专利名称：修饰的2，4-二氧四氢蝶啶合酶的分离的嵌合蛋白的制作方法
修饰的2，4-二氧四氢蝶-定合酶的分离的嵌合蛋白发效拔^说效包括插入布鲁氏菌属的2， 4-二氧四氢蝶啶合酶氨基末端的达到 十个拷贝的肽、多肽或蛋白结构域的分离的嵌合蛋白。编码该嵌合蛋 白的分离的核苷酸序列。用于表达该蛋白的载体、质粒和转化细胞。 由该嵌合蛋白产生的单克隆和多克隆抗体。产生单克隆抗体的杂交瘤。 包含嵌合蛋白、核苷酸序列和抗体的疫苗和药物化合物。 一种在高等 生物中诱导免疫反应的方法，包括给予有效量的疫苗和药物化合物。 包括该嵌合蛋白的生物传感器。由该嵌合蛋白和配体通过共价和非共 价键结合形成的蛋白缀合物。该嵌合蛋白、核苷酸序列、栽体、质粒、 转化细胞、抗体、杂交瘤、缀合物、生物传感器、疫苗和药物化合物 的用途。该嵌合蛋白的四级结构。本发明涉及由布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶与肽、多肽或 蛋白结构域连接得到的经修饰蛋白形成的嵌合蛋白。嵌合蛋白具有在 高等动物中诱导免疫反应和用于其他目的的用途。本发明还涉及包含 与该经修饰蛋白结合的抗原或抗体、或抗原或抗体的片段的药物化合 物。活减毒疫苗的大规模应用带来了若干经济和健康不便。例如，当 活疫苗被减毒后，它们的免疫原性能力常常降低。参见Leclerc， et al.， Immunol. Today, 19 (7): 300-302， (1998) ; Nieba， et al.， Mod. Asp. Immunobiol. ， 1 (2): 36-39 (2000)。另一个不便是减毒作 用被逆转和微生物恢复其疾病诱导性能的可能性。参见
N. Eng. J Med. , 316:673-678 (1998)。因此，在过去的几年里， 趋势一直是基于从细菌或病毒分离的单独化合物配制非细胞疫苗。通 常，这些单独的化合物，象微生物所特有的蛋白，具有低免疫原性。 使用佐剂已经克服了这个限制。然而，有的蛋白甚至在佐剂存在下仍 显示低免疫原性。已提出了几个蛋白质工程策略来克服这些困难。参 见Leclerc， et al. , Immunol. Today, 19 (7): 300—302 (1998)。病毒壳体蛋白能够形成三维有序颗粒，称为"病毒样颗粒"。这 些颗粒具有与完整病毒相同的大小和形状。然而，它们内部是空的并 且没有遗传物质，致使它们没有产生感染的能力。它们的大尺寸和顺 序为它们提供了显著的免疫原性。参见Bachmann，et al. ， Science, 262:1448-1451 (1993)。市场上普遍合格的抗乙型肝炎的重组疫苗是 基于这个概念。为了生产抗某些致病微生物的疫苗，"病毒样颗粒" 已经用作插入这类病原体特征性的肽的载体。参见WO 0032227 (Renner， et al.); WO 0185208 (Bachmann， et al.)。为了给肽提供 载体的辅佐性能，在免疫原性十足的载体中插入多拷贝的肽是有利策 略。然而，这个方法遇到了许多困难由于这些颗粒的尺寸巨大，在 它的复合蛋白中肽的任何插入都妨碍它的正确折叠和，在很多情况下， 降低它的稳定性。此外，只有少数蛋白位点能够接受肽插入，而不改 变它们的一般结构。参见Nieba， et al. Mod. Asp. I画nobiol.， 1 (2): 36-39 (2000)。一些细菌蛋白已被假定作为开发嵌合疫苗的载体。参见Leclerc， et al. ， Immunol. Today, 19 (7): 300-302 (1998)。霍乱毒素的B 亚单位是稳定的五聚蛋白，已用来从粘膜获得抗插入肽的免疫反应。 由于这种毒素穿透胃粘膜的能力，这个策略已经成功。参见Arakawa， et al. Nature Biotech. ， 16:934-938 (1998)。嗜热脂肪芽孢杆菌 的二氢硫辛酸脱氢酶也已被假定作为蛋白载体，因为它形成复合物和 非常稳定的聚合结构。参见Domingo， et al, ， J Mol. Biol. ， 305: 259-267 (2001); WO 0142439 (Domingo, et al.)。2，4-二氧四氢蝶啶合酶催化核黄素生物合成途径中的倒数第二 步。参见Goldbaum， etal.， J Med Microbiol. ， 48: 833-839 (1999)。 它的活性位点位于单体当中的中间相，使得这种蛋白具有很稳定的聚 合次序。参见Ritsert， et al. J Mol. Biol. ， 253: 151-167 (1995)。 这些次序在形成五聚和二十面体颗粒的蛋白之间有变化。参见 Braden, et al.， J Mol. Biol. ， 297:1031-1036 (2000)。枯草芽孢 杆菌2，4-二氧四氢蝶啶合酶的二十面体结构已被假定作为插入肽和 开发疫苗的载体。参见W0 0053229 (Bacher， et al.).布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶是一种非常稳定的蛋白。已 经证明这种18-kDa蛋白是用于人和动物布鲁氏菌病的血清学诊断的 有用才示^己。参见Goldbaum, et al. ， J. Clin. Microbiol. ， 30: 604-607 (1992); Goldbaum， et al. ， J Clin. Microbiol.， 31:2141-2145 (1993) ; Baldi， etal.， Clin. Diag. Lab. Immunol.， 3 (4) : 472-476 (1996)。根据X-射线晶体衍射法分析的免疫化学、 酶作用和三维结构，原始未经修饰蛋白当重组表达时，显示出与天然 蛋白相同的折叠。参见Braden， etal.JMol. Biol. ， 297: 1031-1036 (2000); Goldbaum, et al. ， J Med. Microbiol. ， 48:833-839 (1999); Goldbaum, et al. ， J. Struct. Biol. ， 123: 175-178 (1998)。结 构表明这种18-kDa蛋白在溶液中表现为180-kDa十聚体，变成2， 4-二氧四氢蝶啶合酶的新型四元排列。参见Zylberman， et al. ， J Biol. Chem. ， 279 (9): 8093-8101 (2004)。已假定布鲁氏菌属的2， 4-二氧四氢蝶啶合酶的免疫原性主要源 自于它的聚合特性。参见Baldi， et al.， Braz. J Med. Biol. Res. ， 33:741-747 (2000)。该结构也表明10个氨基酸的氨基末端既 不参与一般折叠也不参与单体当中的联系。参见Braden， et al. J Mol.
Biol. ，297:1031-1036 (2000)。布鲁氏菌属的2，4-二氧四氩蝶咬合 酶是一种能够在鼠模型中产生高体液和细胞免疫反应的强大免疫原。 当用重组未经修饰蛋白和用编码该蛋白的质粒谦导免疫(基因治疗、 DNA疫苗接种)时，已经证实了这个能力。参见Velikovsky， et al.， J. Immunol. Meth. ， 244 (1-2) :1-7 (2000)。通过改变免疫途径和使 用的佐剂有可能调节该反应。参见Velikovsky, et al. ， Infec. Iramun,， 70 (5) :2507-11 (2002)。尤其是，有可能建立强烈的TH1型反 应，其将是布鲁氏菌病中具有最高保护能力的反应。参见Velikovsky, et al. Infec. Immun. ， 70 (5): 2507-11 (2002)。然而，本领域仍然需要通常可用于展示肽、多肽和蛋白，和特别 是展示抗原或免疫反应诱导物的具有较小稳定结构的新载体。本领域 尚未描述过2，4-二氧四氢蝶啶合酶十聚体结构作为这种类型载体的 开发和应用。微^參^沐减pBLS-0MP31质粒于2004年4月1日保藏在德国D-38124 Braunschweig, Mascheroder Weg IB的德意志微生物保藏中心 (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zel lkulturen)， 保藏号为DSM 15546。餘思说效
图1显示了表达载体pETlla (Novagen， USA)中的克隆BLS基因 5'末端的核苷酸和氨基酸序列和所产生的盒。粗体部分显示了编码区。 红色部分显示了盒中的突变碱基。用黄色突出显示的部分显示了新的 限制性酶切位点。图2显示了用于产生BLS-0MP31嵌合体的寡核苷酸。它们的退火 引起对应于Nsil (5'末端)和Af111 (3'末端)限制性内切酶的粘性位
点的出现，嵌合体中插入的27个氨基酸的序列(在下面，以粗体显示) 位于它们当中。也显示了产生的蛋白单体的理论分子量(19， 977. 5道 尔顿)和所插入肽的理论等电点(pl=6. 00)。图3显示a)pETlla质粒方案，包含BLS-0MP31嵌合体序列，显 示了克隆时使用的限制性酶切位点，b)包括BLS-0MP31嵌合体的 pETlla质粒的完整核苷酸序列和c) BLS-0MP31嵌合体的开放读框。图4描述了在17。/。丙烯酰胺中通过SDS-PAGE分析的BLS-0MP31的 表达。MW:以千道尔顿表示的分子量标记，1:纯化的BLS， 2和3: 两个BLS-0MP31克隆的等份表达培养物。蛋白迁移如同20-KDa单体， 因为凝胶是变性的。图5描述了在17。/。丙烯酰胺中通过SDS-PAGE分析的BLS-0MP31的 表达。1:没有诱导的培养物，2:用lmM IPTG诱导的培养物，3:胞 质部分，4:重悬于8M尿素中的包含体部分箭头显示相当于BLS-0MP31 的条带。(LMWM -低分子量标记，以千道尔顿表示的重量)。图6显示了相当于BLS-0MP31在Superdex 200 (Pharmacia, USA) 柱中洗脱的色镨图。然后用凝胶分析峰并计数。参见图7。图7显示了在17。/。丙烯酰胺中通过SDS-PAGE分析的BLS-0MP31的 纯4匕数据。1和2:以BLS-0PM31洗脱梯度通过Sepharose (Pharmacia, USA)柱获得的峰，4和5:与图6中的峰相关的峰数目。(LMWM =低分 子量标记，以千道尔顿表示的重量)。图8显示了 BLS和BLS-0MP31嵌合体的圆二色性语。用分光偏振 计(Jasco， UK)监测190和260 nm之间的1. OyM蛋白溶液的摩尔椭圆 性(elipticity )。
图9描述了 BLS-0MP31嵌合体相对于天然蛋白的稳定性的比较分 析。该曲线显示了在浓度不断增加的变性盐酸胍化学试剂存在下对解 叠的敏感性，用分光偏振计在222認下的由蛋白产生的椭圆性来评价。图IO显示了 ELISA测定的BLS-OMP32的抗原性。lyg、 0. 25yg、 0. lyg和20ng BLS-0MP31和BLS用作抗原。抗BLS Mab (1/1000)和 抗OMP31 Mab (1/1000)用作抗体。图11显示了用ELISA分析的BLS-0MP31的免疫原性。显示了来自 用含有佐剂("AF")或无佐剂("PBS")的BLS-0MP31免疫的小鼠的 血清的1/100稀释物抗0MP31的反应性。根据渐减的反应性，对每组 的血清进行排序。免疫前血清(阴性对照)的反应性以点线图解。来自 AF组的一只小鼠在选取之前死亡。图12显示了来自抗BLS-0MP31兔的血清的ELISA试验的滴定结 果。测定了三个血清抗0MP31的反应性。兔抗天然BLS血清的1/100 稀释物用作阴性血清。这种血清的反应性以点线图解。图13描述了抗BLS-0MP31兔血清(4°剂量)抗平滑或粗糙的马耳他 布鲁氏菌全菌的反应性。从所示的值减去相当于同时滴定的抗这两种 抗原的兔抗天然BLS血清的反应性。误差相当于平均标准误差的总和。图14显示了用lOOpg pCI-BLS-OMP31通过肌内和真皮内途径在4 个时机免疫的小鼠批组BALB/c (8只/组)中总抗OMP31 IgG抗体的动 力学。每15天用ELISA分析抗体水平。该值表示8只动物的平均值 土S.D.。箭头显示了免疫的时间。pCI小鼠(对照)的血清显示与"截止，， 标准相似或低于其的n个DO值。
