂小瓶中。
适合注射用的药物组合物包括灭菌水溶液(水溶性)或分散液，和可即刻制备成灭菌可注射溶液或悬浮液的灭菌粉末。制备过程中应尽量减少蛋白质凝聚物的形成，静脉内给药的合适运载体包括生理盐水、抑菌水、Cemophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须灭菌，应是易装在注射器中的液体。应在操作和贮存条件下稳定，必须防腐以防止微生物，如细菌和霉菌的污染作用。运载体可以是溶剂或分散剂，包括例如，水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可采用包衣剂如卵磷酯，通过维持所需的颗粒大小(分散液时采用表面活性剂)来维持适当的流动性。可用各种抗菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。许多情况下此组合物中宜包含等渗剂，如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可在此组合物中包含能延迟吸收的制剂，如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
如需要，可在合适的溶剂中掺入所需量的一种活性化合物或与上述成分的组合，然后过滤除菌，来制备无菌注射溶液。通常在含有基础分散介质和所需上述其它成分的无菌运载体中加入活性化合物来制备分散液。就制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冻干，产生活性成分的粉末加上先已无菌过滤溶液的其它所需成分。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用运载体。它们可封装在明胶胶囊中或压成片剂。为口服给药，可通过已知方法，将药物制成肠溶形式避免被胃内消化或进一步包衣或混合以在消化道特定部位释放。对于口服治疗给药，可在活性化合物中加入赋形剂和采用片剂、锭剂或胶囊。也可用液体运载体制备口服组合物，用作漱口水。其中化合物随液体运载体口服吸入、咳出或吞入。可包括药学上相容的粘合剂，和/或辅佐物质作为组合物的一部分。药片、药丸、胶囊、锭剂等可含有以下成分或性质相似的化合物粘合剂如微晶纤维素、黄原胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬酯酸镁或氢化植物油(Sterote)；润滑剂如胶质二氧化硅；增甜剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙子香精。
也可通过透粘膜或透皮方式全身给药。为了透粘膜或透皮给药、可在制剂中采用适合透过屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域知道的，包括例如，透粘膜给药的洗涤剂、胆酸盐和羧链孢酸衍生物。
在一实施方式中，用能保护该化合物抵抗被机体快速消除的运载体来制备该活性化合物，如控释制剂，包括植入和微胶囊包裹的运送系统。可采用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法是该领域技术人员知道的。也可从Alza Corporation和NovaPharmaceutical，Inc.购买到这些物质。也可采用脂质体悬浮液(包括用抗病毒抗原的单克降抗体靶向感染细胞的脂质体)作为药学上可接受的运载体。这些可按该领域技术人员已知的方法，如美国专利4,522,811中所述来制备。
特别优选配制易于给药和剂量均一的口服或胃肠道外单位剂型的组合物。单位剂型本文用于指物理上分开的适合治疗对象的不连续剂量；各单位含有与所需药物运载体会混合的预定量经计算能产生所需治疗效果的活性化合物。说明书说明了本发明的单位剂型直接取决于该活性化合物的独特性能和可达到的特定治疗效果，和本专业对这种活性化合物治疗个体的固有限制。
本发明的人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体，可用本领域已知的人IL-2配制方法配制。当前方法中采用的合适制剂可见各种专利和出版物，例如美国专利4,604，377中所述，它们显示的优选IL-2制剂含有治疗量的IL-2，但基本上没有非IL-2蛋白和内毒素，生理学上可接受水溶性运载体和溶解IL-2的足够量表面活性剂，如十二烷基磺酸钠。可包含有其它成分有，例如糖。美国专利4,766,106显示了含有聚乙二醇(PEG)修饰的IL-2制剂。欧洲专利申请出版物No.268,110显示含有选自聚乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(Tween-80)、聚乙二醇单硬酯酸酯和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物(Triton X405)等各种非离子表面活性剂的IL-2制剂。美国专利4,992,271公开了含人血清白蛋白的IL-2制剂。美国专利5,078,997公开了含人血清白蛋白和氨基酸的IL-2制剂。美国专利6,525,102公开了含氨基酸基质作为该多肽主要稳定剂的IL-2制剂，和酸性和/或其盐形式以将溶液缓冲在可接受的pH范围来稳定该多肽。待批美国专利申请No.10/408,648公开了适合肺输送的IL-2制剂。
治疗用途 含有获自这些人IL-2突变蛋白的本发明人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的药物制剂可用于刺激免疫系统，治疗癌症，如目前用天然IL-2或Proleukin

IL-2治疗的癌症。本发明的人IL-2突变蛋白和其合适的生物学活性变体优点是能降低促炎症细胞因子的产生，预计毒性较低，同时能保持或增强所需的功能活性，如NK细胞增殖、存活、NK-细胞介导的细胞毒(NK、LAK和ADCC)和T细胞增殖。
由于预计毒性较低，在那些需要高剂量IL-2的临床病症中，可给予与天然IL-2或

IL-2相似或更高剂量的本发明人IL-2突变蛋白和其生物学活性变体而最大程度降低的毒性作用。因此，本发明为IL-2给药作为治疗方案对象提供了减少白介素-2(IL-2)诱导的毒性症状的方法，该方法包括给予上述IL-2突变蛋白作为IL-2。而且，本发明的人IL-2突变蛋白和其合适的生物学活性变体具有治疗效果更好的其它优点，因此较低剂量的这些人IL-2突变蛋白可提供比天然IL-2或Proleukin

IL-2更好的治疗效果。
给予对象药学上有效量的本发明IL-2突变蛋白药物组合物。“药学上有效量”指可用于治疗、预防或诊断某疾病或病症的量。“对象”指哺乳动物，如灵长动物、人、狗、猫、牛、马、猪、绵羊等。用本发明药物制剂治疗的对象优选人。
为治疗目的给药时，给药可以是预防性或治疗性给药。当预防性提供时，在出现症状前提供药物。预防性给药的作用是预防或减轻后续症状。当治疗性提供时，在症状发作时(或短时后)提供药物。治疗性给予药物作用是减轻现有症状。
因此例如，含有本发明人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的有效量药物组合物的制剂可用于治疗、预防和诊断许多对IL-2治疗有临床反应的疾病。可配制本发明人IL-2突变蛋白和其生物学活性变体用于治疗与天然序列的IL-2或Proleukin

IL-2所治疗的相同疾病。因此，含有本发明人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的制剂可用于诊断、预防和治疗(局部或全身)细菌、病毒、寄生虫、原虫和霉菌感染；增强细胞介导的细胞毒作用；刺激淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞活性；介导淋巴细胞免疫功能的恢复；促进同种异体抗原反应；促进放疗后、化疗后或与其它抗癌药物联合治疗后，或骨髓或自身干细胞移植后(功相结合)癌症病人的免疫重建；促进获得性免疫缺陷状态的免疫功能恢复；重建老人和老龄动物的正常免疫功能；开发诊断试验如利用酶扩增、放射标记、放射显象和本领域已知的监测疾病状态时IL-2水平的其它方法；促进用于治疗和诊断目的的T细胞体外生长；阻断淋巴因子的受体位点；和各种其它治疗性、诊断性和研究应用。已调查了人IL-2或其变体如人IL-2突变蛋白的各种治疗和诊断应用，见Rosenberg等，N.Engl.J.Med.316889-97，1987；Rosemberg，Ann.Surg.208121-135，1988；Topalian，J.Clin.Oncol.6839-53，1988；Rosenberg等，N.Engl.J.Med.3191676-80，1988；W eber等，J.Clin.Oncol.1033-40，1992；Grimm等，Cell.Immunol.70(2)248-59，1982；Mazumder，Cancer J.Sci.Am.3(增刊1)S37-42，1997；Mazumder和Rosenberg，J.Exp.Med.159(2)495-507，1984；和Mazumder等，Cancer Immunol.Immuther.15(1)1-10，1983。含有本发明人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的制剂可用作单一的治疗活性药物，或可与其它免疫学相关细胞或其它治疗药物联用。相关细胞的例子有B或T细胞、NK细胞、LAK细胞等，可用于与IL-2或其变体联用的示范性治疗药物是各种干扰素，特别是γ-干扰素、B-细胞生长因子、IL-1和抗体，包括但不限于抗HER2抗体，如

(Trastuzumab；Genentech，Inc.，South San Francisco，California)或抗-CD20抗体，如

(利妥昔单抗；IDEC-C2B8；Biogen IDEC Pharmaceutical Corp.，San Diego California)。
给予人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的剂量范围可在0.1-15mIU/m2之间。IL-2免疫治疗与抗癌症单克降抗体联用的治疗有效量和具体治疗方案是本领域知道的。参见，例如，题为“非何杰金氏淋巴瘤的治疗方法(Methods of Therapy forNon-Hodgkin’s Lymphoma)”的待批美国专利申请第2003-0185796号和题为“过度表达HER2受体蛋白为特征的癌症IL-2/抗-HER2抗体联合治疗(CombinationIL-2/Anti-HER2 Antibody Therapy for Cancers Characterized by Overexpression of theHER2 Receptor Protein)”的待批美国专利20030235556，和题为“慢性淋巴细胞白血病的治疗方法”的待批美国专利申请No.60/491,371，2003年7月31日提交的代理人备忘录No.59516-278。对于疾病如肾细胞癌和转移性黑色素瘤，可给予人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体300,000-800,000IU/kg/8小时作高剂量静脉药团注射。见上述美国专利申请中B-细胞淋巴瘤、HER2+癌症、乳腺癌和CLL的IL-2免疫治疗推荐剂量。
采用IL-2免疫疗法来治疗HIV感染也是本领域知道的。见例如，美国专利No.6,579,521中此临床疾病推荐的剂量和治疗方案。
因此，本发明提供治疗对象的癌症或调节对象免疫应答的方法，该方法包括给予本发明治疗有效量的IL-2突变蛋白或其生物学活性变体。“治疗有效量”指足以诱导所需生物学结果但不诱导不可接受毒性作用的剂量水平。给予的量根据该药物组合物中人IL-2突变蛋白或其生物学活性变体的浓度、需要的活性、被治疗哺乳动物的疾病状况、剂型、给药方法、给药频率和病人因素如年龄、性别和疾病严重性而不同。认为可提供广泛范围浓度的治疗有效量，如需要可给予对象多次治疗有效量来减轻和/或缓解症状、体症或所述疾病的病因，或进行生物系统的其它所需改变。通常，本发明的IL-2突变蛋白药物组合物含有人IL-2突变蛋白或其变体的浓度范围高于

