生物学上稳定的银纳米颗粒的抗微生物活性的制作方法

专利名称：生物学上稳定的银纳米颗粒的抗微生物活性的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗微生物制剂。
根据本发明涉及含有银的抗微生物制剂。
背景技术：
银作为抗微生物剂的用途长久以来为人类所知。几千年来，银被全世界的文明社会用作愈合和抗微生物剂。其医学、防腐和恢复能力可以追溯至古希腊和罗马帝国。在现代药物学发展之前的很长时间里，银被用作杀菌剂和抗生素●希腊人使用银容器来使水和其它液体保鲜。著作《Herodotus》(希腊的哲学家和历史学家)表明银的使用先于基督诞生。
●罗马帝国将酒储存在银缸中来防止腐败。
●在古印度和古埃及的著作中提到了银的用途。
●在中世纪，银器用来保护贵族免受瘟疫的全部侵袭。
●现代杀菌剂和抗生素诞生之前，人们就已知致病的病原体在银存在时不能存活。因此，银被用于餐具、饮用容器和进食器皿中。
●具体而言，贵族们使用银容器存储和食用他们的食物来防止细菌生长。
●中国的皇帝和他们的大臣使用银质筷子进食。
●Druids留有他们使用银的证据。
●澳大利亚内地的移民在他们的水缸中悬浮银器来防止腐败。
●长途跋涉穿越美国西部的先驱者发现，如果他们将银币或者铜币放在他们的饮水桶中，那么它会保持水不长细菌、藻类等。
●都沿着该边沿，人们将银质美元放在牛奶中来使其保持新鲜。
●第一次世界大战期间，军队保持用银叶来抵抗伤口感染。
●在引入抗生素之前，胶体银在医院中广泛使用，并且其作为杀细菌剂至少已经知道1200年。
●19世纪早期，医生在外科创伤中使用银质缝线取得了非常成功的结果。
●在Ayurvedic医学中，使用少量的银作为由于年龄或疾病而虚弱的病人的补剂、酏剂或恢复剂。
直到19世纪后期，东方的科学家才再次发现数千年来已知的银是非常强大的病菌抵抗剂。随后，才研发出药用的银化合物，从而使银成为常用的药物。到20世纪早期，银作为抗细菌物质的用途变得普遍起来。到1940年，市场上大约有48种不同的银化合物用来治疗各种已知的传染病。它们有口服、注射和局部形式。但是，这些药用银制剂、尤其是某些蛋白质结合类型的银化合物以及不适当制备和不稳定的组合物导致称为银质沉着病的皮肤褪色。
新的身体化学知识导致胶体消毒剂和药物的大量应用，并导致对银胶体的能力和可能性进行持续研究。然而，银的“新发现”的优良抗感染剂的名誉只存在了很短的时间。
20世纪30年代期间，合成制备的药物开始出现，并获得利润，加上制备简单，这种新的治疗来源成为市场上的强大力量。人们对新“特效药”很兴奋，并且那时未出现致病生物的抗抗生素株系。银很快让位于抗生素。
一些银制剂在主流药物中的用途保存下来。它们中包括在新生婴儿的眼睛中使用稀释的硝酸银来防止感染，以及在烧伤病房中使用银基药膏“Silvadine”来消除感染。其它未失宠的用途如下●使用银质水纯化滤器和片剂来防止藻类和细菌生长。
●使用用银离子或铜离子浸渗水的电离单元来消毒蓄水，没有氯气的刺激效果。
●在宇宙飞船上用银来消毒循环水。
●瑞士人在家里和办公室里使用银质滤器。
●自治区使用银来处理污水。
●银是抵抗空气传播的毒素以及其它工业毒物的常用试剂。
但是大部分时候，由于药物抗生素的发现，银作为抗微生物试剂的兴趣几乎下降至消失的程度。
作为Margraf博士著名的工作结果，银作为抗生素治疗的佐剂再次出现，Margraf博士发现，使用5％的硝酸银稀释溶液杀死侵入的烧伤细菌并允许伤口愈合。更重要地，没有抗性菌株出现。在20世纪60年代，Moyer广泛地使用硝酸银来治疗烧伤患者。然而，硝酸银还很不理想。最终，由于许多并发症例如Ag+与体液中的Cl-、HCO3-以及蛋白质阴离子的中和作用(因此降低其杀微生物活性)以及产生容貌异常，即由于银盐在皮肤中沉淀致使蓝灰着色而导致的银质沉着病，其未被认为是理想的抗微生物剂。
研发出目前在70％的烧伤中心中使用的磺胺嘧啶银(Silvadene，Marion Laboratories)。哥伦比亚大学的Charles Fox博士发现，磺胺嘧啶也已经成功用于治疗霍乱、疟疾和梅毒。它也能阻止造成感冒疮、带状疱疹以及更严重疾病的疱疹病毒。
由于研究表明的胶体银在抵抗微生物中的优良表现，其吸引了全世界一流科学家和医学研究者的注意。它的益处激起了新的兴趣，目前50名杰出医生正在研究胶体银在人类健康中的功效以及应用。
根据专家结论，当直接暴露于胶体银时，尚没有检测到微生物能够存活6分钟以上。
