专利名称：利用针对FZD10的siRNA治疗滑膜肉瘤的方法
技术领域：
本发明涉及抑制或减少FZD10基因表达的方法。同样地，本发明涉及治疗和/或预防受试者中FZD10相关疾病的方法，所述疾病特别是滑膜肉瘤、结肠直肠癌、胃癌、慢性髓细胞样白血病和急性髓细胞样白血病。此外，本发明涉及包括针对FZD10的双链RNA分子或能够表达针对FZD10的双链RNA分子的表达载体的药物组合物。
背景技术：
卷曲同源物(frizzled homologue)10(FZD10)是卷曲家族的成员，所述卷曲家族是Wnt信号传导的受体。我们以前报道过FZD10在滑膜肉瘤(SS)中明显超表达(Nagayama S，等人，(2002).CancerRes，625859-5866；WO2004/020668)。
尽管已证实FZD10表达在原发性结肠直肠癌(Terasaki，H.等人，Int J Mol Med.9107-12.，2002)和原发性胃癌(Kirikoshi，H.等人，Int J Oncol.19767-71.，2001)以及SS中是上调的，但FZD10在SS致癌作用中的细胞功能及牵连仍不明了。
发明概述如下文所述，我们证实经由RNA干扰敲除FZD10基因表达导致SS细胞的生长抑制，从而表明FZD10在SS的细胞生长中起重要作用。同样地，我们鉴定出作为FZD10结合蛋白的核输入蛋白质——输入蛋白(importin)-β。
因此，在一方面，本发明提供了体外、体内或离体(ex vivo)抑制或减少FZD10基因在细胞或组织中表达的方法，其包括将针对FZD10的双链RNA分子或能够表达针对FZD10的双链RNA分子的表达载体导入细胞或组织中，其中针对FZD10的双链RNA分子包括靶向SEQ ID NO1的10-100个连续核苷酸，优选10-50个连续核苷酸，更优选10-30个连续核苷酸的核苷酸序列。优选地，针对FZD10的双链RNA分子可以包括作为短干扰RNA(siRNA)的短核苷酸序列。例如，双链RNA分子包括靶向SEQ ID NO1核苷酸编号1481-1499(SEQ ID No.5)或核苷酸编号1595-1613(SEQ ID No.6)的核苷酸序列。更具体而言，针对FZD10的双链RNA分子可以通过具有SEQ ID Nos.7、8、9或10序列的表达载体进行表达。
在其他方面，本发明提供了预防或治疗受试者中滑膜肉瘤的方法，其包括给受试者施用治疗上有效量的针对FZD10的双链RNA或能够表达针对FZD10的双链RNA的表达载体。
此外，本发明人发现FZD10蛋白可以结合输入蛋白-β。因此，抑制FZD10蛋白与输入蛋白-β之间相互作用或结合的化合物也许可以影响滑膜肉瘤的发展。
在一方面，本发明提供了筛选抑制FZD10蛋白与输入蛋白-β蛋白之间相互作用和/或结合的化合物的方法，其包括(a)在测试样品的存在下使FZD10蛋白或其部分肽与输入蛋白-β蛋白或其部分肽接触；并且(b)检测FZD10蛋白与输入蛋白-β蛋白之间的相互作用或结合的形成。
在一个进一步的方面，本发明提供了筛选可以用于治疗或预防滑膜肉瘤的化合物的方法，其包括(a)在测试样品的存在下使FZD10蛋白或其部分肽与输入蛋白-β蛋白或其部分肽接触；并且(b)检测FZD10蛋白与输入蛋白-β蛋白之间的相互作用或结合的形成。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些相似或等同的方法和材料可以在本发明的实践或测试中使用，但下文还是描述了适当的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请书、专利及其他参考文献均整体引入作为参考。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的并不意欲是限制性的。本发明的其他特征和优点由于下述详细描述和权利要求将是显而易见的。
附图简述
图1A-1C显示设计用于减少SS细胞系SYO-1中FZD10表达的小干扰RNA(siRNA)的生长抑制作用。(A)半定量RT-PCR显示了SYO-1细胞中内源性FZD10表达的抑制。使用β2MG作为内部对照。FZD9的表达不受这些siRNA的影响。(B)用psiU6BX3.0载体转染的SYO-1细胞的MTT测定。其中观察到不可检测的FZD10表达的A549细胞是显示这些siRNA没有生长作用的“脱靶(off-target)”对照。(C)集落形成测定证实通过敲除SYO-1细胞中FZD10表达减少集落数目。A549细胞系为“脱靶”对照。
图2A-2C显示FZD10可以形成同型寡聚体。(A)FZD10构建体的示意图。7TM；7跨膜结构域。(B)FZD10与自身的共免疫沉淀。将来自未转染的COS-7细胞或表达HA-FLAG-FZD10和FZD10-myc/His的细胞的裂解物与α-HA抗体一起进行免疫沉淀。通过使用α-HA和α-myc抗体的蛋白质印迹法来分析免疫沉淀。(C)FZD10的胞质区没有牵涉在寡聚化中。将来自未转染的COS-7细胞或表达HA-FLAG-FZD10、HA-FLAG-FZD10ΔC(1-578)、HA-FLAG-FZD10ΔC(1-525)和FZD10-myc/His的细胞的裂解物与α-HAF-7抗体一起进行免疫沉淀。通过使用α-HA F-7和α-myc 9E10抗体的蛋白质印迹法来分析免疫沉淀。
图3A-3C显示FZD10和FZD10结合蛋白的TAP系统纯化。(A)FZD10-TAP和对照TAP的示意图。(B)FZD10的TAP纯化鉴定出一种新的复合物。对来自表达对照TAP或FZD10-TAP的SNU-C5细胞的裂解物实施TAP系统纯化。银染色的凝胶显示了所鉴定的蛋白质。(C)通过共免疫沉淀还显示了FZD10与输入蛋白-β之间的相互作用。将来自未转染的COS-7细胞或表达输入蛋白-β-3XFLAG或FZD10-myc/His或两者的细胞的裂解物与α-myc 9E10抗体一起进行免疫沉淀。通过使用α-FLAG M2和α-myc 9E10抗体的蛋白质印迹法分析免疫沉淀。
发明详述及优选实施方案卷曲同源物10(FZD10)是卷曲家族的成员，所述卷曲家族是Wnt信号传导的受体。如下文所述，我们证实经由RNA干扰敲除FZD10基因表达导致SS细胞的生长抑制，从而表明FZD10在SS的细胞生长中起重要作用。
已知RNA干扰为细胞事件，其中通过导入双链RNA(dsRNA)降解来自内源基因的mRNA，所述双链RNA具有与内源基因序列互补的序列。因此，靶基因的表达可以得到抑制或减少。这个事件在例如Elbashir，SM.等人，Nature 411，494-498，2001；Hannon，GJ.，Nature 418，244-251，2002(综述)；Shinagawa，T.等人，Genes Dev.171340-1345 2003；国际专利公开号WO99/32619和WO99/61613中被报道。
我们成功地设计了经由RNA干扰有效抑制或减少FZD10基因表达的dsRNA分子。因此，在一个实施方案中，本发明提供了体外、体内或离体抑制或减少FZD10基因在细胞或组织中表达的方法，其包括将针对FZD10的双链RNA分子或能够表达针对FZD10的双链RNA分子的表达载体导入细胞或组织中，其中针对FZD10的双链RNA分子包括靶向SEQ ID NO1的10-100个连续核苷酸，优选10-50个连续核苷酸，更优选10-30个连续核苷酸的核苷酸序列。优选地，针对FZD10的双链RNA分子可以包括作为短干扰RNA(siRNA)的短核苷酸序列。例如，双链RNA分子包括靶向SEQ IDNO1核苷酸编号1481-1499(SEQ ID No.5)或核苷酸编号1595-1613(SEQ ID No.6)的核苷酸序列。更具体而言，针对FZD10的双链RNA分子可以通过具有如下所述的SEQ ID Nos.7、8、9或10序列的表达载体进行表达。同样地，具有SEQ ID Nos.7、8、9或10序列的表达载体在本发明的方法中可以是有用的。
序列 Seq ID No.