IL-2所用的范围。由于剂量比

IL-2高，应密切监视对象以确定有无毒性副作用出现。这类临床实验分析是本领域技术人员熟知的，例如已用于确定

IL-2免疫调节和癌症治疗当前所用的剂量。
监测人IL-2突变蛋白功能活性的生物试验 本发明也提供监测IL-2诱导的NK细胞增殖和产生TNF-α、IL-2诱导的NK细胞介导的细胞毒、IL-2诱导的T细胞增殖、和IL-2诱导的NK细胞存活的新型生物试验方法。已开发了这些试验方法来筛选候选IL-2突变蛋白的所需功能特性，如减少促炎症细胞因子的产生(特别是TNF-α和/或TNF-γ)改善耐受性、和促进NK细胞介导的功能，如反映于该突变蛋白能保持或增强NK细胞和/或T细胞增殖、保持或增强NK细胞介导的细胞毒(NK、LAK和ADCC)及保持或增强NK细胞的存活。
这些试验先前在本文中也称为“NK-92生物试验”，用于监测IL-2诱导产生的TNF-α和IL-2诱导的NK细胞增殖。此生物试验采用人NK-92细胞系(ATCCCRL-2407，CMCC ID#11925)。NK-92细胞系最初由Gong等，leukemia 8(4)652-58，1994报导，显示具有活化NK细胞的表型和功能特性。NK-92的增殖是IL-2依赖的，如果在缺乏IL-2的培养基中培养72小时细胞将死亡。该细胞系在接触IL-2后48-72小时之内也产生可检测水平的TNF-α。
按照本发明的方法，可用此NK-92细胞生物试验筛检IL-2突变蛋白诱导产生TNF-α和诱导的NK细胞增殖的相对能力。在此方法中，将NK-92细胞培养在由α-MEM、12％热灭活胎牛血清(FBS)、8％热灭活马血清、0.02mM叶酸、0.2mM肌醇、2mM1-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇组成的完全培养基(NK-92培养基)中。以最低密度1-3 x 105细胞/毫升接种培养物，添加1000IU/ml的参比重组人IL-2突变蛋白(例如称为脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或参比的C125S人IL-2突变蛋白)。准备此试验，将细胞置于新鲜的NK-92培养基中至少48小时然后用于试验。试验前一天，洗涤NK-92细胞三次，置于NK-92培养基中24小时不加IL-2。离心细胞，悬浮在NK-92培养基中(无IL-2)，以4 x 104细胞/孔密度，将NK-92培养基稀释的200微升含不同浓度参比IL-2突变蛋白，如脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2；或不同浓度的待筛选感兴趣功能特性的候选IL-2突变蛋白，接种在96孔平底板中。37℃，5％CO2培养72小时后，取100微升等量培养上清液冻存，随后用商品化购得的TNF-αELISA试剂盒(例如BioSource CytoscreenTM人TNF-αELISA试剂盒；Camarillo，california)定量检测TNF-α。对于培养中存活的细胞，用商品化购得的MTT染料试剂盒(CellTiter96

非放射细胞增殖试验试剂盒(Promega Corp.，madison，Wisconsin)测定增殖，和根据比色读数计算刺激指数。
上述第二种IL-2生物试验提供了筛选IL-2候选突变蛋白能否诱导NK细胞介导的细胞毒方法。此生物试验称为“NK-92细胞毒生物试验”，采用了人NK3.3细胞系。NK3.3细胞系显示具有外周血NK细胞的表型和功能特性(Kornbluth，J Immunol129(6)2831-37，1982)，可通过Fc受体(CD16 FcγRIIIA)介导抗体依赖性细胞毒(ADCC)。以下实验章节的表2小结了用此种IL-2生物试验检测NK3.3细胞的生物学活性。
按照本发明的方法，可用NK3.3细胞毒生物试验筛选具有细胞毒活性的候选IL-2突变蛋白。在此方法中，扩增NK3.3细胞并维持在添加有15％热灭活胎牛血清、25mMhepes\2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作为IL-2来源的RPMI-1640培养基中。准备此试验，在无IL-2(“饥饿”)时培养NK3.3细胞24小时。此试验包括在U形底96-孔板中接种5 x 104个“饥饿的”NK3.3细胞，使其接触不同浓度的参比IL-2突变蛋白，如脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突变蛋白，或不同浓度的感兴趣候选IL-2突变蛋白，总体积200微升。培养18小时后将IL-2激活的NK3.3效应细胞与5 x 103个钙黄绿素(calcein)AM-标记的靶细胞(K562或Daudi)或抗体包被的钙黄绿素AM-标记的靶细胞(包被有最终浓度2μg/ml的利妥昔单抗的Daudi细胞)共培育，得到最终的效-靶比10:1。效应-靶细胞共培育4小时后，简单离心96孔板；取100微升培养上清液置于黑色透明平底96孔板中用荧光计定量测定钙黄绿素AM的释放。测定的量表示为特异性溶解百分比，用以下公式计算％特异性溶解＝100×[(实验孔平均值-自发释放平均值)/(最大释放平均值-自发释放平均值)]；测定含有标记的靶细胞但无效应细胞孔的自发释放，和测定含有标记的酸细胞和1％Triton X-100孔的最大释放。
上述第三种IL-2生物试验提供了筛选IL-2候选突变蛋白诱导T细胞增殖能力的方法。在此方法中，T-细胞增殖IL-2生物试验采用人T-细胞系Kit225(CMCC ID#11234)，其衍生自一慢性T-淋巴细胞白血病病人(Hori等，Blood 70(4)1069-72)。Kit225细胞能组成性表达IL-2受体复合物的α、β、γ亚单位。Kit225增殖是IL-2依赖的，如果培养中长期缺乏IL-2细胞将死亡。
按照本发明，该试验包括在无IL-2时培养Kit225细胞24小时，然后接种入特定数目的细胞和不同浓度的参比IL-2突变蛋白，如脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突变蛋白，或不同浓度的感兴趣候选IL-2突变蛋白，培育48小时后，用标准的商品化购得的MTT染料还原试剂盒检测细胞增殖，根据比色读数计算刺激指数。
本发明的第四种生物试验提供了筛选IL-2候选突变蛋白促进NK细胞存活能力的方法。在此方法中，筛选突变蛋白诱导NK细胞存活信号的能力。Proleukin

IL-2(即含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白的制剂)能诱导事先经IL-2饥饿的NK3.3细胞中AKT的磷酸化，认为这是“存活信号”。按照此生物试验，扩增NK3.3细胞并维持在添加有15％热灭活胎牛血清、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作为IL-2来源的RPMI-1640培养基中。准备此试验，在无IL-2(“饥饿”)时培养NK3.3细胞24小时。作为细胞存活信号的指标，通过加入2nM参比IL-2突变蛋白，如脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突变蛋白，或2nM感兴趣候选IL-2突变蛋白，剌激“饥饿的”NK3.3细胞(2 x 106)30分钟。用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞二次。用50微升含蛋白酶抑制剂的细胞抽提缓冲液溶解细胞团，进行一轮冻熔。4℃，13000rpm离心提取物10分钟。将1:10稀释的澄清溶解液等份加入AKT[pS473]*免疫试验试剂盒(BioSource Internatioal)的孔中。按操作程序，用定量ELISA检测磷酸化AKT的水平。
本发明也提供用人外周血单个核细胞(PBMC)筛选IL-2突变蛋白功能特性的生物试验。这些试验之一是联合的增殖/促炎症细胞因子产生生物试验。当接触IL-2时，人PBMC增殖和以剂量依赖方式分泌细胞因子。设计此种联合试验来评估用参比IL-2突变蛋白(如脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白或C125S突变蛋白)，或感兴趣的候选IL-2突变蛋白刺激72小时后增殖和细胞因子产生水平。用密度梯度离心分离法(如用ACDA Vacutainer CPT试管)分离一名或多名正常供体的PBMC。在96孔组织培养处理平板的完全RPMI培养基(RPMI，10％热灭活人AB血清、25mM HEPES、2mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素/两性霉素)中，与不同浓度(0.039nM-10nM)的IL-2，或作为阴性对照无IL-2，37℃，7％CO2，培养每孔200000个细胞。培育66小时后取等量细胞培养上清液冻存，随后检测细胞因子。用1μCi3H-胸苷脉冲细胞6小时，然后收集细胞测定核苷酸掺入水平(如用Wallac Trilux microbeta平板读数仪)，作为细胞增殖的衡量。可用商品购得的ELISA试剂盒(如购自BioSource International)按厂商指南检测细胞培养上清液中的TNF-α水平。对不同供体，如6、8或10位供体的完全小组反复进行此试验，可提供“正常人群”对IL-2的代表性增殖和细胞因子应答反应的特征。然后可如表1所示分析数据，这将在以下实施例10中进一步描述。
可利用第二种PBMC生物试验来筛选IL-2候选突变蛋白介导效应细胞细胞毒的能力。此试验中，用密度梯度离心分离全血的人PBMC。在存在10nM IL-2对照或感兴趣IL-2突变蛋白下刺激PBMC3天产生LAK活性，如本领域目前通常所实施的那样(见例如，《人NK细胞的分离和LAK活性的产生》(Isolation of Human K Cells andGeneration of LAK activity)，选自《新编免疫学实验指南》(Current protocol inImmunology)；1996 John Wiley & Son，Inc.)。所得细胞群含有“效应”细胞，可分类为NK或LAK，其可分别杀伤K562和Daudi肿瘤靶细胞。这些效应细胞也能介导ADCC，因效应细胞能识别结合于Daudi靶细胞的特异性抗体的Fc部分。一实施方式中，能结合Daudi靶细胞的抗体是

(利妥昔单抗)。
按照本发明的方法，将已用感兴趣的候选IL-2突变蛋白激活的人PBMC(效应细胞)与钙黄绿素AM-标记的靶细胞以不同的效靶比(E:T比例)共培养4小时。检测培养上清液中相对于钙黄绿素AM的细胞毒量。所测得的量根据自发释放和最大释放对照量，表示为各E:T比例时的特异性溶解百分比。该生物试验可检测以下生物学活性自然/自发性细胞毒(NK)，其中靶细胞是K562细胞；淋巴因子活化的杀伤(LAK)，其中靶细胞是Daudi细胞；和抗体依赖的细胞毒(ADCC)，其中靶细胞是抗体包被的Daudi细胞(如

