抑制hsp90与iap蛋白的蛋白－蛋白相互作用的化合物的制作方法

专利名称：抑制hsp90与iap蛋白的蛋白－蛋白相互作用的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制热休克蛋白Hsp90与凋亡抑制物(IAP)蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用的化合物，以及鉴定和利用这样的化合物的方法，所述化合物例如肽和肽衍生物，所述IAP蛋白例如存活蛋白(Survivin)，XIAP，cIAP1或cIAP2。
背景技术：
肿瘤细胞在高度不利环境中存活并增殖的能力增强。例如，肿瘤细胞下调了多个阻止正常(即非-癌)细胞在有利环境中分裂的细胞途径。肿瘤细胞还灭活了使多种正常组织在有害条件下死亡的凋亡途径。肿瘤细胞上调了维持活性增殖所必需的途径。例如，很多肿瘤细胞活化了细胞中使它们能合成并维持持续增殖所需的蛋白机制的应激-反应途径(stress-responsepathway)。肿瘤中活化的应激反应包括上调热休克蛋白(Hsp)，这些蛋白是ATPase-指导的陪伴分子(chaperones)。尤其是，Hsp90在多种癌组织中上调。Hsp90控制着有限量客户蛋白(client protein)的折叠/成熟与蛋白酶体破坏之间的平衡，而这些蛋白中有一些参与了信号传导和细胞增殖。
凋亡抑制物(IAP)蛋白家族的成员的特征包括一或多个杆状病毒IAP重复区。这些蛋白最初是因它们通过阻止昆虫宿主细胞防御性凋亡来促进杆状病毒繁殖的能力而被鉴定出来的。存活蛋白是IAP家族的小分子16.5kDa哺乳动物成员，它在胚和胎的器官中广泛表达，但在大多数终末分化的正常组织中几乎无法检测到。但存活蛋白在多种肿瘤组织中高水平表达，而且被认为参与很多肿瘤细胞避免细胞死亡并持续增殖的机制中。
发明概述本发明是基于，至少是部分基于，在存活蛋白、cIAP1、cIAP2和XIAP等凋亡抑制物(IAP)蛋白中发现了介导与热休克蛋白Hsp90之间蛋白-蛋白相互作用的特定区域，例如结合域或基序。这些区域被鉴定为具有介导这些IAP蛋白(例如存活蛋白)的抗-凋亡活性的特征。本发明提供了鉴定能破坏Hsp90与IAP蛋白相互作用的化合物的方法。能抑制Hsp90与存活蛋白等IAP蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用的化合物，例如肽、肽衍生物、肽模拟物以及小分子，都可以用于治疗与不需要的(unwanted)细胞增殖相关的情况(condition)，例如癌症一方面，本发明包括分离的化合物，其抑制Hsp90和存活蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用。在多个实施方案中，所述化合物是分离的存活蛋白肽，其包含His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO2)或Lys-His-Ser-Ser-Gly(SEQ IDNO26)，并且长度为50或更少，45或更少，40或更少，35或更少，30或更少，25或更少，20或更少，15或更少，12或更少，11或更少，10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，或5个氨基酸。存活蛋白肽的例子包括His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO2)，Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu-Ser-Val-Lys(SEQ ID NO3)，Ile-Asp-Asp-His-Lys-Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu(SEQ ID NO4)，以及Lys-Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu(SEQ ID NO5)。