5’-CACCAACGCTGGACTGCCTGATGTTCAAGAGACATCAGGCAGTCCAGCGTT-3’75’-AAAAAACGCTGGACTGCCTGATGTCTCTTGAACATCAGGCAGTCCAGCGTT-3’85’-CACCGACTCTGCAGTCCTGGCAGTTCAAGAGACTGCCAGGACTGCAGAGTC-3’95’-AAAAGACTCTGCAGTCCTGGCAGTCTCTTGAACTGCCAGGACTGCAGAGTC-3’10加下划线的是针对FZD10的特异性序列。
进一步地，如上所述，FZD10在滑膜肉瘤(SS)中明显超表达，并且通过抑制或减少FZD10的表达抑制SS细胞的生长。因此，在一个可替代的实施方案中，本发明提供了预防或治疗受试者中的滑膜肉瘤的方法，其包括给受试者施用治疗上有效量的针对FZD10的双链RNA或能够表达针对FZD10的双链RNA的表达载体。
本发明的方法可以离体(例如通过将来源于受试者的细胞与dsRNA或表达载体一起温育)或可替代地体内(例如通过给受试者施用dsRNA或表达载体)进行。
dsRNA可以通过各种已知施用法送递到靶位置(例如癌性细胞)。例如，dsRNA可以利用能够表达dsRNA的表达载体进行送递。能够用于本发明的表达载体的实例包括，但不限于，腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒以及RNA病毒例如逆转录病毒。
可以用于将dsRNA施用于靶组织或细胞的基因送递系统的其他实例包括胶态分散系统、脂质体诱导的系统及人工病毒包膜。具体而言，例如大分子复合物、纳米胶囊(nano-capsule)、微球体、珠、水包油型乳剂、微胶粒、混合微胶粒以及脂质体均可用作送递系统。
dsRNA或表达载体可以通过静脉内注射(包括连续输注)、肌内注射、腹膜内注射及皮下注射或经由其他施用途径来直接施用。
可替代地，dsRNA或表达载体可以被导入从受试者获得的细胞或组织中并随后可以将该细胞施用于受试者(离体法)。将dsRNA或表达载体导入细胞或组织可以通过常规基因导入法来完成，例如磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、电穿孔或脂质转染。其中表达dsRNA的细胞或组织的施用也可以以与dsRNA或表达载体直接施用情况下相同的方式来完成。
所施用的dsRNA或表达载体的剂量可以依赖于年龄、性别、症状、施用途径、施用频率及剂量形式而变。然而，相关领域的常规方法均可被适当选择并使用。
在另一实施方案中，本发明提供了包括针对FZD10的双链RNA分子或能够表达针对FZD10的双链RNA分子的表达载体以及药物学上可接受的载体的组合物。
各种类型的组合物均可通过适当选择药物学上可接受的载体以常规方式进行配制，所述载体一般用于制剂的配制，例如赋形剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、增溶剂、抗菌剂、稳定剂及等渗剂。
更进一步地，为了了解经由FZD10超表达的SS肿瘤发生机制，我们致力于通过IP-MS法鉴定新型FZD10结合蛋白。引人注目地，我们分离了作为FZD10结合蛋白的核输入蛋白——输入蛋白-β。我们通过免疫组织化学证实了FZD10蛋白局限于核和胞质机构(数据未公开)。因此，FZD10蛋白除了作为膜蛋白的作用外还可以在细胞核中起作用。
因此，抑制FZD10蛋白与输入蛋白-β之间相互作用或结合的化合物可以影响滑膜肉瘤的发展。
在一个实施方案中，本发明提供了筛选抑制FZD10蛋白与输入蛋白-β蛋白之间相互作用和/或结合的化合物的方法，其包括(a)在测试样品的存在下使FZD10蛋白或其部分肽与输入蛋白-β蛋白或其部分肽接触；并且(b)检测FZD10蛋白与输入蛋白-β蛋白之间的相互作用或结合的形成。
FZD10蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO2中(GenBankAccession No.BAA84093)中。输入蛋白-β蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO4中(GenBank Accession No.NM_002265；PDB IDNo.1QGK-A)中。
通过上述方法筛选的化合物可以用于治疗或预防滑膜肉瘤。
在另一实施方案中，本发明提供了筛选可以用于治疗或预防滑膜肉瘤的化合物的方法，其包括(a)在测试样品的存在下使FZD10蛋白或其部分肽与输入蛋白-β蛋白或其部分肽接触；并且(b)检测FZD10蛋白与输入蛋白-β蛋白之间的相互作用或结合的形成。
测试样品可以包括，但不限于，蛋白质、肽、非肽化合物、合成化合物、发酵产物以及天然提取物包括细胞提取物。同样地，测试样品可以是化学文库或肽文库。
FZD10与输入蛋白-β之间相互作用和/或结合的形成的检测可以根据本领域已知的常规方法来进行。
在一个进一步的实施方案中，本发明提供了治疗或预防滑膜肉瘤的组合物，其中该组合物包括通过上述任何筛选方法获得的作为活性成分的药物学有效量化合物以及药物学上可接受的载体。
在另一方面，本发明涵盖了包含一种或多种本文所述治疗化合物的药物或治疗组合物。此类治疗化合物包括，但不限于，如本文所述的双链RNA。药物制剂可以包括适合于口、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道或肠胃外(包括肌内、皮下和静脉内)施用，或通过吸入或吹入法施用的那些。适当时，制剂可以方便地以不连续剂量单位的形式呈现并且可以通过药剂学领域众所周知的任何方法进行制备。所有此类药剂学方法包括下述步骤如所需的，使活性化合物与液体载体或精密分开的固体载体或两者结合，以及随后需要时将产品制成所需制剂形式。
适合于经口施用的药物制剂可以方便地呈现为不连续的单位，例如胶囊、扁胶剂(cachet)或片剂，每个包含预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；或作为溶液、悬浮液或作为乳剂。活性成分还可以呈现为大丸剂药糖剂或糊剂，并且可以是纯的形式的，即不含载体。用于经口施用的片剂和胶囊可以包含常规赋形剂，例如粘合剂、填料、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可以通过压缩或模制来制造，任选含一种或多种制剂成分。压缩的片剂可以通过在适当的机器中压缩自由流动形式的活性成分例如粉末或颗粒而制成，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合。模制的片剂可以通过在适当的机器中模制用惰性液体稀释剂弄湿的粉末状化合物的混合物而制成。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。经口流体制剂可以是例如水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂的形式，或者可以呈现为用于在使用前用水或其他适当载体构建的干燥产品。此类流体制剂可以包含常规添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水的载体(它可以包括可食用油)或防腐剂。片剂可以被任选地制备以便提供其中活性成分的缓慢或受控制的释放。
