专利名称：提高肾素抑制剂生物利用度的方法
口服途径通常是最方便的施用途径，但不幸的是很多治疗剂由于其生物利用度差而口服无效。
很多治疗剂的生物利用度由于所谓的“外排泵”蛋白的作用而降低，该“外排泵”蛋白可主动地从细胞中排出外来物质而引起例如多药耐药效应。这些药物外排蛋白主要包括MDR(多药耐药蛋白)和MRP(多药耐药相关蛋白)类型的转运蛋白。一些进行过最佳研究的外排蛋白包括P-糖蛋白(Pgp或MDR1)和MRP2。
尽管存在于膜的外排蛋白众所周知是导致很多癌症患者重复化疗后产生的后天多药耐药综合症的因素，但仅仅在近期才在例如小肠、结肠、肝等正常组织中和血脑屏障的内皮细胞中发现了例如MDR1。这类外排蛋白在胃肠道(GI)、特别是在小肠和结肠的存在，与很多天然产物药物(包括抗癌剂长春碱和阿霉素)差的生物利用度有关。例如，很多化疗剂在口服时由于差的生物利用度和无法进入GI组织而不能表现出抗肿瘤活性。此外，存在于肝细胞的外排蛋白可另外通过经胆汁的消除而降低治疗剂的生物利用度(参见Faber等人，Adv.Drug Del.Rev.，55，107-124，2003)。
口服施用的治疗剂在到达靶部位前必须克服多个屏障。要通过的第一个主要障碍是肠上皮细胞。尽管亲脂的化合物能容易地扩散通过顶端的质膜，但无法保证随后通过基底外侧膜并进入血液。外排泵蛋白位于顶膜上，该膜包含多种ATP-结合盒式(ABC)族药物转运蛋白例如MDR1、MRP1和MRP2等ABC转运蛋白，可将化合物从细胞内运送回肠道腔中，通过阻止其吸收进血液中而限制它们的口服生物利用度。面对的第二个主要障碍是肝，在这里药物被被动转运或通过饱和转运过程由门脉血液通过肝细胞质(窦状隙)膜和胆(小管)膜进入胆汁。外排泵蛋白位于胆小管细胞膜上，该膜中也包含多种ABC族药物转运蛋白，例如MDR1、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和MRP2等ABC转运蛋白，可将药物化合物从肝细胞内转运到胆汁中，通过提高胆汁消除来限制它们的口服生物利用度。例如，已证实MDR1转运大多数HIV蛋白酶抑制剂并降低它们的口服生物利用度以及淋巴细胞、脑、睾丸和胎的穿透，可能对这些药物治疗有效性产生主要的限制作用。
因此，提高生物利用度的一种方法可以是共施用药物物质和外排蛋白抑制剂即抑制外排蛋白功能的化合物。换言之，当将外排蛋白抑制剂与治疗剂(其也是该特异性外排系统的底物)共施用时，可通过抑制从细胞内返回至肠道腔内的外排机制和/或通过抑制分泌进入胆汁来提高治疗剂的口服生物利用度和/或在靶部位的药理活性浓度。
但是，外排蛋白呈现低的底物特异性，并且转运多种分子。无法精确了解该特异性，并且没有办法通过药物物质的分子结构来预测药物物质是否为某种转运蛋白的底物。因此，一般无法预测一种特定药物或化合物是否受以上讨论的外排泵作用的影响。并且，如果一种特定药物具有低的口服生物利用度，一般无法预测该低的生物利用度是否全部或部分由以上讨论的外排蛋白引的，也无法预测是否能通过共施用外排蛋白抑制剂来提高低的生物利用度(参见Chan等人，Eur.J.Pharmaceut.Sci.，21，25-51，2004)。
令人惊奇地，已经发现例如在美国专利No.5,559,111、No.6,197,959和No.6,376,672(在这里引用其全部内容作为参考)中公开的多种肾素抑制剂为重要的外排系统的底物，并且被ABC族转运蛋白的成员特别是MDR1和MRP2主动转运。因此可通过抑制有关的外排机制、特别是通过抑制由MDR1和/或MRP2进行的药物转运来提高这些肾素抑制剂的生物利用度。
图1显示肾素抑制剂SPP100对于表达高水平的MDR1的细胞膜囊泡内ATP酶活性的影响。
图2显示肾素抑制剂SPP100通过Caco-2单层细胞在顶部(AP)至底部(BL)方向和BL至AP方向的双向转运。
图3显示MDR1抑制剂PSC833对于肾素抑制剂SPP100通过Caco-2单层细胞的通透性的影响。
图4显示在恒速静脉输注的过程中MDR1抑制剂PSC833对于肾素抑制剂SPP100在大鼠血浆中的浓度和胆汁清除率的影响。
图5显示在含有和不含有PSC833的单剂量口服施用后，肾素抑制剂SPP100在大鼠血浆中的归一化的剂量曲线下面积(AUC)值。
本发明所涉及的肾素抑制剂是那些在体内具有肾素抑制活性并且因此可用作药物的抑制剂，例如作为治疗高血压、充血性心力衰竭、心肥大、心脏纤维化、梗塞后心肌病、糖尿病引起的并发症如肾病、血管病和神经病、冠状动脉疾病、血管成形术后的再狭窄、眼内压升高、青光眼、异常血管增生、醛固酮增多症、焦虑状态和认知障碍的治疗剂。本发明特别涉及在美国专利No.5,559,111中公开的δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物。