在一些实施方案中，分离的存活蛋白肽与增强所述化合物的细胞通透性的异源序列相连，所述异源序列例如肽内化序列(如，Tat，触角足(antennapedia)，vβRR，transportin，或transportan序列)。触角足肽内化序列例如是RQKIWFQNRRMKWKK；(SEQ ID NO29)。在一些实施方案中，所述化合物是本文所述存活蛋白肽的肽模拟物，例如，所述化合物可以是反构型-肽(retro-peptide)、反排列肽(inverso-peptide)，和/或所述化合物可以包括一或多种人工氨基酸类似物。肽模拟物也可以与肽内化序列等异源序列相连。肽衍生物包括，例如与肽内化序列相连的肽和肽模拟物。
本发明还提供了编码本文所述存活蛋白肽和肽衍生物的核酸，以及含有这些核酸的重组细胞。另一方面，本文公开了与本文所述肽或肽衍生物结合的抗-存活蛋白抗体，例如细胞内抗体(intrabodies)。这样的抗体的实例包括对能产生抗体的动物施用本文所述肽或肽衍生物所产生的抗体。
另一方面，本发明还提供了制备肿瘤生长的小分子抑制物的方法。通常，这些方法包括提供一种先导化合物(lead compound)，例如本文所述存活蛋白肽或肽衍生物，运用医学化学方法研发与该先导化合物结构类似的化合物，可选地(optionally)，测定该候选化合物是否抑制肿瘤细胞生长。可以将该候选化合物配制在药用载体中，从而制备肿瘤生长的小分子抑制物。
另一方面，本发明包括鉴定候选的诱导凋亡的化合物的筛选方法。这些方法一般包括(i)将受试化合物、Hsp90肽以及IAP肽(例如存活蛋白)在足以确保相互作用(例如结合)的条件下混合足够的时间；和(ii)检测受试化合物是否抑制Hsp90肽与IAP肽之间的蛋白-蛋白相互作用。抑制Hsp90肽与IAP肽(例如存活蛋白肽)之间蛋白-蛋白相互作用的受试化合物是候选的诱导凋亡的化合物。
另一方面，本发明涉及鉴定候选的诱导凋亡的化合物的筛选方法。这些方法一般包括(i)对表达Hsp90和IAP肽(例如存活蛋白肽)的细胞(例如，在体内的肿瘤细胞或在培养中的肿瘤细胞)施用所述化合物，和(ii)测量Hsp90肽和IAP肽(例如存活蛋白)之间的相互作用，例如结合。可减少Hsp90肽和IAP肽(例如存活蛋白)之间相互作用的化合物是候选的诱导凋亡的化合物。
另一方面，本发明涉及鉴定凋亡诱导物的筛选方法，这些方法一般包括将肿瘤细胞与本文所述方法鉴定出的候选的诱导凋亡的化合物接触；和检测一或多种凋亡标记物的有无。使细胞表现出一或多种凋亡标记物的候选诱导凋亡的化合物是凋亡诱导物。
本文还描述了鉴定肿瘤生长抑制物的筛选方法，这些方法一般包括将一或多种肿瘤细胞与本文所述方法鉴定出的候选的诱导凋亡的化合物接触；和测量所述肿瘤细胞的增殖。当一种候选的诱导凋亡的化合物使所述肿瘤细胞的增殖相对于未接触所述化合物的一或多种肿瘤细胞的增殖而言受到抑制，则该化合物是肿瘤生长抑制物。
另一方面，本发明还涉及治疗受试者的肿瘤的方法，包括(i)鉴别需要治疗肿瘤的受试者；和(ii)对该受试者施用本文所述任一种抑制Hsp90和存活蛋白之间蛋白-蛋白相互作用的化合物的药物组合物。在治疗受试者肿瘤的方法中使用的药物组合物包括抑制Hsp90和存活蛋白之间蛋白-蛋白相互作用的存活蛋白肽(或肽衍生物)和/或抗存活蛋白抗体。另一方面，治疗受试者肿瘤的方法包括(i)鉴别需要治疗肿瘤的受试者；和(ii)对该受试者施用含有本文所述方法鉴定出的化合物或受试物的药物组合物。
本发明还涉及抑制细胞中Hsp90与IAP多肽之间相互作用的方法，该方法包括将有效量的本文所述化合物或药物组合物导入所述细胞中。
术语“蛋白”，“多肽”以及“肽”表示任意氨基酸链，不管它们有多长或者经过了什么样的翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)，除非特别指明，这些术语在本文中可互换使用。
术语“分离的肽”和“分离的核酸”分别包括肽分子和核酸分子，它们基本上不含有在其天然来源(如果有这种来源的话)中存在的其它肽和核酸。分离的肽例如是基本上不含有出现在细胞中的显著量其它肽和物质的肽。另一例中，分离的核酸可以不含有获得或衍生(例如合成)该核酸的生物的基因组DNA中内源核酸侧翼的序列(即位于该核酸的5′和/或3′末端的序列)。分离的肽和核酸可以体外合成和/或从天然来源分离。