用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水的无菌注射液，它可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，所述溶质使得该制剂与预期受体的血液等渗；以及水性和非水的无菌悬浮液，它可以包括悬浮剂和增稠剂。该制剂可以以单位剂量或多剂量容器的形式呈现，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以以冷冻干燥(冻干)的条件储存，只要求紧在使用前添加无菌液体载体例如注射用盐水。可替代地，可以提供该制剂用于连续输注。临时注射液和悬浮液可以由先前描述的类型的无菌粉末、颗粒和片剂进行制备。
用于直肠施用的制剂可以呈现为含常规载体例如可可脂或聚乙二醇的栓剂。用于口中局部施用例如颊或舌下的制剂包括锭剂，其包括在加味的基质例如蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶中的活性成分，以及软锭剂，其包括在例如白明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的活性成分。对于鼻内施用，本发明的化合物可以用作液体喷雾剂或可分散的粉末或以滴剂的形式。滴剂可以与水性或非水基质一起进行配制，还包括一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。液体喷雾剂方便地由加压包装来送递。
对于吸入施用，该化合物方便地由吹入器、喷雾器、加压包装或送递气溶胶喷雾剂的其他便利工具来送递。加压包装可以包括适当的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以送递计量的量来确定。
可替代地，对于吸入或吹入施用，该化合物可以采取干燥粉末组合物的形式，例如化合物与适当的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以呈现单位剂量形式，例如胶囊、药筒、白明胶或泡罩片剂形式，其中的粉末可以借助于吸入器或吹入器施用。
当需要时，可以采用适合于产生活性成分持续释放的上述制剂。药物组合物还可包含其他活性成分，例如抗微生物剂、免疫抑制剂或防腐剂。
应当理解除了上文特别提及的成分外，本发明的制剂可包括与所述的制剂类型有关的领域中的其他常规试剂，例如适合于经口施用的那些可以包括调味剂。
优选的单位剂量制剂是包含如下文所述的有效剂量的活性成分或其适当级分的那些制剂。
对于上述每种情况，该组合物可以经口施用或经由约0.1-约250mg/kg/天的剂量注射施用。成人的剂量范围一般为约5mg-约17.5g/天，优选约5mg-约10g/天，并且最优选约100mg-约3g/天。以不连续单位提供的呈现的片剂或其他单位剂量形式可以方便地包含在此类剂量上有效的量或作为多重所述的量，例如，包含约5mg-约500mg，通常为约100mg-约500mg的单位。
药物组合物优选经口施用或通过注射(静脉内或皮下)施用，并且给受试者施用的精确量将由主治医师负责。然而，所采用的剂量将取决于诸多因素，包括受试者的年龄和性别、所治疗的确切病症及其严重性。同样地，施用途径可以依赖于状况及其严重性而变。
实施例本发明将由下述非限制性实施例进一步地举例说明实施例1siRNA表达载体的构建为了研究FZD10的细胞功能，我们构建了在U6启动子控制下表达对FZD10特异的siRNA的质粒(psiU6BX-FZD10)。根据FZD10ORF序列构建了两种siRNA(psiU6BX-FZD10B和C)。
(1)siRNA表达载体psiU6X3.0的构建因为据报道snRNA U6基因由RNA聚合酶III转录，所述RNA聚合酶III产生在3’端有尿苷的短转录物，所以我们通过PCR扩增了包含其启动子区的snRNA U6基因的基因组片段，所述PCR利用一组引物5′-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’(SEQ ID No.11)和5′-TAGGCCC CACCTCCTTCTAT-3’(SEQ ID No.12)以及人胎盘DNA作为模板。产物被纯化并利用TA克隆试剂盒根据厂商的规程(Invitrogen)克隆到pCR质粒载体中。包含snRNA U6基因的BamHI、XhoI消化的片段被纯化并克隆到pcDNA3.1(+)质粒的核苷酸1257-56片段中，所述片段通过PCR用一组引物5′-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQ ID NO.13)和5′-CTCTATCTC GAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ IDNo.14)进行扩增。使用所连接的DNA作为PCR模板，引物为5′-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTT TTCT-3′(SEQ ID No.15)和5′-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3′(SEQID No.16)(下划线表示HindIII位点)。将产物用Hind III进行消化，它随后自我连接以产生psiU6BX3.0载体质粒。
(2)质粒构建为了构建myc/His标记的全长FZD10表达载体，我们首先利用人胎盘cDNA文库作为模板使用下述引物PCR扩增了FZD10(SEQID No.1)的完整编码序列5′-CCGGAATTCCAGACCGTGCATCATGCAGCGCCCGGGCCCCCGCCT-3’(SEQ ID No.17)(下划线表示EcoRI位点)和5′-AAAAAGCTTCACGCAGGTGGGCGACTG-3’(SEQ ID No.18)(下划线表示HindIII位点)。