因此，本发明提供了提高肾素抑制剂的生物利用度、优选提高口服生物利用度的方法，该方法包括对于需要这类治疗的哺乳动物、特别是人共施用肾素抑制剂和外排蛋白抑制剂的组合。以一定量施用外排蛋白抑制剂以使肾素抑制剂的生物利用度与没有外排蛋白抑制剂时的生物利用度(例如对人口服施用时为10％)相比得到提高。外排蛋白抑制剂和肾素抑制剂优选分别以一定的量共施用以使该组合具有所需的治疗作用，例如抗高血压作用。
特别地，本发明提供一种提高δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物的生物利用度的方法，该方法包括对于需要这类治疗的哺乳动物、特别是人共施用δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物或其可药用盐与外排蛋白抑制剂的组合。
用于肾素抑制剂特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物与外排蛋白抑制剂的组合的术语“共施用”，是指这两种成分可共同作为药物组合物或作为同一单一剂型的一部分而一起施用。共施用也包括分别、但作为同一治疗方案的一部分来施用肾素抑制剂特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物和外排蛋白抑制剂。如果分别施用，这两种成分不必一定在基本上相同的时间施用，尽管如果需要也可以。因此，共施用包括，例如将肾素抑制剂、特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物和外排蛋白抑制剂以单独的剂量或剂型在相同的时间给药。共施用也包括在不同时间和以任意顺序分别施用。
本发明的肾素抑制剂、特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物可以其可药用盐的形式、无水物形式或水合物形式或溶剂化物形式使用。所有这些形式均可用于本发明的范围之内。
本文所用的术语“外排蛋白抑制剂”是指任何抑制ABC转运蛋白的作用的化合物、药物或赋形剂化合物，例如在Bakos等人，Mol Pharmacol.，57，760-768(2002)和Maarten等人，AIDS，16，2295-2301(2002)中公开的那些。
另外，注意到提高了肾素抑制剂生物利用度的外排蛋白抑制剂可能是通过多种机制中的一种或多种起作用的。即，如本领域众所周知的那样，其可以是竞争性或非竞争性的抑制剂，或其可以通过混合机制起作用。这样的抑制剂能否影响某种特定肾素抑制剂的外排取决于多种因素，包括该肾素抑制剂与该外排蛋白抑制剂的相对亲合力；该肾素抑制剂和该外排蛋白抑制剂的相对水溶性，因为这可能影响这两种化合物当其竞争时在体内外排泵中的浓度；该外排蛋白抑制剂的绝对水溶性，因为其必须在体内外排泵中达到足够的浓度以有效抑制外排；以及外排蛋白抑制剂的剂量。对于本发明的目的而言，外排蛋白抑制剂是任何可提高通过口服或任何其他途径给药的肾素抑制剂的系统暴露量的化合物，并且其是在肠上皮细胞或肝细胞内的一种或多种药物外排蛋白/活性的底物和/或抑制剂。
如上所述，本发明提供提高肾素抑制剂、特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物的生物利用度的方法，该方法包括共施用肾素抑制剂和外排蛋白抑制剂的组合。
本发明的外排蛋白抑制剂优选为MDR1抑制剂，例如PSC833。
优选将本发明的具有式(I)结构的δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物或其可药用盐与MDR1抑制剂例如PSC833共施用， 其中R1为C1-4烷氧基-C1-4烷氧基或C1-4烷氧基-C1-4烷基；R2为C1-4烷基或C1-4烷氧基；并且R3和R4独立地为支链C1-4烷基。
更优选将本发明的具有式(I)结构的δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物或其可药用盐与MDR1抑制剂例如PSC833共施用，其中R1为3-甲氧基丙氧基；R2为甲氧基；并且R3和R4为异丙基。
最优选将选自(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基-丙氧基)-苄基]-8-甲基-壬酸(2-氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-酰胺半富马酸盐(也称为SPP100)的本发明的δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物与MDR1抑制剂例如PSC833共施用。