“保守氨基酸取代”是指一种氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基分组在本领域是已知的。这些组包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，lys，arg，his)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，asp，glu)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，gly，asn，gln，ser，thr，tyr，cys)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，ala，val，leu，ile，pro，phe，met，try)，具有beta-分支侧链的氨基酸(例如，thr，val，ile)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，tyr，phe，try，his)。
“Hsp90肽”在本文中是指全长Hsp90或其与存活蛋白、cIAP1、cIAP2和XIAP等IAP蛋白结合的肽。
“IAP肽”在本文中是指全长IAP蛋白或其与Hsp90结合的肽。
“存活蛋白肽”在本文中是指全长存活蛋白或其与Hsp90结合的肽。
除非另外说明，本文使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属技术领域一般技术人员所通常理解的含义。与本文所述方法和物质类似或等效的方法和物质也可以用于实践或检验本发明，但合适的方法和物质在下文中描述。本文提到的所有出版物，专利申请，专利，及其它参考文献都全文引入作为参考。在有冲突的情况下，参看本说明书，包括定义。此外，所述的物质、方法和实施例都仅仅是举例说明，并不作任何限制。本发明的其它特征和优点可以从以下详细描述及从权利要求中显而易见。


图1A的免疫印迹照片显示与结合抗-存活蛋白抗体的Sepharose柱结合的细胞裂解蛋白。将柱结合蛋白充分洗涤后进行洗脱，用图中标示的抗体鉴定洗脱级分中的蛋白。
图1B的免疫印迹照片显示与存活蛋白或作为对照的非结合IgG抗体发生免疫共沉淀的蛋白。S和P分别表示上清和免疫沉淀物。
图1C的免疫印迹照片显示体内pull-down试验的结果，表明从细胞提取物中沉淀出Hsp90可用偶联存活蛋白的SepharoseTM(“存活蛋白”)实现，但不能用单独的SepharoseTM(“Sepharose”)实现。细胞用标示的沉淀或上清处理(25％反应)，用抗-Hsp90进行分析。
图2A和图2B的ELISA定量结果显示与固相存活蛋白底物结合的Hsp90(图2A)以及与固相Hsp90底物结合的野生型存活蛋白(图2B)。而存活蛋白点突变C84A不结合Hsp90(图2B)。
图3A的免疫印迹照片显示体外pull-down试验的结果，表明Hsp90 N-末端含有ATP酶的区域与偶联SepharoseTM的存活蛋白结合，但Hsp90的该N-末端区下游的序列不与偶联SepharoseTM的存活蛋白结合。
图3B的免疫印迹照片显示与Hsp90的FLAG偶联区发生体内免疫共沉淀的蛋白，表明存活蛋白仅与Hsp90的N-末端区沉淀，不与Hsp90该N-末端区的下游部分共沉淀。
图4A的免疫印迹照片显示cIAP1，cIAP2以及XIAP与Hsp90发生免疫沉淀。
图4B的免疫印迹照片显示体外pull-down试验的结果，表明cIAP1，cIAP2，XIAP，以及仅含有三个杆状病毒重复序列(BIR)区的截短型XIAP(t-XIAP)与GST-Hsp90融合蛋白结合。
图5A的免疫印迹照片显示，HeLa细胞提取物经指定浓度的格尔德霉素(geldanamycin，GA)处理24小时后，细胞中的IAP蛋白被降解。
图5B的免疫印迹照片显示，因存在蛋白酶体抑制物乳胱素(lactacystin)，存活蛋白受到保护而避免了GA-介导的降解。
图5C的免疫印迹照片显示，因存在蛋白酶体抑制物乳胱素，XIAP受到保护而避免了GA-介导的降解，但caspase抑制物Z-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F(ZVAD-fmk)不能保护XIAP免受GA-介导的降解。
图6的免疫印迹照片显示XIAP的第一个BIR区与GST-Hsp90结合。
图7的柱状图是ELISA试验测量结果，显示所示存活蛋白片段肽对Hsp90-存活蛋白的蛋白-蛋白相互作用的抑制效应。
图8A的免疫印迹照片显示，mAb 8E2抑制存活蛋白与GST-Hsp90的蛋白-蛋白相互作用，但mAb 58不具有这种抑制效应。
图8B的免疫印迹照片显示，细胞内加入mAb 8E2可诱导存活蛋白表达的下调。该免疫印迹的定量见其下图。
