专利名称：作为佐剂的脑膜炎奈瑟氏菌lgtB LOS的制作方法
技术领域：
本发明涉及能提高免疫调节活性的奈瑟氏菌脂寡糖(Lipo-Oligo-Saccharides，LOS)。本发明的奈瑟氏菌脂寡糖包括三糖外核，该三糖外核显示与树突细胞上的受体的结合能力提高。与毒性降低的类脂A部分结合的奈瑟氏菌脂寡糖的三糖外核可用作疫苗制剂中的佐剂。
背景技术：
由于脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)脂多糖(LPS)具有诱导LPS-特异的免疫反应，因此将其作为潜在的候选疫苗以及有效的佐剂已经受到关注。然而，到目前为止，LPS的内毒素活性限制了其在疫苗中的使用。
脑膜炎球菌(Meningococcal)LPS包括锚定在细菌外膜上的疏水性的类脂A部分和暴露于细菌表面的亲水性的寡糖核心(图1)。由于其结构与宿主糖脂(glycolipid)抗原相似，因此不建议在疫苗制剂中包含天然寡糖链。LPS寡糖生物合成途径的基因工程已经能生产一系列表达截短寡糖链的脑膜炎奈瑟氏菌突变体(图1)。LPS的内毒素性和佐剂特性似乎可以由该分子中的类脂A部分来确定。此前，我们已制备了一套独特的药理学特性得到极大改进的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)类脂A突变体。特别是，在类脂A的酰氧基的酰化作用中涉及的lpxL1(htrB1)基因的失活使一个类脂A突变体分离出来，该突变体表达的是5-酰化的类脂A而不是6-酰化的类脂A，其内毒素活性降低并保留佐剂活性。另外，由于脑膜炎球菌lpxA基因失活，因此分离出来完全缺失LPS的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)突变体。这样，对类脂A部分以及脑膜炎球菌LPS的寡糖部分进行修饰就为研发脑膜炎球菌疫苗开拓了新的可能性。
由于树突细胞(DC)在天然感染和对疫苗的应答中都具有起始免疫反应的作用，因此它已成为主要的研究目标。对细菌的免疫应答是由DC起始的，DC吞噬并将对细菌抗原进行加工以呈现给T细胞。最近我们的研究已表明脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)LPS在与人DC相互作用中发挥重要作用。并且，LPS是细菌内化(internalisation)和DC充分激活所必须的。
发明内容
定义在此将佐剂定义为包括任何物质或化合物，当与抗原结合使用免疫哺乳动物，优选人类时，所述的物质或化合物刺激免疫系统，从而激起，增强或促进对抗原的免疫应答，优选对佐剂本身不产生特异的免疫应答。在不含佐剂的相同条件下，与对给定的抗原所产生的免疫应答相比，优选的佐剂能以至少1.5，2，2.5，5，10或20的系数(factor)增强对该给定抗原的免疫应答。确定一组动物或一组人相对于相应的对照组由佐剂产生的对一给定的抗原的免疫应答的统计学平均增强程度的试验可以从现有技术中得到。佐剂优选能增强对至少两种不同的抗原的免疫应答。本发明的佐剂通常是哺乳动物的外源化合物，因此不包括对哺乳动物来说内源性的免疫刺激化合物，如，白细胞介素，干扰素和其他激素。
本发明的详细说明本发明基于意外发现具有一个特殊的三糖外核结构的奈瑟氏菌LPS，显示了与人的树突细胞(DC′s)结合能力和内化程度的提高。含有三糖的LPS或更确切的说含三糖的LOS(脂寡糖)的结合和内化是通过在人的DC上表达的C-型凝集素DC-SIGN介导的，并以增加的速率使该DC活化和成熟。该新型的奈瑟氏菌含三糖的LOS的免疫刺激活性的提高使得它可在免疫和疫苗中用作有效的佐剂。
因此，第一方面，本发明涉及用抗原免疫或对哺乳动物接种疫苗的方法，该方法包括抗原和奈瑟氏菌LOS的给药(给与哺乳动物)，并且奈瑟氏菌LOS用式(I)表示KDO·2·4GlcNAc·1·3Gal·1·4Glc·1·4Hep·1·5KDO-LA·1·3Hep·PEA(3或6)·1·2GlcNAc，其中LA是野生型类脂A部分，优选奈瑟氏菌属株，或更优选毒性降低的类脂A部分。
式(I)中，GlcNAc定义为D-葡萄糖胺；Gal定义为D-半乳糖；Glc定义为D-葡萄糖；Hep定义为D-庚糖；KDO定义为3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸；PEA定义为磷酸-乙醇胺；β1→4定义为第一和第四位置之间的β-糖苷键；β1→3定义为第一和第三位置之间的β-糖苷键；α1→5定义为第一和第五位置之间的α-糖苷键；α1→3定义为第一和第三位置之间的α-糖苷键；α1→2定义为第一和第二位置之间的α-糖苷键；α2→4定义为第二和第四位置之间的α-糖苷键；PEA(3或6)是指磷酸-乙醇胺可以连接到庚糖的第三或第六的任一位置或这两个位置上都没有连接磷酸-乙醇胺。
因此本发明涉及上述定义的奈瑟氏菌LOS在制备用于哺乳动物免疫或接种疫苗的药物中的应用。优选将本发明的奈瑟氏菌LOS用作佐剂。更优选的，将奈瑟氏菌LOS与抗原结合制备药物用于提高哺乳动物对抗原(或用抗原接种疫苗)的免疫反应。