如上所公开，可将肾素抑制剂，特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物和外排蛋白抑制剂作为药物组合物共施用。这些成分可以任何常规剂型进行施用，通常也可与可药用载体或稀释剂一起施用。
对于口服施用的包含肾素抑制剂、特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物和外排蛋白抑制剂的药物组合物，可采用溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、微乳剂、单剂量药包等形式。优选为片剂和明胶胶囊，其包含活性成分和a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂还有c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐，或泡腾混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。可注射组合物优选为水等渗溶液或混悬液，并且最好利用脂肪乳浊液或混悬液来制备栓剂。
所述组合物可以是灭菌的和/或含有辅助剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们也可包含其他有治疗价值的物质。可按照常规的混合、制粒或包衣方法分别制备上述组合物，并可含有约0.1-75％、优选约1-50％的活性成分。
更具体地说，本发明提供包含治疗有效量的肾素抑制剂、优选δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物和外排蛋白抑制剂的组合的药物组合物，所述外排蛋白抑制剂的含量可在施用后将肾素抑制剂的生物利用度提高至少5％。
本发明的药物组合物优选含有MDR1抑制剂，例如PSC833。
本发明的药物组合物优选包含式(I)所示的δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物或其可药用盐和MDR1抑制剂例如PSC833， 其中R1为C1-4烷氧基-C1-4烷氧基或C1-4烷氧基-C1-4烷基；R2为C1-4烷基或C1-4烷氧基；并且R3和R4独立地为支链C1-4烷基。
本发明的药物组合物更优选包含式(I)所示的δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物或其可药用盐和MDR1抑制剂例如PSC833，其中R1为3-甲氧基丙氧基；R2为甲氧基；且R3和R4为异丙基。
本发明的药物组合物最优选包含(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基-丙氧基)-苄基]-8-甲基-壬酸(2-氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-酰胺半富马酸盐和MDR1抑制剂例如PSC833的组合。
优选将肾素抑制剂特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物例如SPP100或其可药用盐的生物利用度提高至少5％。
按照本领域已知的方式通过测定AUC来评估药物生物利用度，其中AUC是沿纵轴(Y轴)的血清或血浆药物浓度相对于沿横轴(X轴)的时间作出的曲线下面积(AUC)。通常，AUC值表示取自测试人群的所有对象的多个值并因此是整个测试人群的平均值。
相对于在不含外排蛋白抑制剂的情况下施用肾素抑制剂，共施用肾素抑制剂和外排蛋白抑制剂也可增加Cmax，这是本发明提供的另一方面。Cmax作为测试对象血清或血浆中的最大药物浓度的缩写在本领域也是众所周知的。
因为本发明一方面涉及利用可分别进行共施用的化合物的组合来治疗，本发明还涉及以药盒形式组合的不同的药物组合物。该药盒包含两种不同的药物组合物(1)包含肾素抑制剂特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物加上可药用载体或稀释剂的组合物；和(2)包含外排蛋白抑制剂加上可药用载体或稀释剂的组合物。(1)和(2)的量在分别共施用时可将肾素抑制剂特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物的生物利用度提高至少5％。药盒包含如分离的瓶或分离的箔包装这样的装有不同组合物的容器，其中每个室含有包含(1)和(2)的多个剂型(例如片剂)。