图15描述了 a)用于获得BLS-KETcl嵌合体的寡核苷酸序列，b) 包括BLS-KETcl嵌合体的pETlla质粒的全部核苷酸序列和 c)BLS-KETcl嵌合体的开放读框及其氨基酸序列。图16显示了产生混合嵌合体的一般战略性方案。图17显示了在BLS-0MP31和BLS-KETcl嵌合体之间建立的混合嵌 合体的纯化结果和分析。A: BLS-0MP31 (峰3)和BLS-KETcl (峰l)再 折叠嵌合体和二者的化学计量混合物(峰2)的MonoQ柱的阴离子交换 色谱法分析，Bl:通过阴离子交换色镨法中获得的峰1、 2和3的 SDS-PAGE的分析，B2:通过纯BLS-0MP31和BLS-KETcl嵌合体和相当 于混合嵌合体的峰2的天然PAGE的分析。图18显示了用ELISA分析的BLS-0MP31-KETcl混合嵌合体的免疫 原性。来自用BLS-0MP31-KETcl (空棒)免疫的小鼠的血清的1/100稀 释物抗BLS和抗0MP31和KETcl合成肽的反应性。抗相同抗原的免疫 前血清(阴性对照)的反应性以灰色棒表示。图19显示了通过用BLS-KETcl免疫诱导的脾细胞的体外增殖。它 表明了体外刺激用乳化于皂苷中的KETcl肽或BLS-KETcl预先免疫的 小鼠脾细胞后，滴定的(以cpm计)胸苷掺入的平均值加l个标准偏差。 *就用培养基孵育的脾细胞来说cpm计显著增加(P〈0. 05)。图20描述了 BLS-RBD3嵌合体的核苷酸和氨基酸序列。以红色显 示了鼠蛋白Staufen-l的结构域RBD3的编码序列。以黑色显示了其氨 基末端的前8个残基的截短BLS的编码序列。图21显示了 BLS-RBD3嵌合体的结构(图A:侧视图，图B:俯视 图)。用MacroModel程序设计结构，将鼠蛋白Staufen-l的结构域RBD3的理论结构(以蓝色显示)的C-末端与BLS晶体结构(蛋白数据库文件 pdb : 1DI0)N-末端(以红色显示)合并。鼠蛋白Staufen-l的结构域 RBD3的理论结构是通过用Prc^o/^/7a /z e/a^ai70Sfer的蛋白Staufen 结构域RBD3结构(pdb : 1EKZ)的同源建模的方式构建的。该图是用 CHIMERA程序建立的。图22显示A:通过在15%聚丙烯酰胺凝胶(7v)中的SDS-PAGE 分离BLS-RBD3嵌合体，各种分子量标记在右侧泳道中运行。B:远离 BLS-RBD3嵌合体的UV圆二色性镨。该图比较显示了实验测定的嵌合 体谱(以实线表示)和它的理论谱(以虚线表示)，该理论谱由相当于在 分离状态中的BLS蛋白和鼠蛋白Staufen-l的RBD3结构域的谱组合计 算而来。该测定在50 mM Tris/HCl、 1. 2M NaCl、 pH 8緩冲液、4°C 进行。C:通过使用与分子滤柱出口和折光指数(RI)检测器串联连接的 光散射检测器估计BLS-RBD3嵌合体的分子量。BLS-RBD3在 Superdex-200柱中运行并用50 mM Tris/HCl、 3M尿素、1M NaCl、 pH 8緩沖液，以0.5 ml/min的流速洗脱。通过测定其在90度的光散射 信号和光折射(LR)监测洗脱。通过比较其与用作参考模式的牛血清白 蛋白样品(BSA分子量66.5 kDa)的光散射和折射信号的关系计算样 品分子量。图23显示了在492nm获得的分析的每个研究組每只小鼠血清的 1/100稀释物的光密度。第二次免疫后30天时间间隔的结果作为代表 性实例显示。水平线表示每组的平均值。图24显示了抗OMP31 Mab ELISA试验的结果。图25显示了使用通过用BLS-0MP31嵌合蛋白衍生形成的生物传感 器检测抗OMP31、 AcMo37F7单克隆抗体。
图26显示了在用BLS刺激的树突细胞中共刺激分子的表达。来源 于骨髓的树突细胞用BSL (IOjjM BLS)或仅仅用培养基(对照)孵育18 小时。显示了 CD40在CDllc+细胞(A)和I-Ad在CDllc+ (B)中的表达。 该同种型对照在每个图的左边示出。图27显示了用掺入经修饰的BLS蛋白的互补异源二聚肽与理论X 抗原靶形成分子装配物所遵循的策略。参见Braden， et al.，见上 文。使用Swisspdbviewer建模软件。图28显示了在表达栽体pETlla (Novagen， USA)中克隆的肽 BLS-RRuEE34sL插入基因的核苷酸序列。红色部分显示了 BLS-RR12EE3"L 插入肽的编码区。黑色部分显示了经修饰的BLS蛋白的编码区。图29描述了 BLS-RR12EE345L融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列。红 色部分显示了 RRuEEwL肽的编码区。黑色部分显示了经修饰的BLS蛋 白的编码区。绿色部分显示了用丝氨酸置换的IU残基的位置。图30显示了通过在17%聚丙烯酰胺凝胶中的SDS-PAGE分离 BLS-RR12EE345L融合蛋白。1:分子量标记；2:不相关样品；3:融合 蛋白BLS-RR12EE345L。图31显示了使用与分子滤柱出口和折光指数(RI)检测器串联连 接的光散射检测器估计BLS-RI^EE345L嵌合体的分子量。BLS-RR12EE345L 在Superdex-200柱中运行并用50 mM Tris/HCI、 3M尿素、0. 1MNaCl、 pH8緩冲液，以0. 5ml/min的流速洗脱。通过测定其在90度的光散 射信号和光折射(LR)监测洗脱。通过比较其与用作参考模式的牛血清 白蛋白样品(BSA分子量66.5 kDa)的光散射和折射信号的关系计算 样品分子量。
图32显示了在表达载体pGEX-4Tl(Novagen， USA)中克隆的肽 EEuRRwL插入基因的核苷酸序列。该序列插在该载体的BamHl和EcoRl 限制性酶切位点之间。黑色部分显示了 GST蛋白的编码区。红色部分 显示了 EEuRR化L肽的编码区。本发明描述了通常可用于展示肽、多肽和蛋白的嵌合蛋白。在此 显示的肽、多肽和蛋白可以诱导免疫反应或适于其他有用的目的。本发明还描述了药物化合物和免疫原性值和功效高的疫苗。这些 化合物和疫苗包括用布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)作为 免疫原性载体产生的嵌合蛋白。本申请中描述的嵌合蛋白可以展示肽、多肽、蛋白或其他特殊的 病原体和非病原体型的分子。更具体而言，本申请中描述的嵌合蛋白可以有效治疗和预防人类 疾病。这些实体可用于具有低或无免疫原性活性的抗原、毒素和蛋白 结构域的接种。这些适应症的实例将是抗嬰儿中的普通麻渗、风瘆、 肝炎、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、白喉、流行性腮腺炎、脑膜炎 和狂犬病的疫苗接种。这些适应症的其他实例是抗成人中的甲型肝炎、 乙型肝炎和丙型肝炎、流感、脑炎、狂犬病、伤寒、黄热病、单纯疱 渗、水痘带状疱渗、登革热、人乳头瘤病毒、霍乱、痗疾、肺结核和 流行性腮腺炎的疫苗接种。这些适应症的其他实例是对抵抗生物恐怖 活动有用的疫苗，适合于下列病原体肉毒毒素、炭疽芽孢杆菌、产 气荚膜梭菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、出血性结膜炎病毒(肠 道病毒70)和轮状病毒。这些实体还可以用于慢性病症的治疗，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏症和类风湿性关节炎或其他病症的治疗，如过敏和肿瘤。后者的 实例可以由同时包括抗肿瘤标记或用于放疗的放射性元素的抗体或抗 体片段的嵌合蛋白组成。根据本发明开发的嵌合蛋白，和来源于它们 的抗体，还可以用于诊断生育力和妊娠，或诊断疾病如结肠、肺、乳 房和前列腺癌。这些实体还可以用于监测和控制药物滥用或治疗法的 发展。本发明描述的嵌合蛋白还具有用于饲养家畜、农畜和鱼的多种用 途。这些实体可以用来制备抗布鲁氏菌属-在牛中引起很多问题的细 菌因子的疫苗，或抗鲑鱼立克次氏体的疫苗，该立克次氏体主要影响 鲑鱼的商业饲养。此外，这些实体可用于将抗菌剂，如青霉素、羟氨 苄青霉素或其他青霉素副产品，单独或与特异性抗体联合给予驯养动 物，象猫和狗，或农畜，象牛。本申请描述的嵌合蛋白的其他可能用途是抗猪肺炎枝原体- 一种 引起猪巨大损失的肺炎因子的疫苗的制备，和通常将杀寄生物药，象 抗奥氏奥斯特他(氏)线虫的丙硫咪唑、苯硫咪唑和伊维菌素给予小牛和牛。还可能使用这些新实体将杀寄生物药，象abamectine和吡会酮 给予马，或用抗原表位或病毒蛋白结构域，象禽流感接种鸟。无论如 何，嵌合蛋白可以同时含有杀寄生物药和抗有关寄生虫的特异性抗体。 新实体的另外的治疗用途将是将抗炎剂，象卡洛芬给予驯养动物，象 狗和猫。根据本发明的嵌合蛋白还可以具有控制病原体的不同适应症。这 些实体可用于调节某些激素的表达，在农畜中加快生长速率和增加乳汁产量，或使得它们的肉变得更瘦。这些非常规适应症的实例将是使 用这些实体免疫阉割农畜，象猪。本申请描述的嵌合蛋白还可以用于分子农业中疫苗和抗体的大规
模生产。在这种方法中，疫苗或抗体将首先在合适的植物中表达。然 后将从植物中提取疫苗或抗体并纯化来制备药物制剂。另一种可能性 将是为了通过动物的摄食来免疫(可食用疫苗)，用以在此描述的实体 转化的植物喂养它们。本发明的特殊优点是在此描述的载体能够携带比本领域已知其他 栽体，如"病毒样颗粒"所携带的肽更大的肽。这个优点是由于它们的 尺寸小和稳定性更高。在此描述的载体的这种抗原展示系统具有另外的优点展示重复和按空间顺序插入的肽、多肽和蛋白，增加它们的 稳定性和半衰期。载体蛋白(BLS)对所插入的肽、多肽和蛋白还具有相 当大的辅佐作用，因此提高免疫反应有效性。本发明的另 一个优点是载体蛋白BLS在没有另外的佐剂存在下， 单独诱导免疫反应。这个特征促进在有或无佐剂的情况下通过各种给 药途径(例如静脉内、经鼻、口、无针)给予根据本发明制备的疫苗。本申请描述的药物化合物和疫苗的特征是它们在室温下的高稳定 性。这个特征将很可能保存化合物或疫苗，而不必保持严格的冷藏环 节。含插入载体蛋白BLS不同末端的多种肽的混合嵌合体的产生还对 设计多价疫苗或针对不同免疫反应途径的疫苗有用。目前本领域中普 遍的观点是疫苗不应该含有10种以上免疫反应诱导物。疫苗应该含有 5种或更少的诱导物以达到最佳效果也是本领域中普遍的观点。本申请描述的嵌合蛋白具有生产抗体的用途。这些抗体和它们的 相关实体可以用于诊断。使用上面提及的抗体和相关实体开发用于诊 断疾病的试剂盒也是可能的。
根据本发明开发的这些实体中的几个也可以用于展示肽和建立蛋 白文库及其相关应用(例如应用于鉴定开发药物的分子或鉴定用于纳 米生物应用的优选结合无机化合物的多肽序列的组合生物学)。这些新 实体中的一些还可以用于生产和装配纳米技术装置或用于纳米技术方 法的实施。根据本发明的嵌合蛋白可用于构建和开发应用于分析检测几种物 质和分子(例如检测水、土壤或空气中的污染物或毒素、检测食品中的 药物、除草剂和杀虫剂残留物)的生物传感器。本申请描述的实体的另一个优点是它的生产容易和低成本。从来 自熟知操作和培养的微生物大肠杆菌的转化菌林模型获得了高产量的本申请描述的嵌合蛋白。根据这种方法获得的感兴趣蛋白容易从培养 基中纯化。在本发明的一个方案中，在此要求保护的分离的嵌合蛋白是由与从布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶突变的蛋白连接的肽、多肽或蛋 白形成的，其编码核苷酸序列在其N-末端的前8个残基已被修饰以允 许它被限制性内切酶切割，当然该酶不切割布鲁氏菌属的天然2，4-二 氧四氢蝶啶合酶蛋白的编码核苷酸序列。优选，突变的布鲁氏菌属蛋 白2，4-二氧四氩蝶咬合酶在其N-末端前8个残基已被修饰以便允许用 Nsi I和Afl II限制性内切酶切割该酶。更优选，根据本发明使用的 突变的2，4-二氧四氢蝶啶合酶蛋白具有SEQ ID NO: la、 SEQ ID NO: 2a、 SEQ ID NO: 3a、 SEQ ID NO: 4a、 SEQ ID NO: 5a、 SEQ ID NO: 6a或SEQ ID NO: 7a的氨基酸序列。连接的肽、多肽或蛋白可以是同 源的或异源的。在本发明的一个方案中，与突变蛋白连接的肽是异源 二聚结构域。优选，这个异源二聚结构域是"亮氨酸拉链"结构域。 由此获得的嵌合蛋白包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO: 8a，且优 选用于蛋白结构域、完整蛋白或其他非蛋白实体的偶联。在本发明的