图9A是带有免疫印迹照片的图。该图用caspase底物的积累量化caspase活性，是通过用流式细胞术测量加载了mAb 8E2或对照IgG的细胞而测出的。这些细胞在无四环素(Tet-)时表达存活蛋白，在有四环素(Tet+)时不表达。这些数据表明，利用四环素诱导系统(Tet-Off系统)过表达存活蛋白可以克服细胞内加载抗体8E2对凋亡的诱导作用。图中的免疫印迹照片显示，mAb8E2诱导aspase 9裂解，它指示诱导凋亡。
图9B，图9C和图9D是一组400x放大的显微照片，分别显示加载了指定抗体的细胞。图9B显示加载了对照IgG的细胞。图9C显示加载了mAb8E2的细胞。图9D显示加载了mAb 58的细胞。加载了mAb 8E2的细胞在箭头所示细胞中诱导多核化(multinucleation)(图9C)，这是与存活蛋白功能丧失或下调有关的有丝分裂缺陷的特征。
图9E对胞内加载了mAbs 8E2，mAb 58或IgG的细胞中的有丝分裂缺陷进行量化。
图10A的免疫印迹照片显示亲和层析结果。免疫印迹表明，Hsp90和Hsp70以及相关蛋白Akt与指定的存活蛋白肽(Ile74-Leu87)亲和柱结合，Hsp27不与该存活蛋白肽柱结合。
图10B显示含有Hsp90结合位点的存活蛋白肽(Ile74-Leu87)与Hsp90结合，是通过质子共振(plasmon resonance)测出的。
图10C丙氨酸扫描诱变对存活蛋白肽(K79-L87)与Hsp90结合的能力的影响，是通过ELISA定量测定的。每一种指定的存活蛋白肽突变体被固定在微滴板上，用来测试与Hsp90结合的能力。
图11A的显微照片显示，与可通透细胞的存活蛋白肽(存活蛋白)、以及与对照倒序(scrambled)肽(对照)一起保温的细胞在相差显微镜和荧光显微镜下的图像。在每一对柱中，左侧柱表示存活蛋白，右侧柱表示对照。
图11B量化了图11A的结果，证实对照和存活蛋白肽都已有效内化至细胞中。
图12A记录了暴露于指定浓度的可通透细胞的存活蛋白肽或对照倒序肽的细胞进行流式细胞术试验的结果，表明可通透细胞的存活蛋白肽诱导凋亡。
图12B比较了可通透细胞的存活蛋白肽以及指定的化学治疗剂诱导凋亡的能力，是通过流式细胞术测量的。结果表明，可通透细胞的存活蛋白肽比这些化学治疗剂更有效诱导凋亡。
图13是多参数流式细胞术结果，X轴量化显示caspase活性(指示凋亡)，Y轴量化显示浆膜完整性的丢失(指示细胞死亡)。结果表明，在HeLa细胞中，可通透细胞的存活蛋白肽比对照倒序肽更有效诱导细胞死亡。
图14是多参数流式细胞术结果，X轴量化显示caspase活性(指示凋亡)，Y轴量化显示浆膜完整性的丢失(指示细胞死亡)。结果表明，在MCF-7细胞中，可通透细胞的存活蛋白肽比对照倒序肽更有效诱导细胞死亡。
图15是多参数流式细胞术结果，X轴量化显示caspase活性(指示凋亡)，Y轴量化显示浆膜完整性的丢失(指示细胞死亡)。结果表明，在具有野生型p53等位基因的HCT116细胞以及在具有失活的p53等位基因的HCT116细胞中，可通透细胞的存活蛋白肽比对照倒序肽更有效诱导细胞死亡。
图16的免疫印迹照片显示细胞提取物，是来自加载了递增浓度的存活蛋白细胞通透肽或对照倒序肽的细胞。表明，存活蛋白细胞通透肽降低存活蛋白和AKT的表达(稳定性)。
图17比较了递增浓度的反构型-反排列存活蛋白细胞通透肽(P3)和对照肽(P4)对指定肿瘤细胞系(HeLa，MDA-MB231，MCF-7和PANC-1)的细胞活力的影响。
图18是一组显微镜检照片，显示经反构型-反排列存活蛋白细胞通透肽(P3)或对照肽(P4)处理过的指定肿瘤细胞系。
图19是软琼脂组织培养板照片，这些培养板上有～20,000个乳癌MCF-7细胞悬浮在含有指定浓度的P31存活蛋白肽或对照倒序肽的培养基中。
图20记录了体内肿瘤形成试验的结果，表明存活蛋白细胞通透肽(P3)比盐水对照更有效抑制肿瘤生长，是通过肿瘤体积(y-轴)测量的。
图21是一组存活蛋白细胞通透肽衍生物以及相应的倒序对照。野生型(正向)存活蛋白氨基酸链序列和相应的倒序序列用下划线表示，它们各自的“反构型-反排列”序列也用下划线表示。序列中的“X”表示EAHX，是一种己酸间隔臂。
图22A和图22B显示，存活蛋白肽(P31；实心符号)和对照肽(P33；空心符号)对肿瘤细胞系(图22A)和正常细胞系(图22B)的凋亡的影响。
图23是多参数流式细胞术结果，X轴量化显示膜联蛋白V标记(指示凋亡)，Y轴量化显示碘化丙锭(propidium iodide)染色(指示细胞死亡)。结果表明，存活蛋白肽以剂量依赖方式诱导凋亡而对照肽没有该效果。