在本发明的方法和用途中，所述的哺乳动物优选是人。所述的抗原优选是从如下进一步定义的细菌，病毒，真菌，寄生生物，癌细胞或过敏原中得到或由其产生的抗原。所述的抗原和奈瑟氏菌LOS优选用于治疗和/或预防由细菌，病毒，真菌，寄生生物，或由癌细胞引起的肿瘤，或由过敏原引起的过敏导致的感染疾病。
在本发明优选的实施例中，本发明的奈瑟氏菌LOS具有一个毒性降低的经修饰的类脂A部分(LA)。该经修饰的LA的毒性优选小于相应的野生型LA的毒性，更优选的经修饰的LA毒性小于90，80，60，40，20，10，5，2，1，0.5或0.2％的野生型LA的毒性。野生型和各种经修饰的毒性降低的LA的毒性可通过本领域中已知的任何适当的分析方法进行确定。确定毒性，即LA或本发明的奈瑟氏菌LOS的生物活性的优选的分析方法是在MM6巨噬细胞细胞系中诱导TNT-α的WEHI试验(Espevik andNiessen，1986，J.Immunol.Methods9599-105；Ziegler-Heitbrock等，1988，.Int.J.Cancer41456-461)。
另一方面，本发明的具有毒性降低的LA的奈瑟氏菌LOS仍然具有足够的免疫刺激活性，即佐剂活性。本发明的具有毒性降低的奈瑟氏菌LOS优选具有至少10，20，40，80，90或100％的相应的野生型LA奈瑟氏菌LOS的免疫刺激活性，其中所述的免疫刺激活性是通过测定至少一种细胞因子的产生或至少一种共刺激分子的表达确定的，这将在实例3中进行描述。
类脂A部分的毒性降低但同时保留(部分)佐剂活性的奈瑟氏菌LOS可以从如基因修饰的革兰氏阴性病原体中获取，如WO02/09746中所述。特别是，具有毒性降低的类脂A部分的优选奈瑟氏菌LOS包括(a)从奈瑟氏菌菌株中得到的含有类脂A部分的LOS，所述的奈瑟氏菌菌株携带导致一个或多个lpxL1和lpxL2基因(以前称为htrB和msbB)或其同源基因表达减少或失活的突变(请看如EP1 127 137；US5,997,881)；(b)通过酰氧水解酶(acyloxyhydrolase)或碱性水解法的处理从野生型的类脂A部分中脱去一个或多个二级O-连接的酯化了的脂肪酸而获得的含有类脂A部分的LOS(US5,103,661；Erwin等，1991，Infect.Immun.591881-87)；(c)通过对野生型类脂A部分进行联胺(hydrazine)处理获得的含有类脂A部分的LOS(Gu等，1996，Infect.Immun.644047-53；Polotsky等，1994，Infect.Immun.62210-14；Gu等，1998，Infect.Immun.661891-97，1998)；(d)通过碱性磷酸酶对类脂A部分进行脱磷酸化获得的含有类脂A部分的LOS(US 6,290,952)；以及，(e)通过对表达异源lpxE或pagL基因的奈瑟氏菌宿主中产生的LOS进行酶催化的脱磷酸化作用或脱酰化作用而获得的LOS。在此表达降低应当理解为当与相应的野生型菌株相比较时的增加或降低，其中表达水平优选与相应的野生型菌因数至少差2，5或10。
因此，具有毒性降低的优选的LA包括仅在还原性的葡萄糖胺上具有二级C12-酰基的LA，仅在非还原性的葡萄糖胺上具有二级C12-酰基的LA，两个二级C12-酰基基团都缺少的LA，1或4位上的任何一个位置缺少一个或多个磷酸基团以及前述的脱酰化或脱磷酸化的组合的LA。
在另一个方面，本发明涉及式(I)表示的奈瑟氏菌LOSKDO·2·4GlcNAc·1·3Gal·1·4Glc·1·4Hep·1·5KDO-LA·1·3Hep·PEA(3或6)·1·2GlcNAc，其中优选LA是如上定义的毒性降低的类脂A部分。
仍然在另一个方面，本发明涉及包括如上定义的奈瑟氏菌LOS和药物上可接受的载体的组合物。优选，该组合物进一步包括从细菌，病毒，真菌，寄生生物，癌细胞或过敏原中得到或产生的抗原。所述的药物组合物可进一步包括药学上可接受的稳定剂，渗透剂，缓冲剂，分散剂等。所述的药物组合物的优选形式取决于给药的模式和治疗应用。所述的药物载体可以是任何相容的，无毒性的且适于将活性成分如奈瑟氏菌LOS和抗原输送给患者的物质。用于鼻腔输送的药物可接受载体例子是水，缓冲的生理盐水溶液，甘油，聚山梨酯20，聚氧乙烯醚蓖麻油，以及辛酸/癸酸甘油酯的水混合物，并且可通过缓冲液得到中性pH环境。用于肠胃外输送的药物可接受载体的例子是无菌的缓冲的0.9％NaCl，或任选的补加了20％自蛋白的5％的葡萄糖。用于肠胃外给药的制剂应当是无菌的。活性成分的肠胃外给药途径可以根据已知的方法，如通过皮下，静脉，腹膜内，肌内，动脉内或病灶内途径注射或输液。本发明的组合物优选通过团注(bolusinjection)给药。用于肌内注射的典型的药物组合物可制成含有，例如，1-10ml的磷酸缓冲生理盐水和1-100ug，优选15-45ug的抗原和1-100ug，优选15-45ug的本发明的奈瑟氏菌LOS。对于口服给药，可将所述的活性成分施加到液体剂型中，如酏剂，浆液，和悬液。口服给药的液体剂型可含有色素和调味剂以提高患者的接受度。肠胃外，口服或鼻内给药的组合物的制备方法是本领域内熟知的并在各种文献中进行过详细的描述，包括，例如，Remington′Pharmaceutical Science(15thed.Mack Publishing，Easton，PA，1980)(在此通过参考将其全部合并)。