另一个方案中，也要求保护本申请描述的分离的嵌合蛋白的组合。也 要求保护这些分离的嵌合蛋白和它们的组合的用途。在本发明的另一个实施方案中，要求保护本申请描述的分离的编码嵌合蛋白的核苷酸序列。这些序列可以是RNA、基因组DNA或拷贝 DM的序列。在本发明的另一个实施方案中，连接的肽、多肽或蛋白 的编码序列位于编码突变的布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶蛋白 的核苷酸序列的5'区。在本发明的另一个实施方案中，连接的肽、多 肽或蛋白的编码序列与编码突变的布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合 酶蛋白的核普酸序列的5'区可操作连接。优选，使用的下列DNA序列 是SEQ ID NO: lb、 SEQ ID NO: 2b、 SEQ ID NO: 3b、 SEQ ID NO: 4b、 SEQ ID NO: 5b、 SEQ ID NO: 6b、 SEQ ID NO: 7b或SEQ ID NO: 8b。本发明中使用的突变蛋白序列的具体例子包括但不限于框架核普 酸序列a) BLS-0MP31 b) BLS-KETcl和c) BLS-RBD3，分别在实施 例1、 5和8中使用。在本发明的另一个实施方案中，要求保护本申请 描述的分离的核苷酸序列的组合。也要求保护这些分离的核苷酸序列 和它们的组合的用途。在本发明的另一个实施方案中，要求保护本申请描述的分离的嵌 合蛋白的组合和分离的核苷酸序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，要求保护包括在此描述的嵌合蛋 白的编码序列的载体。这些载体可以是细菌、病毒或其他来源，且能 够表达本申请描述的嵌合蛋白或促进该表达。这些载体的具体例子是 pBLS-匿31、 pBLS-KETcl和pBLS-RBD3质粒，分别在实施例1、 5和 8中使用。优选，使用pBLS-0MP31、 DSM 15546质粒作为栽体和作为 产生表达本申请描述的嵌合蛋白的质粒的前体。也要求保护这些载体 的用途。
在本发明的另一个实施方案中，要求保护用本申请描述的载体转 化的细胞或微生物。这些微生物可以是原核、真核或其他来源的微生虫细胞，细菌如大肠杆菌，和哺乳动物细胞如CHO、 C0S、 BHK、 Namalwa 和HeLa。更优选，使用感受态大肠杆菌菌林进行这类转化。也要求保 护这些细胞的用途。在本发明的方案中，在此描述的分离的嵌合蛋白能够在真核生物 中诱导免疫反应。这些嵌合蛋白可以在所治疗的生物中诱导细胞或体 液反应。在这些情况下，该反应可以对抗相同抗原、毒素、蛋白结构 域或诱导物或对抗不同抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物。根据本发 明使用的抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物可以是细菌、寄生虫、病 毒或其他来源的，并且能够诱导免疫反应。这些诱导物的具体例子包 括但不限于a)马尔他布鲁氏菌0MP31蛋白的27个氨基酸的序列， b)猪肉绦虫KETcl蛋白的14个氨基酸的序列和c)鼠蛋白Staufen RBD3结构域的75个氨基酸的序列，它们分别在实施例l、 5和8中使 用。通常，所治疗的真核生物是鸟、鱼或哺乳动物。优选，这些生物 来自鼠、兔或人来源。更优选，该生物是人来源的。也要求保护能够 诱导免疫反应的这些嵌合蛋白的用途。在本发明的方案中，编码在此描述的分离的嵌合蛋白的核苷酸序 列能够在真核生物中诱导免疫反应。这些核苷酸序列可以在所治疗生 物中诱导细胞或体液反应。在这些情况下，该反应可以对抗相同抗原， 毒素，蛋白结构域或诱导物或对抗不同抗原、毒素、蛋白结构域或诱 导物。根据本发明使用的抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物可以是细 菌、寄生虫、病毒或其他来源的，并且能够诱导免疫反应。这些诱导 物的具体例子包括但不限于，编码下列蛋白的核苷酸序列a)马尔他 布鲁氏菌0MP31蛋白的27个氨基酸，b)猪肉绦虫KETcl蛋白的14个 氨基酸和c)鼠蛋白Staufen RBD3结构域的75个氨基酸，它们分别在
实施例1，5和8中使用。通常，所治疗的真核生物是鸟、鱼或哺乳动 物。优选，这些生物来自鼠、兔或人来源。更优选，该生物是人来源 的。也要求保护能够诱导免疫反应的这些核苷酸序列的用途。在本发明的方案中，要求保护包括下列成分的药物化合物或疫苗 l)至少一种类型的本申请描述的嵌合蛋白、2)至少一种类型的编码本 申请描述的嵌合蛋白的核苷酸序列或3) 1)和2)的组合。本申请要求保护的药物制剂或疫苗可以是液态的或者是本领域中 已知的任何其他药物形式，如可注射乳剂。本发明中描述的药物化合 物或疫苗还可以是用于口服的片剂、液体溶液、悬浮液或酏剂，或无 菌液体如溶液或悬浮液。优选使用惰性介质，如盐水介质、磷酸盐緩 沖液和任何其他介质，在其中嵌合蛋白、核苷酸序列或其片段具有适 当的溶解度。本发明要求保护的药物化合物或疫苗的活性物质以有效的生理剂 量存在。这些活性物质可以单独给予，或与可接受药物赋形剂，如为 了增加抗体产生的佐剂联合给予。根据本发明使用的药物化合物或疫苗包括但不限于几种油性制 剂，如弗氏佐剂、酪氨酸硬脂酸盐、MDP二肽、皂苷、氢氧化铝(明矾)、 淋巴细胞因子，布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白和在此 描述的由布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶突变的蛋白。参见US 4, 258, 029 (Moloney, et al.); US 5,057, 540 (Kensil， et al.)。 优选，就人而言使用酪氨酸硬脂酸盐、氢氧化铝、布鲁氏菌属2，4-二 氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白和在此描述的突变蛋白。弗氏佐剂尽管有 效，但在人中通常不使用。还可以利用緩释机制，如脂质体给予药物 化合物或疫苗。参见US 4,235, 877 (Fullerton， W.)。在高等生物 中使用的疫苗和药物化合物的制备是本领域中已知的。参见 Remington, et al. ， Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton， Pennsylvania, 1980; Voller， et al.， Eds. ， New Trends and Developments inVaccines， University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978。在本发明的方案中，要求保护一种在真核生物中诱导免疫反应的 方法。该方法包括给这种生物施用有效量的药物化合物或疫苗，包括 l)至少一种类型的本申请描述的嵌合蛋白，2)至少一种类型的编码本 申请描述的嵌合蛋白的核苷酸序列或3) 1)和2)的组合。在本发明的 方案中，诱导了体液反应。在本发明的另一个实施方案中，诱导了细 胞反应。在本发明的另一个实施方案中，同时或顺序诱导了体液或细 胞反应。在这些情况下，该反应可以对抗相同抗原、毒素、蛋白结构 域或诱导物或对抗不同抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物。根据本发 明使用的抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物可以是细菌、寄生虫、病 毒或其他来源的，并且能够诱导免疫反应。这些诱导物的具体例子包 括但不限于，编码下列蛋白的核苷酸序列a)马尔他布鲁氏菌0MP31 蛋白的27个氨基酸，b)猪肉绦虫KETcl蛋白的14个氨基酸和c)鼠蛋 白Staufen RBD3结构域的75个氨基酸，它们分别在实施例1， 5和8 中使用。可以用本申请描述的疫苗和药物化合物治疗的生物实例是鸟、 鱼或哺乳动物。优选，这些生物来自鼠、兔或人来源。更优选，该生 物是人来源的。本发明描述的疫苗或药物化合物可以一剂或多个剂量 给予。优选，仅以一剂进行给药。还可以通过皮下、静脉内、肌内、 经口、鼻或无针途径进行给药。优选，通过皮下或肌内途径进行给药。在本发明的另一个实施方案中，要求保护应答用在此描述的嵌合 蛋白和核苷酸序列免疫而产生的单克隆和多克隆抗体。还要求保护为 表达和产生本申请描述的抗体而开发的杂交瘤。要求保护这些抗体用 于预防、治疗、诊断和其他目的的用途。还要求保护包括在此描述的 抗体的药物化合物和它们的用途。
在本发明的另一个实施方案中，要求保护在此描述的嵌合蛋白和 至少一个配体之间形成的蛋白缀合物。在本发明的方案中，嵌合蛋白 和配体之间的连接是共价的。在这些情况下，优选该连接是肽键。在 本发明的另 一个实施方案中，嵌合蛋白和配体之间的连接是非共价的。 还要求保护这些蛋白缀合物的用途。在本发明的另一个实施方案中，要求保护在此描述的嵌合蛋白的 典型四级结构。在此使用的术语"活性物质"被定义为l)编码本申请描述的嵌 合蛋白或其片段的基因组DNA、拷贝DNA、信使RM或其片段和2)本 申请描述的嵌合蛋白或其片段，3) l)和2)的組合或4)在此描述的嵌 合蛋白和其它实体之间形成的蛋白缀合物、其片段。在此使用的术语"有效量"被定义为足以产生一种或多种下列结 果的量l)诱导适当的免疫反应，无论是体液的还是细胞的，包括生 产抗诱导物的抗体；2)抑制与诱导物相关的细胞或微生物的生长、发 育、大小或运动性。当诱导物是肿瘤时，"有效量"将是足以减小肿 瘤大小、阻止肿瘤生长、抑制转移或肿瘤生长，或减轻由这种肿瘤引 起的不适或延长罹患这种肿瘤的个体的生命的量。在此使用的，术语"哺乳动物"被定义为用其乳腺的分泌的乳汁 来喂养其后代的热血脊推动物。术语"哺乳动物，，包括但不限于大鼠、 小鼠、兔、狗、猫、山羊、母牛、绵羊、猪、灵长类动物和人。在此使用的术语"药物化合物或疫苗"被定义为与活性物质共同 给予的稀释剂、佐剂或赋形剂。它包括每种溶剂、分散介质、水溶液 和气体溶液、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延緩剂或催化
剂或类似物质。活性药物物质给药中使用这类介质和试剂是本领域中 已知的。除非用该介质导致活性物质无效，否则这类常规介质与活性 物质一起使用是必要的。补充的有效成分也可以合并到本发明描述的 活性物质中。术语"药物化合物或疫苗"包括但不限于惰性溶剂或赋 形剂、无菌水溶液和几种无毒有机溶剂。"药物化合物或疫苗，，既不 应该与活性物质反应，也不应该另外降低活性物质的功效或稳定性。 可接受的药物载体包括但不限于水、乙醇、聚乙二醇、矿物油、矿脂、 丙二醇、羊毛脂和类似物质。注射使用的"药物化合物或疫苗"包括 无菌水溶液(当可溶于水时)或无菌分散液和制备无菌注射分散液或溶 液的粉剂。在每种情况下，该制剂都应该是无菌的和为了使它能够通 过注射器给予，优选为液体。它还应该在制备和贮藏条件下稳定并且 应该得到保护免受微生物如细菌、病毒和真菌的污染作用。在此使用的术语"预防应用"被定义为诱导和产生抗一种或多种 抗原、毒素、蛋白结构域或其他诱导物或其片段的免疫反应的能力。在此使用的术语"顺序给药"意思是l)同一活性物质以连续的 时段，在一个以上的时机给予或2)两种或多种活性物质以连续的时 段，在一个以上的时机交替给予。当"顺序"给药时，活性物质给药 之间的时间差可以是数分钟、数小时、数天、数周或数月，取决于用 途是预防还是治疗和所治疗生物的自然状态。在此使用的术语"单次或同时给药"意思是在相同时机同时给予 一种或多种活性物质。在此使用的术语"治疗应用"被定义是指高等生物，包括人，为 了直接或间接改善这种生物的病症或抗病性的目的，接受医疗护理的 每一过程、应用、疗法或类似行为。