图24A和24B显示存活蛋白肽(相比于对照肽)与Hsp90的N-末端(图24A)和C-末端(图24B)区的结合，是通过ELISA定量的。
图25A和图25B是存活蛋白肽的分子模型。图25A是反构型-反排列存活蛋白K79-L87序列在溶液中显示β-转角显性构象的能量最小化预测结构。图25B显示反构型-反排列存活蛋白K79-L87肽停靠(docking)在Hsp90的ATP酶口袋中，是通过分子建模(molecular modeling)预测的。
图26A是存活蛋白、AKT、CDK-6、Hsp90、Hsp70和PCNA在经存活蛋白肽处理的细胞中的免疫印迹复制图。
图26B是TRAP试验结果复制图，该试验用于检测经存活蛋白肽处理的细胞的免疫沉淀物中端粒酶的活性。在标示为“无反应”的泳道中，未添加细胞提取物。R8，外部定量标准；ITAS，内部扩增标准。
图27A显示经盐水或存活蛋白肽处理11天期间的肿瘤体积。
图27B是肿瘤细胞的免疫荧光显微照片。有荧光表示存在存活蛋白肽。
图28是小鼠体内肿瘤生长图，所述小鼠带有源自MCF-7细胞的肿瘤，并按照图中指定的时间间隔在腹腔中注射了盐水或存活蛋白P3肽(50mg/kg/日)(6只小鼠/组)。每条线代表一只小鼠。
图29A是免疫印迹复制图，显示AML细胞中的存活蛋白水平。图29B-29D显示存活蛋白肽对AML细胞的杀伤作用。图29B显示HL-60细胞中的存活蛋白肽活性，是用台盼兰(Trypan blue)排除法检测的。图29C和29D显示全长存活蛋白肽(SEQ ID NO19)、存活蛋白肽K79-G83(SEQ ID NO20)或倒序肽(SEQ ID NO25和SEQ ID NO28)对HL-60(图29C)或THP-1(图29D)细胞的杀伤作用，是用MTT检测的。
图30显示存活蛋白K79-G83在AML细胞中的杀伤活性。图中指示的人AML细胞系(U937，K562，HL60和THP1)与倒序肽(SEQ ID NO28)或与存活蛋白(SEQ ID NO20)肽一起保温，用MTT评价细胞活力。
图31显示与存活蛋白肽结合的Hsp90，是用ELISA检测的。图中数据为两个独立实验的均值±S.D.。
图32是与荧光素(fluorescein)和罗丹明(rhodamine)偶联的存活蛋白肽的分子结构，该肽用于FRET和/或FP方法中。在FP方法中，存活蛋白肽可以仅与上述一种荧光团偶联。
发明详述本发明是基于，至少是部分基于，在存活蛋白、cIAP1、cIAP2和XIAP等凋亡抑制物(IAP)蛋白中发现了介导与热休克蛋白Hsp90之间蛋白-蛋白相互作用的特定区域。Hsp90与IAP蛋白的相互作用在肿瘤细胞中介导对凋亡的抑制。本文公开了可以在肿瘤细胞中用作Hsp90-IAP相互作用抑制物和凋亡调节物的IAP蛋白的肽和肽衍生物。例如，本文公开了在体外和体内抑制Hsp90-存活蛋白相互作用并诱导肿瘤细胞凋亡的新存活蛋白肽。本发明还提供了鉴定抑制Hsp90-IAP例如Hsp90-存活蛋白的蛋白-蛋白相互作用并诱导肿瘤细胞凋亡的化合物的筛选方法。存活蛋白肽的合理设计见Plescia et al.，Cancer Cell，7457-468(May 2005)，其全文引入作参考。
存活蛋白肽本文公开的存活蛋白肽及其肽衍生物共享Hsp90核心结合基序SEQ IDNO2(His Ser Ser Gly Cys)。该Hsp90核心结合基序位于存活蛋白的单个杆状病毒IAP重复(BIR)区内。更具体地，该基序对应于全长存活蛋白(SEQ IDNO1) 80-84位的氨基酸残基。含有该基序的肽及其肽衍生物可以(a)结合Hsp90的N端ATP酶区(“ATP口袋”)并(b)在体内和体外抑制Hsp90-存活蛋白的蛋白-蛋白相互作用。
术语存活蛋白肽和存活蛋白肽衍生物，在本文中用于指，含有比功能性存活蛋白完整氨基酸序列少的氨基酸序列且阻止凋亡的肽。本文公开的存活蛋白肽和肽衍生物在体内和/或体外抑制Hsp90-存活蛋白相互作用，因此在体内和/或体外诱导肿瘤细胞凋亡。