Science Digest将胶体银引证为“......现代药物的奇迹”，并进一步陈述为“抗生素杀死6种不同的致病微生物，但银杀死大约650种。不能产生抗性菌株。而且，银几乎无毒性。作为抗微生物试剂使用，胶体银不会像抗生素一样创造超级菌。”giant Searle Pharmaceuticals)(现在的Monsanto)的创始人Alfred Searle说道“向人类受试者应用胶体银已经在大量病例中进行，得到令人惊讶的成功结果。对于体内施用，它具有快速致死病原体但对宿主无毒性的优点。它非常稳定。”更多的信息表明，胶体银不与其它药疗法或局部治疗产生有害的相互作用。在用胶体银进行实验室检测时，细菌、病毒和真菌生物体在接触数分钟之内被杀死。1988年11月1日，健康科学中心(Centre For The Health Science)UCLA医学院(UCLA School of Medicine)Department of Obstetrics and Genecology的M.D.Larry C.Ford报导“我用标准的杀菌剂抗微生物测试检测了它们(银溶液)。对于酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria Gonorrhea)、阴道加德纳氏菌(Gardnerella Vaginalis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)和其它肠道病原体，银溶液抗菌浓度为每毫升105个生物，并且对白假丝酵母(Candida Albicans)、Candida Globata和糠秕马拉色菌(M.Furfur)是杀真菌的”。
由于许多生物演化出抵抗现代抗生素的菌株，所以Rober Becker博士的发现尤其重要。锡拉丘兹大学(Syracuse University)的Becker说道“我们检测的所有微生物都对用电产生的银离子敏感，包括一些抵抗所有已知抗生素的微生物。任何情况下，银治疗都不会有不希望的副作用。”由于胶体银不像抗生素仅对细菌特异，它失活厌氧细菌、病毒、酵母和真菌必需的某些酶从而破坏这些酶，所以胶体银的潜力非常显著。由于银攻击细菌的食物来源而非直接攻击它们，所以进一步表明这些细菌不能像对抗生素一样发展出对银的抗性。
然而，现在已经认识到，硝酸银和磺胺嘧啶银都损害成纤维细胞和上皮细胞增殖，最终阻止愈合过程。发现更好的含银药物的尝试仅取得了有限的成功。在过去几年中，出现了一些有趣的报道，其中描述了在烧伤治疗应用银涂布的薄膜。这些薄膜用蒸汽沉积技术制备，从而具有大约300nm的厚度。在一项这些研究中，据称薄膜包含化学封端的纳米结晶银，一般粒径为大约50nm。此类薄膜递送持续剂量的高浓度(5000-10000mg/l)银，这具有细胞毒性效应。当病人用局部含银制剂进行治疗时，会通过烧伤伤口发生银离子的显著吸收。当使用膏基包含高达3000μg Ag+/gm的银制剂时，肝中估计的银浓度为14mg/gm。Hidalgo等人研究了硝酸银对人类皮肤成纤维细胞的效应，并发现低浓度(8.2μM/l)的银离子显示出抑制效应。
因此，存在对作为有效的抗微生物剂使用但不具有任何细胞毒性效应并且不需要加入任何生物不相容物质的含银制剂的需求。
发明简述本发明的目的是提供包含生物学稳定化的银纳米颗粒的抗微生物制剂，其中所述银纳米颗粒通过“绿色”生物路线稳定，其在载体中具有1-100nm的平均大小和1-6ppm的浓度。
本发明的另一目的是提供包含生物学稳定化的银纳米颗粒的抗微生物制剂，其中所述银纳米颗粒(a)在非常低的有效浓度(由于它们非常大的表面积)呈现抗微生物活性，并且(b)在这些浓度下无细胞毒性。
发明详述根据本发明提供了抗微生物制剂，其包含(1)1-100nm大小范围的生物学稳定化的银纳米颗粒；和(2)载体，其中所述生物学稳定化的银纳米颗粒的浓度范围为1-6ppm。
一般而言，银纳米颗粒用浸软的植物组织细胞的水溶液进行生物学稳定。
根据本发明的一个实施方案，水溶液用去离子水中进行高达10倍的稀释。
一般而言，植物组织是选自一组植物组织的至少一种组织，所述一组植物组织包括下面植物的叶、根、茎、花和果实苜蓿(Alfa alfa)、阿拉伯金合欢(Acacia arabica)、芫荽(Coriandrum sativum)、East IndianRosebay(Ervatamia coronaria)、黄细心(Boerhavia diffusa)、具芒小檗(Berberris aristata)、金盏花(Calendula officinalis)、欧芹(Petroselinumsativum)、土牛膝(Achyranthes aspera)、耳叶番泻(Cassia auriculata)、熏衣草、红果榄仁树(Terminalia belerica)、茴香(Fenniculum vulgare)、问荆(Equisetum arvense)、复盆子(Rubus idaeus)、翠叶芦荟(Aloebarbadensis)、白毛茛(Hydrastis canadensis)、大蒜(Allium sativum)、紫松果菊属(Echinacea spp.)