,滋辦J 5i^-嵌合差厉的祐建这个实施例描述了用于将相当于马尔他布鲁氏菌0MP31蛋白的多 肽序列第48至74位氨基酸的序列插入形成布鲁氏菌属2， 4-二氧四氢 蝶啶合酶十聚体的IO个氨基末端的策略。1. ^^T々义磬通过下列方案构建pBLS-0MP31质粒，SEQ ID NO: 9c:a) 为了克隆布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的编码基因 (BLS)，通过用特异性引物从流产布鲁氏菌基因组DM进行PCR扩增获 得BLS序列并在pETl 1 a载体(Novagen， USA)中克隆。用Bam HI和Xba 1 限制性内切酶进一步消化包括布鲁氏菌属2，4-二氧四氬蝶啶合酶开 放读框的pETll-BLS质粒。获得的插入物在pALter-Exl载体(Promega: USA)中亚克隆。b) 对编码布鲁氏菌属(BLS) 2,4-二氧四氢蝶啶合酶开放读框的 序列进行定点诱变。使用ALTERED s i tes 11试剂盒(Promega， USA)将 这个序列在pALter-Exl载体(Promega， USA)中克隆。为了产生该盒， 将两个新限制位点插入BLS基因的5'区Nsi位点插入BLS天然氨基 酸序列5'末端的前两个密码子中，而一个AFL II位点插入包含BLS 天然氨基酸序列的8和9个残基的两个密码子中。要考虑到这些限制 位点在天然BLS基因或pETlla载体中不存在。参见图1。c) 然后通过测序检查突变。包括突变BLS序列(SEQ ID NO: 16) 的盒在pETlla栽体(Novagen， USA)中亚克隆以获得以下称作pBSLm 的质粒。d) 为了插入相当于0MP31质粒的序列，设计两个寡核苷酸以便它 们形成双链DNA并包括马尔他布鲁氏菌0MP31蛋白第48-74位氨基酸 的编码序列，其在退火时被Nsi I和Afl II限制性内切酶特有的粘性 末端所保护。图2显示了为构建pBLS-0MP31而设计的寡核苷酸和由这 些寡核苷酸形成的合成插入物。e) 用Nsi I和Afl II限制性内切酶消化pBLSm质粒。除去相当 于BLS前8个残基的编码序列。在这种情况下，原始的BLS序列被变 为插入的0MP31肽的核苷酸序列。f) 上述步骤d)的合成插入物与步骤e)中获得的开放pBLSm盒通 过用DM T4连接酶在16。C孵育过夜而连接。通过测序证实该插入。 从而，获得了具有SEQ ID NO: 9b序列的基因。序列分析表明布鲁氏 菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的前8个氨基酸被来自马尔他布鲁氏菌 0MP31蛋白的第48-74位序列的27个氨基酸替代。这个开放读框称作 BLS-0MP31嵌合体，由SEQ ID NO: 9b组成。它的相应质粒称作 pBLS-0MP-31,由SEQ ID-N0 : 9c组成。参见图3b和c。使用突变BLS的DNA序列SEQ IDN0: 2b、 SEQ ID N0: 3b、 SEQ ID NO: 4b、 SEQ ID NO: 5b、 SEQ ID NO: 6b和SEQ ID NO: 7b重复这个 实验。获得了类似结果。2. 脊/么用根据上述方案获得的pBLS-0MP31质粒通过热休克转化感受态 大肠杆菌BL21 (DE3)菌林。然后，在包括LB-琼脂/氨千青霉素的琼脂 平板中培养细菌以选择用该质粒转化的细菌。将2 ml LB/氨千青霉素 培养基接种到从琼脂平板提取的菌落中进行小规模表达试验。摇动该 菌落并在37T孵育。用2yl 1M IPTG诱导饱和的培养物。三小时后， 移出lOOpl培养物并离心。将产生的沉淀重悬于25jj1样品緩沖液IX， 通过SDS-PAGE 17%进行分析。参见图4.3. ALS"-ftW^7嵌合f根据上述步骤用500 ml LB/氨节青霉素培养5-ml转化菌林的预 培养物至饱和。孵育该培养物并在37'C摇动。用0，5 ml IPTG (1M)
诱导以达到600 nm下0.6-0.8的光密度。三小时后移出培养物并以 4， 000 g离心20分钟。将沉淀悬浮于15 ml悬浮液(50 raM Tris、 5 mM EDTA、 1% Triton X-IOO， pH 8. O)中。以每分钟1分钟的时间间隔超声处理悬浮液5分钟并以20， 000 g 离心30分钟。将沉淀重悬于无Triton X-100的15 ml悬浮溶液中并 重复超声处理过程。第三次重复该步骤。细胞质中表达的嵌合体包含 在三次超声处理的上清液中，而包含体包含在沉淀中。参见图5。将包含体重悬于含8M尿素的PBS緩冲液中并在室温下放置过夜。 对着PBS透析重悬液两天，更换緩冲液。将样品离心并对着緩冲液A(50mMTris/HCl、 pH8.5)透析上清液。通过在FPLC设备(Pharmacia, USA)中的MonoQ或Q-Sepharose (Pharmacia, USA)柱中的阴离子交换色谱法进行第一个纯化步骤。将样品注射到用緩沖液A平衡的柱中并 通过直至50。/。緩沖液B (緩沖液A+1M NaCl)的线性梯度洗脱。通过在Superdex 200 (Amersham， UK)分子排阻柱中的色谗法进 行第二个纯化步骤。参见图6和7。为此，将嵌合体峰集中在Centriprep (Millipore， USA)管中并注射到柱中,用PBS洗脱。用SDS-PAGE估 计峰中嵌合蛋白的存在。使用本领域已知的分子生物学技术进行BLS-OMP31嵌合基因的构 建。参见 Sambrook, et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, New York, 1989; Brown, Gene Cloning, Chapman & Hal 1, London, England, 1995; Watson, et al. ， Recombinant DNA， 2nd Ed. ， Scientific American Books, New York, New York, 1992 and Davis et al. ， Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publ ishing Co. ， New York, New York, 1986， Alberts, et al. , Molecular Biology of the Cell,4th Ed. ， Garland Science, New York, New York, 2002。^/ W嵌合^裙定#通过光散射技术获得了 BLS-0MP31嵌合蛋白采取十聚体折叠的第 一个证据。这个步骤用来计算在溶解状态中该蛋白的分子大小。为进 行这些测定，将分子排阻柱与光散射检测器相连。随蛋白从柱中洗脱， 它的分子量被测定。根据这种方法，计算的BLS分子量是163 kDa，而BLS-0MP31嵌 合体的分子量是215 kDa。天然BLS和BLS-0MP31十聚体的理论分子 量分别是174.4和197. 8kDa。考虑到这种方法准确性是90%，这个结 果提示BLS-0MP31嵌合体形成非常类似于天然BLS蛋白的十聚体。通过圆二色性研究了嵌合蛋白的折叠。在J-810分光偏振计 (Jasco， UK)中进行圓二色性测定，设置IOO nm/min的阅读速度、4s 的响应时间和1 nm的带宽。^使用1、 2或5 mm的石英盘(Hellma)。 在50 mM pH 7磷酸盐緩冲液中测定样品。BLS-0MP31嵌合体和天然BLS 的圆二色性i普的覆盖图表明这两种蛋白的一般折叠非常类似。参见图 8。因此，证实了该正确折叠的嵌合蛋白和十聚体一样，具有与天然蛋 白相似的二级结构。接下来，研究了在该嵌合蛋白N末端的置换是否影响它们的稳定 性。为此，通过圆二色性研究了通过盐酸胍(Gdm-HC1)和温度诱导的嵌 合体变性。从变性-平衡曲线，有可能获得几个热力学参数，如与解叠相关的 自由能的变化。用这个参数，估计蛋白所特有的构象稳定性。参见Pace， et al， Methods Enzymol.， 131: 266-80 (1986)。为评价与每种蛋 白解叠相关的自由能变化，调整研究数据以适合理论描述性曲线。这 个图描述了嵌合蛋白的折叠和解叠期之间的平衡常数和变性剂的变化 浓度的相关性。为进行这些实验，将相同量的蛋白(O. 1 M十聚体)与浓度渐增的 变性剂一起孵育。由6 M胍-HC1 (ICN，超高纯)、50 mM磷酸盐，pH 7 的基质溶液制备曲线上每个点的溶液。样品在室温下孵育三小时并在 测定前离心。在5mm盘中25。C进行圆二色性测定。由此证明了用胍使 BLS天然蛋白和BLS-0MP31嵌合蛋白变性的可逆性。调整变性-平衡曲线以适合两步解离模式。根据这个模式，十聚体 首先分离为两个相等的五聚体。在变性的第二步中，这些五聚体的每 一个进一步解离为五个解叠单体。描述这个转变的公式源自于已经对 于单体蛋白提出的公式。参见Zylberman， et al， J Biol. Chem.， 279 (9): 8093-8101 (2004)。由天然BLS和BLS-0MP31获得的热力学数值表明BLS N末端的替 代不影响十聚体稳定性。参见图9。因此，证实了 BLS嵌合体形成正 确折叠的十聚体，而且它们的稳定性类似于天然BLS的稳定性。^4辨J 》LSH M^7嵌合雄戎#^和_^瘦通过测定BLS-0MP31与抗插入肽的特异性单克隆抗体 (A59/10F09/G10单克隆抗体)和抗天然BLS蛋白的特异性单克隆抗体 (BI24单克隆抗体)结合的能力研究了它的抗原性。参见Vizcaino, et al., Infect. Im瞧.，69 (11): 7020-28， (2001) ; Goldbaum， et al.， J CHn. Microbiol. ， 31: 2141-2145 (1993)。这个步骤允许测定插 入物和蛋白核心的抗原性。用ELISA测定抗原性。参见图10。用抗天然BLS的单克隆抗体和抗插入肽的单克隆抗体鉴定了 BLS-0MP31。正如所料，天然BLS仅由第一个抗体识别。这个结果表明 插入肽当被嵌合体展示时保留了其抗原性能。此外，还表明了嵌合体 的折叠不影响抗BLS抗体与蛋白核心的亲合力。这两个抗体检测达到 每孔2Gng嵌合体。然后，评价BLS-0MP31诱导抗插入肽的特异性体液免疫反应的能 力。在有和没有佐剂辅助下，在小鼠中分析了这种能力。以每组五只 小鼠的两个组进行实验。"AF"组通过腹膜内途径以0、 20和40天间 隔接受三个剂量的含弗氏佐剂的乳剂中的25jjg蛋白。第一剂量与弗 氏完全佐剂一起给予。其余剂量与弗氏不完全佐剂一起给予。"PBS" 组得到相同处理，但是在无佐剂情况下注射嵌合蛋白。第三次免疫后 7天抽取血液并用ELISA测定抗0MP31膜蛋白的血清反应性。参见图 11。在用嵌合体和佐剂免疫的小鼠中获得了抗0MP31的强烈反应。从用嵌合蛋白有和没有佐剂免疫的小鼠获得的血清学反应也是相应的。 这些结果表明用BLS-0MP31嵌合体有或没有佐剂免疫的小鼠具有抗插 入肽的特异性免疫反应。根据下列方案用BLS-0MP31嵌合体与佐剂注入兔第一剂量，第0天:含200jjg BLS-0MP31的lml PBS+lml弗氏完 全佐剂，通过肌内注射。第二剂量，第22天含200jjg BLS-0MP31的lml PBS+lml弗氏 不完全佐剂(IFA)，通过皮下注射。第三剂量，第45天含200pg BLS-0MP31的lml PBS+lml IFA， 通过肌内注射。