全长野生型人存活蛋白多肽具有以下氨基酸序列MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD (SEQ ID NO1)全长野生型人Hsp90多肽具有以下氨基酸序列MPEETQTQDQPMEEEEVETFAFQAEIAQLMSLIINTFYSNKEIFLRELISNSSDALDKIRYETLTDPSKLDSGKELHINLIPNKQDRTLTIVDTGIGMTKADLINNLGTIAKSGTKAFMEALQAGADISMIGQFGVGFYSAYLVAEKVTVITKHNDDEQYAWESSAGGSFTVRTDTGEPMGRGTKVILHLKEDQTEYLEERRIKEIVKKHSQFIGYPITLFVEKERDKEVSDDEAEEKEDKEEEKEKEEKESEDKPEIEDVGSDEEEEKKDGDKKKKKKIKEKYIDQEELNKTKPIWTRNPDDITNEEYGEFYKSLTNDWEDHLAVKHFSVEGQLEFRALLFVPRRAPFDLFENRKKKNNIKLYVRRVFIMDNCEELIPEYLNFIRGVVDSEDLPLNISREMLQQSKILKVIRKNLVKKCLELFTELAEDKENYKKFYEQFSKNIKLGIHEDSQNRKKLSELLRYYTSASGDEMVSLKDYCTRMKENQKHIYYITGETKDQVANSAFVERLRKHGLEVIYMIEPIDEYCVQQLKEFEGKTLVSVTKEGLELPEDEEEKKKQEEKKTKFENLCKIMKDILEKKVEKVVVSNRLVTSPCCIVTSTYGWTANMERIMKAQALRDNSTMGYMAAKKHLEINPDHSIIETLRQKAEADKNDKSVKDLVILLYETALLSSGFSLEDPQTHANRIYRMIKLGLGIDEDDPTADDTSAAVTEEMPPLEGDDDTSRMEEVD (SEQ IDNO21)本文公开的一种新存活蛋白肽是五肽His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ IDNO2)，它对应于SEQ ID NO1的His 80-Cys 84。这种五肽序列可以再包含一或多个在全长存活蛋白中位于该五肽序列侧翼的氨基酸(即恰好在该五肽序列之前或之后，它们之间不再插有其它氨基酸)。例如，本文公开的一种新肽是9肽SEQ ID NO24(Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu)，其含有SEQID NO1的残基Lys 79-Leu 87。另一种新肽是10肽SEQ ID NO5(Lys Lys HisSer Ser Gly Cys Ala Phe Leu)，其含有SEQ ID NO1的残基Lys 78-Leu 87。另一种新肽是12肽SEQ ID NO3(Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu SerVal Lys)，其含有SEQ ID NO1的残基Lys 79-Cys 90。本文公开的另一种新肽是14肽SEQ ID NO4(Ile Asp Asp His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala PheLeu)，其含有SEQ ID NO1的残基Ile 74-Leu 87。
本文提供的新肽包括位于SEQ ID NO1中His 80-Cys 84所示五肽序列一侧(氨基侧或羧基侧)或双侧的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸。
新存活蛋白肽还包括这样的肽，其侧翼有上述五肽序列氨基侧的氨基酸残基，也有上述五肽序列羧基侧的氨基酸残基，但氨基侧残基数不同于羧基侧残基数，例如，本发明包括这样的肽，其具有SEQ ID NO1中His80-Cys 84所示五肽序列氨基侧的0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸，还具有SEQ ID NO1中His 80-Cys 84所示五肽序列羧基侧的0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸，且其中该五肽序列氨基侧氨基酸数不同于该五肽序列羧基侧氨基酸数。存活蛋白肽的例子见表1。
表1.存活蛋白肽举例