包被的Daudi细胞)。
获得荧光仪测得的数据，表示为相对荧光(强度)单位(rfu)。此生物试验的对照包括只有标记的靶细胞(最小)和作为100％溶解衡量的标记靶细胞与最终浓度1％Triton X-100(最大)。用以下公式计算衡量此试验有效性(如>30％试验无效)的最小与最大比值的百分率
一旦该试验证实有效，计算出一式三份样品的平均值和标准差，然后用以下公式从一式三份样品的平均值计算出特异性溶解百分比
数据报告为特异性溶解百分比；此外，可用候选IL-2突变蛋白相对于IL-2参比对照(如脱丙氨酰-1，C125S突变蛋白或C125S突变蛋白)的比值来确定在供体的混合人PBMC群中细胞毒活性是否保持于IL-2参比对照的水平。
可利用上述试验来筛选IL-2候选突变蛋白库中具有所需功能特性者，其中感兴趣的功能活性包括以下一种或多种IL-2诱导的促炎症细胞因子的产生(特别是TNF-α和/或INF-γ)、IL-2诱导的NK细胞和/或T细胞增殖、IL-2诱导的NK细胞介导的细胞毒(NK、LAK和ADCC)和IL-2诱导的NK细胞存活。
给予以下实施例是为了阐述而非限制。
实施例 IL-2的治疗应用受到与其给药相关毒性的阻碍，包括发热、寒战、低血压和血管渗漏综合征。具有改进的耐受性和IL-2介导的NK和T细胞效应功能的IL-2突变蛋白允许给予相似的能更好耐受的治疗剂量或较高剂量，因此提高了此蛋白更佳疗效的潜力。本研究的整体策略是选择新型人IL-2突变蛋白，利用一组全面的专门化产量适度的人NK-细胞为基础的免疫试验筛选系统显示其具有以下功能特性能降低促炎症细胞因子(特别是TNF-α)的产生，因而改善了耐受性，和促进NK细胞介导的功能，反映在该蛋白能保持或增强NK细胞和/或T细胞的增殖、保持或增强NK细胞介导的细胞毒(NK、LAK和ADCC)和保持或增强NK细胞的存活。
为了鉴定具有所需治疗特性的合适的IL-2突变蛋白，将候选的重组人IL-2突变蛋白的生物学活性与称为参比IL-2突变蛋白的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(在以下实施例中用其缩写“Pro”)和C125S人IL-2(在以下实施例中用其缩写“Ala-Pro”)显示的这些生物学活性相比较。阿地白介素是大肠杆菌产生的重组脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白，投放市场的制品商标名为

IL-2(Chiron Corporation，Emeryville，California)。

IL-2是一种专门的冻干制剂，为该突变蛋白的非糖基化形式，用大肠杆菌生产，在下述生物试验中使用时以蒸馏水重建。
在某些实施方式中，使用了以商品名

IL-2(Chiron)销售的阿地白介素的单体制剂，它是含有与

IL-2相同人IL-2突变蛋白(阿地白介素)的液体制剂，但制备前的最终纯化步骤不同。参见美国专利No.4,931,543和美国专利No.6,525,102。用于最初筛选实验的C125S人IL-2是用AME哺乳动物系统制造的，并用专利AME缓冲液配制。
下述的人IL-2突变蛋白在宿主哺乳动物293T细胞中表达。其中参比IL-2突变蛋白是C125S人IL-2，宿主细胞用含C125S突变的操作性连接有Pro-1启动子的天然人IL-2编码序列的表达构建物转化。在脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(即SEQ ID NO7)的编码序列上融合了含人IL-2的真正IL-2信号序列和N-末端丙氨酸密码子(即SEQID NO1的核苷酸1-63)的编码序列。该蛋白质在293T细胞哺乳动物表达系统中表达为GSHis-加尾蛋白，用NI-NTA珠纯化。
实施例1 初步筛选人IL-2突变蛋白 利用密码子诱变技术平台(Applied Molecular Evolution，Inc.，San Diego，California)构建了含有C125人IL-2分子(本实施例称为“Ala-Pro”)2508个所有可能的单个氨基酸突变的变体库。商品购得的

IL-2产品中所用的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白与Ala-Pro不同在于C125S人IL-2突变蛋白中保留了天然产生的人IL-2序列1位N-末端Ala残基。在重组生产Ala-Pro突变蛋白时采用了AME哺乳动物表达系统DirectAMETM和ExpressAMETM(Applied MolecularEvolution，Inc.，San Diego，California)。
初步筛选用人NK-92细胞系功能性免疫试验进行，用人NK3.3细胞系测试了促炎症细胞因子(TNF-α)的产生、NK细胞增殖和NK溶细胞杀伤(NK、LAK和ADCC)及细胞存活(pAKT)。选择的初步功能终点包括(1)与Ala-Pro IL-2(即C125S人IL-2突变蛋白)或

IL-2(即脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白)观察到的相比，减少了NK-92细胞系的促炎症TNF-α产生；(2)与这二种参比IL-2突变蛋白观察到的相比，保持或增强了人NK-92细胞系的增殖；和(3)与这二种参比IL-2突变蛋白观察到的相比，保持或增强了人NK3.3细胞系介导的NK、LAK和ADCC-介导的溶细胞杀伤。第二种功能终点是，在NK3.3细胞系中，与这种参比IL-2突变蛋白相比，保持或增强了对磷酸化AKT(pAKT)的诱导，和与Ala-Pro IL-2(即C125S人IL-2突变蛋白)或

IL-2(即脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白)观察到的相比，保持或增强了人Kit225 T细胞系的T细胞增殖。
在人C125S IL-2分子所有2,508种可能的单个氨基酸突变蛋白变体中鉴定的168种进行进一步的实验(见上面的表1)。用这种方法鉴定到三类非常需要求的具有改进功能特征的IL-2突变蛋白。与脱丙氨酰-1，C125S(即

IL-2中存在的)或C125S(即Ala-Pro)人IL-2突变蛋白相比，所有选出的IL-2突变蛋白保持了NK溶细胞功能(NK/LAK/ADCC)。
预计第一类突变蛋白具有改进的耐受性，通过与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白或C125S人IL-2突变蛋白观察到的相比，其诱导NK细胞产生的TNF-α减少可以证实。这类突变蛋白可分成两种(1)在浓度为50pM-1000pM时诱导低TNF-α产生并维持NK细胞增殖，包括含有L72N取代的脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突变蛋白；和(2)仅在高浓度(1nM)时诱导低TNF-α产生并维持增殖，包括含有V91D或F42E取代的脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突变蛋白。见下面的实施例8和表13和14。
第二类突变蛋白包括那些与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白(即

IL-2中的)或C125S人IL-2突变蛋白(这里称为Ala-Pro IL-2)观察到的相比，具有增强NK细胞功能、尤其是NK细胞增殖的突变蛋白。鉴定属于此功能类型的突变蛋白包括含有L36D和L40D取代的脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突变蛋白。见下面的实施例8和表15。
第三类突变蛋白包括“双功能”突变蛋白，更加与

IL-2中存在的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白或C125S人IL-2突变蛋白(文中称为Ala-Pro IL-2)观察到的相比，第三类突变蛋白诱导TNF-α产生减少同时增强NK增殖，因此预计其具有改进的耐受性。这些“双功能”突变蛋白显示出大于1.5的改进的NK增殖TNF-α产生比例。鉴定属于此功能类型的突变蛋白包括含有L19D、F42R或E61R取代的脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突变蛋白。见下面的实施例8和表16。
下面的实施例进一步描述了将主要候选物鉴定分成这三种功能类别的筛选方法。筛选方法采用以下方案。
NK细胞的增殖/TNF-α产生 自然杀伤(NK)细胞增殖和TNF-α产生的IL-2生物试验采用人NK-92细胞系(ATCC CRL-2407，CMCC ID#11925)。最初由Gong等，Leukemia 8(4)652-658，1994报导的NK-92细胞系显示了活化NK细胞的表型和功能特性。NK-92的增殖是IL-2依赖的；如果在没有IL-2时培养细胞会死亡。接触IL-2后48-72小时内，该细胞系也产生可检测水平的TNF-α。
将NK-92细胞培养在含α-MEM、12％热灭活胎牛血清(FBS)、8％热灭活马血清、0.02mM叶酸、0.2mM肌醇、2mM1-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇的完全培养基(NK-92培养基)中。以最低密度1-3 x 105细胞/毫升接种培养物，添加1000IU/ml的参比重组人IL-2突变蛋白(脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(即阿地白介素或

IL-2，Chiron Corporation，Emeryville，California)或C125S人IL-2突变蛋白(在上述AME哺乳动物表达系统中重组产生)。准备此试验时，将细胞置于新鲜的NK-92培养基中至少48小时然后用于试验。试验前一天，洗涤NK-92细胞三次，置于NK-92培养基中24小时不加IL-2。离心细胞，悬浮在NK-92培养基中(无IL-2)，以4 x 104细胞/孔密度，用NK-92培养基稀释的200微升含有作为参比IL-2分子的不同浓度脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突变蛋白；或不同浓度的本发明IL-2突变蛋白，接种在96孔平底板中。37℃，5％CO2培养72小时后，取100微升等量培养上清液冻存，随后用商品化购得的TNF-αELISA试剂盒(BioSource CytoscreenTM人TNF-αELISA试剂盒；Camarillo，California)定量检测TNF-α。对于培养中存活的细胞，用商品化购得的MTT染料试剂盒(