EcoRI和HindIII消化后，将PCR产物克隆到pcDNA3.1-myc/His载体(Invitrogen)中，并随后将插入的含myc/His标记的FZD10 cDNA进一步亚克隆到pCAGGS/neo表达载体中。然后，通过使用下列引物组合的PCR扩增从克隆的全长FZD10 cDNA产生内部标记的HA-FLAG-FZD10FL(残基1-581；SEQ ID No.2)表达质粒构建体对于FZD10 N-末端部分(SEQ ID No.2的氨基酸1-217)为FZD10-ATG，5’-AAGTCGACACCATGCAGCGCCCGGGCCCC-3′(SEQ ID No.19)(下划线表示SalI位点)和FZD10-nt651，5′-TCTCGAGGACATCCACGCCGGGCGTG-3’(SEQ ID NO.20)(下划线表示XhoI位点)；对于FZD10 C-末端部分(SEQ ID NO.2的氨基酸218-581)为FZD10-nt652，5′-AAGTCGACTACTGGAGCCGCGAGGACAAG-3’(SEQ IDNO.21)(下划线表示SalI位点)和FZD10-TGA，5′-AACTCGAGTCACACGCAGGTGGGCGACT-3’(SEQ ID NO.22)(下划线表示XhoI位点)。
通过正向引物(FZD10-nt652)和下述反向引物分别产生FZD10ΔC1(残基1-578)和FZD10ΔC2(残基1-525)表达质粒构建体的N-末端部分(残基1-217)以及每种构建体的C-末端部分(残基218-各端)FZD10ΔC1(1-578)，5′-AACTCGAGTCAGGGCGACTGGGCAGGGATCT-3’(SEQ IDNo.23)(下划线表示XhoI位点)和FZD10ΔC2(1-525)，5′-AACTCGAGTCAGGAGGTCCAAATCCACATCCC-3’(SEQ IDNo.24)(下划线表示XhoI位点)。
通过将双链寡核苷酸克隆到psiU6BX3.0载体中制备表达对FZD10特异的siRNA的质粒(表1)。每种质粒中关于siRNA的靶序列显示于表2中。互补寡核苷酸各自通过与T4多核苷酸激酶在37℃一起温育30分钟进行磷酸化，随后煮沸并缓慢冷却至室温以使两种寡核苷酸复性。将每种产物连接到psiU6BX3.0中以构建FZD10-siRNA表达载体。
表1插入到siRNA表达载体中的特异性双链寡核苷酸序列Seq ID No.
psi-U6BX-FZD10-B5’-CACCAACGCTGGACTGCCTGATGTTCAAGAGACATCAGGCAGTCCAGCGTT-3’75’-AAAAAACGCTGGACTGCCTGATGTCTCTTGAACATCAGGCAGTCCAGCGTT-3’ 8psi-U6BX-FZD10-C5’-CACCGACTCTGCAGTCCTGGCAGTTCAAGAGACTGCCAGGACTGCAGAGTC-3’95’-AAAAGACTCTGCAGTCCTGGCAGTCTCTTGAACTGCCAGGACTGCAGAGTC-3’10psi-U6BX-EGFP5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’255’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’26psi-U6BX-Luc5’-CACCGTGCGCTGCTGGTGCCAACTTCAAGAGAGTTGGCACCAGCAGCGCAC-3’275’-AAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACTCTCTTGAAGTTGGCACCAGCAGCGCAC-3’28加下划线的是针对FZD10的特异性序列。
表2针对siRNA的靶序列Seq ID No.
psi-U6BX-FZD10-B5’-AACGCTGGACTGCCTGATG-3’5psi-U6BX-FZD10-C5 ’-GACTCTGCAGTCCTGGCAG-3’ 6psi-U6BX-EGFP5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’29psi-U6BX-Luc5’-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3 ’ 30实施例2FZD10-siRNA对滑膜肉瘤细胞系生长的作用我们将实施例1中制备的质粒转染到滑膜肉瘤细胞系SYO-1中并通过半定量RT-PCR检查FZD10的表达水平。同样地，我们进行细胞生长测定以证实细胞生长抑制作用。
(1)半定量RT-PCR
将SYO-1细胞维持在补充有10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基中。使用细胞系NucleofectorTM试剂盒V(Amaxa Biosystems，Cologne，德国)转染SYO-1细胞。转染的细胞在转染后48-72小时进行测定。
利用TRIZOL试剂(Invitrogen)根据厂商规程从转染的细胞中提取总RNA。被提取的RNA用DNA酶I(Roche Diagnostics，Mannheim，德国)进行处理并利用oligo(dT)12-18引物用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)逆转录为单链cDNA。利用cDNA作为模板及下述引物进行PCR扩增对于FZD10为5′-TATCGGGCTCTTCTCTGTGC-3′(SEQ IDNO.31)和5′-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3′(SEQ ID No.32)，对于FZD9为5′-CTGCACGCTGGTCTTCCTCT-3′(SEQ IDNO.33)和5′-CCGATCTTGACCATGAGCTTC-3′(SEQ ID NO.34)，对于β2MG为5′-TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3′(SEQ IDNO.35)和5′-TCACATGGTTCACACGGCAG-3′(SEQ ID NO.36)。
因此，与对照(psiU6BX-LUC或-EGFP)相比，两种siRNA构建体-FZD10(si-B和-C)-特异性siRNA显著抑制表达，而FZD9的表达不受这些siRNA影响(图1A)，所述FZD9在卷曲家族基因中与FZD10最相似。
(2)细胞生长测定为了证实FZD10-特异性siRNA的细胞生长抑制，我们分别进行了集落形成和MTT测定。将SYO-1细胞如上文(1)中所述进行转染。将肺癌细胞系A549细胞维持在补充有10％胎牛血清和抗生素的RPMI1640培养基中。使用FuGENE6(Roche)转染A549细胞。
将用psiU6-FZD10、psiU6-luc或psiU6-EGFP质粒转染的SYO-1和A549细胞在含有适当浓度遗传霉素的培养基中维持13天。将细胞用4％多聚甲醛固定并用吉姆萨(Giemsa)溶液染色。此外，如所述的(Shimokawa T等人(2003).Cancer Res，63，6116-20)，利用细胞计数试剂盒8(Dojindo)通过MTT测定来测量细胞生存力。