本发明的组合物中的抗原优选从细菌，病毒，真菌，寄生生物，癌细胞或过敏原中得到或产生的抗原。可与本发明的奈瑟氏菌LOS组合在一起的病毒抗原是从所有病毒中产生的，这类病毒的非限制实例是反转录病毒科，如人类免疫缺乏病毒(HIV)；风疹病毒；副粘液病毒科，如副流行性感冒病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，呼吸道合胞病毒，人类梅塔肺炎病毒(human metapneumovirus)；黄病毒科，如黄热病病毒，登革病毒，丙型肝炎病毒(HCV)，日本脑炎病毒(JEV)，森林脑炎病毒，圣路易脑炎或两尼罗河病毒；疱疹病毒科，如单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，EB病毒(Epstein-Barr virus)；布尼亚病毒科；沙粒状病毒科；汉坦病毒科(Hantaviridae)，汉滩病毒；冠状病毒科；乳多空病毒科(Papovaviridae)，如人类乳头状瘤病毒；弹状病毒科，如狂犬病病毒。冠状病毒科，如人冠状病毒；HYM1(Alphaviridae)，动脉炎病毒科，丝状病毒科，如埃博拉病毒，沙粒状病毒科，痘病毒科，如天花病毒，和非洲猪瘟病毒。同样，本发明的奈瑟氏菌LOS可以与来自病原细菌，真菌(包括酵母)，或寄生生物的抗原联合使用。这类抗原包括细菌抗原如幽门细菌(Helicobacter)，如幽门螺杆菌；奈瑟氏菌，如脑膜炎球菌；嗜血杆菌属，如流感嗜血杆菌；鲍特氏菌属，如百日咳鲍特氏菌；衣原体；链球菌属，如链球菌属血清A型(Streptococcus sp.serotype A)，弧菌属，如霍乱弧菌，革兰氏阴性肠道病原菌，包括如沙门氏菌，志贺氏菌属，弯曲杆菌属和大肠杆菌属，以及从导致炭疽病，麻风病，结核病，白喉，莱姆病，梅毒，伤寒，淋病的细菌中得到的抗原。来自寄生生物的抗原如包括原生物抗原，如Babeosis bovis，疟原虫，利什曼原虫，弓形虫，和锥虫，如克鲁斯锥虫。真菌抗原可包括来自真菌的抗原，如曲霉，白色念珠菌，隐球酵母，如新生隐球菌，和荚膜组织胞浆菌。
尽管接种疫苗通常是用于预防性保护免受病原侵害或治疗由于病原性感染产生的疾病，然而本领域的技术人员意识到可将疫苗应用在肿瘤的治疗中。而且，已经发现了大量的肿瘤特异蛋白，这些肿瘤特异蛋白是能通过人或人化抗体靶向的适当实体。这些肿瘤特异蛋白也包括在本发明的范围内。本领域已经知道了很多的肿瘤特异蛋白。因此，在一个优选的实施例中，本发明提供了包括肿瘤特异抗原和如上所述的奈瑟氏菌LOS的组合物。合适的肿瘤抗原包括如癌胚抗原，前列腺特异性膜抗原，前列腺特异性抗原；MZ2-E蛋白，多态性上皮粘蛋白(PEM)，叶酸结合蛋白LK26，(截短的)表皮生长因子受体(EGRF)，HER2，Thomsen-Friedenreich(T)抗原，GM-2和GD-2神经节苷脂，Ep-CAM，粘蛋白-1，epithialial糖蛋白-2，和结肠特异抗原。
而且，将抗原靶向DC以诱导预防自身免疫性疾病的耐受性。这样的过敏原也包括在本发明的范围内。
另一方面，本发明涉及制备上述奈瑟氏菌LOS的方法。优选的方法包括的步骤为(a)培养脑膜炎球菌(N.menigitidis)菌株，该菌株表达免疫型L2，L3或L4的奈瑟氏菌LOS并且该菌株缺乏活性lgtB基因，或表达免疫型L6的奈瑟氏菌LOS，并且该菌株携带使一个或多个lpxL1和lpxL2基因的表达失活或降低的突变；和(b)使奈瑟氏菌LOS复性。另一种替换的方法，该方法包括的步骤有(a)培养脑膜炎球菌(N.menigitidis)菌株，该菌株表达免疫型L2，L3或L4的奈瑟氏菌LOS并且该菌株缺乏活性lgtB基因，或表达L6免疫型的奈瑟氏菌LOS；(b)使奈瑟氏菌LOS复性；和，(c)用联胺，碱性磷酸酶或酰氧水解酶(acyloxyhydrolase)中的至少一种处理奈瑟氏菌LOS以降低类脂A部分的毒性。在该方法中，步骤(b)和(c)的顺序可互换。在一个优选的方法中，步骤c)中毒性降低到野生型奈瑟氏菌LOS的毒性的80％以下，毒性是通过上述的WEHI方法测定的。
仍然在另一方面，本发明涉及包括上述奈瑟氏菌LOS的革兰氏阴性OMV(外膜小泡)或囊泡。产生革兰氏阴性OMV或囊泡的手段和方法在WO02/09746中进行了描述。因此获得的革兰氏阴性囊泡可以与本发明的奈瑟氏菌LOS结合起来产生包括奈瑟氏菌LOS的革兰氏阴性囊泡。可替换的，可从上述能够产生本发明的奈瑟氏菌LOS的奈瑟氏菌菌株中得到囊泡。包含的革兰氏阴性囊泡可进一步与上述抗原和/或上述药学上可接受的载体结合。