非放射细胞增殖试验试剂盒(PromegaCorp.，Madison，Wisconsin)测定增殖，和根据比色读数计算刺激指数。
NK细胞介导的细胞毒 自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒的IL-2生物试验采用人NK3.3细胞系。NK3.3细胞系显示了外周血NK细胞的表型和功能特性(Kornbluth，J.Immunol.129(6)2831-2837，1982)，可通过Fc受体(CD16 FcγRIIIA)介导抗体依赖细胞毒(ADCC)作用。该细胞系获自Jackie Kornbluth博士，限制许可在露易斯洲立大学中使用，保存于CMCC(ID12022)。
表2 用IL-2生物试验检测Nk3.3细胞生物活性的小结
扩增NK3.3细胞并维持在添加有15％热灭活胎牛血清、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作为IL-2来源的RPMI-1640培养基中。准备此试验，在无IL-2(“饥饿”)时培养NK3.3细胞24小时。此试验包括在U形底96-孔板中接种5 x 104个“饥饿的”NK3.3细胞，使其接触作为参比IL-2分子的不同浓度的脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2，或不同浓度的本发明IL-2突变蛋白，总体积200微升。培养18小时后将IL-2激活的NK3.3细胞效应细胞与5 x 103个钙黄绿素AM-标记的靶细胞(K562或Daudi)或抗体包被的钙黄绿素AM-标记的靶细胞(包被有最终浓度2μg/ml的利妥昔单抗的Daudi细胞)共培育，得到最终的效-靶比10:1。效应-靶细胞共培育4小时后，简单离心96孔板；取100微升培养上清液置于黑色透明平底96孔板中用荧光计定量测定钙黄绿素AM的释放。测定的量表示为特异性溶解百分比，用以下公式计算％特异性溶解＝100×[(实验孔平均值-自发释放平均值)/(最大释放平均值-自发释放平均值)]；测定含有标记的靶细胞但无效应细胞孔的自发释放，和测定含有标记的靶细胞和1％Triton X-100孔的最大释放。
T细胞增殖 T细胞增殖的IL-2生物试验采用人T-细胞系Kit225(CMCC ID #11234)，其衍生自一慢性T-淋巴细胞白血病病人(Hori等，Blood70(4)1069-72，1987)。Kit225细胞能组成性表达IL-2受体复合物的α、β、γ亚单位。Kit225增殖是IL-2依赖的，如果培养中长期缺乏IL-2细胞将死亡。该试验包括将Kit225细胞在无IL-2时培养24小时，然后接种入特定数目的细胞和不同浓度的作为参比IL-2分子的脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突变蛋白，或不同浓度的本发明IL-2突变蛋白，培育48小时后，用标准的商品化购得的MTT染料还原试剂盒检测细胞增殖，根据比色读数计算出刺激指数。
NK细胞存活信号 筛选了人IL-2突变蛋白库某亚组诱导NK细胞存活信号的能力。Proleukin

IL-2(即含有脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白的制剂)能诱导事先经IL-2饥饿的NK3.3细胞中的AKT磷酸化，认为这是“存活信号”。按照此生物试验，扩增NK3.3细胞并维持在添加有15％热灭活胎牛血清、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和20％人T-StimTM w/PHA作为IL-2来源的RPMI-1640培养基中。准备此试验，在无IL-2(“饥饿”)时培养NK3.3细胞24小时。作为细胞存活信号的指标，通过加入2nM参比IL-2突变蛋白，如脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2突变蛋白，或2nM感兴趣的候选IL-2突变蛋白，刺激“饥饿的”NK3.3细胞(2 x 106)30分钟。用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞二次。用50微升含蛋白酶抑制剂的细胞抽提缓冲液溶解细胞团，进行一轮冻熔。4℃，13000rpm离心提取物10分钟。将1:10稀释的澄清溶解液等份加入AKT[pS473]*免疫试验试剂盒(BioSource Internatioal)的孔中。按操作程序，用定量ELISA检测磷酸化AKT的水平。
实施例2根据能否增强NK细胞增殖来鉴定IL-2突变蛋白 在鉴定的供进一步筛选的168种突变蛋白(表1)中，总共有97种有益的突变显示能使NK细胞增殖比0.1nM脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(即Proleukin

IL-2中存在的突变蛋白)高130％，同时不会增加TNF-α的产生(即比1nM脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白介导的TNF-α产生低100±8％)。这些突变蛋白列于表3。
表3.采用NK-92细胞增殖试验(CPA)作为主要选择标准鉴定的IL-2突变蛋白。显示了1.0nM蛋白质时的总TNF-α产生(pg/ml)和与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2观察到的相比TNF-α产生百分比(％Pro)。CPA值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2观察到的值的百分比(％Pro)。显示在0.1nM蛋白质时％NK细胞增殖与1.0nM蛋白质时的％TNF-α产生的比值(％CPA0.1TNF-α)。细胞毒试验的值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的值或对C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的值的比值。



对定量<0.066ng/μl的IL-2突变蛋白制品进行了第二次分析。该分析鉴定到4种额外的突变，所有突变都发生在关键位置36、40和65上，其中，突变蛋白诱导的NK细胞增殖比0.1nM脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白(即存在于Proleukin

IL-2中)介导的高150％，而在1nM时诱导的TNF-α产生是类似量脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白(即1nM)介导的≤100％。第二次分析还鉴定到7种其它突变，所有突变都发生在关键位置36、64和65上，在1nM时诱导TNF-α产生略微增加(约为用类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2参比分子观察到的101-109％)，同时在0.1nM时仍可诱导NK细胞增殖比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白介导的高150％。TNF-α的产生见表4。
表4.采用NK-92细胞增殖试验(CPA)作为主要选择标准鉴定到的其它IL-2突变蛋白。显示在1.0nM蛋白质时的总TNF-α产生(pg/ml)和与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2观察到相比的TNF-α产生百分比(％Pro)。CPA值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2观察到的值的百分比(％Pro)。显示在0.1nM蛋白质时％NK细胞增殖与1.0nM蛋白质时％TNF-α产生的比值(％CPA0.1TNF-α)。细胞毒试验的值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的值或对C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的值的比值。

实施例3根据能否降低的TNF-α产生来鉴定IL-2突变蛋白 选择在1nM时能使TNF-α产生比脱丙氨酰-1，C125S(即Proleukin

IL-2中存在的突变蛋白)或C125S人IL-2突变蛋白IL-2(指Ala-Pro IL-2)低87％，或在0.1nM和1nM时与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2相比能维持(至少96.4％)或增强NK细胞增殖，及在0.1nM时与C125S人IL-2突变蛋白相比能维持(至少79.2％)NK细胞增殖(数据未显示)的突变蛋白。见表5。
表5.用以下选择标准鉴定的IL-2突变蛋白1.0nM时TNF-α产生比用脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的<87％，且在两种浓度(0.1和1.0nM)时与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的相比能维持或增强NK细胞增殖。显示了在1.0nM蛋白质时的总TNF-α产生(pg/ml)和与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)观察到相比的TNF-α产生百分比。CPA值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2观察到的值的百分比(％Pro)。显示在0.1nM蛋白质时％NK细胞增殖与1.0nM蛋白质时％TNF-α产生的比值(％CPA0.1TNF-α)。细胞毒试验的值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的值或对C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的值的比值。

调整这些筛选标准以获得那些符合以下标准的突变蛋白TNF-α产生比1nM脱丙氨酰-1，C125S或C125S人IL-2刺激的低81％，且在1nM时(即只在一种参比IL-2突变蛋白浓度时)与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2相比能维持或增强NK细胞增殖(至少95％)。用这些筛选标准鉴定的其它突变蛋白涉及位置20、78、79、80、81、88和126上残基的变化。见表6。
表6.用以下选择标准鉴定的IL-2突变蛋白TNF-α产生比用1.0nM脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的<81％，且在1.0nM时与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白(Pro)相比能维持或增强NK细胞增殖。显示在1.0nM蛋白质时的总TNF-α产生(pg/ml)和与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)观察到相比的TNF-α产生百分比。CPA值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2观察到的值的百分比(％Pro)。显示在0.1nM蛋白质时％NK细胞增殖与1.0nM蛋白质时％TNF-α产生的比值(％CPA0.1TNF-α)。细胞毒试验的值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的值或对C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的值的比值。

对定量≤0.066ng/μl的IL-2突变蛋白制品进行第二次分析。该分析鉴定到在1nM时显示TNF-α产生比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白低96.2％，并在1nM浓度时维持参比IL-2分子诱导的NK细胞增殖至少100％的其它IL-2突变蛋白。见表7。
表7.用以下选择标准鉴定的IL-2突变蛋白TNF-α产生比用1.0nM脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的<96.2％，且在1.0nM时与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白(Pro)相比能维持或增强NK细胞增殖。显示在1.0nM蛋白质时的总TNF-α产生(pg/ml)和与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)观察到相比的TNF-α产生的百分比。CPA值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2观察到的值的百分比(％Pro)。显示在0.1nM蛋白质时％NK细胞增殖与1.0nM蛋白质时％TNF-α产生的比值(％CPA0.1TNF-α)。细胞毒试验的值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的值或对C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的值的比值。

实施例4鉴定具有增强NK-介导细胞毒的IL-2突变蛋白 选择在0.1nM或1.0nM测定时对K562细胞的NK-介导的细胞毒超过C125S人IL-2突变蛋白(即Ala-Pro)至少140％、超过脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白(即Proleukin

IL-2中存在的突变蛋白)至少115％，以及在1nM测定时诱导TNF-α产生比这两种参比IL-2突变蛋白低100％，并且在0.1nM或1nM测定时与这两种参比IL-2突变蛋白相比能维持NK细胞增殖(至少100％)的突变蛋白。见表8。
表8.采用NK3.3细胞毒试验(K562靶)鉴定的IL-2突变蛋白天然细胞毒突变蛋白。显示在1.0nM蛋白质时总TNF-α产生(pg/ml)和与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)观察到相比的TNF-α产生百分比。CPA值表示为0.1nM或1nM时对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)观察到的值的百分比。显示了Pro(％CPATNF-α(Pro))和Ala-Pro(％CPATNF-α(Ala-Pro))在0.1nM蛋白质时％NK细胞增殖与1.0nM蛋白质时％TNF-α产生的比值。细胞毒试验的值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的值或对C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的值的比值。

实施例5鉴定LAK活性增强的IL-2突变蛋白 然后根据以下标准选择突变蛋白NK细胞介导的LAK活性比C125S人IL-2突变蛋白(即Ala-Pro)增强120％，且与Proleukin

IL-2中存在的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白相比保持了(至少100％)NK细胞介导的LAK活性，并且在1nM时产生的TNF-α比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白和C125S人IL-2突变蛋白少100％，在0.1nM和1nM时与这些参比IL-2突变蛋白相比能保持NK细胞增殖(至少100％)。见表9。
表9.采用NK3.3细胞毒试验(Daudi靶细胞)鉴定的目标IL-2突变蛋白的淋巴因子激活杀伤(LAK)活性。显示了各突变蛋白的总TNF-α产生(pg/ml)和与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)观察到相比的TNF-α产生百分比。CPA值表示为0.1nM或1nM时对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)观察到的值的百分比。显示了Pro(％CPATNF-α(Pro))和Ala-Pro(％CPATNF-α(Ala-Pro))在0.1nM蛋白质时％NK细胞增殖与1.0nM蛋白质时的％TNF-α产生的比值。细胞毒试验的值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的值或对C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的值的比值。