因此，与上述结果一致，抑制SYO-1生长的FZD10 siRNA构建体的导入降低了这种基因的表达(图1B和1C)。此外，显示不可检测的FZD10表达的A549细胞的生长不受影响，从而表明这些siRNA没有发生“脱靶”作用。每种结果都由3次独立实验证实。因此，我们的发现提示FZD10在滑膜肉瘤细胞生长中具有重要作用。
实施例3FZD10同型二聚体的形成因为据报道卷曲家族的成员FZD1可以形成寡聚体(Kaykas A，等人(2004).Nat.Cell Biol.652-8)，所以我们研究FZD10是否也能够通过免疫沉淀进行寡聚化。将两种FZD10构建体，HA-FLAG-FZD10(下文所述)和FZD10-myc-His(实施例1中制备；图2A)共转染到COS-7细胞中并利用α-HA抗体进行共免疫沉淀。
为了构建HA-FLAG-FZD10，一组下述寡核苷酸，5’-ACGTGTCGACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCTCGAGATGC-3’(SEQ IDNo.37)(下划线表示SalI位点)和5′-GCATCTCGAGCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTCGACACGT-3’(SEQ IDNO.38)(下划线表示XhoI位点)被退火并用SalI和XhoI消化以产生HA-FLAG标记。首先，单独PCR扩增残基1-217和218-终止密码子(或C-末端缺失)片段。将PCR产物用SalI和XhoI进行消化，并顺序连接到pCAGGS/neo表达载体中。将用SalI和XhoI消化的HA-FLAG标记片段符合读框地连接在nt651和nt652之间。
将COS-7细胞维持在补充有10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基中。使用FuGENE6(Roche)转染COS-7细胞。转染的细胞在转染后48-72小时使用。
将被转染的COS-7细胞用冷PBS(-)洗涤两次并在IPP缓冲液中进行裂解。将细胞裂解物与抗-HA F7抗体(Santa Cruz)和G蛋白-琼脂糖(Sigma)一起温育。将结合的蛋白用IP缓冲液洗涤5次并用SDS-样品缓冲液洗脱。将被洗脱的蛋白质通过10％SDS-PAGE进行分析。将蛋白质经电泳转移至硝酸纤维素膜(Amersham Biosciences)。将膜与抗-myc 9E10单克隆抗体、抗-FLAG M2抗体或抗-HA F7抗体温育，随后与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(Amersham Biosciences)温育。结合的第二抗体通过ECLTM蛋白质印迹检测试剂(AmershamBiosciences)显现。
如图2B中上部小图所示，免疫沉淀的HA-FLAG-FZD10看起来表现为预测分子量一倍或两倍的多重条带，并且最高的条带堆积在SDS-PAGE电泳胶的顶部，从而提示FZD10能够形成寡聚体。此外，利用α-HA抗体以破坏(pull down)HA-FLAG-FZD10导致FZD10-myc-His共免疫沉淀(图2B，下部小图)，从而表明FZD10可以形成同型二聚体，并且当来自转染了HA-FLAG-FZD10或FZD10-myc的细胞的裂解物在免疫沉淀之前混合时，不是共免疫沉淀的，从而表明寡聚化发生在活细胞中(数据未显示)。FZD10包含两个基序，KTxxxW(Umbhauer M，等人(2000).EMBO J.194944-4954)，它定位在第7个跨膜结构域后2个氨基酸处，以及在预期的C-末端处的TCV基序，它被认为对于蛋白质-蛋白质相互作用很重要。为了研究这些基序在寡聚化中的牵涉，我们设计了两种C-末端缺失的构建体(图2A)它们是否能够形成寡聚体。如图2C中所示，利用α-HA抗体的破坏导致FZD10-myc-His共免疫沉淀，从而提示FZD10的C-末端基序可能不参与寡聚化。
实施例4与输入蛋白-β的相互作用为了经由相互作用的蛋白质进一步研究FZD10蛋白的功能，我们实施了TAP系统纯化法。
根据先前报道(Rigaut G，等人(1999).Nat Biotechnol，171030-1032)进行TAP(串联亲和纯化)系统纯化。简言之，将作为对照的pCAGGS/neo-FZD 10-TAP或pCAGGS/neo-TAP转染到SNU-C5细胞中。
为了构建TAP表达载体，根据标准规程PCR扩增了在3’端有SalI的TAP标记序列的cDNA，所述TAP标记序列由免疫球蛋白G结合结构域和钙调蛋白结合肽组成，其通过烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)的切割位点分开(图3A)。首先，将上述TAP标记序列克隆到pcDNA-3.1(+)-myc-His表达载体中。然后，将pcDNA-3.1(+)-myc-His-TAP用XhoI和SalI进行消化并将所得到的myc-His-TAP片段插入到pCAGGS/neo载体中。将FZD10 ORF cDNA亚克隆到pCAGGS-myc-His-TAP/neo表达载体中。
将结肠癌细胞系SNU-C5维持在补充有10％胎牛血清和抗生素的RPMI1649培养基中。使用FuGENE6(Roche)转染SNU-C5细胞。
转染后72小时，用IPP缓冲液(含有蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail)SetIII(Calbiochem)的10mM Tris-HCl[pH8.0]、0.1％NP-40、150mM NaCl、1mM NaF)裂解细胞。取出不溶的级分并将上清液与IgG-琼脂糖(Amersham Biosciences)一起温育。将结合的蛋白与TEV蛋白酶(Invitrogen)一起在4℃温育过夜，并且将被洗脱的蛋白质进一步与含1mM CaCl2的钙调蛋白亲和(Calmodulin Affinity)树脂(Stratagene)一起温育。最后，将结合的蛋白用1mM EGTA洗脱并实施12％SDS-PAGE。利用Silver Stain“Daiichi”(Daiichi Pure Chemicals)通过银染色显现蛋白质。从凝胶上切下与对照TAP有差异的蛋白质条带并通过Aproscience Co.(Tokushima，日本)常规运行MALDI-TOF MS分析。
当我们转染FZD10-TAP且作为对照的TAP载体在SNU-C5细胞中超表达时(图3B)，我们鉴别出输入蛋白-β为FZD10的候选相互作用蛋白。我们进一步证实FZD10在COS-7细胞中可以与输入蛋白-β共免疫沉淀(图3C)。
尽管本发明已根据某些优选实施方案进行详细描述，但应当理解在如附加权利要求中所定义的本发明精神和范围内，本领域技术人员可以进行多种改变和修饰。
序列表<110>The University of TokyoOncotherapy Science，Inc.