或者，与分开含有活性成分的剂型相比更为优选的是，使药盒包含分离的室，每个隔室含有一个完整的剂量，所述完整的剂量包含不同的剂型。这种类型的药盒的一个例子是凸泡包装，其中每个独立的凸泡含有两片(或更多片)的片剂，一片(或多片)片剂含有药物组合物(1)，第二片(或多片)含有药物组合物(2)。一般该药盒包含不同成分施用的说明。当各成分优选以不同剂型施用(例如，口服和非胃肠道)、以不同剂量间隔施用或需要由处方医生滴定组合中的各成分时，该药盒形式特别有利。在这样的情况下本发明的药盒因而包含(1)治疗有效量的包含肾素抑制剂特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物例如SPP100或其可药用盐和可药用载体或稀释剂的组合物，为第1剂型；
(2)包含一定量的外排蛋白抑制剂和可药用载体或稀释剂的组合物，上述剂量在施用时可将肾素抑制剂特别是δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物例如SPP100或其可药用盐的生物利用度提高至少5％，为第2剂型；和(3)装有所述的第1剂型和第2剂型的容器。
最后，本发明涉及外排蛋白抑制剂特别是MDR1抑制剂例如PSC833，用于制备可提高肾素抑制剂、优选为δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物例如SPP100或其可药用盐的生物利用度、优选口服生物利用度的药物的用途。
可鉴别参与药物物质外排的外排蛋白，并确定相关的动力学参数，即，Michaelis-Menten常数和最大药物转运系数(Km和Jmax)，使用的方法是本领域已知的，例如使用表达高水平的所选ABC转运蛋白的Sf9(草地夜蛾)细胞膜囊泡进行的ATP酶测定。在该测定中，ABC转运蛋白利用ATP水解作为能源将底物转运出细胞。ATP水解产生可通过简单的比色反应检测的无机磷酸盐(Pi)。转运蛋白释放的Pi量与转运蛋白的活性成正比。包含ABC转运蛋白的细胞膜制剂显示了随不同转运蛋白而变化的基线ATP酶活性。被转运的底物增加了基线ATP酶活性，而抑制剂抑制了有刺激剂存在时所测定的基线ATP酶活性和/或ATP酶活性。激活和抑制研究都可进行。如本文实施例1(图1)所说明，SPP100增加了在表达高水平MDR1的细胞膜囊泡中的ATP酶活性，Km值约为3μM，提示在SPP100转运中参与的外排系统可能是MDR1。
或者，在体外转运蛋白对于药物物质的亲合力可通过Caco-2细胞测定来确定和估算，例如Camenisch等人在Pharm.Act.Helv.71，309-327(1996)中所述或如在本文实施例中所说明的。转运蛋白的鉴别和化合物抑制参与的外排系统的有效性也可在Caco-2细胞测定中得到确定。例如，SPP100被鉴别为低到中等的可通透化合物(固有通透性＜80％)，另外为主要的外排系统的底物(图2)。但是，在有MDR1抑制剂PSC833时SPP100的通透性显著增加，即，PSC833抑制了SPP100的外排，IC50值约为0.1μM(图3)。
外排蛋白抑制剂例如MDR1抑制剂的共施用对于肾素抑制剂的胆汁排泄的影响，可通过比较在有和没有外排蛋白抑制剂时排泄进胆汁中的化合物量来研究。例如，在有PSC833时SPP100的胆汁清除率与对照组相比下降了97％(图4)。
类似地，在体内外排蛋白抑制剂例如MDR1抑制剂的共施用对于肾素抑制剂的生物利用度的影响，可通过比较在有和没有外排蛋白抑制剂时的药物动力学参数Cmax和AUC来研究。如本文实施例4(图5)中所说明的那样，口服施用大鼠的SPP100剂量归一化AUC(0-t最后)在有PSC833时与单独施用SPP100的对照组相比增加了约70倍。
上述描述充分公开了包括其优选实施方案的本发明。对本文具体公开的实施方案的修正和改进在以下权利要求的范围内。无需更详细说明，可以相信本领域技术人员能够使用前面的描述来最大程度地利用本发明。因此，本文的实施例是仅仅用作说明的，并没有以任何方式对本发明范围进行限制。
实施例1ATP酶测定通过在pH 7.4及37℃的转运缓冲液中、在不同的药物物质浓度
下，通过在有和没有刺激剂(40μm维拉帕米用于MDR1、10mM NEM-GS用于MRP1、1mM丙磺舒用于MRP2)时培育纯化的细胞膜囊泡来测定由人MDR1、人MRP1或人MRP2介导的外排。
可在常用的有机溶剂例如二甲亚砜、乙醇、甲醇及乙腈中制备感兴趣的治疗剂的5mM储备液，将储备液或它的稀释液加入到测定混合物中以产生上述的最终浓度，并且使用的有机溶剂为总体积的2％(v/v)。在该测定中使用的所有溶液保持在pH 7.4。