、小米草(Euphrasis offcinalis)、木桔(Aeglemarmelos)、土木香(Trachyspermum ammi)、德国甘菊(Matricariachamomilla)、丁香(Syzygium aromaticum)、姜(Zingiber officinale)、圣罗勒(Ocimum sanctum)、印度铁苋(Acalypha indica)、曼陀罗(Daturainnoxia)、薄荷(Mentha spp.)、萎叶(Piper betle，linn)、金盏花(Calendulaofficinalis LINN)、Chick weed(Trichobasis lychnidearum)、黄瓜(cucumissativus，Linn)、Acasia arabica、油橄榄(Olea europea L.)、野雏菊(Wilddaisy)、枯茗种子(Cuminum cyminum)、咖喱叶(Murraya koengi)、莳萝(Anethum graveolens)、磨盘草(Abutilon indicum)、楝树(Azadirachtaindica)、Madhua(Madhuca indica)、罗望子(Tamarinus indicus)、姜黄(Curcuma longa)、催眠睡茄(Withania sommnifera)、枣(Zizyphus jujuba)、西葫芦(Pumpkin)(Cucurbita pepo，Cucurbita maxima)、美洲椴(TiliaAmericana)、菖蒲(Acorus calamus)、苋(Amaranthus spinosa)、山生阿尼菊(Arnica Montana)、美洲接骨木(Sambucus Canadensis)、药水苏(Stachysofficinalis)、黑莓(Black berry)(Eugenia jambolana)、金盏花(Calendulaofficinalis LINN)、黄春菊(Matricaria chamomilla)、石松((Lycopodiumselago或clavatum)、蒲公英(Taraxacum officinalem)、Echinicea(Echinaceaangusifolia)、桉树(Eucalyptus globules)、白毛茛(Hydrastis Canadensis)、Fig wort、聚合草(Symphytum officinale)、连香报春花(Primula veris(L))、欧洲变豆菜(Sanicula europaea)、欧洲马鞭草(Verbena offcinalis)、Horseweed、石莲花(Sempervivum tectorum，Linn)、美洲落叶松(Larix laricina)、疗肺草(Pulmonaria angustifolia)、洋葱(Alium cepa)、番木瓜(Caricapapaya)、桃树(Prunus persica、三色堇(Viola tricolor(LINN)、珠光香青(Anaphalis margaritacea)。
载体是乳膏、凝胶剂、软膏剂、液体、混悬剂、气溶胶喷雾剂、纱布、纤维填料、膜、薄膜、带子、硬膏。
根据本发明的另一方面，提供了制备根据前述权利要求中任意一项的抗微生物制剂的方法，其包括步骤(1)用常规方法制备选自乳膏、凝胶剂、软膏剂、液体、混悬剂、气溶胶喷雾剂、纱布、纤维填料、膜、薄膜、带子、硬膏、结块的载体，(2)制备1到100nm大小范围的生物学稳定化的银纳米颗粒的水性分散液；(3)在所述载体中混合所述水性分散液的分配量，从而形成其中银纳米颗粒的浓度范围介于1到6ppm之间的均匀基质。
生物学稳定银纳米颗粒的水性分散液通过下列步骤制备(a)在具有低于3微西门子电导率的水中溶解银盐，从而获得其中银离子浓度在20,000到50,000ppm范围的溶液，(b)制备生物组织提取物新鲜过滤的水溶液；(c)用去离子水以1∶5到1∶50的比率稀释所述水溶液，从而形成具有+0.2至+0.2伏特之间的断路电位和5.5到7.5之间的pH以及至少7,500ppm的总的有机碳含量的溶液；(d)在20-30摄氏度之间的温度、持续搅拌下维持所述水溶液；(e)在持续搅拌下，在所述水提取溶液中接种微量的银盐溶液，从而使反应混合物中金属离子的终浓度在50到300ppm的范围内；(f)在充分照明的条件下继续搅拌30分钟至3小时，从而获得银纳米颗粒的胶体悬浮液；(g)通过已知方法例如离心从胶体悬浮液中分离纳米颗粒。