<120>利用针对FZD10的siRNA治疗滑膜肉瘤的方法<130>PH-2219-PCT<150>US 60/598,834<151>2004-08-05<160>38<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2811<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(18)..(1763)<223>
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act ttg gtc atc atg gaa cga ctg caa cag gtt ctt cag atg gag tca2034Thr Leu Val Ile Met Glu Arg Leu Gln Gln Val Leu Gln Met Glu Ser555 560 565cat atc cag agc aca tcc gat aga atc cag ttc aat gac ctt cag tct2082His Ile Gln Ser Thr Ser Asp Arg Ile Gln Phe Asn Asp Leu Gln Ser570 575 580tta ctc tgt gca act ctt cag aat gtt ctt cgg aaa gtg caa cat caa2130Leu Leu Cys Ala Thr Leu Gln Asn Val Leu Arg Lys Val Gln His Gln585 590 595gat gct ttg cag atc tct gat gtg gtt atg gcc tcc ctg tta agg atg2178Asp Ala Leu Gln Ile Ser Asp Val Val Met Ala Ser Leu Leu Arg Met600 605 610ttc caa agc aca gct ggg tct ggg gga gta caa gag gat gcc ctg atg2226Phe Gln Ser Thr Ala Gly Ser Gly Gly Val Gln Glu Asp Ala Leu Met615 620 625 630gca gtt agc aca ctg gtg gaa gtg ttg ggt ggt gaa ttc ctc aag tac2274Ala Val Ser Thr Leu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Phe Leu Lys Tyr635 640 645atg gag gcc ttt aaa ccc ttc ctg ggc att gga tta aaa aat tat gct2322Met Glu Ala Phe Lys Pro Phe Leu Gly Ile Gly Leu Lys Asn Tyr Ala650 655 660gaa tac cag gtt tgt ttg gca gct gtg ggc tta gtg gga gac ttg tgc2370Glu Tyr Gln Val Cys Leu Ala Ala Val Gly Leu Val Gly Asp Leu Cys665 670 675cgt gcc ctg caa tcc aac atc ata cct ttc tgt gac gag gtg atg cag2418Arg Ala Leu Gln Ser Asn Ile Ile Pro Phe Cys Asp Glu Val Met Gln680 685 690ctg ctt ctg gaa aat ttg ggg aat gag aac gtc cac agg tct gtg aag2466Leu Leu Leu Glu Asn Leu Gly Asn Glu Asn Val His Arg Ser Val Lys695 700 705 710ccg cag att ctg tca gtg ttt ggt gat att gcc ctt gct att gga gga2514Pro Gln Ile Leu Ser Val Phe Gly Asp Ile Ala Leu Ala Ile Gly Gly715 720 725
gag ttt aaa aaa tac tta gag gtt gta ttg aat act ctt cag cag gcc2562Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Val Val Leu Asn Thr Leu Gln Gln Ala730 735 740tcc caa gcc cag gtg gac aag tca gac tat gac atg gtg gat tat ctg2610Ser Gln Ala Gln Val Asp Lys Ser Asp Tyr Asp Met Val Asp Tyr Leu745 750 755aat gag cta agg gaa agc tgc ttg gaa gcc tat act gga atc gtc cag2658Asn Glu Leu Arg Glu Ser Cys Leu Glu Ala Tyr Thr Gly Ile Val Gln760 765 770gga tta aag ggg gat cag gag aac gta cac ccg gat gtg atg ctg gta2706Gly Leu Lys Gly Asp Gln Glu Asn Val His Pro Asp Val Met Leu Val775 780 785 790caa ccc aga gta gaa ttt att ctg tct ttc att gac cac att gct gga2754Gln Pro Arg Val Glu Phe Ile Leu Ser Phe Ile Asp His Ile Ala Gly795 800 805gat gag gat cac aca gat gga gta gta gct tgt gct gct gga cta ata2802Asp Glu Asp His Thr Asp Gly Val Val Ala Cys Ala Ala Gly Leu Ile810 815 820ggg gac tta tgt aca gca ttt ggg aag gat gta ctg aaa tta gta gaa2850Gly Asp Leu Cys Thr Ala Phe Gly Lys Asp Val Leu Lys Leu Val Glu825 830 835gct agg cca atg atc cat gaa ttg tta act gaa ggg cgg aga tcg aag2898Ala Arg Pro Met Ile His Glu Leu Leu Thr Glu Gly Arg Arg Ser Lys840 845 850act aac aaa gca aaa acc ctt gct aca tgg gca aca aaa gaa ctg agg2946Thr Asn Lys Ala Lys Thr Leu Ala Thr Trp Ala Thr Lys Glu Leu Arg855 860 865 870aaa ctg aag aac caa gct tga tctgttacca ttgggatgat aacctgagga 2997Lys Leu Lys Asn Gln Ala875cccccactgg aaatctccca tcttttgaaa aacctggaag tgaggagtgt gcacggatgc 3057tgaatgtttg ggaatgagag gatgagtgag tgaggcttga aaacacacca cattgaaaat 3117
cctgccacag cagcagccgc agccgccaac agcagcgctg ttagtgagct aagtaagcac 3177tgacttcgta gaaaaccata acatcggcca tcttggaaaa gagaaaaaca atggagttac 3237ttatttaaaa aaaaagaaag aaagttatct cttcccagga gaggctagaa gtagcttttc 3297tgtcttttgg ccagtgccga gtggaatgcc tggtttgggg gaggaggagg gactgggttc 3357agctgtggtg ctttgttgta aaaggcagcc tggcctttgc tactgaggag aaagatggag 3417cctgggtctc aagcccacct tcgctgtacc tttgccacat ggtactgtat gcttgccagc 3477tagaaggagg gtcagggatt ttttacagtc tgagaatgag tgtgtgtgag tgaggcggta 3537tccacattct caacttcaag tcattgcagt ttctttttcc cagaaaacaa ggggttagat 3597gttgcatttc ataaaactaa ccgaagttct gtctactgat gcagcacaag agatgtaaaa 3657aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaacacac acacagagga aagacgctct ttaggttttg 3717ttttgttttt tttttttggt tttgtttttt gtttttttta ctctagggaa aacactgacg 3777aatggtcaga gctcctatcc tgatcttttc atcaaggcgc ctttcctaat aatatggttc 3837aactgtgaat gtagaagtgg gggggagggg ggagaaaaag aaaactctgg cgttagagga 3897tatagaaaaa tataagtaca attgttacaa ataacgcaga cttcaaaaac aaaaaaatca 3957caacccaaac aaaccaaaat ttaaatgatc agaattggca gcacaaagaa aacgccctct 4017cctgacttgt attgtggcag tctgaacgcc cccagaaaat tgtgccaaag agtttagaaa 