将保持在-80℃的细胞膜囊泡用于ATP酶试验。转运蛋白介导的外排可如文献(Sarkadi，B.Price，E.Boucher，R.Germann，U.和Scarborough，G.J.Biol.Chem.1992，2674854-4858)所述来确定。简单地说，在有和没有测试药物、刺激剂(60mM的Na3VO4和2mM的谷胱甘肽)(仅用于MRP1和MRP2转运蛋白)的条件下将膜悬浮液移入96孔板并转移至37℃预培养5分钟。通过加入25mM Mg-ATP溶液然后在37℃培养(MDR1为20分钟、MRP1为60分钟、MRP2为30分钟)来开始ATP酶反应。然后，通过加入SDS(5％)至每一培养物来停止ATP酶反应。添加钼酸铵/醋酸锌比色检测试剂后，将板在37℃再培养25分钟。
培养后在730nm测定OD。利用事先测定的磷酸盐标准曲线可以计算出释放的Pi[nmol/孔]。OD值将以所完成试验的平均值±标准偏差(n＝2)来表示。使用Microsoft EXCEL 5.0c完成所有统计分析。
为了计算每种药物和测定药物浓度的所谓特异性(Na3VO4敏感的)转运蛋白ATP酶的活性，必须从没有Na3VO4时测定的Pi值中减去有Na3VO4存在的Pi值。以释放的Pi/mg细胞膜蛋白/分钟表示的Na3VO4敏感性转运蛋白活性可通过将该数值除以加入每个孔中的细胞膜蛋白的量及以分钟为单位的培养时间来确定(图1)。
实施例2Caco-2细胞测定将在PET滤器生长21～25天的Caco-2单层细胞用于该转运试验。通过在PET滤器上生长的Caco-2单层细胞的化合物的通量与通过没有Caco-2细胞的PET滤器本身的化合物的通量用如下方法进行确定在进行转运试验之前，用在37℃预培养的接受溶液(当相应包含感兴趣的抑制剂时的HBSS)代替接受室的培养基(0.2mL用于顶端，1.0mL用于底部)。开始试验，用在37℃预培养的供体溶液(当相应包含感兴趣的抑制剂时在HBSS中的化合物)代替供体室的培养基(0.35mL用于顶端，1.15mL用于底部)。在约1分钟及120分钟后从供体侧和接受侧取出150μL的等分试样。在顶端至底端方向和底端至顶端方向的转运试验都在37℃无摇动的培养箱中进行3次。
通过测定在相同批次细胞中的全部6个代表性的细胞单层(每种化合物为3个)在120分钟内≤0.1μM的[3H]-甘露醇和≤0.1μM的[3H]普萘洛尔由顶端侧至底部的通透性，可检查Caco-2细胞对于转运试验的适用性。
通过液体闪烁计数来分析放射活性样品。将所有其他的非放射活性标记样品在-20℃冷冻直到用液相色谱/质谱联用法(LC-MS/MS)进行分析为止。
利用以下公式(Artursson等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.175880-885，1991)来确定检测化合物的转运值Papp=ΔQΔt·A·C0]]>其中Papp(cm/min)为表观通透性系数，ΔQ为t时间在接受室中测定的化合物的量，Δt(分钟)为培养时间，Co(μg/mL)为在供体室的化合物的初始浓度，并且A(cm2)为细胞膜的表面积。
对于标记的样品，将定量限(LOQ)作为由放射性大小得到的最低样品浓度值，其要显著地高于测量的空白值并且对于其的测量标准差低于20％。在本研究的条件下，对于[14C]标记的SPP100的绝对放射活性的LOQ为2dpm，相当于12nmol/L。
Papp值以所进行的转运试验的平均值±标准偏差(n＝3)表示。任意两个给出的数据组之间的差别的统计学意义通过t检验进行检查。显著差别的概率水平规定为p＜0.025。使用Microsoft EXCEL 5.0c完成所有统计分析。
对于浓度为1μM的SPP100，在120分钟的时间间隔内可检测到约0.2×10-5cm/min的由顶端至底端的转运。另一方面，底端至顶端的转运的通透值约为10×10-5cm/min，其显著地高于顶端至底端的转运。
对于浓度为1、5、10及50μM的SPP100观察到了由顶端至底端的转运逐渐增加，在10μM时接近约7×10-5cm/min的稳态通透值。另一方面，由底端至顶端的转运随着浓度的增加没有显著的改变。
SPP100的Caco-2转运的回收值(1、5、10及50μM)普遍很高(＜100％)，表明SPP100不与滤器支持物或培养器具中的塑料结合。
细胞旁标记物甘露醇和跨细胞标记物普萘洛尔的由顶端至底端的通量通常分别低于阈值Papp值3×10-5cm/min和90×10-5cm/min。确定的顶端至底端的过滤通透性普遍高于相应的Caco-2通透性数据，表明过滤扩散对于Caco-2转运来说不是速率限制步骤(图2和3)。