图1脑膜炎球菌WT L3 LPS和其寡糖突变体的示意性说明，所述的突变体通过插入无活性的编码糖基转移酶的基因(斜体字所示)产生。
图2树突细胞(DC)与FITC-标记的细菌以1∶50的比例共同培养24小时。在指定的时间点取样，通过FACS测定细菌与树突细胞的结合。图中表示了来自三个不同供体的三个独立的实验。
图3在布雷非德菌素A(brefeldin A)的存在下，用FITC-标记的细菌以1∶50的比例刺激树突细胞18小时，然后对胞内TNF-α和IL-12进行染色。点阵图表示了与细菌结合但不产(右下象限)或产生(右上象限)胞内细胞因子的DC的百分比。
图4共培养18小时后，通过ELISA测定培养基上清夜中应答脑膜炎球菌WT和突变体的由DC产生的TNF-α，IL-12，IL-1β，1L-10和IL-6。图中示出了三个独立实验的平均值和标准方差。
图5脑膜炎球菌WT和突变体与DC共培养18小时后，用平均荧光强度(MFI)表示的CD40和CD86的表达。
图6用可溶粘附分析方法测定C型凝集素-Fc分子与脑膜炎球菌WT和突变体的连接。
图7在存在或缺少20mg/ml抗DC-SIGN抗体AZN-D1情况下，脑膜炎球菌WT和lgtB突变体的结合。
图8DC起动的Th1/Th2细胞增殖将DC与野生型脑膜炎球菌H44/76，lgtB突变体，E.coli.LPS，多聚IC(poly IC)或PEG2共同孵育48小时，洗涤并(A)对成熟标记进行分析(三个独立试验的平均值和标准方差)或(B)与高度纯化的CD45RA+CD4+T细胞共培养。用PMA和离子霉素再次刺激沉默T细胞，通过流式细胞术分析单细胞基的胞内IL-4(灰色)和IFN-γ(黑色)。图中表示了来自三个不同供体的数据。
图9活细菌与DC的结合和细胞因子的诱导。树突细胞(DC)与FITC-标记的野生型脑膜炎球菌和LPS突变体以1∶100的比例共同培养。在给定的时间点取样，通过FACS测定细菌与DC的结合。图中显示的是来自两个不同供体的细胞的结果。
实例1材料和方法1.1细菌菌株从野生型(WT)B组脑膜炎球菌H44/76中提取寡糖核芯和类脂A突变体，并在前面已进行过描述。
在本研究中使用的寡糖核芯突变体的结构表示在图1中。在36℃，6％CO2的大气中在添加了Vitox(Oxoid Ltd.Basingstoke，UK)的淋菌琼脂上培养所有的菌株。在培养18小时后使用处于静止期的细菌。在不含有酚红的RPMI 1640培养基(Gibc，Paisley，UK)上制备细菌悬液，在540nm处测定其光密度。将光密度为1记为相当于109生物体/ml。在含有0.5％多聚甲醛(PFA)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中固定细菌并充分洗涤RPMI培养基上的细菌。FITC标记的细菌通过在37℃下与0.5mg/ml的FITC(Sigma，Poole，UK)共同孵育20分钟，随后进一步洗涤而制备。
1.2细胞如上所述，从人外周血单核细胞(PBMC)中制备DC(F.Sallusto and A.Lanzavecchia，1994，J.Exp.Med.1791109-1118；H.Uronen-Hansson等，2004，Immunology111173-178)。简单的说，通过多步Percoll梯度离心从PBMC中制备单核细胞。单核细胞组分中CD14+/CD3-/CD19-大于95％。为了获得DC，将单核细胞在补加了10％热失活的FCS，2.4mM L-谷氨酸，100U/ml青霉素-链霉素溶液(这些试剂都是从GIBCO，Paisley UK购买的)，100ng/ml的人重组GM-CSF和50ng/ml的人重组IL-4(Schering-Plough，Welwyn Garden City，Herts UK)的RPMI中孵育7天。根据该方法制备的未成熟的DC是CD14low，CD83-ve，CD86low，CD25-ve。它们还表达HLA DR，HLA DQ，HLA I类，CD40和CD1a，但对CD19和CD3是阴性的。
将浓度为5×105/ml的DC与脑膜炎球菌H44/76细菌以DC/细菌的比例为1∶50和1∶200(如图例指定的)在补加了10％FCS的RPMI1640中培养。当测定胞内细胞因子的时候，加入蛋白质转运抑制剂布雷非德菌素A(Sigma，Poole，UK)至10ug/mL。
lgtB突变体与DC的特异性结合的测定通过将未熟化的DC与20ug/ml抗DC-SIGN mAb AZN-D1在37℃孵育30分钟，然后与野生型和突变细菌在37℃孵育45分钟进行的。