制备生物学稳定化的银纳米颗粒的过程可以如下例证使用带有预滤器、碳滤器和反渗透膜的Labconco，USA专业水处理系统采集水。经安装在仪器上的联机数字计测得所述水具有2.7微西门子的电导率。
将50枝整朵朱槿(Hibiscus rosasinensis Linn)(48.37gm湿重)用150ml去离子水在搅拌器(500rpm)中软化10分钟以获得均质粘性悬浮液。使该粘性悬浮液通过Whatman No1滤纸在真空下过滤以获得澄清的165ml粘性溶液。从中取10ml等分试样用水稀释至100ml。
取7ml等分试样在电化学分析仪(CH Instruments 600B，USA)上使用三电极系统在25℃检测断路电位。Ag/AgCl(aq)用作参考电极，玻态碳用作工作电极(直径3mm)，Pt金属丝(长4cm)用作对电极。测出值为+0.15伏特。同样的，使用数字pH计(control Dynamics，印度)检测自由流动溶液的pH为5.6。
使用Beckman TOC分析仪测量总的有机碳的浓度为22180ppm。
使用Borohydride还原法合成银纳米颗粒，方法如Jin.R、Cao.Y.W.、Kelly k.l.、Schatz G.C.、Zheng J.G.和Chad A.Mirkin(2001)Photoinducedconversion of silver nanospheres to nanoprisms.Science294；1901-1903所述。简言之，10ml花的水性提取液与100μl硝酸银母液(100mM)反应，继之加入100μl的硼氢化钠(500mM)使形成胶态悬浮液。
使用Diode Array分光光度计(Ocean Optics，USA)在200-800nm扫描胶态悬浮液样品。在410nm的峰被检出。该峰是银纳米颗粒的特征性等离子体振子峰(附1)，通常具有5-120nm的平均直径。
使用透射电镜(TEM)在200kV用装备有场发射枪，即CM200 FEG的Philips电子显微镜检查另一份胶态悬浮液。吸取2μl的胶体溶液至碳包被的铜网制备TEM标本并获得图像。在图像中所见平均大小为10-20nm(附2)。
使用带有E扫描头的Nanonics MultiView 1000 AFM(NanonicsImaging Ltd.，Jerusalem，以色列)对样品进行原子力显微镜扫描。用具有20nm半径和80kHz共振频率的探针以非接触模式扫描样品。使用QUARTZ软件，版本1.00(Cavendish Instruments Ltd.，UK)对AFM图像进行捕获、加工和分析。将5μl样品置于1cm2载玻片(厚度0.5mm)上并在成像前层流干燥。观察50-100nm直径和125nm高的均匀颗粒，样品的一部分的三维AFM视图如在附3a所示，图3b是二维视图，显示通常颗粒的大小分析。
抗微生物活性评估为了评估，如下制备制剂液体悬浮物在单独的容器中用去离子水稀释如上制备的银纳米颗粒，其中生物学稳定化的银纳米颗粒的浓度测定为在1.56-6ppm的范围。
膏基软膏剂用氧化锌(25gm)和甘油(25gm)混合液态石蜡(400ml)，获得均匀混合物。在设置为100℃的水浴中加热蜡(50gm)、特种蜡(50gm)和硬脂酸(11gm)，形成均匀的液体混合物。将液态石蜡混合物缓慢地倒入石蜡混合物中，并剧烈搅拌，以便获得均匀物质。缓慢地将生物学稳定化的银纳米颗粒(5mg)引入该物质并不断搅拌，获得包含均匀银纳米颗粒的软膏。
纱布条将如上制备的生物学稳定化的银纳米颗粒悬浮物或软膏剂浸渗在消毒的纱布条中。
生物学稳定化的银纳米颗粒的抗微生物潜力在下列方法和检测的基础上进行评估。
微生物。在研究中用到下列细菌菌株大肠杆菌ATCC117(Esherichiacoli ATCC 117)、铜绿假单胞杆菌ATCC 9027(Pseudomonas aeruginosaATCC 9027)、奥博尼沙门氏菌(Salmonella abony)NCTC 6017、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 23564(Salmonella typhimurium ATCC 23564)、产气克雷伯氏菌ATCC 1950(Klebsiella aerogenes ATCC 1950)、普通变形菌NCBI4157(Proteus vulgaris NCBI 4157)、金黄色葡萄球菌ATCC 6538P(Staphylococcus aureus ATCC 6538P)、枯草芽孢杆菌ATCC 6633(Bacillussubtilis ATCC 6633)和白色念珠菌(Candida albicans)[酵母]。