本文公开的新存活蛋白肽包括肽SEQ ID NOs3-5。应注意，紧接所述五肽基序N端的Lys(即SEQ ID NO1的Lys 79)可以被保守氨基酸取代，也可以被一些非保守氨基酸取代。例如参见实施例10。更常见地，在本文公开的存活蛋白肽中，可以对SEQ ID NO1的核心五肽序列His 80-Cys 84以外的一或多个氨基酸进行保守氨基酸取代。此外，位于SEQ ID NO2任一端的一或两个氨基酸可以被保守氨基酸取代或被删除。因此，His-Ser-Ser(SEQ ID NO11)，Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO12)，Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO13)，His-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO14)，Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO15)，以及Lys-His-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO26)也都是存活蛋白肽。
此外，可以在SEQ ID NO2或SEQ ID NO26的任一侧或全部双侧连接随机氨基酸、或随机氨基酸组成的链，而形成存活蛋白多肽。
其它可用于本文所述方法的存活蛋白肽包括，例如在本文所述方法中鉴定出的、结合Hsp90并在肿瘤细胞中诱导凋亡的多肽。例如，存活蛋白肽包括结合Hsp90并在肿瘤细胞中诱导凋亡的杆状病毒IAP重复区及其片段。
IAP肽与Hsp90相互作用的其它凋亡抑制物蛋白包括cIAP1(Entrez AccessionNo.NP_001156)，cIAP2(Entrez登录号NP_001157)，以及XIAP(Entrez登录号NP_001158)。见例如Deveraux and Reed，Genes and Dev.，13239-252(1999)。这些IAP蛋白包含至少一个介导与Hsp90的相互作用的杆状病毒IAP重复区，如本文所述。例如XIAP的第一个BIR区(BIR1)对应于全长XIAP的约氨基酸1-123，它介导Hsp90-XIAP结合相互作用。
对应于这些IAP蛋白中一或多个BIR区的肽或其Hsp90-结合片段因此可以用于本文所述方法中，抑制Hsp90-IAP蛋白相互作用，并因此调节肿瘤细胞的凋亡。例如，XIAP，cIAP1或cIAP2的第一个BIR区可以用于抑制Hsp90与XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用。在另外的实施方案中，对应于与Hsp9结合的IAP蛋白BIR区片段的肽可以用于破坏Hsp90-IAP蛋白相互作用。
XIAP第一个BIR区的例子包括以下序列RLKTFANFPSGSPVSASTLARAGFLYTGEGDTVRCFSCHAAVDRWQYGDSAVGRHRKVSPNCRFIN (SEQ ID NO16)cIAP1第一个BIR区的例子包括以下序列RMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGLMLDNWKRGDSPTEKHKKLYPSCRFVQ (SEQ ID NO17)cIAP2第一个BIR区的例子包括以下序列RMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGLMLDNWKLGDSPIQKHKQLYPSCSFIQ (SEQ ID NO18)肽衍生物本文公开的肽的修饰形式称“肽衍生物”，它们也可以用于所述新方法中。例如，在本文公开的筛选方法和治疗方法中，可以用肽的肽衍生物代替该肽。
1.肽内化序列结合Hsp90并在肿瘤细胞中诱导凋亡的存活蛋白的肽可以通过附加细胞通透肽序列(有时称载体区或蛋白转运区)来修饰。细胞通透肽序列的例子见Hom et al.，J Med.Chem.，461799(2003)和Bonny et al.，Diabetes，5077-82(2001)。