实施例3大鼠原位胆管插管试验下述研究用于阐明MDR1和/或MRP2参与的SPP100在大鼠中的胆汁排泄。因此，施用PSC833(一种已知的MDR1和MRP2的抑制剂)或丙磺舒(一种已知的MRP2选择性抑制剂)之前和之后在恒速静脉输注[14C]标记的SPP100半富马酸盐期间评价在胆管插管和麻醉的雄性大鼠中SPP100的胆汁清除率。
可使用的动物为例如雄性白化HANWIST大鼠，每个治疗组4～5只动物。
施用在0.9％氯化钠中的[14C]标记的SPP100半富马酸盐，并且施用在1/3/1比例的乙醇/聚乙二醇200/5％葡萄糖溶液混合物中的PSC833和丙磺舒。
在全部治疗组中，通过静脉推注(2mL/kg)的[14C]标记SPP100半富马酸盐推注溶液(0.015mg碱/mL)并随后静脉输注(6.67mL/h/kg)的[14C]标记SPP100半富马酸盐输注溶液(0.022mg碱/mL)，可获得在血浆中的母体化合物的恒定浓度。
两小时后进行以下化合物的静脉推注·治疗组11/3/1的乙醇/聚乙二醇200/5％葡萄糖溶液混合物(5mL/kg；溶媒)·治疗组210mg/kg剂量的PSC833；和·治疗组350mg/kg剂量的丙磺舒。
在治疗后0.5、1、1.33、1.67、2、2.33、2.67、3小时收集所有治疗组的血液样品并将血液立刻加工成血浆。胆汁收集时间为1至3小时，间隔20分钟。
测定方法
·所有样品的总放射活性LSC；血浆和胆汁的LOQ为3.4μg/L；和·测定所选择的样品池的代谢模式带有放射活性检测装置的HPLC。
在将溶媒(乙醇/聚乙二醇200/5％葡萄糖溶液)静脉施用后，发现在14C标记的SPP100半富马酸盐恒速输注给胆管插管的大鼠期间，对血浆中的14C浓度和14C标记化合物的胆汁清除率没有影响。
在施用PSC833后，14C浓度显示出在血浆中的时间依赖性增加和在胆汁中显著降低的趋势。14C标记化合物最终的胆汁清除率大约为PSC833施用前值的7％。
在施用丙磺舒后，发现对在胆管插管的大鼠中14C标记的化合物的血浆浓度没有影响。但是，丙磺舒导致胆汁流量的增加(施用后的值比施用前的值大约高65％)并降低在胆汁中14C的浓度(施用后的值比施用前的值大约低40％)。然而，胆汁清除率在两个时间间隔是相似的(丙磺舒施用前和后)。
由这些结果(图4)可以推断，MDR1似乎在SPP100及SPP100相关化合物的胆汁清除中起着重要的作用。此外，MRP2似乎不参与SPP100及SPP100相关化合物的胆汁排泄。
实施例4体内生物利用度试验以下试验可用于研究雄性大鼠单剂量口服施用SPP100半富马酸盐并且联合或不联合口服施用PSC833后的SPP100相对口服生物利用度。为了说明对于共施用PSC833的剂量依赖，在服用限定剂量的SPP100半富马酸盐(6mg游离碱/kg)条件下服用不同剂量的PSC833(0、5、12.5、25和50mg/kg)。
可使用的动物为例如雄性白化HANWIST大鼠，每个治疗组5只动物。
施用在0.9％氯化钠溶液中的SPP100半富马酸盐，并且施用在1/3/1比例的乙醇/聚乙二醇200/5％葡萄糖溶液混合物(溶媒)中的PSC833。
首先，通过管饲法给大鼠施用溶媒(5mL/kg)，再施用SPP100半富马酸盐(2mL/kg)(时间间隔2至3分钟)。所有大鼠接受6mg游离碱/kg剂量的SPP100半富马酸盐。施用以下剂量的PSC833·治疗组1和61/3/1的乙醇/聚乙二醇200/5％葡萄糖溶液混合物(5mL/kg；溶媒)；·治疗组250mg/kg的PSC833；·治疗组325mg/kg的PSC833；·治疗组412.5mg/kg的PSC833；和·治疗组55mg/kg的PSC833。
在施用后0.25、0.5、1、2、4、8、24和48小时舌下收集血液样品。血浆用于生化分析。
分析方法HPLC-MS/MS，其以SRM阳性方式使用APCI分析SPP100，血浆最低LOQ范围为0.6ng/mL-0.7ng/mL。
在口服SPP100半富马酸盐(6mg碱/kg)和溶媒的大鼠中，一直到施用后2小时才在血浆中检测到SPP100。施用后Cmax达到约24.8±27ng/mL并且tmax达到0.44±0.1h。剂量归一化的AUC(0-t最后)值为2.38±3.4[(ng*h/mL)/(mg/kg)]。
在口服SPP100半富马酸盐(6mg碱/kg)和PSC833(5、12.5、25及50mg/剂)的大鼠中，一直到施用后24或48小时才在血浆中检测到SPP100。对比接受溶媒的大鼠，分别给予5、12.5、25及50mg/kg剂量的PSC833后，Cmax值增加到35.7±18、115±93、81.4±19和26.7±18ng/mL，并且tmax值增加到4.8±1.8、4.95±4.2、15.2±18和3.06±1.9h。分别以5、12.5、25和50mg/kg剂量共施用PSC833后，剂量归一化的AUC(0-t最后)值约高于溶媒组约23、69、76和17倍。无法给出50mg/kg剂量的PSC833与25mg/kg剂量的PSC833相比frel值相对较低的原因(图5)。