敏感性检测。根据National Committee for Clinical LaboratoryStandards，NCCLS的推荐，在含有200μl MH培养液的96孔微量滴定板上进行生物学稳定化的银纳米颗粒对上述菌株的最低抑制浓度(theminimum inhibitory concentration，MIC)实验。孔中银的浓度在1.56-25μg/ml的范围。用盐水稀释对数生长期细胞悬浮液，并将其接种至孔中，使接种物的终浓度为1×105CFU/ml。在37℃温育微量滴定板，并在24小时后通过肉眼对其生长/无生长打分。银抑制生长的最低浓度记录为最低抑制浓度(MIC)。从显示无可见生长的孔中取培养基点接种于MH琼脂平板上，并将平板温育24小时，从而测定杀菌的最低银浓度(MBC)。
结果如附图
的图4[表1]所示。结果显示，革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的MIC值介于1.56-3.12ppm生物学稳定化的银纳米颗粒的范围，而MBC值介于6.25-12.5ppm生物学稳定化的银纳米颗粒的范围。酵母的MIC值为12.5ppm，而MBC为50，这表明所选浓度对酵母没有显著作用。
中和剂对生物学稳定化的银纳米颗粒的影响。在存在血清白蛋白、氯化钠和巯基乙醇酸钠时在MHB中测定生物学稳定化的银纳米颗粒活性的中和作用。为了这个目的，按照Furr等人(1994)的建议在一组MHB中加入三种不同浓度的血清白蛋白(2％、5％、10％)和0.85％氯化钠，而在另一组中加入0.1％、0.5％和1％的巯基乙醇酸钠。如上所述测定MIC。
发现存在上述中和剂时MIC值保持不变。
时间-杀灭动力学。在加入适量生物学稳定化的银纳米颗粒(对应不同培养物MBC的浓度下)的2ml MH培养液中接种细菌培养物(最终的细胞密度为1×105CFU/ml)。在暴露于生物学稳定化的银纳米颗粒后的特定时间间隔(大约0、30、60、90和120分钟)取出0.1ml样品，连续稀释，并接种于MH琼脂平板上。将平板置37℃温育24小时后测定总的活菌数目(thetotal viable count，TVC)。所有实验一式四份地进行。通过CFU/ml的log10对时间绘图构建杀灭曲线。这些杀灭曲线如附图的图5所示。
对于所有检测的细菌培养物，在2小时短暂的暴露时间内总存活细胞数减少了90％。数据表明，生物学稳定化的银纳米颗粒有效地抑制革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，包括铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的多药物抗性菌株。
生物学稳定化的银纳米颗粒的后效应。使用分光光度法研究生物学稳定化的银纳米颗粒的后效应。简而言之，将所有细菌菌株(105CFU/ml)在37℃暴露于4×MBC的生物学稳定化的银纳米颗粒1小时。未暴露于生物学稳定化的银纳米颗粒的培养物在实验中作为对照。将悬浮物在3000×g离心10分钟，并用生理盐水洗涤沉淀物数次以除去痕量的银纳米颗粒。在时间0(Ninic)和除去生物学稳定化的银纳米颗粒后(Nnanaosilver)后进行菌落计数。然后在MHB中悬浮培养物沉淀，并通过660nm下O.D测量定期监视培养物的生长。所有培养物于37℃搅拌下进行温育，并在每小时之后测量O.D。生物学稳定化的银纳米颗粒的后效应计算为暴露和未暴露于生物学稳定化的银纳米颗粒的测试培养物的CFU达到一个对数刻度增加所需的时间的差异。
计算生物学稳定化的银纳米颗粒的后效应一旦测定了Ninic和Nnanaosilver，并且对照和通过分光光度法监视暴露的培养物的生长，那么进行下列步骤(i)在半对数纸上绘制对照和暴露后培养物的分光光度生长曲线，其y轴代表光密度(O.D)，而x轴代表时间，通常第一个有意义的O.D读数可以在对照培养物起始时间(tinic＝0)后4或5小时处获得。(ii)从分光光度的生长曲线测定世代时间(lg)。(iii)计算杀菌效应(r)r＝Ninic/Nnanosilver(iv)对照培养物和暴露后培养物的分光光度生长曲线时间分离(tsep)的图解测定。(v)根据下列公式计算生物学稳定化的银纳米颗粒的后效应生物学稳定化的银纳米颗粒后效应＝tsep-texpo-tglogr/log2其中tsep为对照培养物和暴露后培养物分光光度生长曲线的分离时间；texpo为等效于1小时持续时间的暴露时间，trecrt为经处理的培养物的生活力计数(Nanti)匹配最初计数(Ninic)所需的理论时间，r为杀菌效应，而tg为世代时间。附图的图6a和6b分别显示生物学稳定化的银纳米颗粒对革兰氏阴性细菌培养物和酵母的后效应。如生长曲线中的停滞期所示，发现生物学稳定化的银纳米颗粒的后效应为6-8小时。