实施例6鉴定具ADCC活性增强的IL-2突变蛋白 然后根据以下标准选择突变蛋白NK细胞介导的ADCC活性比C125S人IL-2突变蛋白(Ala-Pro)增强至少115％，比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白(Pro)增强至少105％，在1nM时产生的TNF-α比参比IL-2突变蛋白少100％，在0.1nM时与这两种参比IL-2突变蛋白相比能保持NK细胞增殖(至少100％)。见表10。
表10.采用NK3.3细胞毒试验(利妥昔单抗包被的Daudi靶细胞)鉴定的目标IL-2突变蛋白抗体依赖性细胞毒(LAK)。显示了总TNF-α产生(pg/ml)和与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)或C125S人IL-2(％Ala-Pro)观察到相比的TNF-α产生百分比。CPA值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(％Pro)观察到的值的百分比。显示在0.1nM蛋白质时％NK细胞增殖与1.0nM蛋白质时％TNF-α产生的比值。细胞毒试验的值表示为对脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(Pro)观察到的值或对C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的值的比值。

实施例7选择支持NK细胞存活增强的突变蛋白 选择与脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白相比能增强NK细胞存活的突变蛋白。见表11。
表11.采用NK3.3pAKT诱导试验鉴定的细胞存活阳性目标IL-2突变蛋白。

实施例8选择具有最大增强治疗能力(Therapeutic Profile)的人IL-2突变蛋白 采用上述选择标准鉴定到25种特别感兴趣的人IL-2突变蛋白。这些突变蛋白示于表12。

根据上述标准选择突变蛋白后按以下选择这些标准将突变蛋白进一步分组 1)显示TNF-α产生比C125S人IL-2突变蛋白观察到的<80％并有以下特征的突变蛋白 a)在1nM时保持增殖能力，但相比参比IL-2突变蛋白，增殖活性在较低浓度时下降，包括还具有F42E或V91D突变的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白或C125S人IL-2突变蛋白(见表13)；或 b)在1nM时显示TNF-α产生显著降低，且在低至50pM时保持增殖活性，其包括还具有L72N突变的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白或C125S人IL-2突变蛋白(见表14)； 2)在一种或多种测试浓度(5pM、20pM、50pM、100pM和1000pM)时使NK-92增殖比C125S人IL-2突变蛋白>200％，但对TNF-α产生没有不良影响(在浓度为100pM或1nM时的TNF-α产生比参比IL-2突变蛋白观察到的<100％)的突变蛋白。此外，选择标准包括，在至少2种浓度测试时增殖指数比参比IL-2突变蛋白，即C125S人IL-2(Ala-Pro)观察到的高150％；该组突变蛋白包括还具有L36D或L40D突变的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白或C125S人IL-2突变蛋白(见表15)；和 3)显示出增强的增殖活性和降低TNF-α产生的突变蛋白，其中，TNF-α产生是在1nM测试时C125S人IL-2突变蛋白观察到的<75％，同时NK细胞增殖是任何一种浓度(5pM、20pM、50pM、100pM和1000pM)测试时C125S人IL-2突变蛋白观察到的>150％；该组突变蛋白包括还具有L19D、F42R或E61R突变的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白或C125S人IL-2突变蛋白(见表16)。


实施例9人IL-2突变蛋白维持T细胞增殖 作为选择有益突变基础的第二功能终点(secondary functional endpoint)是与用Ala-Pro IL-2(即C25S人IL-2突变蛋白)或

(即脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白)观察到的相比能保持或改进人KIT225 T细胞系的增殖。选择上表1所示的168种突变蛋白亚组进行这种功能终点测试。结果示于下表17。
表17.Kit225人T细胞系的增殖—MTT试验得到的与Y-Pro IL-2对照(酵母表达的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白)或Pro对照(阿地白介素，

)相比的OD比值。
*Y-Pro＝酵母系统表达的脱丙氨酰-1，C125S IL-2；该试验用的所有突变蛋白均为酵母载体所表达 “保持”T细胞增殖定义为IL-2对照+/-20％ 实施例10能降低正常人外周血单个核细胞促炎症细胞因子产生 同时保持或增强其增殖和细胞毒水平的优选IL-2突变蛋白的鉴定 从上述单个氨基酸取代序列中选出表18所示的25种IL-2突变蛋白进行小规模表达/纯化。测试了这些IL-2突变蛋白能否导致分离自几位正常人供体的外周血单个核细胞(PBMC)耐受性提高和保持活性的类似功能特性，与相关的IL-2对照(脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白(存在于Proleukin

IL-2中))和酵母菌表达的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2突变蛋白(在下述数据中称为Y-Pro)作比较。具体说，通过用感兴趣的IL-2突变蛋白刺激衍生自一组正常人供体的PBMC，测定增殖和促炎症细胞因子(TNF-α)的产生，及能否通过自然/自发性细胞毒(NK)、淋巴因子活化的杀伤(LAK)，或抗体依赖的细胞毒(ADCC)而杀伤肿瘤靶细胞。
表18.筛选在人PBMC中具有活性的含以下其它取代的C125S人IL-2(SEQ IDNO6)或脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(SEQ ID NO8)氨基酸序列的人IL-2突变蛋白。1 1通过与成熟的人IL-2(SEQ ID NO4)相关的氨基酸位置和该位置的氨基酸取代鉴定IL-2突变蛋白 采用了以下主要功能终点 1)与相关的人IL-2突变蛋白对照相比，IL-2突变蛋白激活的人PBMC产生降低的促炎症细胞因子(TNF-α)； 2)与相关的人IL-2突变蛋白对照相比，能保持或增强IL-2诱导的人PBMC增殖，但不提高促炎症细胞因子的产生； 3)与相关的人IL-2突变蛋白对照相比，能保持或增强体外用IL-2突变蛋白激活的人PBMC的NK、LAK和ADCC介导的溶细胞杀伤。
试验说明 联合增殖/促炎症细胞因子产生试验的方法 接触IL-2后，人PBMC以剂量依赖方式增殖和分泌细胞因子。为最大程度提高数据输出和效率，设计了联合试验来评估用参比IL-2突变蛋白或感兴趣人IL-2突变蛋白刺激72小时后的增殖和细胞因子产生水平。试验设置包括用密度梯度离心分离法(ACDAVacutainer CPT试管)分离一名或多名正常供体的PBMC。在96孔组织培养处理平板的完全RPMI培养基(RPMI，10％热灭活人AB血清、25mMHEPES、2mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素/两性霉素)中，加入不同浓度(0.039nM-10nM)的IL-2，或作为阴性对照不加IL-2，37℃，7％CO2，培养每孔200000个细胞。培育66小时后取等量细胞培养上清液冻存，随后检测细胞因子。用1μCi3H-胸苷脉冲细胞6小时，然后收集细胞测定核苷酸掺入水平(Wallac Trilux Microbeta平板读数仪)，来衡量细胞增殖。用商品购得的ELISA试剂盒(BioSource International)按厂商指南检测细胞培养上清液中的TNF-α水平。对一完整组6名不同供体反复进行此试验，提供了“正常人群”对IL-2的代表性增殖和细胞因子应答反应的特征分析。
数据分析 在不同的试验平板中一式二份接种PBMC样品来评估(试验)的可重复性。分析增殖数据通过减去本底增殖(PBMC+无IL-2)和计算一式二份样品的平均值。从含PBMC的试验孔中取得细胞培养上清液，合并后得到细胞因子数据，为一式二份孔的细胞因子平均水平。根据ELISA试剂盒中装的纯化TNF-α的标准曲线，定量TNF-α的水平，用pg/ml表示。进一步汇编一组6名正常人供体的数据，概括在图1所示的示意图中。
细胞毒试验(NK/LAK/ADCC) 此试验中，用密度梯度离心分离全血的PBMC。如本领域目前通常进行的那样，(见例如，《人NK细胞的分离和LAK活性的产生》，选自《Current protocols inImminnology(新编免疫学实验指南)》；1996 John Wiley & Son，Inc.)，在存在10nM IL-2对照或感兴趣的IL-2突变蛋白时刺激PBMC了无产生LAK活性。所得细胞群含有“效应”细胞，可分类为NK或LAK，其可分别杀伤K562和Daudi肿瘤靶细胞。这些效应细胞也能介导ADCC，因效应细胞能识别结合于Daudi靶细胞的特异性抗体(此例是