第四剂量，第155天:含200jjg BLS-0MP31的lml PBS+lml IFA， 通过皮下注射。在第31、 52和180天抽取血液样品。将样品离心并冷冻血清。用ELISA滴定注射第二、第三和第四剂量的抗原后收集的抗0MP31 膜蛋白的抗血清。参见图12。对于相当于第二、第三和第四剂量的血 清，测定的抗血清滴度分别是3,200、 12， 800和25, 600。将基线定义 为能够鉴定出阴性血清中抗原的最大稀释度。经免疫的兔显示出抗 OMP31的强烈特异性免疫反应。由于抗天然BLS的血清不能鉴定OMP31 ， 因此这种高反应性是由于特异性抗体抗插入嵌合体的肽的反应。参见 图13，阴性对照。在大肠杆菌中重组产生ELISA试验中使用的OMP31蛋白。由于这 个分子是膜蛋白，它不能保持在水溶液中，因此在变性条件下获得。 在进行的试验中，没有证实抗血清能够鉴定作为细菌膜蛋白的呈天然 构象的0MP31嵌合体。这个性能对评价嵌合体作为能够提供抗布鲁氏 菌属的体液免疫的免疫原的潜在有效性很重要。为评估这个性能，使 用马耳他布鲁氏菌H38的平滑和粗糙菌抹作为抗原进行ELISA试验。 参见图13。由于使用的抗原的复杂性，通常难以评价血清抗全菌的反 应性。然而，该试验表明抗BLS-0MP31血清特异性识别插入粗糙菌林 膜的0MP31。这种血清抗光滑菌林的反应性不同于由抗天然BLS血清 显示的反应性。这个结果与对于A59/10F09/G10单克隆抗体所公开的 数据完全一致。参见Vizcaino, etal.，见上文。对包含在BLS-OMP31 嵌合体中的插入物特异性的这种抗体与马耳他布鲁氏菌林H38的粗糙 而不是光滑菌林具有强烈的反应性。*滋辨4 将BLS-0mp31的编码序列亚克隆入栽体pCI-neo (Promega， USA)， 包含引物5'末端(符合读框)的限制位点和Kozak共有序列(带下划 线)。因此，构建了下列寡核普酸BLS-0MP31 "有义，，:5'TAAGAA GAATCC ACCACCATG CAT ACC GCC GGT TA 3:BLS-0MP31 "反义":5'TGT CCA CCA GTC AT GCTAGCT CAG ACA AGC GCG ATG C 3'。使用pET-BLS-0MP31质粒作为模板通过PCR扩增该序列。用相应 的限制性内切酶消化PCR产物和载体，然后进行连接反应。通过测序 核查获得的构建体。在大肠杆菌JM109细胞中扩增pCI-BLS-0MP31质 粒并用"mega prep"柱(Quiagen, UK)进一步纯化。在260/280nm 下用分光光度测定法估计DNA纯度和浓度。用鲎变形细胞溶胞产物分 析试剂盒(Sigma， USA)测得，质粒制剂含有每100jjg DNA少于0.05 单位的内毒素。在第0、 2、 4和6周，通过肌内(im)和皮内(id)途径给Balb/c 小鼠组接种含lOOpg pCI-BLS0MP31质粒和无插入物的对照质粒(pCI) 的生理溶液。在第一次免疫后第0、 15、 30、 45、 60和75天，通过眶 后途径抽取动物血液。将血清保存在-20。C用于特异性抗体的检测。通过使用重组0MP31蛋白作为抗原的间接ELISA分析经 BLS-0MP31 DNA疫苗(pCI-BLS0MP31)免疫诱导的抗OMP31体液反应。 免疫后，所有动物产生体液免疫反应。观察到产生的特异性抗0mp31 蛋白的高水平IgG同种型。参见图14。
使用分子生物学技术和本领域已知的药物化合物的制备和给药方法进行pCI-BLS-0MP31质粒的制备、扩增、纯化和作为DNA疫苗的使 用。参见Schleef， M， Ed， Plasmids for Therapy andVaccination， Wiley-VCH Verlag GmbH， Weinheim， Ger醒y， 2001。^^嵌合沐的;遂合參当用高浓度氯化胍处理时，布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶可 逆解离的事实用来构建混合嵌合体。参见Zylberman， etal.，JBiol. Chem. 279 (9): 8093-8101 (2004)。构建了插入物大小和等电点具有 显著差异的两个嵌合体。为了更容易地区别由混合嵌合体形成的十聚 体，遵循这个策略。为此，除了已经描述的0MP31肽，使用图15所示的KETcl肽。KETcl高保护性。参见Huerta， et al. ， Vaccine 20:62-266 (2001); Toledo, et al.，Infect. Immun. ， 69:1766-1773 (2001)。根据下列方案获得BLS-KETcl嵌合蛋白a) 用Nsi I和Afl II限制性内切酶消化pBLS-0MP31质粒以除 去相当于0MP31蛋白第48-74位序列的27个氨基酸的编码序列。提取 0MP31蛋白编码序列。b) 将KETcl肽的14个氨基酸的编码序列与a)中的开放盒连接， 其通过pBLS-0MP3r,"质粒的开放盒与DNA T4连接酶在16'C孵育过 夜来进行。由此获得了 BLS-KETcl读框。经读框测序证实了该插入。 这个读框称作BLS-KETcl嵌合体，具有SEQIDNO: 1Qb，和表达质粒， pBLS-KETcl。
还可以遵循实施例1的步骤l)中指出的方案进行这个步骤，其通过用Nsi和Afl I限制性内切酶切割BLSm盒(SEQ ID NO: lb)和它与 KETcl插入物进一步连接来进行。由此，也获得了 BLS-KETcl读框和 pBLS-KETcl质粒。使用突变BLS的DM序列SEQ IDNO: 2b、 SEQ ID NO: 3b、 SEQ ID NO: 4b、 SEQ ID NO: 5b、 SEQ ID NO: 6b和SEQ ID NO: 7b重复这个 实验。得到相似结果。2. 辟/A用根据上述方案获得的pBLS-KETcl质粒通过热休克转化感受态 大肠杆菌BL21菌林(DE3)。然后，在包含LB-琼脂/氨节青霉素的琼脂 平板中培养细菌以选择用该质粒转化的细菌。3. "^y-i^rW嵌合蛋^时》S;^趟必将2ml LB/氨千青霉素培养基接种到从琼脂平板提取的菌落中进 行小规模表达试验。摇动该菌落并在37'C孵育。用2yl 1M IPTG诱导 饱和的培养物。三小时后，移出100yl培养物并离心。产生的沉淀重 悬于25yl样品緩沖液IX，用SDS-PAGE 17%进行分析。根据上述步骤用500 ml LB/氨千青霉素培养5-ml转化菌抹的预 培养物至饱和。孵育该培养物并在37t:摇动。用0.5 ml 1M IPTG诱 导以达到600 nm下0. 6-0. 8的光密度。三小时后移出培养物并以4， 000 g离心20分钟。沉淀重悬于15 ml悬浮溶液(50 raM Tris、 5 mM EDTA、 1% Triton X-IOO， pH 8. 0)中。以每分钟1分钟的时间间隔超声处理悬浮液5分钟并以20, 000 g 离心30分钟。沉淀重悬于无Triton X-100的15 ml悬浮溶液并重复
超声处理过程。第三次重复该步骤。细胞质中表达的嵌合体包含在三 次超声处理的上清液中，而包含体包含在沉淀中。包含体重悬于含8 M尿素的PBS緩沖液中并在室温下放置过夜。 对着PBS透析重悬液两天，更换緩冲液。将样品离心并对着緩冲液A (50mMTris/HCl、 pH8.5)透析上清液。通过在FPLC设备(Pharmacia, USA)中的MonoQ或Q-Sepharose (Pharmacia, USA)柱中阴离子交换色 i普法进行第一个纯化步骤。将样品注射到用緩冲液A平衡的柱中并通 过直至50。/。緩冲液B (緩冲液A+1M NaCl)的线性梯度洗脱。通过在Superdex 200 (Amersham， UK)分子排阻柱中的色语法进 行第二个纯化步骤。为此，将嵌合体峰集中在Centriprep (Millipore， USA)管中并注射到柱中，用PBS洗脱。用SDS-PAGE估计峰中嵌合蛋白 的存在。使用本领域已知的分子生物学技术进行BLS-KETcl嵌合基因的构 建。参见Sambrook, et al.，见上文；Brown，见上文；Watson， et al.， 见上文；Daviset al.，见上文，Alberts, et al.，见上文。BLS-0MP31和BLS-KETcl嵌合体在2M氯化胍中解叠，以等摩尔浓 度混合并通过透析重聚。添加2M胍，使十聚体分离，由此产生保留它 们的二级结构的五聚体。当通过透析除去胍时，五聚体重聚再次形成 十聚体。参见Zylbe簡n， etal.， J Biol. Chem. ， 279 (9): 8093-8101 (2004)。用这种方式，产生了 BLS嵌合体的混合物。参见图16。通过在MonoQ (Amersham， UK)阴离子交换柱中的交换色镨法纯化 重聚产物。根据下列方案将结果与每个单独的嵌合体(没有解离的样品) 的洗脱分布图相比以16. 8。/。緩沖液B洗脱BLS-KETcl嵌合体(由于插 入物理论等电点，估计这个颗粒碱性最大)和以35. 8%的相同緩冲液洗
脱BLS-0MP31嵌合体。重聚样品分离产生三个不同的峰，第一个峰相 当于纯BLS-KETcl嵌合体；第二个最大的峰相当于混合嵌合体而最后 一个峰相当于纯BLS-0MP31嵌合体。参见图17 A。用SDS-PAGE和天然PAGE分析相当于第二个峰的样品。结果表明 相当于由在一个五聚体的五个氨基末端展示的KETcl肽和由在另一个 五聚体的五个氨基末端展示的0MP31肽形成的嵌合体混合物的样品。 参见图17B1和B2。这个结果表明提出的分离、混合和重聚经修饰蛋白的策略可有效 产生嵌合体的混合物，其中由BLS十聚体结构展示五个拷贝的两种不 同的肽。参见图16。该混合物可能具有不同的特性，这取决于插入物 的性质(例如一种插入物可能针对特定的细胞运输，而另一种可能诱导 特定的免疫反应)。见^嵌会伴W;遂会游^;^将BLS-0MP31-KETcl嵌合体的混合物与佐剂一起给予小鼠以估计 它诱导特异性体液免疫反应的能力。以每组五只小鼠进行实验。该组 在0、20和40天通过腹膜内途径接受三个剂量的含弗氏佐剂的乳剂中 的25|jg蛋白。第一剂量与完全佐剂一起应用。笫二和第三剂量与不 完全佐剂一起应用。第三次免疫后7天抽取血液并用ELISA测定抗 0MP31和KETcl合成肽的血清反应性。参见图18。在用嵌合体的混合物与佐剂一起免疫的小鼠中获得了抗这两种肽 的强烈反应。这证明了用BLS-0MP31-KETcl嵌合体的混合物免疫的小鼠同时产生了抗这两种插入物的特异性免疫反应。 《顺7拔嵌合# ^勿應^^^:^用乳化于皂苷中的50iJg/小鼠的BLS-KETcl嵌合体和用乳化于皂 苷中的10jjg/小鼠的KETcl合成肽免疫每组五只BALB/c小鼠的组，以 评估由BLS-KETcl嵌合体诱导的抗插入肽的特异性细胞免疫反应。在 10天间隔内通过皮下途径免疫小鼠两次。最后一次免疫后三天无菌摘除两组的脾。脾细胞重悬于补充了 L-谷氨酰胺(O. 2mM)、 2-巯基乙醇(O. 05mM)、非必需氨基酸(0. OlmM)、青 霉素(IOO U/ml)、链霉素(1QQi4g/ml)和胎牛血清10% (FBS)的RPMI 1640 Gibco (InVitrogen Corp., USA)培养基中。将培养基、KETcl 肽或BLS-KETcl嵌合体(10iJg/ml)添加至不同的细胞培养物中。将细 胞以每200|jl终体积2 x 105个细胞的浓度悬于平底培养微板中。将 它们保持在5。/。C02, 37'C的湿润环境中。72小时后，向每个培养物添加l|jCi [曱基-力]胸苷(Amersham Biosciences, UK)。接种细胞和在1205 betaplate 液体闪烁计数器 (Wallac 0y， FI)中测定滴定的胸苷掺入水平。所有试验一式三份进行。该试验表明用BLS-KETcl嵌合体免疫的小鼠脾细胞在肽和嵌合体 都存在下在培养物中增殖。这个结果清楚地表明BLS-KETcl嵌合体能 够诱导抗插入BLS的KETcl肽的特异性细胞免疫反应。参见图19。BLS可以被修饰，不仅展示肽，而且在它的十个氨基末端展示完 整蛋白结构域。为了证明这个交替的用途，通过将修饰的BLS编码序