药物与生物学稳定化的银纳米颗粒的相互作用。使用二维棋盘大量稀释技术来表征生物学稳定化的银纳米颗粒与药物(即庆大霉素、青霉素、头孢噻肟、Ceptazidime、卡那霉素、万古霉素)之间的相互作用。对上述铜绿假单胞杆菌MDR菌株进行6次实验。相似于进行易感性测试的接种物制备接种物。每种含生物学稳定化的银纳米颗粒的药物用连续两倍稀释法稀释，浓度为MIC的1/4以下至MIC的四倍以上。将与生物学稳定化的银纳米颗粒组合的药物抑制测试生物可见生长的最高稀释浓度认为是部分抑制浓度(the fractional inhibitory concentration，FIC)。用部分抑制浓度(FIC)指数(FICI)来定义两种药物间的相互作用。FICI为每种药物FIC的总和。FIC如下计算组合进行检测的药物的MIC/单独进行检测的药物的MIC。如果FICI为0.5，那么相互作用定义为协同的，如果FICI＞0.5至1.0，那么为加性的，如果FICI＞1.0至2.0，那么为中性的，如果FICI＞2.0，那么为拮抗性的。
这项工作过程期间获得的平均FICI值表明，生物学稳定化的银纳米颗粒的作用与头孢噻肟和头孢菌素是协同性的，而与ceptazidime部分协同，与庆大霉素、青霉素和氨苄青霉素为中性的。然而，与卡那霉素和万古霉素组合时可见到拮抗效应。
生物学稳定化的银纳米颗粒在纱布条上的抗微生物活性。纱布条(2cm×2cm)进行高压灭菌，并用100μl生物学稳定化的银纳米颗粒悬浮液或通过涂敷包含生物学稳定化的银纳米颗粒的软膏剂(对各自培养物都含有4×MIC浓度的生物学稳定化的银纳米颗粒)将其润湿，然后接种105个细胞。同时用生理盐水处理作为对照。纱布条置于无菌培养皿中，并将其保持在37℃潮湿的培养箱中。在0时并且以4小时的间隔检查培养物的生活力，持续24小时。为此，取出一块纱布条，放置在10ml盐水中，涡旋，并对悬浮液进行连续稀释，最后接种在营养琼脂平板上。37℃温育24小时后测定TVC。对处理和对照纱布条在每个反应时间进行6次平行实验。
对所有6次平行实验计算从每种类型的纱布条回收的生物的log10对数值(当检测到零个菌落时，假定为一个菌落)。结果如附图的图7A、7B和7C中相对于反应时间的平均Log值。
所得结果显示，测试生物的数量下降＞97％所需要的时间为8小时。
体外细胞毒性测试。人白血病细胞系K562、肝细胞癌细胞系HEPG2和小鼠成纤维细胞L929在补加了10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌的商品化制剂的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Sigma，美国)中进行常规培养。培养物维持在37℃、5％的CO2气氛中。
用XTT测定试剂盒(Roche Molecular Biochemicals，德国)检验四种制剂即用甘油(EC-Gly)稳定的电化学合成的银纳米颗粒、用聚乙烯吡咯烷酮(EC-PVP)稳定的电化学合成的银纳米颗粒、生物学稳定化的银纳米颗粒(Chem-Bio)和硝酸银(AgNO3)对以上3种细胞系的细胞增殖和生活力的比较效应。简而言之，在含有DMEM的微量滴定板(96孔)中接种，最初的细胞密度为每毫升1×105个细胞。让细胞在37℃、5％CO2中繁殖24小时。温育之后，小心移出上清液培养基，并加入添加了1.5-15μg/ml纳米银的DMEM。平板进一步在37℃、5％的CO2气氛中温育48小时。温育后，向每孔中加入50μl XTT试剂，平板在37℃、5％的CO2气氛中温育4小时。用ELISA读出器(μQuant，Biotech Instruments)在450nm定量由于形成甲 而产生的颜色。在690nm扫描平板，以便提供对细胞吸光度的校正。XTT测定法用不含银纳米颗粒的适当对照进行6次重复。
所得结果如附图的图8、9和10中的表所示。
可以清楚地看到，生物学稳定化的银纳米颗粒在1-6ppm浓度下对所有三种细胞系都没有毒性。也可以看到，化学稳定的银纳米颗粒和硝酸银甚至在3.12ppm的浓度时也是高度细胞毒性的。
因此，在根据本发明所做的实验中，发现生物学稳定化的银纳米颗粒在1-6ppm的浓度范围内具有广谱的抗微生物效应。而且，在这个浓度范围内，生物学稳定化的银纳米颗粒不显示出体外细胞毒性。