)的Fc部分。此试验包括以不同的效--靶比(ET比例)共培养效应细胞与钙黄绿素AM-标记的靶细胞4小时。检测培养上清液中相对于钙黄绿素AM的细胞毒活性量。所测得的量根据自发释放和最大释放对照量，表示为各ET比例时的特异性溶解百分比。小结此试验可检测以下生物学活性 数据分析 获得荧光仪测得的数据，表示为相对荧光(强度)单位(rfu)。对照包括只有标记的靶细胞(最小)和作为100％溶解衡量的标记靶细胞与最终浓度1％Triton X-100(最大)。用以下公式计算衡量此试验有效性(如>30％试验无效)的最小与最大比值的百分率
一旦证实该试验有效，计算出一式三份样品的平均值和标准差，然后用以下公式从一式三份样品的平均值计算出特异性溶解百分比
数据报告为特异性溶解％；此外，可利用IL-2突变蛋白与相关IL-2对照的比值来确定与对照相比，是否保持了对混合的人PBMC群具有细胞毒活性。
结果 鉴定到能降低正常人PBMC促炎症细胞因子产生同时保持或增强增殖和细胞毒水平的5个优选IL-2突变蛋白。对于以下提供的数据，只与相关对照，即在同一酵母系统中表达式并纯化的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2(称为Y-Pro)一起测试了IL-2突变蛋白。在二次独立的试验中，用联合的增殖/促炎症细胞因子产生试验，先测试了IL-2突变蛋白的剂量反应曲线(39pM-10nM)，各用三名正常供体的PBMC作一式二份测试。数据分析包括供体的个体概况、均值±标准差、与内部对照IL-2的差异分析和细胞因子产量(pg/ml)按增殖(cpm)标准化，以得到每个细胞产生的细胞因子相对量。最后计算出与IL-2对照相比TNF-α产量减少的百分数。如果10,000pM浓度时保持了增殖水平和TNF-α产量减少25％以上的IL-2突变蛋白确实是优选的。表19小结了在脱丙酰-1，C125S人IL-2突变蛋白骨架中含有所示其它氨基酸取代的5种优选IL-2突变蛋白观察到的TNF-2产生减少的百分比。图2-6分别显示在人PBMC中，F42E、L94Y、E95D、E95G和Y107R突变蛋白介导的增殖和TNF-α产生。
表19.IL-2对照TNF-α产生减少的百分比1
1数值代表一组6名正常人供体PBMC的Y-Pro对照平均降低百分比。
细胞因子数据按增殖标准化 一旦鉴定到5种优选的IL-2突变蛋白，重要的是确定此IL-2突变蛋白激活的PBMC是否保留了通过NK、LAK和ADCC活性溶解肿瘤靶细胞的能力。如图7所示，观察到IL-2突变蛋白与相关IL-2对照之间在通过NK、LAK和ADCC活性溶解肿瘤靶细胞能力上未见差异。
实施例11用B16F10黑色素瘤模型评价IL-2突变蛋白的效果 实验设计 用IL-2敏感的B16F10黑色素瘤模型测试了Y107R、F42E和E95D IL-2突变蛋白。评价目标的剂量反应，确定最小有效剂量(MED)，并证明抑制肺转移的效果。
研究的第一天给C57BL/6小鼠静脉内植入B16F10黑色素瘤细胞(50,0000细胞/小鼠)。小鼠为4-6周龄，根据体重将它们随机分成10组。每组的平均体重相差20％之内。在第2天开始治疗，包括给予

形式的IL-2、RL-2(大肠杆菌产生的研究级IL-2)、

(IL-2的单体形式)，或者给予IL-2突变蛋白E95D或Y107R。
测试两种不同的剂量方案1)根据Sleijfer等(J.Clin.Oncol.10(7)1119-1123，1992)所述方案的改进“Sleijfer”方案，包括用皮下给予的IL-2治疗2周，每天一次，每周5天(给药5天/停药2天/给药5天，采用升高剂量(dose-up)设计)，和2)每周给予IL-2三次的方案。根据测定的作为药物耐受性指标的肺转移数(第18-21天，盲试)、临床观察和体重测量评价治疗的功效和耐受性。
结果 每周三次静脉内给予C57BL/6小鼠的鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型

RL-2、

以及IL-2突变蛋白E95D和Y107R(图8和9)。IL-2测试药剂的最小有效剂量(MED)(统计学上有意义的剂量与药物运载体的比值)如下

(3.3mg/kg)、

(3.3mg/kg)、RL-2(3.3mg/kg)、E95D(5.7mg/kg)、Y107R(5.7mg/kg)。测试药剂的ED50(相比药物运载体抑制50％转移)分别为

2.4mg/kg、E95D 4.8mg/kg、Y107R 6.1mg/kg。相比IL-2基准(


剂量为5.7mg/kg(每周三次)的Y107R和E95D能产生相同的转移抑制。突变蛋白或

未达到最大耐受剂量(MTD)。所有测试药剂剂量都可良好耐受，在研究期间小鼠显示体重正常(图9)。下表20总结了药效结果。
表20.鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型每周三次给予


以及IL-2突变蛋白E95D和Y107R的效果。
*ANOVA/Student-Newmans-Keul检验 然后采用“Sleijfer”剂量方案(给药5天/停药2天/给药5天)测试IL-2药剂。与运载体治疗或未治疗的小鼠相比，E95D和Y107R在所有剂量(3.3、5.7和8.1mg/kg)都显著减少了平均肺转移数(p<0.001 ANOVA/Student-Newmans-Keul检验)，其效果与IL-2基准(


)相当(图10和11)。3.3和8.1mg/kg的Y107R显示分别为2/10和1/10只小鼠有完全反应(CR)(表21)，CR被定义为小鼠肺部的肿瘤(包括显微病损)完全消失。与运载体治疗或未治疗的小鼠相比，5.7mg/kg的

和8.1mg/kg的RL-2以及3.3、5.7和8.1mg/kg的

显著降低肺转移(p<0.001ANOVA/Student-Newmans-Keul检验)。

E95D和Y107R的最小有效剂量为3.3mg/kg，计算出的E95D、Y107R和

的ED50为<3.3mg/kg。高至8.1mg/kg0的测试药剂的所有剂量都耐受良好，小鼠显示体重正常。未达到MTD(图11)。下表21总结了药效结果。
表21.按“Sleijfer”方案(给药5天/停药2天/给药5天)鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型给予

RL-2、

以及IL-2突变蛋白E95D和Y107R的效果 ANOVA/Student-Newmans-Keul检验 在重复研究中，采用“Sleijfer”剂量方案(给药5天/停药2天/给药5天)评价了


Y107R以及F42E在B16F10黑色素瘤肺转移模型中的效果。与运载体治疗或未治疗的小鼠相比，5.7mg/kg和10.5mg/kg的Y107R、F42E、L2-7001以及5.7mg/kg的

显示了可显著降低肺转移数(p<0.05ANOVA/Student-Newmans-Keul检验)(图12和13)。

F42E和Y107R的最小有效剂量为5.7mg/kg，计算出的ED50分别为F42E 6.47mg/kg、Y107R 6.33mg/kg、L2-70015.37mg/kg。类似剂量的测试药剂(


F42E和Y107R)之间效果没有差别，说明IL-2突变蛋白具有与基准(

和

)相同的活性。剂量为5.7mg/kg的

和10.5mg/kg的

显示小鼠体重减轻，并分别鉴定为各药剂的MTD剂量(图13)。对所有测试剂量的突变蛋白Y107R和F42E都未观察到体重减轻(即未达到IL-2突变蛋白的MTD)，说明这些突变蛋白比IL-2基准能被更好地耐受(图13)。表22总结了药效结果。
表22.在重复研究中按“Sleijfer”方案(给药5天/停药2天/给药5天)鼠B16F10黑色素瘤肺转移模型给予Proleukin、RL-2、

以及IL-2突变蛋白E95D和Y107R的效果 ANOVA/Student-Newmans-Keul检验 结论 1.IL-2突变蛋白E95D、Y107R和F42E在体内保留抗肿瘤活性。
2.当每周给予三次或按“Sleijfer”方案给药时，IL-2突变蛋白E95D、Y107R和F42E在经典的B16黑色素瘤转移模型中的效果与类似剂量的基准(

或

相当。
3.与IL-2基准

或

相比，IL-2突变蛋白Y107R和F42E能被更好耐受、保留了IL-2活性、显示了较高治疗指数。
4.用IL-2突变蛋白Y107R和F42E能获得较高的最大耐受剂量(MTD)，且在临床方案中允许采用较高的剂量强度，因此具有提高的药效。
实施例12突变蛋白在非何杰金淋巴瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性 实验设计 这些研究的目的是评价

(IL-2)、

E95D和Y107R作为单一药剂或与单克隆抗体利妥昔单抗(

IDEC-C2B8；IDEC Pharmaceuticals Corp.，San Diego，California)联用在NK(或免疫效应细胞)/ADCC-介导的效力模型中的活性(图14-20)。在两种不同的非何杰金淋巴瘤(NHL)模型，即对IL-2敏感的Namalwa(高等级NHL)模型和对IL-2显示边缘活性(marginal activity)但对利妥昔单抗有反应的Daudi模型(低等级NHL，CD20+)中评价IL-2突变蛋白的效果。
结果 接种Namalwa或Daudi细胞之前使无胸腺BALB/c裸鼠适应1周。在经过经照射的幼龄裸鼠(3戈瑞，约3.2分钟)右腹皮下植入Namalwa或Daudi细胞(5×106细胞/小鼠)和0.1mL50％基质胶。当平均肿瘤体积达到100-200mm3时开始治疗。该日指定为研究的第1天。肿瘤体积和体重每周评价两次。记录临床观察。对肿瘤体积大于3000mm3的各小鼠或平均肿瘤体积大于2000mm3的一组小鼠实施安乐死。体重下降大于20％的小鼠也处死。根据肿瘤体积的测量、体重和临床观察确定终点。
在经照射的Balb/c裸鼠内的分期的侵入性人NHL模型(Namalwa)中评价每周三次给予


突变蛋白Y107R或E95D的效果(图14-16)。

单一药剂显示出良好的剂量反应效果，其计算出的ED50为2mg/kg(图16)。与仅用运载体治疗相比，1mg/kg、每周3次(p＝0.038)和3mg/kg、每周3次(p＝0.009)的

的活性显著不同。然而，用1mg/kg、每周3次

治疗和用1mg/kg、每周3次

治疗没有统计学差异(p>0.05)(图16？)。
IL-2突变蛋白Y107R和E95D在Namalwa肿瘤模型中显示了剂量反应效果(图15和16)。用1和3mg/kg E95D每周治疗三次与用运载体治疗显著不同(p<0.001)，而在该模型中Y107R的最小有效剂量略高(3mg/kg)。在Namalwa模型中，以1mg/kgY107R和E95D每周治疗三次与以1mg/kg基准

和

)每周治疗3次的活性相当(p>0.05)。突变蛋白测试到3mg/kg，未达到MTD。
在Balb/c裸鼠的CD20+低等级人NHL Daudi异种移植物中评价了每周3次给予


或IL-2突变蛋白Y107R与利妥昔单抗联合治疗的效果(图17-20)。这些试验的目的是评价体内活化效应细胞(NK、单核细胞、巨噬细胞、噬中性粒细胞)对于IL-2和治疗性抗体(利妥昔单抗)联合治疗效果的作用。用3mg/kg的


或Y107R单一药剂治疗对肿瘤生长的抑制在统计学上与运载体治疗没有差别(p>0.05，ANOVA，第26天)(图17)。然而，当根据肿瘤生长延迟(即肿瘤发展到1000mm3的天数)分析时，与运载体治疗相比观察到统计学差异(p<0.05，Lon Rank检验)。与单一药剂各自相比，采用

或

与利妥昔单抗联合治疗观察到显著增强了对肿瘤的疗效(p>0.05，ANOVA，第26天)(图18和19)。与Proleukin/L2-7001一样，在B-细胞淋巴瘤的Daudi人异种移植模型中，当与利妥昔单抗联合给予时，Y107R突变蛋白诱导了类似的对肿瘤疗效的增强。与