列与鼠蛋白Staufen-l的RBD3蛋白结构域的编码序列连接而构建 BLS-RBD3嵌合体。参见图20和21。根据下列方案获得BLS-KETcl嵌合蛋白1. Ma) 用Nsi I和Afl II限制性内切酶消化pBLS-0MP31质粒以除 去相当于0MP31蛋白第48-74位序列的27个氨基酸的编码序列。提取 0MP31蛋白编码序列。b) 将鼠蛋白Staufen的RBD3结构域的75个氨基酸的编码序列与 a)中的开放盒连接，其通过pBLS-0MP31，"质粒的开放盒与DNA T4 连接酶在16'C孵育来进行。由此获得了 BLS-RBD3读框。经读框测序 证实了该插入。这个读框称作BLS-RBD3嵌合体，具有SEQIDNO: llb， 和表达质粒，pBLS-RBD3。还可以遵循实施例1的步骤l)中指出的方案进行这个步骤，其通 过用Nsi和Afl I限制性内切酶切割BLSm盒(SEQ ID NO: lb)和它与 RBD3插入物进一步连接来进行。由此，也获得了 BLS-RBD3读框和 pBLS-RBD3质粒。寸吏用突变BLS的DNA序列SEQ IDNO: 2b、 SEQ ID NO: 3b、 SEQ ID NO: 4b、 SEQ ID NO: 5b、 SEQ ID NO: 6b和SEQ ID NO: 7b重复这个 实验。得到相似结果。2. 转化用根据上述方案获得的pBLS-KETcl质粒通过热休克转化感受态 大肠杆菌BL21菌林(DE3)。然后，在有氨千青霉素存在的LB培养基中 接种菌抹。用IPTG 1 mM在28。C诱导基因表达4小时。 3. "LSS /U嵌合蛋-付^这;^趟^该蛋白以包含体表达，用4和6M尿素溶液洗涤并通过在4。C磁力 搅拌16小时溶于緩冲液Tris/HCl 50 mM、尿素8 M、 EDTA 5raM、 ^ -ME5mM、 PMSFlmM、 pH 8。溶解蛋白在变性条件下，在Q-Sepharose 离子交换柱中纯化，应用在緩冲液Tris/HCl 50mM、 8M尿素、pH 8. 5 中0至1MNaCl的线性梯度。洗脱蛋白通过对着PBS緩沖液透析再折 叠并用肝素Hyper D柱纯化。对于洗脱，使用緩沖液Tris/HCl 50 mM、 NaCl 1.2 M、 pH 8。图22显示了通过如上所述方法获得的BLS-RBD3嵌合体的 SDS-PAGE、圆二色性和光散射分析。SDS-PAGE分析显示获得的BLS-RBD3嵌合体纯度很高。在电泳迁 移中观察到的微小异常归因于RBD3结构域正电荷的高密度。通过BLS 和分离的鼠蛋白Staufen-l的RBD3结构域的谱组合计算的BLS-RBD3 圆二色性谱与其理论谱的相似性表明该嵌合体很好折叠。由嵌合体在 与光散射检测器和折光指数检测器串联连接的分子滤柱中运行计算的 嵌合体分子量(257 kDa)表明BLS-RBD3嵌合体呈现十聚体结构。使用本领域已知的分子生物学技术进行BLS-RBD3嵌合基因的构 建。参见Sambrook, et al.，见上文；Brown，见上文；Watson， et al.，见上文；Daviset al.，见上文，Alberts, et al.，见上文。^ 嵌会琳^《,^f *戎# 使用BLS-Staufen嵌合体作为免疫原以获得抗Staufen RBD3结构 域的抗体。给5只Balb/c小鼠接种含80|jg BLS-RBD3嵌合体的緩沖 液200|jl HCl 50mM、 NaCl 1, 2M、 50mM磷酸盐、pH8，不含佐剂，通 过腹膜内途径以14天的间隔接种两次。作为对照，用BLS蛋白和 S t auf en RBD3结构域的混合物免疫同 一品系的5只小鼠，包含的嵌合 体质量相同。最后一次免疫后十五天通过眶后穿刺抽取小鼠血液。通 过以1000 xg离心10分钟制备血清。在具有谷胱甘肽S-转移酶-RBD3 (GST-RBD3)融合蛋白的96孔板中通过ELISA测定抗RBD3的血清反应 性。与羊过氧化物酶(DakoCytomation， USA)缀合的小鼠抗免疫球蛋白 用作第二抗体。用orthophenildyamin (0PD)引发反应，并用4 N硫 酸中止。用ELISA读数器在492 mn处测定光密度。图23显示了由两组产生的体液免疫反应的代表性实例。观察到， 用BLS-RBD3嵌合体免疫引起强烈的抗RBD3抗体反应。在用BLS和RBD3 混合物接种的小鼠中没有观察到抗该肽的反应性。,施鄉M遞迎^ 嵌合傳克《Z^卓^謦^e傳评估用BLS-0MP31嵌合体免疫的小鼠脾细胞产生抗0MP31肽的特 异性单克隆抗体的能力。以每组五只小鼠进行实验。该组以0、 20和 40天间隔通过腹膜内途径接受三个剂量的含弗氏佐剂的25pg蛋白的 乳剂。在第60天，通过腹膜途径给显示抗0MP31肽的较好反应的小鼠 接种溶于PBS的25pg BLS-0MP31。取出这种小鼠的脾并将脾细胞与 NSO骨髓瘤细胞融合。在HAT培养基中选择所产生的杂交瘤，并且测 定它们的培养物上清液，通过ELISA测定抗0MP31肽的反应性。通过 有限稀释克隆显示较高反应性的杂交瘤。图24显示了抗0MP31肽和完 整0MP31蛋白的AcMo 37F7反应性。获得了抗二者的强烈反应。这证 明了用BLS-0MP31嵌合体免疫的小鼠产生了抗插入肽的特异性免疫反 应。这个经验也表明使用BLS嵌合体可以产生特异性单克隆抗体。嵌合# #为^參传4器#^途生物传感器允许检测大分子当中的特异性相互作用，其通过增加与反应表面上的质量累积成比例的信号显现。使用BLS-0MP31经修饰 蛋白研究BLS嵌合体作为用于开发生物传感器的肽和蛋白结构域载体 的应用。为此目的，进一步分析了上述实施例中描述的BLS-0MP31和 AcMo 37F7之间的反应。BLS-0MP31嵌合体用来衍生葡聚糖羧曱基(dextran carboximethyl )平板(IAsys Affinity Sensors, Thermo, USA)。 为 了该目的，包含80|jg/ml BLS-0MP31的10 mM乙酸钠pH 5. 5緩冲液 在用EDC/NHS试剂预先衍生的平板中孵育。使相当于800弧秒的信号 (等于5 ng的抗原)固定后，用二乙胺封闭反应表面。衍生后，研究抗 -0MP31 AcMo 37F7反应性，为此将50|jl的培养物上清液在预先活化 的平板中孵育。如在图25中所观察到的，AcMo 37F7发生强烈反应，产生了大约 300弧秒的信号。在分离阶段，洗涤和添加緩沖液PBS + Tween，观察 对应于固相AcMo分离的信号下降。这个实施例清楚显示了该嵌合体能 够检测针对生物传感器中肽的抗体。紹辦" 遽d见S承^^^f爻勿^分析BLS活化树突细胞的能力。为此，在这些细胞与BLS孵育18 小时后，研究它们中不同标记的活化水平。来自Balb/c小鼠的骨髓细 胞在含RPMI培养基的培养平板中，在5°化02环境下37'C的培养箱中培 养，RPMI培养基含2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100|jg/inl链 霉素、50yM 2-巯基乙醇和10。/。胎牛血清(培养基R10)，补充了小鼠粒 细胞和巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)。在第3、 6和8天更换培养
基。在第9天，取出非贴壁细胞并以300 xg离心8分钟。然后将细胞 以2xl(^个细胞/ml的浓度在R10培养基中孵育18小时(n-4)，终体积 lffll，有BLS ( 1， 5或IO一)或没有BLS。然后，将每200jul终体积 4xl05个细胞离心并与和异疏氰酸荧光素(FITC)缀合的下列单克隆抗 体(Pharmingen):抗-CD40、抗-CD80、抗I-Ad或抗-CD86，和与同藻 红蛋白(PE)缀合的抗-CDllc单克隆抗体孵育。进行三次洗涤并用 FACScan细胞计数器(Becton Dickinson, USA)提取细胞。用CellQuest (Becton Dickinson, USA)软件分析获得的数据。在与BLS孵育的细胞中，在CDllc+亚群(75-80%)内，观察到表达 CD40、 CD80、 I-Ad和CD86的细胞的百分比和平均荧光显著增加。实 验进行三次，获得相似的结果。图26显示了在有或没有BLS时处理的 CDllc+细胞中，CD40表达(A)和I-Ad (B)的代表性直方图。在C3H/HeJ小鼠(对LPS无应答者)的树突细胞中或当BLS蛋白与 多粘菌素B预先孵育以便除去大肠杆菌的LPS时，观察到由BLS引起 的类似活化。这些结果证明BLS能够活化树突细胞。遽《4 ^^嵌合伴^凝^接兴农一f冷潜种喊承4'^^f袭翁浙的/^BLS蛋白可以在它的氨基末端被修饰以展示完整的蛋白结构域。 这可以伴随分子装配物的形成。在这些簇中，互补异源二聚肽与修饰 的BLS蛋白和靶合并。然后，异源二聚体之间的高亲合力将靶分子和 修饰的BLS蛋白连接起来。高亲合力异源二聚体的使用对避免影响载 体蛋白的正确折叠有用。为证明BLS嵌合体的这个应用，使用本领域
已知的两种异源二聚肽RR12EE3"L和EE12RR345L。参见Moll, et al.，M Protein Sci. ， 10:649-655 (2001)。参见图27。这个策略允许分子 装配物的构建，包括十个拷贝的与BLS结合的结构域。体外进行装配， 使得可能控制该过程的化学计量。这个系统也能够在不同于BLS的重 组系统中表达抗原。参见图28。1. 融合蛋白BLS-RR12EE345L的构建在BLS的N-末端克隆肽RRuEEwL。参见图28和29。位于BLS和 RR12EE3"L接头区的IU残基替代丝氨酸。BLS-RR12EE345L嵌合基因在 pETlla载体中克隆。用所产生的载体转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3) 细菌菌林。然后，将该细菌在LB-琼脂/氨节青霉素培养基中培养。用 1M IPTG在37'C诱导基因表达16小时。该蛋白以包含体表达。用緩冲液50 mMTris/HCI、 5mM EDTA、 5 mM P-ME、 1 mM PMSF， pH 8洗涂包含体。用緩沖液50 mMTris/HCl、 8M尿素、5mM EDTA、 5 mM P-ME、 lmM PMSF、 pH 8处理溶解的蛋白并在4'C磁力搅拌16小时。 在变性条件下通过在Q-Sepharose (Pharmacia, USA)柱中的阴离子交 换色i普法純化所产生的BLS-RR12EE345L嵌合体。使用緩沖液50 mM Tris/HCl、 8 M尿素、pH 8. 5在0至1 M NaCl线性梯度下洗脱样品。 用SDS-PAGE和光散射分析测定该融合蛋白。参见图30和31。SDS-PAGE分析表明该融合蛋白BLS-RR12EE345L具有高水平的纯度。 用光散射技术测得，该蛋白分子量是224 kDa。此外，该蛋白在远距 离紫外光谱中显示出高质量的CD信号。这些结果提示该融合蛋白很好 地折叠并观察到在8M尿素存在下与天然BLS蛋白相似的十聚体结构。 当尿素浓度降低时，BLS结构在室温下变形。这大概是由于RR12EE345L 与其本身的结合。2. 肽EEuRR"sL的构建
在谷胱甘肽S-转移酶(GST)蛋白的C-末端克隆肽EE12RR345L。这个 肽与由BLS融合蛋白展示的RRuEEwL肽互补。参见图32。EE12RR345L肽基因在pGEX-4Tl栽体中克隆。用所产生的载体转化 感受态大肠杆菌BL21 (DE3)细菌菌林。然后，将该细菌在LB-琼脂/ 氨苄青霉素培养基中37'C培养。用lniMIPTG在37。C诱导基因表达16 小时。然后超声处理该细菌。使用谷胱甘肽/琼脂糖基质纯化所产生的EE12RR345L肽，作为GST 融合蛋白。将偶联的复合物装入柱并用緩冲液50niMTris， pH 8洗涤， 直到洗脱液中没有肽。然后，将基质与凝血酶在室温下孵育16小时以 从GST融合蛋白中切下EEI2RR345L。然后用緩冲液50 inM Tris， pH 8 洗脱该肽以进一步纯化它。产生的EEuRR34sL肽具有高水平的纯度。3.融合蛋白BLS-RRuEE化L和肽EEuRRwL之间分子装配物的形成 将一份融合蛋白BLS-RR12EE345L与8 M尿素、50 mM Tris、 0.5 M NaCl， pH 8在30。C预先孵育15分钟。将四份肽EE12RR345L在緩沖液 50 mM Tris、 0. 1 M NaCl、 pH 8中，30。C预先孵育15分钟。将该融 合蛋白和肽混合并在30'C孵育15分钟。孵育后该混合物保持可溶。通过光散射分析测定产生的分子装配物并计算它的理论分子量 (MW: 222. 1 kDa)。参见图34。这个分析表明大约10个EE12RR345L肽 (MW: 5. 6 kDa)与BLS-RR12EE3"L十聚体歸:222. 1 kDa)连接在一起。参 见图35。此外，该装配物在远距离紫外光i普中显示出高质量的CD信号。这 些结果提示使用这种技术产生与修饰的BLS蛋白形成的分子装配物是 可行的。