1.3DC的结合和内化DC与细菌的结合和细菌的内化通过将流式细胞术和共聚焦显微镜结合起来进行测定。用流式细胞术检测时，将DC与FITC标记的细菌共孵育30分钟到24小时，在FACSFix(BD)中固定，洗涤，并在流式细胞仪(FACSCalibur)上进行分析。与细菌结合的DC在DC通道聚集处(DC gated population)通过荧光可很容易进行确定。用共聚焦显微镜测定时，使经FITC标记的脑膜炎球菌刺激的DC在防脱载玻片(Bio-RadLaboratories Ltd.，Herts，UK)上黏附10分钟。为了使内化停止，将DC用4％PFA固定10分钟。用5ug/ml的抗MHC II类单克隆抗体(Dako，Glostrup，Denmark)进行染色观察DC。洗涤后，结合抗体用5ug/ml Texas Red-共轭的山羊抗鼠抗体(分子探针)检测1小时。将载玻片洗涤并安装到Citifluor(Citifluor Ltd，UK)上。使用配有合适滤波器的Leica SP2共聚焦激光扫描显微镜系统(Leica，Milton Keynes，UK)获得共聚焦图像。为了确定胞内细菌，照射覆盖全部DC的15-20个光学切面(0.2-0.5um)并用Leica共聚焦成像软件进行叠加成像。
1.4测定细胞因子为了测定胞内细胞因子的产生，用含有4％PFA的PBS固定DC15分钟，在含有0.1％叠氮钠和0.5％BSA(都从Sigma购买)的PBS中洗涤，并在25ul渗透溶液(Permeabilisation solution)(Caltag)中进行渗透。然后在暗室室温中将细胞与TNF-α的单克隆抗体(Becton Dickinson BD，Oxford，UK)和IL-12p40/70(Pharmingen)或同型匹配对照共孵育30分钟。然后，细胞在PBS中洗涤两次，固定在CellFix(BectonDickinson)中并使用Cell Quest软件(Becton Dickinson)在FACScalibur上通过流式细胞术进行分析。通过正向直角散射(forward and right angle scattering)确定由明显细胞群组成的DC。通过它们表达的MHCII，CD1a，CD25，CD80，CD83和CD86确定该细胞群中至少95％的细胞是DC。收集该通道内与DC相关的最少3000 events用于分析。为了使用ELISA分析可溶细胞因子，使用CytoSetsTMELISA试剂盒(BiosourceEurope.S.A，Nivelles Belgium)根据生产商的说明分析人IL-12，TNF-α和IL-10，IL6和IL1β。
1.5可溶性C型凝集素-Fc粘附分析方法C型凝集素-Fc分子包括C型凝集素受体(DC-SIGN，MGL和Dectin-1B)的胞外部分，所述受体的COOH末端与人的IgG1-Fc片段(T.Geijtenbeek等，2003，J.Exp.Med.1977-17)融合。按下列方法进行可溶性C型凝集素-Fc粘附分析。在室温(RT)下将全部细胞(OD540＝0.1)涂布到ELISA平板上(100ul/孔)保持18小时，随后在37℃下用1％BSA阻断30分钟。在室温下加入可溶性C型凝集素-Fc上清夜保持2小时。洗掉未结合的C型凝集素-Fc并用抗-IgG1 ELISA确定结合情况。
1.6 DC起动的Th1/Th2分化将从健康供体的单核细胞中得到的DC在加入了10％FCS(Bio Withaker，Verviers，Belgium)，500U/ml IL-4和800U/ml GM-CSF(二者均来自Schering-Plough)的lscove′s改良的Dulbecco′s培养基(Gibco)上进行培养。在第6天，DC的熟化用感染复数为10的野生型脑膜炎球菌和lgtB突变体进行诱导。在该分析方法中包括下列的阳性对照(i)混合的Th1/Th2应答，10ng/ml大肠杆菌LPS(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，(ii)Th1分化，20ug/ml的多聚IC(Sigma-Aldrich)和(iii)Th2分化，10ug/ml PGE2，10ng/ml LPS(Sigma-Aldrich)。在第2天，通过流式细胞术分析DC的成熟标记物(CD80，CD83，CD86和HLA-DR)。为了评价T细胞的分化，将成熟的DC与CD45RA+/CD4+T细胞(5.103T细胞/20.103DC)共孵育。在第12-15天，用10ng/ml PMA(Sigma-Aldrich)和1ug/ml离子霉素(Sigma-Aldrich)再次刺激沉默T细胞6小时。1小时后，将10ug/ml布雷非德菌素A(Sigma-Aldrich)加入到T细胞中。用胞内流式细胞分析方法测定单个细胞产生的IL-4和IFN-γ。细胞固定在2％PFA中，用0.5％皂苷(Saponin)(Sigma-Aldrich)渗透并用抗人IFN-γ-FITC和抗人IL-4-PE(BD Pharmingen，San Diego，CA)进行染色。
2.实例DC结合和内化的脑膜炎球菌的寡糖核芯突变体菌株使用流式细胞技术研究人DC结合和内化的WT脑膜炎球菌，寡糖突变体和LPS-缺失的突变体。未成熟DC与从WT脑膜炎球菌H44/76中得到的FITC标记的突变体菌株以DC/细菌的比例为1∶50(图2)和1∶200(未示出)进行共培养并通过FACS分析与FITC标记的细菌结合的DC的存在。可以观察到对于WT和寡糖突变体来说DC的结合随时间和剂量增加。发现在指定的时间段的前6个小时内LPS-缺失的突变体几乎没有任何DC的结合。显示lgtB突变体在两个浓度对DC的结合都比WT或galE突变体高。