通过这些结果可推断，ABC外排转运蛋白MDR1和MRP2中的至少一种或两种似乎在口服施用SP100后在系统暴露的程度中起着重要的作用。
实施例5(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基-丙氧基)-苄基]-8-甲基-壬酸[14C]-(2-氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-酰胺，[14C]-SPP100，半富马酸盐 A.氰基-[14C]-二甲基-乙酸甲酯在室温下，向安瓿中加入在甲醇(2mL)中的甲醇钠(119mg，2.2mmol)溶液。在0℃下加入氰基乙酸甲酯(99mg，1.0mmol)。将混合物在室温下振摇几分钟并接着在氮气下冷冻至-192℃，将[14C]标记的甲基碘(3.7GBq，2.04GBq/mmol，1.82mmol，可由Amersham Biosciences获得)真空转移至反应混合物中。真空下密封安瓿并使其在1小时内缓慢温热到室温。在50℃下振荡安瓿16小时。接着将安瓿再冷冻至-192℃并利用冷冻干燥法除去挥发性溶剂和未反应的[14C]甲基碘。然后通过GC分析粗品氰基-[14C]-二甲基-乙酸甲酯以确保形成的一甲基化的副产物＜0.2％。然后不必进一步纯化而将该原料用于下一步骤。
B.2-氰基-2，2-[14C]-二甲基-乙酰胺将氨气在室温下通入含有干燥甲醇的烧瓶30分钟或直至摩尔浓度为5M或5M以上。在室温下往粗品标题A化合物氰基-[14C]-二甲基-乙酸甲酯中加入新制备的含有5.5M NH3的甲醇溶液(3mL，16.5mmol)。室温下搅拌反应2小时直至按照以下方法通过GC分析证明所有起始原料转变为腈产物70℃下10分钟，接着以10℃/分钟升高温度至200℃，然后在200℃停留10分钟。反应完成后，利用冷冻干燥法除去溶剂并利用快速色谱法(乙酸乙酯→乙酸乙酯/10％甲醇)纯化产物得到2.813GBq的2-氰基-2，2-[14C]-二甲基-乙酰胺。
C.3-氨基-2，2-[14C]-二甲基-丙酰胺室温下往新纯化的标题B化合物2-氰基-2，2-[14C]-二甲基-乙酰胺(2.813GBq、77mg、0.69mmol)中加入新制备的5.5M的甲醇氨溶液，再加入5％Rh/Al2O3(33mg)。在55℃下搅拌反应达5小时并利用GC每1小时进行检测直至所有反应原料转化为产物。GC方法80℃下1分钟，接着以20℃/分钟升高温度至240℃，然后在240℃停留1分钟。反应完成后，通过硅藻土(Hyflo)过滤混合物，用旋转蒸发器除去溶剂并利用快速色谱法(CH2Cl2/2％MeOH/NH3→CH2Cl2/5％MeOH/NH3→CH2Cl2/10％MeOH/NH3)纯化产物得到白色固体状的2.7GBq的3-氨基-[14C]2，2-二甲基-丙酰胺。该产物可以固体形式保存1星期以上。对于长时间保存，可将3-氨基-2，2-[14C]-二甲基-丙酰胺以不大于50MBq/mL的浓度在-80℃下溶解于乙醇/20％甲苯中。
D.(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基-丙氧基)-苄基]-8-甲基-壬酸[14C]-(2-氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-酰胺，[14C]-SPP100，半富马酸盐可按照本领域已知的方法，例如在美国专利No.6,730,798中所述方法，将标题C化合物3-氨基-2，2-[14C]-二甲基-丙酰胺用于标题D化合物[14C]标记的SPP100半富马酸盐的制备。
权利要求
1.提高肾素抑制剂生物利用度的方法，该方法包括对于需要这类治疗的哺乳动物共施用肾素抑制剂和外排蛋白抑制剂的组合。
2.根据权利要求1的方法，其中外排蛋白抑制剂为MDR1抑制剂。
3.根据权利要求1或2的方法，其中肾素抑制剂为δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物或其可药用盐。
4.根据权利要求3的方法，其中δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物为具有式(I)结构的化合物或其可药用盐， 其中R1为C1-4烷氧基-C1-4烷氧基或C1-4烷氧基-C1-4烷基；R2为C1-4烷基或C1-4烷氧基；且R3和R4独立地为支链C1-4烷基。