本文所述生物学稳定化的银纳米颗粒可以作为多种医疗装置的涂布材料用于烧伤治疗，其中所述医学装置为例如导管、心脏瓣膜、生物活性眼镜涂布的缝线(bioactive glasses coated sutures)和矫形装置。其非医学应用为应用于水和空气净化系统中。
根据本发明的生物学稳定化的银纳米颗粒可以用作多种细菌感染的杀菌剂和抗生素。
因此，用生物学稳定化的银纳米颗粒制备的制剂可以用于治疗炭疽、脚癣、疖、念珠菌性腹膜炎(Candida)、脑脊髓膜炎、结肠炎、膀胱炎、皮炎、白喉、双球菌(diplococcus)、大肠杆菌(E.Coli)、淋病、脓疱病、感染、肺炎球菌(Pneumococci)、癣、带状疱疹、葡萄球菌(Staphylococci)、结核病、疣、百日咳。
生物学稳定化的银纳米颗粒可以制成悬浮液/溶液，其中溶剂可以是能够应用于无菌制剂的纯化水、注射用水，和任何其它的非水共溶剂，例如聚乙二醇、醇、惰性液化气和卤碳相关化合物等等。
其它赋形剂可以包括表面活性剂、悬浮剂和粘性修饰剂、蜡、纤维素聚合物、聚羧乙烯以及任选防腐剂、缓冲剂、渗透调节剂或张力(tonicifying)调节剂、烃和低沸点溶剂。
制剂中的赋形剂可以包括聚山梨酯、聚羧乙烯、羟丙基甲基纤维素、petrolactum base、蜡、氯化钠、甘露醇、柠檬酸、磷酸、乙酸、苯甲醇、丁化羟基甲苯(butyratehydroxytoluene)(BHT)、丁基化羟基苯甲醚(butyrated hydroxyanisone)(BHA)、二元醇，例如甘油、聚乙二醇、丙二醇、山梨醇，惰性气体，例如氮、氢和其它气体，烃可以是乙醇、丁醇等、碳氟化合物。
制剂可以包含滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂、溶液剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂和其它烧伤或感染的敷料制剂。
那些在感染区域进行外部应用的制剂也可以包含其它协同活性成分，例如rubifacients，其可以至少是一种选自薄荷醇、水杨酸甲酯、亚麻子油、辣椒碱的物质。
这个含有低沸点溶剂或压缩的液化气或烃或任意两种的组合的溶液可以使用适当的机器置于增压系统中，其中所述药物喷射进入感染的区域进行即时作用。
软膏剂可以通过使用含所述活性赋形剂的生物学稳定化的银纳米颗粒的溶液/悬浮液制备，并且可以带有上述共溶剂。按照制剂的需要，使用适当浓度的粘度修饰剂，以便获得预期的粘度。
外用制剂也可以通过使用不合防腐剂的天然成分制备。制剂中细小的颗粒提供了更好的生物利用率和吸收率。
权利要求
1.无细胞毒性的抗微生物制剂，其包含a)1到100nm大小范围的生物学稳定化的银纳米颗粒；和b)载体，其中所述生物学稳定化的银纳米颗粒的浓度为1到6ppm。
2.如权利要求1所述的抗微生物制剂，其中所述银纳米颗粒用浸软的植物组织细胞的水溶液生物学稳定化。
3.如权利要求2所述的抗微生物制剂，其中所述水溶液用去离子水稀释十倍。
4.如权利要求2所述的抗微生物制剂，其中所述植物组织是选自一组植物组织的至少一种组织，所述一组植物组织包括下面植物的叶、根、茎、花和果实苜蓿(Alfa alfa)、阿拉伯金合欢(Acacia arabica)、芫荽(Coriandrum sativum)、East Indian Rosebay(Ervatamia coronaria)、黄细心(Boerhavia diffusa)、具芒小檗(Berberris aristata)、金盏花(Calendulaofficinalis)、欧芹(Petroselinum sativum)、土牛膝(Achyranthes aspera)、耳叶番泻(Cassia auriculata)、熏衣草、红果榄仁树(Terminalia belerica)、茴香(Fenniculum vulgare)、问荆(Equisetum arvense)、复盆子(Rubusidaeus)、翠叶芦荟(Aloe barbadensis)、白毛茛(Hydrastis canadensis)、大蒜(Allium sativum)、紫松果菊属(Echinacea spp.)、小米草(Euphrasisofficinalis)、木桔(Aegle marmelos)、土木香(Trachyspermum ammi)、德国甘菊(Matricaria chamomilla)、丁香(Syzygium aromaticum)、姜(Zingiberofficinale)、圣罗勒(Ocimum sanctum)、印度铁苋(Acalypha indica)、曼陀罗(Datura innoxia)、薄荷(Mentha spp.)