为了区分细菌结合和内化，接着我们使用共聚焦显微镜研究WT脑膜炎球菌和突变体(未示出)的DC内化。FITC细菌作为载玻片上的绿色小颗粒很容易被确定。使用MHC II类染色观察DC。孵育1小时后，与WT细菌或galE突变体相比，绝大多数的DC内化了更多的lgtB。在LPS-缺失突变体中几乎没有看到任何内化。除了内化水平高外，在整个时间期间lgtB突变体细菌的表面粘附都非常高。这些结果证实了FACS的结果；与DC结合的细菌增多使细菌的内化增多。
3.实例DC的活化和成熟以应答脑膜炎球菌突变体菌株为了研究细菌内化和细胞因子产生之间的关系，对为了应答WT和突变体而由DC产生的IL12和TNF-α进行了测定并同时进行了胞内内化分析(图3)。将DC与FITC标记的细菌以1∶50比例共培养18小时，然后染色确定胞内产生的TNF-α和IL12。设置象限以将与FITC细菌结合的细胞和没有结合FITC细菌的细胞分离开来。所给出的百分比是内化细菌后产生(右上象限)或没有产生(右下象限)胞内细胞因子的DC的百分比。WT，lgtB和galE突变体都是DC产生TNF-α和IL12的有效诱导子，相反LPS-缺失的突变体不是。实际上所有内化了脑膜炎球菌WT，lgtB和galE突变体的DC都产生了高水平的TNF-α。在IL12的情况下，发现产生了约50％的已内化FITC标记细菌的DC。
除了测定胞内细胞因子外，我们还测定了为应答脑膜炎球菌由DC分泌的细胞因子水平(图4)。将DC与突变体和WT细菌以1∶200比例共培养18小时，并收集上清液分析所分泌的IL12，IL10，TNF-α，IL6和IL-1β。结果显示了与WT(WT＝100％)相比的细胞因子产生的百分比。lgtB和galE突变体诱导的IL12，TNF-α，和IL-1β都稍低于WT细菌。lgtB和galE两个突变体产生的IL10和IL6看起来与WT菌株相似。发现LPS-缺失菌株几乎没有产生任何细胞因子。
最后，通过测定共刺激分子CD40和CD86(图5)的表达研究了用WT和突变体细菌刺激的DC的熟化。与用WT或galE突变体细菌刺激的DC相比，用lgtB突变体刺激的DC中CD40特别是CD86的表达较高。而用lpxA突变体刺激的DC中几乎没有发现任何CD40和CD86的表达。
总之，这些数据证实DC结合并内化lgtB突变体使DC的成熟和活化可与用WT细菌诱导的DC活化和成熟的水平相当。
4.实例鉴定受体介导的lgtB突变体的结合和内化DC对lgtB突变体的结合和吸收的增强促使我们研究该结合和内化是否是通过一个特定的DC受体介导的。因此，我们分析了WT和突变体与C型凝集素受体的结合能力，所述的受体能够识别寡糖并在未成熟的DC上高度表达。用可溶粘附分析方法研究了一组C型凝集素-Fc嵌合体与WT和突变体细菌的全部细胞的结合(图6)。而WT，galE突变体和LPS-缺失突变体没有结合任何的C型凝集素Fc-嵌合体，发现lgtB突变体与DC-SIGN-Fc强烈结合。还在被DC-SIGN瞬时转染的HEK293T细胞中或稳定表达DC-SIGN(数据未示出)的K562细胞中发现lgtB突变体与DC-SIGN结合。而且，通过研究在存在或不存在抗-DC-SIGN阻断抗体AZN-D1(图7)情况下DC对lgtB突变体的吞噬作用证实lgtB LPS对DC-SIGN的特异性。在AZN-D1存在的情况下，观察到DC对lgtB的吞噬降低到与WT的结合水平，这清楚的证明DC-SIGN结合并内化了lgtB变体。
5.实例lgtB突变体靶向DC-SIGN起始了Th1免疫应答如果要评价lgtB突变体LPS与DC-SIGN相互作用的功能相关性，我们研究了用PFA-固定的野生型或lgtB突变体细菌刺激未成熟的DC后，DC起动的T细胞应答。通过对共刺激分子和成熟标记的表达的评价发现用野生型或lgtB突变体细菌刺激的DC的熟化没有差异(图8a)。然而，发现用这些菌株诱导的Th1/Th2曲线有明显的差异(图8b)。用野生型脑膜炎球菌刺激的DC主要产生Th2型免疫应答，因为绝大多数的T细胞产生了IL-4。用lgtB突变体刺激的DC主要诱导产生INF-γ的T细胞，从而使Th1对Th2细胞的平衡向Th1移动。在3个独立供体中部发现了Th1/Th2平衡的这种移动。这些数据说明lgtB LPS对DC-SIGN的特异靶向产生了起动朝向Th1的免疫应答的DC信号，这是作为佐剂最希望的现象。参见.P.Moingeon等(2001)Vaccine194363-4372。
6.实例DC对脑膜炎球菌的寡糖/类脂A双突变体菌株的结合和内化使用流式细胞技术研究人DC对WT脑膜炎球菌，lgtA和lgtB寡糖突变体和其lpxL1双突变体，以及LPS-缺失的突变体的结合和内化。未成熟DC与从WT脑膜炎球菌H44/76中得到的FITC标记的突变体菌株以DC/细菌的比例为1∶100进行共培养并通过FACS分析与FITC标记的细菌结合的DC的存在(图9)。LgtB单突变体显示了比WT或lgtA单突变体一致的较高的DC结合。另外，在lpxL1突变体背景中，lgtB突变还导致了比野生型或lgtA寡糖结构较高的结合，这说明lgtB介导的与DC-SIGN结合的增加还具有含有戊酰化的lpxL1类脂A的LPS。