5.根据权利要求4的方法，其中δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物为具有式(I)结构的化合物或其可药用盐，其中R1为3-甲氧基丙氧基；R2为甲氧基；且R3和R4为异丙基。
6.根据权利要求5的方法，其中δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物为(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基-丙氧基)-苄基]-8-甲基-壬酸(2-氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-酰胺半富马酸盐。
7.根据权利要求6的方法，其中MDR1抑制剂为PSC833。
8.药物组合物，该组合物包含治疗有效量的肾素抑制剂和外排蛋白抑制剂，所述的外排蛋白抑制剂的量可在施用后将肾素抑制剂的生物利用度提高至少5％。
9.根据权利要求8的药物组合物，其中外排蛋白抑制剂为MDR1抑制剂。
10.根据权利要求8或9的药物组合物，其中肾素抑制剂为δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物或其可药用盐。
11.根据权利要求10的药物组合物，其中δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物为具有式(I)结构的化合物或其可药用盐， 其中R1为C1-4烷氧基-C1-4烷氧基或C1-4烷氧基-C1-4烷基；R2为C1-4烷基或C1-4烷氧基；且R3和R4独立地为支链C1-4烷基。
12.根据权利要求11的药物组合物，其中δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物为具有式(I)结构的化合物或其可药用盐，其中R1为3-甲氧基丙氧基；R2为甲氧基；且R3和R4为异丙基。
13.根据权利要求12的药物组合物，其中δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物为(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基-丙氧基)-苄基]-8-甲基-壬酸(2-氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-酰胺半富马酸盐。
14.根据权利要求13的药物组合物，其中MDR1抑制剂为PSC833。
15.外排蛋白抑制剂在制备用于提高肾素抑制剂或其可药用盐的生物利用度的药物中的用途。
16.根据权利要求14的用途，其中外排蛋白抑制剂为MDR1抑制剂。
17.根据权利要求15或16的用途，其中肾素抑制剂为δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物或其可药用盐。
18.根据权利要求17的用途，其中δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物为具有式(I)结构的化合物或其可药用盐， 其中R1为C1-4烷氧基-C1-4烷氧基或C1-4烷氧基-C1-4烷基；R2为C1-4烷基或C1-4烷氧基；且R3和R4独立地为支链C1-4烷基。
19.根据权利要求16的用途，其中δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物为具有式(I)结构的化合物或其可药用盐，其中R1为3-甲氧基丙氧基；R2为甲氧基；且R3和R4为异丙基。
20.根据权利要求17的用途，其中δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸酰胺衍生物为(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基-丙氧基)-苄基]-8-甲基-壬酸(2-氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-酰胺半富马酸盐。
21.根据权利要求20的用途，其中MDR1抑制剂为PSC833。
全文摘要
本发明提供了提高肾素抑制剂、优选δ－氨基－γ－羟基－ω－芳基－链烷酸衍生物的生物利用度的方法，该方法包括对于需要这类治疗的哺乳动物、特别是人共施用肾素抑制剂或其可药用盐和外排蛋白抑制剂的组合。
文档编号A61K38/13GK1993116SQ200580026174
公开日2007年7月4日 申请日期2005年8月2日 优先权日2004年8月3日
发明者G·P·卡梅尼施, G·格罗斯, I·奥汀格尔, D·瓦斯穆特 申请人:诺瓦提斯公司