治疗相比，Y107R和利妥昔单抗的联合治疗导致持续反应数增加(5CR)及条件性存活改善(图18和19)。IL-2突变蛋白单一药剂以及与利妥昔单抗联合的所有剂量都被良好耐受(图20)。
结论 1.突变蛋白E95D和Y107R显著抑制侵入性B-细胞NHL(NHL的Namalwa模型)的肿瘤生长。
2.IL-2突变蛋白可能是对黑色素瘤、NHL等癌症亚类有效的一种药剂。
3.IL-2突变蛋白Y107R对低等级B细胞NHL Daudi模型具有边缘活性，但与利妥昔单抗联用时能够激活免疫效应细胞(即NK、单核细胞、巨噬细胞、噬中性粒细胞)从而有效介导ADCC 4.IL-2突变蛋白Y107R和利妥昔单抗联合治疗显示疗效好于单用IL-2或利妥昔单抗。
5.IL-2突变蛋白的活性可以与通过ADCC接到的效应或类似的免疫效应细胞机制起作用的其它抗体联合应用。
6.这些发现的含意可应用于作用机制与IL-2(或突变蛋白)相似的其它细胞因子分子，来介导效应细胞反应可能用于其它疗法或疾病适应证。
实施例13评价在IL-2诱导的血管渗漏综合征模型中的耐受性 实验设计 研究开始前使雌性C57BL/6小鼠适应1周。小鼠为8-10周龄，根据体重将它们随机分成5组。腹膜内(i.p.)注射6mg/kg(约2,000,000IU)


或者IL-2突变蛋白E95D或Y107R，每天三次。重复注射10剂。第4天在给予

剂量4小时后注射用0.1ml含1％小鼠血清的PBS配制的125I-白蛋白(1μCi，PerkinElmer Life Sciences Inc.Boston，MA)。注射125I-白蛋白60分钟后对小鼠实施安乐死。收集肺并将其置入γ计数小瓶中。
结果 采用高剂量IL-2或

(6mg/kg，i.p.，每天3次，10剂)治疗导致保留于小鼠肺中的125I-白蛋白有统计学增加，这是由于血管渗漏增加而模拟了类似于人的血管渗漏综合征(VLS)病理模型(图21)。在此试验性VLS“急性”模型中，IL-2突变蛋白E95D和Y107R都引起了125I-白蛋白保留增加；然而，Y107R显示VLS诱导程度比

治疗降低了16％(图21)。
实施例14用温度芯片监测体温变化评价IL-2突变蛋白的耐受性 介绍 尽管IL-2诱导的毒性和VLS的确切机制还不清楚，但积累的数据提示，IL-2诱导的天然杀伤细胞(NK)引发了剂量限制性毒性，这是过度产生IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1β和IL-6等促炎症细胞因子的结果，这些细胞因子能活化单核细胞/巨噬细胞和诱导产生一氧化氮(NO)从而导致随后对内皮细胞的损伤(Dubinett等，1994，CellImmunol.157(1)170-180；和Samlowski等，1995，J.Immunother.Emphasis TumorImmunol.18(3)166-78)。
发热和寒冷是IL-2治疗期间常见的3级不良症状。发热是对TNF-α诱生前列腺素E2的生理反应，发热导致血管收缩和颤抖，随后导致中心温度发生实质性改变。IL-2在体外不直接诱导前列腺素E2合成；因此IL-2本身归类为一种非热原性细胞因子。然而，IL-2在外源给药后可诱导释放热原性细胞因子，尤其是TNF-α，这是发热和IL-2治疗期间急性反应其它方面的主要原因(Mier等，1988，J.Clin.Immunol.8426)。已报道用IL-2治疗的患者的TNF-α血浆水平可超过600ng/ml(Gemlo等(1988)Cancer Res.48(20)5864-5867)。
人类的剂量限制性毒性(例如，发热/寒冷、VLS和低血压)都与产生促炎症细胞因子和NO有关。因此，促炎症细胞因子如TNF-α的产生与诱导生理体温变化之间有直接关系，可监测温度变化作为IL-2免疫治疗耐受性的预报。
为建立不良症状的模型，重要的是要将温度变化与促炎症细胞因子产生之间的关系由人外推到小鼠。在这两种物种中，促炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β等)的产生是诱生下丘脑前列腺素E2所介导的体温变化的原因。通常使用的试验动物如小鼠当急性接触多种药物时会出现体温过低和代谢减退。推测这是一种为降低毒性攻击致死性而固有的保护性反应(Gordon和Yange(1997)Ann.N.Y.Acad.Sci.813835)。
尽管可以预测IL-2给药后小鼠模型的中心体温将升高，但实际上观察到该模型的中心体温降低。本领域已知炎症的外源性介质如LPS诱导TNF-α并使小鼠模型的中心体温暂时降低(Kozak等(1997)Ann.NY Acad.Sci.813835)。在另一种模型中，体温过低的预测评价被证明是SEB肠休克小鼠类模型死亡率的有效指示(Vlach等(2000)Comp.Med.50160)。
实验设计 在C57BL/6小鼠皮下植入温度芯片，用POCKET SCANNER系统(BioMedic DataSystems，Inc.Seaford，DE)来监测体温变化。


或者IL-2突变蛋白E95D、Y107R、L94Y或F42E采用“Slefer”剂量方案(给药5天/停药2天/给药5天)皮下给药。在IL-2给药前后的给定时间点监测小鼠体温，并与注射缓冲液对照(载体)的小鼠进行比较。根据中心体温、临床观察、体重和血浆促炎症细胞因子(例如TNF-α)水平确定终点。
结果

或

给药后(5.7mg/kg或8.1mg/kg，每天皮下注射给药，持续5天)，第4和5天给药后4小时观察到温度显著降低。尽管温度降低(不是人类中观察到的升高)，但此作用可重现，且在运载体治疗动物中未观察到此作用。图22显示了延长时间，包括10种剂量为期2周到给药后9小时的温度监测。最一致的显著变化发生在第5天给药后4小时。此外，此小鼠模型中IL-2诱导的温度变化与血浆TNF-α水平显著相关。该模型可重现，表23总结了对IL-2治疗反应中体温显著降低的结果。
表23.给药后4小时体温变化小结。
第1周
第2周
1数值表示为平均体温(℉)+/-SD，统计学检验(ANOVA+Studen-Newman-Keuls)，p>0.05表示不显著 *以10.5mpk剂量给药2周小组的动物 2用于研究的BALB/c小鼠 3研究荷瘤动物，以5.7mpk剂量所有小组的药效研究 4由于严重低温1只小鼠在最后一次注射后30分钟死亡 5NS＝不显著(P>0.05) 注意，

制剂在该小鼠模型中被较好耐受，这是因为体温显著下降与剂量等于或大于8.1mg/kg时观察到的结果一致，此模型中

的最大耐受剂量为5.7mg/kg。这些观察结果与给药时间延长(通常为每轮给药2周)的其它荷瘤动物临床前模型一致。
两种IL-2突变蛋白Y107R和F42E显示出体温变化减少与诱生的TNF-α降低显著相关，预测其耐受性优于