权利要求书(按照条约第19条的修改)1..奈瑟氏菌(Neisserial)LOS在制备免疫哺乳动物的药物中的用途，其中所述的奈瑟氏菌LOS用式(I)表示KDOα2→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→4Hepα1→5KDO-LAα1→3Hep→PEA(3或6)α1→2GlcNAc，其中LA是野生型类脂A部分或毒性降低的类脂A部分，并且所述的奈瑟氏菌LOS用作佐剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的奈瑟氏菌LOS与抗原结合用于制备提高哺乳动物对抗原进行免疫应答的药物。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的抗原从细菌，病毒，真菌，寄生生物，癌细胞或过敏原中得到或由其产生。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的用途，其中所述的LA是毒性小于野生型类脂A部分的毒性的80％的类脂A部分，所述的毒性由WEHI方法确定。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的用途，其中所述的类脂A部分选自包括下列的组(a)从奈瑟氏菌菌株中得到的类脂A部分，所述的奈瑟氏菌菌株携带使lpxL1或lpxL2基因或其同源基因的活性降低或失活的突变；(b)通过酰氧水解酶处理从野生型的类脂A部分中脱去一个或多个二级O-连接的酯化了的脂肪酸而获得的类脂A部分；(c)通过对野生型类脂A部分进行联胺处理获得的类脂A部分；(d)通过碱性磷酸酶的脱磷酸化作用获得的类脂A部分。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的用途，其中所述的类脂A部分选自包括下列的组(a)仅在还原性的葡萄糖胺上具有二级C12-酰基的类脂A部分；
(b)仅在非还原性的葡萄糖胺上具有二级C12-酰基的类脂A部分；(c)两个二级C12-酰基基团都不存在的类脂A部分；(d)在1或4′位上的任何一个位置缺少一个或多个磷酸基团的类脂A部分；和(e)包括(a)、(b)或(c)中的脱酰化和(d)中的脱磷酸化的组合的类脂A部分。
7.一种包括式(I)表示的奈瑟氏菌LOS的组合物KDOα2→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→4Hepα1→5KDO-LAα1→3Hep→PEA(3或6)α1→2GlcNAc，其中LA是野生型类脂A部分或毒性降低的类脂A部分，并且所述的组合物进一步包括从病毒，真菌，寄生生物，癌细胞，过敏原或细菌中得到或由其产生的抗原，以及所述的细菌选自包括下列的组如幽门细菌，嗜血杆菌属，鲍特氏菌属，衣原体，链球菌属，弧菌属，革兰氏阴性肠道病原菌，沙门氏菌属，志贺氏菌属，弯曲杆菌属，大肠杆菌属，以及导致炭疽病，麻风病，结核病，白喉，莱姆病，梅毒，伤寒的细菌。
8.根据权利要求7所述的组合物，该组合物进一步包括药学上可接受的载体。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述的类脂A部分的毒性小于野生型类脂A部分的毒性的80％，所述的毒性由WEHI方法确定。
10.根据权利要求7-9中任一权利要求所述的组合物，其中所述的类脂A部分选自包括下列的组(a)从奈瑟氏菌菌株中得到的类脂A部分，所述的奈瑟氏菌菌株携带使lpxL1或lpxL2基因或其同源基因的活性降低或失活的突变；(b)通过酰氧水解酶处理从野生型的类脂A部分中脱去一个或多个二级O-连接的酯化了的脂肪酸而获得的类脂A部分；(c)通过对野生型类脂A部分进行联胺处理获得的类脂A部分；(d)通过碱性磷酸酶的脱磷酸化作用获得的类脂A部分。
11.根据权利要求7-10中任一权利要求所述的组合物，其中所述的类脂A部分是(a)仅在还原性的葡萄糖胺上具有二级C12-酰基的类脂A部分；(b)仅在非还原性的葡萄糖胺上具有二级C12-酰基的类脂A部分；(c)两个二级C12-酰基基团都不存在的类脂A部分；(d)在1或4′位上的任何一个位置缺少一个或多个磷酸基团的类脂A部分；和(e)包括(a)、(b)或(c)中的脱酰化和(d)中脱磷酸化的组合的类脂A部分。
权利要求