已经相当详细地描述并举例说明了本发明以便于对它的理解和重 现。本领域任何技术人员都可以进行形式和细节方面的某些改变，而 不背离本发明权利要求的真实目的和范围。在此引用方面的全部出版 物完全引入作为本发明说明书的参考文献。
参考文献Arakawa， T., Yu， J., Chong， D.， Hough, J，， Engen, P， C. and LangHdge， W. H. R. "A plant-based cholera toxin B subunit-insulin fusion protein protects against the development of autoimmune diabetes" Nature Biotech,, 16:934-938, 1998.Bacher A. and Fischer M. "Protein conjugates, methods, vectors, proteins and DNA for producing them, their use, and medicaments and vaccines containing a certain quantity of said protein conjugates" WO0053229.Bachmann, M. F.， Rohrer, U. H., Kundig， T. M.， Burki, K.， Hengartner, H. and Zinkernagel， R. M. "The influence of antigen organization on B cell responsiveness" Science, 262:1448-1451, 1993.Baldi， P.C,， Velikovsky， C.， Braden， B.C., Giambartolomei， G.H,, Fossati, C.A, and Goldbaum， F.A. "Structural, functional and immunological studies on a polymeric bacterial protein" Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 33:74卜747， 2000.Baldi, P,C.， Giambartolomei, G.H.， Goldbaum, F.A.， Abd6n, L.F.， Velikovsky， C.A. Kittelberger, R. and Fossati, C.A. "Humoral immune response against LPS and cytoplasmic proteins of Brwce//" in cattle vaccinated with "6orto S19 orexperimentally infected with Tm1/"/" ew/erao ////ca 0:9" Clinical Diagnostic and Laboratory Immunology, 3 (4):472-476， 1996,Braden, B,C,， Vdikovsky， C.A.， Cauerhff， A.， Polikarpov， I. and Goldbaum, F. A. "Divergence in macromolecular assembly: X-ray crystallographic structure analysis of lumazine synthase from 5rwce〃" a6or加"Journal of Molecular Biology, 297:1031-1036， 2000.Domingo, G丄,Orru， S, and Perham, R.N. "Multiple display of peptides and proteins on a macromolecular scaffold derived from a multienzyme complex" Journal of Molecular Biology, 305:259-267,2001.Domingo, G丄，Orru， S. and Perham， R.N. "Molecular display on multimeric protein scaffolds derived from the E2 component of the alphaketoacid dehydrogenase" WO0185208.Goldbaum， F.A,， Rubbi, C,P，， Wallach， J.C., Miguel, S.E.， Baldi, P.C. and Fossati， C.A "Differentiation between active and inactive human brucellosis by measuring antiprotein humoral immune responses" Journal of Clinical Microbiology, 30:604-607， 1992.Goldbaum， F,A', Leoni, J.， Wallach， J.C. and Fossati， C.A. "Characterization of an 18 kDa brucella cytoplasmic protein which appears to be a serological marker of active infection of both human and bovine brucellosis" Journal of (jlinical Microbiology, 31:2141-2145， 1993.Goldbaum, F.A.， Polikarpov, L， Cauerhff, A.， Velikovsky， C.A., Braden B.C. and Poljak， R丄"Crystallization and preliminary X-ray analysis of the lumazine synthase from 卿."Journal of Structural Biology, 123:175-178， 1998.Goldbaum, F,A,， Velikovsky, C.A., Baldi， P.C., Mdrtl， S., Bacher， A. and Fossati, C.A. "The 18 kDa cytoplasmic protein of 5race〃a卿.is as enzyme with lumazine synthase activity" Journal of Medical Microbiology, 48:833-839， 1999.Huerta, M,， " "Synthetic peptide vaccine against 7bem,a w//, pig cysticercosis: successful vaccination in a controlled field trial in rural Mexico" Vaccine, 20:262-266， 2001.Laemmli, U.K. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature, 227(259): 680-5, 1970.Leclerc, C. and Ronco， J. "New approaches in vaccine development" Immunol. Today， 19(7):300-302， 1998.Li， Y., Mui， S. ， Brown, J. H. ， Strand， J. ， Reshetnikova, L. ， Tobacman, L. S. y Cohen, C. 2002. The Crystal Structure of the C-Terminal Fragment of Striated-Muscle Alpha-Tropomyosin Reveals a Key Troponin T Recognition Site. Procedings Nacional Academy of Sciences USA, 99: 7378.Moll, J.， Ruvinov， S., Pastan, I. and Vinson, C. "Designed heterodimerizing leucine zippers with a ranger of pis and stabilities up to 10-15 M" Protein Sci.， 10:649-655, 2001.Nieba， L. and Bachmann， M. F. "A new generation of vaccines" Moderns Aspects of Immunobiology， l(2):36-39, 2000.Pace, C,N. "Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves" Methods Enzymol,， 131: 266-80， 1986.Redfield， N. New England Journal of Medicine, 316:673-678， 1998，Renner, W.A.， Bachmann， M.， Hennecke， F.， and Nieba， L. "Ordered molecular presentation of antigens, method of preparation and use" WO0032227.Bachmann， M.， Dunant N., Sebbel, P.， Tissot， A., and Lechener， F. "Molecular antigen array" WO0185208.Ritsert， K.， Huber， R.， Turk， D.， Ladenstein， R.， Schmidt陽Base， K. and Bacher， A. "Studies on the lumazine synthase/riboflavin synthase complex of 5a"7/ws sw6"/^y: crystal structure analysis of reconstituted, icosahedral p-subunit capsids with bound substrate analogue inhibitor at 2.4 A resolution" Journal of Molecular Biology， 253: 151-167,1995.Toledo， A., & a/. "Two epitopes shared by rae /a cray57ce戸and !Taem'a jo/z'w/w confer protection against murine 71. cysticercosis along with a prominent Tlresponse" Infect Immun 69:1766-1773， 2001. Velikovsky, C. A., Cassataro， J., Sanchez, M.， Fossati， C. A.， Fainboim， L. and Spitz, M. "Single-shot plasmid DNA intrasplenic immunization for the production of monoclonal antibodies" Persistent Expression of DNA, J. Immunol. Meth., 244(1-2): 1-7, 2000b.