4077aataaatata caataaaagt aaacacatac acacaaaaca gcaaacttca ggtaactatt 4137ttggattgca aacaggataa attaaatgtt caaacaatct gataaaataa ccatttggaa 4197actgaaaa 4205<210>4<211>876<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<400>4Met Glu Leu Ile Thr Ile Leu Glu Lys Thr Val Ser Pro Asp Arg Leu1 5 10 15Glu Leu Glu Ala Ala Gln Lys Phe Leu Glu Arg Ala Ala Val Glu Asn20 25 30Leu Pro Thr Phe Leu Val Glu Leu Ser Arg Val Leu Ala Asn Pro Gly35 40 45Asn Ser Gln Val Ala Arg Val Ala Ala Gly Leu Gln Ile Lys Asn Ser50 55 60Leu Thr Ser Lys Asp Pro Asp Ile Lys Ala Gln Tyr Gln Gln Arg Trp65 70 75 80Leu Ala Ile Asp Ala Asn Ala Arg Arg Glu Val Lys Asn Tyr Val Leu85 90 95Gln Thr Leu Gly Thr Glu Thr Tyr Arg Pro Ser Ser Ala Ser Gln Cys100 105 110Val Ala Gly Ile Ala Cys Ala Glu Ile Pro Val Asn Gln Trp Pro Glu115 120 125Leu Ile Pro Gln Leu Val Ala Asn Val Thr Asn Pro Asn Ser Thr Glu130 135 140His Met Lys Glu Ser Thr Leu Glu Ala Ile Gly Tyr Ile Cys Gln Asp145 150 155 160Ile Asp Pro Glu Gln Leu Gln Asp Lys Ser Asn Glu Ile Leu Thr Ala165 170 175
Ile Ile Gln Gly Met Arg Lys Glu Glu Pro Ser Asn Asn Val Lys Leu180 185 190Ala Ala Thr Asn Ala Leu Leu Asn Ser Leu Glu Phe Thr Lys Ala Asn195 200 205Phe Asp Lys Glu Ser Glu Arg His Phe Ile Met Gln Val Val Cys Glu210 215 220Ala Thr Gln Cys Pro Asp Thr Arg Val Arg Val Ala Ala Leu Gln Asn225 230 235 240Leu Val Lys Ile Met Ser Leu Tyr Tyr Gln Tyr Met Glu Thr Tyr Met245 250 255Gly Pro Ala Leu Phe Ala Ile Thr Ile Glu Ala Met Lys Ser Asp Ile260 265 270Asp Glu Val Ala Leu Gln Gly Ile Glu Phe Trp Ser Asn Val Cys Asp275 280 285Glu Glu Met Asp Leu Ala Ile Glu Ala Ser Glu Ala Ala Glu Gln Gly290 295 300Arg Pro Pro Glu His Thr Ser Lys Phe Tyr Ala Lys Gly Ala Leu Gln305 310 315 320Tyr Leu Val Pro Ile Leu Thr Gln Thr Leu Thr Lys Gln Asp Glu Asn325 330 335Asp Asp Asp Asp Asp Trp Asn Pro Cys Lys Ala Ala Gly Val Cys Leu340 345 350
Met Leu Leu Ala Thr Cys Cys Glu Asp Asp Ile Val Pro His Val Leu355 360 365Pro Phe Ile Lys Glu His Ile Lys Asn Pro Asp Trp Arg Tyr Arg Asp370 375 380Ala Ala Val Met Ala Phe Gly Cys Ile Leu Glu Gly Pro Glu Pro Ser385 390 395 400Gln Leu Lys Pro Leu Val Ile Gln Ala Met Pro Thr Leu Ile Glu Leu405 4l0 415Met Lys Asp Pro Ser Val Val Val Arg Asp Thr Ala Ala Trp Thr Val420 425 430Gly Arg Ile Cys Glu Leu Leu Pro Glu Ala Ala Ile Asn Asp Val Tyr435 440 445Leu Ala Pro Leu Leu Gln Cys Leu Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Pro450 455 460Arg Val Ala Ser Asn Val Cys Trp Ala Phe Ser Ser Leu Ala Glu Ala465 470 475 480Ala Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ala Asp Asp Gln Glu Glu Pro Ala Thr485 490 495Tyr Cys Leu Ser Ser Ser Phe Glu Leu Ile Val Gln Lys Leu Leu Glu500 505 510Thr Thr Asp Arg Pro Asp Gly His Gln Asn Asn Leu Arg Ser Ser Ala515 520 525
Tyr Glu Ser Leu Met Glu Ile Val Lys Asn Ser Ala Lys Asp Cys Tyr530 535 540Pro Ala Val Gln Lys Thr Thr Leu Val Ile Met Glu Arg Leu Gln Gln545 550 555 560Val Leu Gln Met Glu Ser His Ile Gln Ser Thr Ser Asp Arg Ile Gln565 570 575Phe Asn Asp Leu Gln Ser Leu Leu Cys Ala Thr Leu Gln Asn Val Leu580 585 590Arg Lys Val Gln His Gln Asp Ala Leu Gln Ile Ser Asp Val Val Met595 600 605Ala Ser Leu Leu Arg Met Phe Gln Ser Thr Ala Gly Ser Gly Gly Val610 615 620Gln Glu Asp Ala Leu Met Ala Val Ser Thr Leu Val Glu Val Leu Gly625 630 635 640Gly Glu Phe Leu Lys Tyr Met Glu Ala Phe Lys Pro Phe Leu Gly Ile645 650 655Gly Leu Lys Asn Tyr Ala Glu Tyr Gln Val Cys Leu Ala Ala Val Gly660 665 670Leu Val Gly Asp Leu Cys Arg Ala Leu Gln Ser Asn Ile Ile Pro Phe675 680 685Cys Asp Glu Val Met Gln Leu Leu Leu Glu Asn Leu Gly Asn Glu Asn690 695 700
Val His Arg Ser Val Lys Pro Gln Ile Leu Ser Val Phe Gly Asp Ile705 710 715 720Ala Leu Ala Ile Gly Gly Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Val Val Leu725 730 735Asn Thr Leu Gln Gln Ala Ser Gln Ala Gln Val Asp Lys Ser Asp Tyr740 745 750Asp Met Val Asp Tyr Leu Asn Glu Leu Arg Glu Ser Cys Leu Glu Ala755 760 765Tyr Thr Gly Ile Val Gln Gly Leu Lys Gly Asp Gln Glu Asn Val His770 775 780Pro Asp Val Met Leu Val Gln Pro Arg Val Glu Phe Ile Leu Ser Phe785 790 795 800Ile Asp His Ile Ala Gly Asp Glu Asp His Thr Asp Gly Val Val Ala805 810 815Cys Ala Ala Gly Leu Ile Gly Asp Leu Cys Thr Ala Phe Gly Lys Asp820 825 830Val Leu Lys Leu Val Glu Ala Arg Pro Met Ile His Glu Leu Leu Thr835 840 845Glu Gly Arg Arg Ser Lys Thr Asn Lys Ala Lys Thr Leu Ala Thr Trp850 855 860Ala Thr Lys Glu Leu Arg Lys Leu Lys Asn Gln Ala865 870 875