1..奈瑟氏菌(Neisserial)LOS在制备免疫哺乳动物的药物中的用途，其中所述的奈瑟氏菌LOS用式(I)表示 其中LA是野生型类脂A部分或毒性降低的类脂A部分。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的奈瑟氏菌LOS用作佐剂。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述的奈瑟氏菌LOS与抗原结合用于制备提高哺乳动物对抗原进行免疫应答的药物。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述的抗原从细菌，病毒，真菌，寄生生物，癌细胞或过敏原中得到或由其产生。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的用途，其中所述的LA是毒性小于野生型类脂A部分的毒性的80％的类脂A部分，所述的毒性由WEHI方法确定。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的用途，其中所述的类脂A部分选自包括下列的组(a)从奈瑟氏菌菌株中得到的类脂A部分，所述的奈瑟氏菌菌株携带使lpxL1或lpxL2基因或其同源基因的活性降低或失活的突变；(b)通过酰氧水解酶处理从野生型的类脂A部分中脱去一个或多个二级O-连接的酯化了的脂肪酸而获得的类脂A部分；(c)通过对野生型类脂A部分进行联胺处理获得的类脂A部分；(d)通过碱性磷酸酶的脱磷酸化作用获得的类脂A部分。
7.根据权利要求1-6中任一权利要求所述的用途，其中所述的类脂A部分选自包括下列的组(a)仅在还原性的葡萄糖胺上具有二级C12-酰基的类脂A部分；(b)仅在非还原性的葡萄糖胺上具有二级C12-酰基的类脂A部分；(c)两个二级C12-酰基基团都不存在的类脂A部分；(d)在1或4′位上的任何一个位置缺少一个或多个磷酸基团的类脂A部分；和(e)包括(a)、(b)或(c)中的脱酰化和(d)中的脱磷酸化的组合的类脂A部分。
8.一种式(I)表示的奈瑟氏菌LOS 其中LA是毒性降低的类脂A部分。
9.根据权利要求8所述的奈瑟氏菌LOS，其中所述的类脂A部分的毒性小于野生型类脂A部分的毒性的80％，所述的毒性由WEHI方法确定。
10.根据权利要求8或9所述的奈瑟氏菌LOS，其中所述的类脂A部分选自包括下列的组(a)从奈瑟氏菌菌株中得到的类脂A部分，所述的奈瑟氏菌菌株携带使lpxL1或lpxL2基因或其同源基因的活性降低或失活的突变；(b)通过酰氧水解酶处理从野生型的类脂A部分中脱去一个或多个二级O-连接的酯化了的脂肪酸而获得的类脂A部分；(c)通过对野生型类脂A部分进行联胺处理获得的类脂A部分；(d)通过碱性磷酸酶的脱磷酸化作用获得的类脂A部分。
11.根据权利要求8-10中任一权利要求所述的奈瑟氏菌LOS，其中所述的类脂A部分是(a)仅在还原性的葡萄糖胺上具有二级C12-酰基的类脂A部分；(b)仅在非还原性的葡萄糖胺上具有二级C12-酰基的类脂A部分；(c)两个二级C12-酰基基团都不存在的类脂A部分；(d)在1或4′位上的任何一个位置缺少一个或多个磷酸基团的类脂A部分；和(e)包括(a)、(b)或(c)中的脱酰化和(d)中脱磷酸化的组合的类脂A部分。
12.包括权利要求8-11中任一权利要求所述的奈瑟氏菌LOS和药学上可接受的载体的组合物。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述的组合物进一步包括从细菌，病毒，真菌，寄生生物，癌细胞或过敏原中得到或由其产生的抗原。
14.一种制备权利要求8-11中任一权利要求所述的奈瑟氏菌LOS的方法，所述的方法包括的步骤有(a)培养脑膜炎球菌(N.menigitidis)菌株，其中该菌株表达免疫型L2，L3或L4的奈瑟氏菌LOS并且该菌株缺乏活性lgtB基因，或表达免疫型L6的奈瑟氏菌LOS，并且该菌株携带使一个或多个lpxL1或lpxL2基因或其同源基因失活或降低其表达的突变；和(b)使奈瑟氏菌LOS复性。
15.一种制备权利要求8-11中任一权利要求所述的奈瑟氏菌LOS的方法，所述的方法包括的步骤有(a)培养脑膜炎球菌(N.menigitidis)菌株，其中该菌株表达免疫型L2，L3或L4的奈瑟氏菌LOS并且该菌株缺乏活性lgtB基因，或表达L6免疫型的奈瑟氏菌LOS；(b)使奈瑟氏菌LOS复性；和，(c)用联胺，碱性磷酸酶或酰氧水解酶中的至少一种处理奈瑟氏菌LOS以降低类脂A部分的毒性。
16.根据权利要求15所述的方法，其中步骤(c)中的所述毒性降低到野生型奈瑟氏菌LOS的毒性的80％以下，所述的毒性是通过WEHI方法测定的。
全文摘要
本发明涉及奈瑟氏菌脂寡糖(Lipo－Oligo－Saccharides，LOS)，所述的奈瑟氏菌脂寡糖包括三糖外核，该三糖外核显示与树突细胞上的DC－SIGN受体的结合能力提高。其结果是本发明的奈瑟氏菌脂寡糖提高了免疫活性。与毒性降低的类脂A部分结合的奈瑟氏菌脂寡糖的三糖外核可用作疫苗制剂中的佐剂。
文档编号A61K39/095GK1997392SQ200580018170
公开日2007年7月11日 申请日期2005年5月11日 优先权日2004年5月11日
发明者李安娜·朱立安娜·约瑟芬·史提夫思, 约翰内斯·赫拉多斯·约瑟夫·方·德·温克, 皮特·安德烈·方·德尔·里 申请人:荷兰健康、福利与体育部部长代表的荷兰国