和

见图23-25。
本领域技术人员将记住上述的本发明的许多修改和其它实施方式，这些发明具有以上所述和附图所提出优点。因此应理解本发明不限于上述的具体实施方式
，各种修改和其它实施方式也包括在本文所述实施方式的范围内。虽然本申请采用了一些专门术语，但它们只按通用的含义使用，而不是限制本发明的范围。
序列表
<110>L.奥克曼(Lea Aukerman)
K.德尼斯—米泽(Kimberly Denis-Mize)
C.海斯(Car la Heise)
B.杰拉(Bahi ja Jal lal)
D.门尼泽斯(Daniel Menezes)
S.E.威尔森(Susan T.Wilson)
<120>改进的白介素-2突变蛋白
<130>PP020354.0003
<140>60/550,868
<141>2004-03-05
<140>60/585,980
<141>2004-07-07
<140>60/646,095
<141>2005-01-21
<160>346
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
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<220>
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
<220>
<223>T123S，C125S人IL-2突变蛋白
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<213>人工序列
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<223>Q126I，C125S人IL-2突变蛋白
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Q126I，C125S人IL-2突变蛋白
<400>342
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<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Q126V，C125S人IL-2突变蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>343
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<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Q126V，C125S人IL-2突变蛋白
<400>344
<210>345
<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C61R，C125S人IL-2突变蛋白，具有为大肠杆菌表达最优化的E61R密码子
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>345
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<211>399
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Y107R，C125S人IL-2突变蛋白，具有为大肠杆菌表达最优化的Y107R密码子
<221>CDS
<222>(1)...(399)
<400>34权利要求
1.一种分离的核酸分子，其特征在于，该核酸分子含有选自以下的核苷酸序列
a)编码人IL-2突变蛋白的核苷酸序列，所述突变蛋白含有选自SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342和344的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343所示的核苷酸序列；
c)编码人IL-2突变蛋白的核苷酸序列，所述突变蛋白选自包含SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168，170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示序列的残基2-133的氨基酸序列；
d)含有SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343所示序列核苷酸4-399的核苷酸序列；
e)a)、b)、c)或d)中任一项所述的核苷酸序列，其中所述序列包含SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343的核苷酸373-375被编码丙氨酸的三联密码子取代；
f)a)、b)、c)或d)中任一项所述的核苷酸序列，其中所述序列包含SEQ ID NO9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、375、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341或343的核苷酸373-375被编码半胱氨酸的三联密码子取代；和
g)a)、b)、c)、d)、e)或f)中任一项所述的核苷酸序列，其中一个或多个编码所述突变蛋白的密码子在感兴趣宿主细胞中的表达已被优化。
2.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，g)所述的核苷酸序列选自SEQ ID NO345的序列、SEQ ID NO345的核苷酸4-399、SEQ ID NO346的序列、和SEQ ID NO346的核苷酸4-399。
3.一种含有如权利要求1所述核酸分子的表达载体。
4.一种含有如权利要求1所述核酸分子的宿主细胞。
5.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽含有选自以下的氨基酸序列
a)SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的残基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位丝氨酸残基的丙氨酸残基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位丝氨酸残基的半胱氨酸残基。
6.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽含有人IL-2突变蛋白，其中所述突变蛋白含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，在SEQ ID NO4的125位丝氨酸取代了半胱氨酸，和在SEQ ID NO4中至少有一处其它的氨基酸取代，其中所述突变蛋白在相等试验条件下，与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，1)能保持或增强自然杀伤(NK)细胞的增殖；2)能导致NK细胞产生促炎症细胞因子的水平降低，其中所述NK细胞的增殖和所述NK细胞产生促炎症细胞因子用NK-92生物试验检测。
7.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白还含有SEQ IDNO4的1位丙氨酸缺失。
8.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，所述其它的取代选自T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、I24L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V。
9.如权利要求8所述的分离的多肽，其特征在于，所述取代是H16D、L19D、L19E、L36D、L36P、L40D、L40G、F42E、F42R、E61R、P65Y、L72N、L80K、R81K、N88D、V91D、V91N、L94Y、E95D、E95G、Y107H或Y107R。
10.如权利要求8所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白还含有SEQ IDNO4的1位的丙氨酸缺失。
11.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，所述促炎症细胞因子是TNF-α。
12.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，在相等试验条件下，与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的相比，所述突变蛋白提供了保持或增强的人NK细胞介导的自然杀伤细胞毒、淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞毒、或ADCC介导的细胞毒性，其中所述NK细胞介导的细胞毒用NK3.3细胞毒生物试验检测。
13.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，在相等试验条件下，与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的相比，所述突变蛋白能提供维持的或改进的NK3.3细胞系磷酸化AKT的诱导。
14.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，在相等试验条件下，所述突变蛋白诱导的NK细胞增殖比类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的高150％。
15.如权利要求14所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白诱导的NK细胞增殖比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的高170％。
16.如权利要求15所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白诱导的NK细胞增殖为脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的约200％至约210％。
17.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，在相等试验条件下，所述突变蛋白诱导的NK细胞增殖比类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的至少高10％。
18.如权利要求17所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白诱导的NK细胞增殖比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的至少高15％。
19.如权利要求18所述的分离的多肽，其特征在于，在相等试验条件下，所述突变蛋白诱导产生的促炎症细胞因子低于类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的100％。
20.如权利要求19所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白诱导的促炎症细胞因子的产生低于脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2诱导的70％。
21.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽含有人IL-2突变蛋白，其中所述突变蛋白含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，在SEQ ID NO4的125位丝氨酸取代了半胱氨酸，和在SEQ ID NO4中至少有一处其它的氨基酸取代，其中在相等试验条件下，所述突变蛋白的IL-2诱导的NK细胞增殖与IL-2诱导的TNF-α产生的比率，比类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少高1.5倍，其中用NK-92生物试验检测0.1nM突变蛋白的NK细胞增殖和1.0nM突变蛋白的TNF-α产生。
22.如权利要求21所述的分离的多肽，其特征在于，所述比率比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少高2.5倍。
23.如权利要求21所述的分离的多肽，其特征在于，所述比率比脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的至少高3.0倍。
24.如权利要求21所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白还含有SEQ IDNO4的1位的丙氨酸缺失。
25.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽含有人IL-2突变蛋白的氨基酸序列，其中所述突变蛋白含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，在SEQ ID NO4的125位丝氨酸取代了半胱氨酸，和SEQ ID NO4中选自16、36、40、42、61、65、67、72、91、94、95和107位置至少一处的其它氨基酸取代。
26.如权利要求25所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白还含有SEQ IDNO4的1位的丙氨酸缺失。
27.一种制造人白介素-2(IL-2)突变蛋白的方法，在相似的试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的参比人IL-2突变蛋白相比，该突变蛋白能保持或增强NK细胞增殖也能诱导NK细胞产生较低水平促炎症细胞因子，其中，采用NK-92生物试验检测所述NK细胞的增殖和促炎症细胞因子产生，所述方法包括
a)用含有权利要求1所述核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
b)在允许所述核酸分子表达成多肽的条件下在细胞培养基中培养所述宿主细胞；和
c)分离所述多肽。
28.一种制造人白介素-2(IL-2)突变蛋白的方法，在相似的试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的参比人IL-2突变蛋白相比，该突变蛋白能保持或增强NK细胞增殖也能诱导NK细胞产生较低水平促炎症细胞因子，其中，采用NK-92生物试验检测所述NK细胞的增殖和促炎症细胞因子产生，所述方法包括
a)用含有编码权利要求25所述多肽的核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
b)在允许所述核酸分子表达成多肽的条件下在细胞培养基中培养所述宿主细胞；和
c)分离所述多肽。
29.一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求2所述人IL-2突变蛋白和药学上可接受的运载体。
30.一种刺激哺乳动物免疫系统的方法，其特征在于，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的人IL-2突变蛋白，其中，在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的参比IL-2分子相比，所述突变蛋白能诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子，和保持或增强NK细胞的增殖，其中用NK-92生物试验检测NK细胞增殖和所述促炎症细胞因子的产生。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述人IL-2突变蛋白含有选自以下的氨基酸序列
a)SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的残基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位丝氨酸残基的丙氨酸残基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位丝氨酸残基的半胱氨酸残基。
33.一种治疗哺乳动物癌症的方法，其特征在于，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的人IL-2突变蛋白，其中在相似的试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的参比IL-2分子相比，所述突变蛋白能诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子，和保持或增强NK细胞的增殖，其中用NK-92生物试验检测NK细胞增殖和所述促炎症细胞因子的产生。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述人IL-2突变蛋白含有选自以下的氨基酸序列
a)SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的残基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位丝氨酸残基的丙氨酸残基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位丝氨酸残基的半胱氨酸残基。
36.一种减轻经过IL-2给药治疗方案的对象中白介素-2(IL-2)诱导的毒性症状的方法，其特征在于，该方法包括给予IL-2突变蛋白作为所述IL-2，其中所述IL-2突变蛋白含有选自以下的氨基酸序列
a)SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的残基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位丝氨酸残基的丙氨酸残基；和
d)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位丝氨酸残基的半胱氨酸残基。
37.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白的最大耐受剂量高于脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2观察到的，其中所述最大耐受剂量用B16F10黑色素瘤动物模型测定。
38.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，在相等治疗条件下，与用脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2治疗相比，所述突变蛋白显示了相同或改进的抗肿瘤活性和降低的副作用，其中所述抗肿瘤活性用B16F10黑色素瘤动物模型评价。
39.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，在相等治疗条件下，与用脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2治疗相比，所述突变蛋白显示了相同或改进的抗肿瘤活性和降低的副作用，其中所述抗肿瘤活性用高等级非何杰金淋巴瘤Namalwa动物模型或低等级非何杰金淋巴瘤Daudi动物模型评价。
40.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，在相等治疗条件下，与用脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2治疗相比，当所述突变蛋白与利妥昔单抗共同给予时显示了相同或改进的抗肿瘤活性和降低的副作用，其中所述抗肿瘤活性用高等级非何杰金淋巴瘤Namalwa动物模型或低等级非何杰金淋巴瘤Daudi动物模型评价。
41.如权利要求39或40所述的分离的多肽，其特征在于，与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，所述突变蛋白显示了增强的免疫效应细胞激活作用。
42.如权利要求41所述的分离的多肽，其特征在于，所述突变蛋白显示了增强的免疫效应细胞的细胞激活作用，所述细胞选自T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和噬中性粒细胞。
43.如权利要求40所述的分离的多肽，其特征在于，与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，所述突变蛋白显示了增强的抗体依赖的细胞毒(ADCC)-介导的溶细胞杀伤效力。
44.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，所述突变蛋白在血管渗漏综合征动物模型中引起的血管渗漏较少。
45.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，与类似量的脱丙氨酰-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，所述突变蛋白在动物模型中引起的体温变化较少，其中所述动物的体温用温度芯片监测。
46.如权利要求6所述的分离的多肽，其特征在于，如用体内温度芯片测量体温、测量血管渗漏或测量所述对象的最大耐受剂量所确定的那样，所述突变蛋白当给予对象时具有改进的耐受性。
47.人IL-2突变蛋白在刺激哺乳动物免疫系统方法中的应用，其特征在于，该应用包括给予所述哺乳动物治疗有效量的人IL-2突变蛋白，其中在相等试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的参比IL-2分子相比，所述突变蛋白能诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子，和保持或增强NK细胞的增殖，其中用NK-92生物试验检测NK细胞增殖和所述促炎症细胞因子的产生。
48.人IL-2突变蛋白在治疗哺乳动物癌症方法中的应用，其特征在于，该应用包括给予所述哺乳动物治疗有效量的人IL-2突变蛋白，其中在相似的试验条件下，与类似量的选自脱丙氨酰-1，C125S人IL-2和C125S人IL-2的参比IL-2分子相比，所述突变蛋白能诱导NK细胞产生较低水平的促炎症细胞因子，和保持或增强NK细胞的增殖，其中用NK-92生物试验检测NK细胞增殖和所述促炎症细胞因子的产生。
49.人IL-2突变蛋白在降低经过IL-2给药治疗方案的对象中白介素-2(IL-2)诱导的毒性症状方法中的应用，其特征在于，该方法包括给予所述IL-2突变蛋白作为所述IL-2，其中所述突变蛋白含有选自以下的氨基酸序列
a)SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344所示的氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344的残基2-133的氨基酸序列；
c)a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位丝氨酸残基的丙氨酸残基；和
d)有a)或b)所述的氨基酸序列，其中所述序列包含取代10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342或344第125位丝氨酸残基的半胱氨酸残基。
全文摘要
本发明提供了新型人白介素-2(IL-2)突变蛋白或其变体、其核酸分子和变体。也公开了制备这些突变蛋白的方法和刺激动物免疫系统的方法。此外，本发明提供含有本发明核酸分子的重组表达载体和已导入了该表达载体的宿主细胞。包括含有治疗有效量的本发明人IL-2突变蛋白和药学上可接受运载体的药物组合物。与天然的IL-2或ProleukinIL-2相比，该IL-2突变蛋白制品毒性较低，同时保持或提高了NK细胞介导的作用，可用于制备治疗癌症和刺激免疫系统的药物组合物。
文档编号A61P37/04GK101426916SQ200580014421
公开日2009年5月6日 申请日期2005年3月4日 优先权日2004年3月5日
发明者K·德尼斯-米泽, C·海斯, D·门尼泽斯, S·E·威尔森 申请人:诺华疫苗和诊断公司