权利要求
1.分离的嵌合蛋白，包含与修饰的2，4-二氧四氢蝶啶合酶蛋白连接的肽、多肽或蛋白结构域，其中编码该经修饰蛋白的前8个N-末端残基的核苷酸序列已被改变以允许其被限制性内切酶切割，该酶不切割编码天然存在的2，4-二氧四氢蝶啶合酶蛋白的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中编码经修饰蛋白N-末 端前8个残基的核苷酸序列包含酶Nsi I和Afl II的限制性酶切位点。
3. 根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白来源于布 鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶。
4. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: la。
5. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 2a。
6. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 3a。
7. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 4a。
8. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 5a。
9. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 6a。
10. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 7a。
11. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 8a。
12. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 9a。
13. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 10a。
14. 根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: lla。
15. 分离的核苷酸序列，包含根据权利要求1至14的嵌合和经修 饰蛋白的编码序列。
16，根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQIDNO: lb。
17. 根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQIDNO: 2b。
18. 根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO: 3b。
19. 根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO: 4b。
20. 根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO: 5b。
21. 根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO: 6b。
22. 根据权利要求15的分离的DM序列，包含SEQ ID NO: 7b。
23. 根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQIDNO: 8b。
24. 根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO: 9b。
25. 根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQIDNO: 10b。
26. 根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQIDNO: llb。
27. 用来运载根据权利要求15至26的核苷酸序列的载体。
28. 根据权利要求27的载体，其中该载体是病毒性的。
29. 根据权利要求27的载体，其中该载体是质粒性的。
30. SEQ ID NO: 9c的质粒。
31. 质粒pBLS-0MP31，保藏号DSM 15546。
32. 用根据权利要求27至31的载体转化的细胞。
33. 根据权利要求32转化的真核细胞。
34. 根据权利要求32转化的原核细胞。
35. 根据权利要求34转化的大肠杆菌细胞。
36. 根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或蛋 白结构域是同源的。
37. 根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或蛋 白结构域是异源的。
38. 根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或蛋 白结构域是抗原、毒素、物质或其片段，能够在真核生物中诱导免疫反 应。
39. 根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或 蛋白结构域是细菌来源的抗原、毒素、物质或其片段。
40. 根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或 蛋白结构域是病毒来源的抗原、毒素、物质或其片段。
41. 根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或 蛋白结构域是寄生虫来源的抗原、毒素、物质或其片段。
42. 根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中该抗原是BLS-0MP31 或其片段。
43. 根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中该抗原是BLS-KETcl 或其片段。
44. 根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中该抗原是BLS-RD3 或其片段。
45. 根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中免疫反应是体液的。
46. 根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中免疫反应是细胞的。
47. 根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中真核生物包括鸟、 鱼或哺乳动物样本。
48. 根据权利要求47的分离的嵌合蛋白，其中真核生物是哺乳动 物样本。
49. 根据权利要求47的分离的嵌合蛋白，其中哺乳动物样本包括 鼠、兔或人样本。
50. 根据权利要求49的分离的嵌合蛋白，其中哺乳动物样本是人。
51. 根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或 蛋白结构域是在体外或体内诱导免疫反应的抗原、毒素、物质或其片段。
52. 根据权利要求51的分离的嵌合蛋白，其中免疫反应是在体外 引发的。
53. 根据权利要求51的分离的嵌合蛋白，其中免疫反应是在体内 引发的。
54. 根据权利要求1的两种或多种分离的嵌合蛋白的组合，其中与 每个经修饰蛋白连接的肽、多肽或蛋白结构域是不同的。
55. 根据权利要求1的两种或多种分离的嵌合蛋白的组合，其中与每个经修饰蛋白连接的肽、多肽或蛋白结构域是相同的。
56. 根据权利要求15的两种或多种分离的核苷酸序列的组合，其 中编码与经修饰蛋白连接的肽、多肽或蛋白结构域的核苷酸序列是不同 的。
57. 根据权利要求15的两种或多种分离的核苷酸序列的组合，其 中编码与经修饰蛋白连接的肽、多肽或蛋白结构域的核苷酸序列是相同 的。
58. 根椐权利要求1的一种或多种分离的嵌合蛋白和根据权利要 求15的一种或多种分离的核苷酸序列的组合。
59. —种药物化合物，包含至少一种根据权利要求1至14的分离 的嵌合蛋白。
60. 根据权利要求59的药物化合物，包含药物可接受赋形剂。
61. 根据权利要求60的药物化合物，其中药物可接受赋形剂是佐剂。
62. 根据权利要求61的药物化合物，其中佐剂包括弗氏佐剂、MDP 二肽或皂苷。
63. 根据权利要求61的药物化合物，其中佐剂包括酪氨酸硬脂酸 盐、氢氧化铝、淋巴细胞因子、布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的天 然蛋白或布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。
64. 根据权利要求63的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白。
65. 根据权利要求63的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。
66. —种药物化合物，包含至少一种根据权利要求15至26的分离 的核苷酸序列。
67. 根据权利要求66的药物化合物，包含药物可接受赋形剂。
68. 根据权利要求67的药物化合物，其中药物可接受赋形剂是佐剂。
69. 根据权利要求68的药物化合物，其中佐剂包括弗氏佐剂、MDP 二肽或皂苷。
70. 根据权利要求68的药物化合物，其中佐剂包括酪氨酸硬脂酸 盐、氢氧化铝、淋巴细胞因子、布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的天 然蛋白或布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。
71. 根据权利要求70的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白。
72. 根据权利要求70的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。
73. —种药物化合物，包含至少一种根据权利要求1至14的分离 的嵌合蛋白和至少一个根据权利要求15至26的分离的核苷酸序列。
74. 根据权利要求73的药物化合物，包含药物可接受赋形剂。
75. 根据权利要求74的药物化合物，其中药物可接受赋形剂是佐剂。
76. 根据权利要求75的药物化合物，其中佐剂包括弗氏佐剂、MDP 二肽或皂苷。
77. 根据权利要求75的药物化合物，其中佐剂包括酪氨酸硬脂酸 盐、氢氧化铝、淋巴细胞因子、布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的天 然蛋白或布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。
78. 根据权利要求77的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白。
79. 根据权利要求77的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。
80. —种在真核生物中诱导免疫反应的方法，包括给该生物施用有 效量的根据权利要求59、 66或73制备的药物化合物。
81. 根据权利要求80的方法，其中免疫反应是体液的。
82. 根据权利要求80的方法，其中免疫反应是细胞的。
83. 根据权利要求80的方法，其中药物化合物是同时给予的。
84. 根据权利要求80的方法，其中药物化合物是顺序给予的。
85. 根据权利要求80的方法，其中真核生物包括鸟、鱼或哺乳动 物样本。
86. 根据权利要求85的方法，其中真核生物是哺乳动物样本。
87. 根据权利要求86的方法，其中哺乳动物样本包括鼠、兔或人 样本。
88. 根据权利要求87的方法，其中哺乳动物样本是人。
89. 根据权利要求80的方法，其中药物化合物通过皮下、静脉内、 腹膜内、肌内、经口或鼻途径或通过无针注射系统给予。
90. 根据权利要求89的方法，其中药物化合物通过皮下、腹膜内 或肌内途径给予。
91. 单克隆和多克隆抗体，其中该抗体与由根据权利要求15的核 苷酸序列所编码的肽、多肽和蛋白结构域或其片段起反应。
92. 单克隆和多克隆抗体，其中该抗体与包含根据权利要求1的氨 基酸序列或其片段的肽、多肽和蛋白结构域或其片段起反应。
93. 包含根据权利要求91和92的单克隆和多克隆抗体的药物化合物。
94. 表达根据权利要求91和92的单克隆抗体的杂交瘤。
95. —种生物传感器，包括(a)基底，其固定了至少一种根据权 利要求1的分离的嵌合蛋白和(b)所述基底与能够测定配体是否附着于分离的嵌合蛋白或与其起反应的测量单元连接。
96. 根据权利要求95的生物传感器，其中配体是抗体。
97. 蛋白缀合物，包含与肽、多肽或蛋白结构域连接的配体，该肽、 多肽或蛋白结构域与根据权利要求1的布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶 合酶的经修饰蛋白连接。
98. 根据权利要求97的蛋白缀合物，其中连接是共价键。
99. 根据权利要求98的蛋白缀合物，其中共价键是肽键。
100. 根据权利要求97的蛋白缀合物，其中连接是非共价的。
101. 根据权利要求97的蛋白缀合物，其中配体和嵌合蛋白通过异 源二聚体结构域的连接序列而连接。
102. 根据权利要求101的蛋白缀合物，其中异源二聚体结构域的 连接序列编码亮氨酸拉链。
103. 根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中它们的四级结构是 五聚二聚体。
全文摘要
包括插入布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶氨基末端的达到十个拷贝的肽、多肽或蛋白结构域的分离的嵌合蛋白。编码该嵌合蛋白的分离的核苷酸序列。用于表达该蛋白的载体、质粒和转化细胞。由该嵌合蛋白诱导的单克隆和多克隆抗体。产生该单克隆抗体的杂交瘤。包括该嵌合蛋白、核苷酸序列和抗体的疫苗和药物化合物。一种在高等生物中诱导免疫反应的方法，包括给予有效量的疫苗和药物化合物。包括该嵌合蛋白的生物传感器。由该嵌合蛋白和配体通过共价和非共价键结合形成的蛋白缀合物。该嵌合蛋白、核苷酸序列、载体、质粒、转化细胞、抗体、杂交瘤、缀合物、生物传感器、疫苗和药物化合物的用途。该嵌合蛋白的四级结构。
文档编号A61K39/12GK101133163SQ200580026046
公开日2008年2月27日 申请日期2005年6月3日 优先权日2004年6月3日
发明者F·A·戈德鲍姆 申请人:金基因有限公司