、萎叶(Piper betle，linn)、金盏花(Calendula officinalis LINN)、Chick weed(Trichobasis lychnidearum)、黄瓜(cucumis sativus，Linn)、Acasia arabica、油橄榄(Olea europea L.)、野雏菊(Wild daisy)、枯茗种子(Cuminum cyminum)、咖喱叶(Murrayakoengi)、莳萝(Anethum graveolens)、磨盘草(Abutilon indicum)、楝树(Azadirachta indica)、Madhua(Madhuca indica)、罗望子(Tamarinusindicus)、姜黄(Curcuma longa)、催眠睡茄(Withania sommnifera)、枣(Zizyphus jujuba)、西葫芦(Pumpkin)(Cucurbita pepo，Cucurbita maxima)、美洲椴(Tilia Americana)、菖蒲(Acorus calamus)、苋(Amaranthusspinosa)、山生阿尼菊(Arnica Montana)、美洲接骨木(SambucusCanadensis)、药水苏(stachys officinalis)、黑莓(Black berry)(Eugeniajambolana)、金盏花(Calendula officinalis LINN)、黄春菊(Matricariachamomilla)、石松((Lycopodium selago或clavatum)、蒲公英(Taraxacumofficinalem)、Echinicea(Echinacea angusifolia)、桉树(Eucalyptusglobules)、白毛茛(Hydrastis Canadensis)、Fig wort、聚合草(Symphytumofficinale)、连香报春花(Primula veris(L))、欧洲变豆菜(Sanicula europaea)、欧洲马鞭草(Verbena officinalis)、Horse weed、石莲花(Sempervivumtectorum，Linn)、美洲落叶松(Larix laricina)、疗肺草(Pulmonariaangustifolia)、洋葱(Alium cepa)、番木瓜(Carica papaya)、桃树(Prunuspersica、三色堇(Viola tricolor(LINN)、珠光香青(Anaphalis margaritacea)。
5.如权利要求1或2所述的抗微生物制剂，其中所述载体为乳膏、凝胶剂、软膏剂、液体、混悬剂、气溶胶喷雾剂、纱布、纤维填料、膜、薄膜、带子、硬膏。
6.根据前面权利要求任意一项所述的抗微生物制剂的制备方法，其包括下列步骤a)以常规方式制备选自包括乳膏、凝胶剂、软膏剂、液体、混悬剂、气溶胶喷雾剂、纱布、纤维填料、膜、薄膜、带子、硬膏、结块的载体，b)制备1到100nm大小范围的生物学稳定化的银纳米颗粒的水性分散液；c)在所述载体中混合所述水性分散液的分配量，从而形成其中生物学稳定化的银纳米颗粒的浓度范围介于1到6ppm之间的均匀基质。
7.如权利要求6所述的抗微生物制剂的制备方法，其中所述生物学稳定化的银纳米颗粒的水性分散液通过如下步骤制备(a)在具有低于3微西门子电导率的水中溶解银盐，从而获得其中银离子浓度在20,000到50,000ppm范围的溶液，(b)制备生物组织提取物的新鲜过滤的水溶液；(c)用去离子水以1∶5到1∶50的比率稀释所述水溶液，从而形成具有+0.2至+0.2伏特之间的断路电位和5.5到7.5之间的pH以及至少7,500ppm的总的有机碳含量的溶液；(d)在20到30摄氏度之间的温度、持续搅拌下维持所述水溶液；(e)在持续搅拌下，在所述水提取溶液中接种微量的银盐溶液，从而使反应混合物中金属离子的终浓度在50到300ppm的范围内；(f)在充分照明的条件下继续搅拌30分钟至3小时，从而获得银纳米颗粒的胶体悬浮液；(g)通过已知方法例如离心从胶体悬浮液中分离纳米颗粒。
全文摘要
本发明公开了含有通过“绿色”生物学途径稳定化的生物学稳定化的银纳米颗粒的抗微生物制剂，载体中银纳米颗粒的平均直径为1－100nm，浓度为1到6ppm。
文档编号A61K36/00GK1953664SQ200580015104
公开日2007年4月25日 申请日期2005年5月12日 优先权日2004年5月12日
发明者基肖尔·马杜卡尔·帕克尼卡尔 申请人:基肖尔·马杜卡尔·帕克尼卡尔