<210>5<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>5aacgctggac tgcctgatg 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>6gactctgcag tcctggcag 19<210>7<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>7caccaacgct ggactgcctg atgttcaaga gacatcaggc agtccagcgt t 51<210>8<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>8aaaaaacgct ggactgcctg atgtctcttg aacatcaggc agtccagcgt t 51<210>9<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>9caccgactct gcagtcctgg cagttcaaga gactgccagg actgcagagt c 51<210>10<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>10aaaagactct gcagtcctgg cagtctcttg aactgccagg actgcagagt c 51<210>11<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>11ggggatcagc gtttgagtaa20<210>12<211>20
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>12taggccccac ctccttctat20<210>13<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>13tgcggatcca gagcagattg tactgagagt 30<210>14<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>14ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca 29<210>15<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>15tttaagcttg aagactattt ttacatcagg ttgtttttct 40
<210>16<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>16tttaagcttg aagacacggt gtttcgtcct ttccaca 37<210>17<211>45<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>17ccggaattcc agaccgtgca tcatgcagcg cccgggcccc cgcct45<210>18<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>18aaaaagcttc acgcaggtgg gcgactg27<210>19<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>19aagtcgacac catgcagcgc ccgggcccc 29<210>20<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>20tctcgaggac atccacgccg ggcgtg 26<210>21<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>21aagtcgacta ctggagccgc gaggacaag 29<210>22<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>22aactcgagtc acacgcaggt gggcgact 28<210>23<211>31
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>23aactcgagtc agggcgactg ggcagggatc t 31<210>24<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的人工合成的引物<400>24aactcgagtc aggaggtcca aatccacatc cc 32<210>25<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>25caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c 51<210>26<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>26aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c51
<210>27<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>27caccgtgcgc tgctggtgcc aacttcaaga gagttggcac cagcagcgca c 51<210>28<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>28aaaagtgcgc tgctggtgcc aactctcttg aagttggcac cagcagcgca c 51<210>29<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的靶序列<400>29gaagcagcac gacttcttc 19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>siRNA的靶序列<400>30gtgcgctgct ggtgccaac 19<210>31<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>31tatcgggctc ttctctgtgc20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>32gactgggcag ggatctcata20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>33ctgcacgctg gtcttcctct20<210>34
<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>34ccgatcttga ccatgagctt c 21<210>35<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>35ttagctgtgc tcgcgctact20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物<400>36tcacatggtt cacacggcag20<210>37<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>标记的人工合成的寡核苷酸<400>37
acgtgtcgac tacccatacg acgtcccaga ctacgctatg gactacaagg acgacgatga60caagctcgag atgc 74<210>38<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>标记的人工合成的寡核苷酸<400>38gcatctcgag cttgtcatcg tcgtccttgt agtccatagc gtagtctggg acgtcgtatg60ggtagtcgac acgt 7权利要求
1.一种用于体外、体内或离体抑制或减少FZD10基因在细胞或组织中表达的方法，其包括将针对FZD10的双链RNA分子或能够表达针对FZD10的双链RNA分子的表达载体导入所述细胞或组织中，其中所述针对FZD10的双链RNA分子包括靶向SEQ ID NO1的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列。
2.权利要求1的方法，其中所述针对FZD10的双链RNA分子是短干扰RNA(siRNA)。
3.权利要求1或2的方法，其中所述双链RNA分子包括靶向SEQ ID NO1核苷酸编号1481-1499(SEQ ID No.5)或核苷酸编号1595-1613(SEQ ID No.6)的核苷酸序列。
4.权利要求1或2的方法，其中所述针对FZD10的双链RNA分子通过具有SEQ ID Nos.7、8、9或10所述序列的表达载体进行表达。
5.一种用于预防或治疗受试者中与卷曲同源物10(FZD10)相关的疾病的方法，其包括给所述受试者施用治疗上有效量的针对FZD10的双链RNA或能够表达针对FZD10的双链RNA的表达载体。
6.权利要求5的方法，其中所述针对FZD10的双链RNA分子是短干扰RNA(siRNA)。
7.权利要求5或6的方法，其中所述双链RNA分子包括靶向SEQ ID NO1核苷酸编号1481-1499(SEQ ID No.5)或核苷酸编号1595-1613(SEQ ID No.6)的核苷酸序列。
8.权利要求5或6的方法，其中所述表达载体包括SEQ ID Nos.7、8、9或10所述的序列。
9.权利要求5-8中任何一项的方法，其中所述与FZD10相关的疾病选自滑膜肉瘤、结肠直肠癌、胃癌、慢性髓细胞样白血病和急性髓细胞样白血病。
10.一种药物组合物，其包括针对FZD10的双链RNA分子或能够表达针对FZD10的双链RNA分子的表达载体，以及药物学上可接受的载体。
全文摘要
提供了用于抑制或减少FZD10基因表达的方法。同样地，提供了用于治疗和/或预防受试者中FZD10相关的疾病的方法。进一步提供的是包括针对FZD10的双链RNA分子或能够表达针对FZD10的双链RNA分子的表达载体的药物组合物。
文档编号A61K31/713GK1993466SQ20058002617
公开日2007年7月4日 申请日期2005年7月14日 优先权日2004年8月5日
发明者中村祐辅, 片桐丰雅, 福川千香子 申请人:国立大学法人东京大学, 肿瘤疗法科学股份有限公司