例如，本文公开的肽和片段可以附加触角足载体序列第三个α-螺旋中的序列(Gratton et al.，Cancer Cell，431，(2003))。可以附加本文所述肽和片段的细胞通透序列的其它例子包括HIV-1的TAT蛋白序列(Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，964325(1999)Kelemen et al.，J.Biol.Chem.，2778741-8748，(2002)。另外的例子包括单纯疱疹病毒的VP22蛋白(Lundberg and Johansson，Biochem.Biophys.Res.Comm.，291367-371(2002))和Pep-1肽载体(Morris et al.，Nature Biotech.，191173-1176(2001))。包含具有细胞通透肽序列的肽和片段的多肽可以通过标准技术制备，如化学合成，或由编码该多肽的核酸表达。含有内化序列(internalization sequence)的肽的例子有RQIKIWFQNRRMKWKKKHSSGCAFL(SEQ ID NO19)和RQIKIWFQNRRMKWKKKHSSG(SEQ ID NO20)，其中的下划线序列是存活蛋白的序列。
2.肽模拟物本文公开的肽可以按照本领域已知方法修饰，得到肽模拟物。见例如Kazmierski，W.M.，ed.，Peptidomimetics Protocols，Human Press(Totowa NJ1998)；Goodman et al.，eds.，Houben-Weyl Methods of Organic ChemistrySynthesis of Peptides and Peptidomimetics，Thiele Verlag(New York 2003)；Mayo et al.，J.Biol.Chem.，27845746(2003)。在一些例子中，本文所述肽和片段的这些修饰的肽模拟物比非-肽模拟性肽的体内稳定性增强。
产生肽模拟物的方法包括，将肽序列中的一或多个(例如全部)氨基酸替换为D-氨基酸对映异构体。这种序列在本文中称“反构型(retro)”序列。在另一方法中，将氨基酸残基从N-末端到C-末端的顺序颠倒，使得原始肽中从N-端到C-端的氨基酸残基排列顺序变成修饰后的肽模拟物中从C-端到N-端的氨基酸残基排列顺序。这种序列可称“反排列(inverso)”序列。
肽模拟物可以既是反构型又是反排列的形式，即本文所述肽的“反构型-反排列(retro-inverso)”形式。新的肽模拟物可以由D-氨基酸组成，这些氨基酸的排列导致，在肽模拟物中从N端到C端的氨基酸残基顺序与在原始肽中从C端到N端的氨基酸残基顺序一致。
其它制备肽模拟物的方法包括，将肽中的一或多个氨基酸残基替换为与所述氨基酸的化学性质不同、但可识别的功能类似物，即人工氨基酸类似物。人工氨基酸类似物包括β-氨基酸，β-取代的β-氨基酸(“β3-氨基酸”)，氨基酸的磷类似物(phosphorous analog)，如α-氨基膦酸(phosphonic acids)和α-氨基次膦酸(phosphinic acids)，以及具有非-肽连接的氨基酸。人工氨基酸可以用于制备肽模拟物，如肽寡聚物(如拟肽酰胺或酯类似物)，β-肽，环肽(cyclic peptide)，寡尿(oligourea)或寡氨基甲酸酯肽(oligocarbamate peptide)；或杂环分子。存活蛋白反构型-反排列肽模拟物例子有LFACGSSHK，CGSSH，GSSHK，KKWKMRRNQFWVKVQRLFACGSSHK，KKWKMRRNQFWVKVQRCGSSH和KKWKMRRNQFWVKVQRGSSHK，这些序列包括所有D-氨基酸。这些序列可以通过例如使氨基端生物素化和使羧基端酰胺化而修饰。
核酸，载体和宿主细胞本发明一方面包括核酸，其编码破坏Hsp90-IAP蛋白相互作用的肽或经修饰的肽。例如，本发明包括编码新肽的核酸，所述新肽包括位于五肽序列SEQ ID NO2(即SEQ ID NO1的His 80-Cys 84)的一侧(氨基侧或羧基侧)或双侧的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸。
所述新核酸包括编码肽SEQ ID NOs2，3，4或5的核酸序列。本文公开的核酸还包括编码一些经修饰的存活蛋白肽(例如反构型-存活蛋白肽、与细胞内化(载体)序列相连的存活蛋白肽、以及与载体序列相连的反构型-存活蛋白肽)的核酸。
所述核酸还编码IAP蛋白家族成员中破坏Hsp90与XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的肽。例如，本发明包括编码BIR1即XIAP蛋白的Met 1-Ser 123的核酸。本文公开的核酸可以编码由本文所述方法鉴定出的破坏Hsp90与XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的任一种肽。本文公开的核酸还包括这样的核酸，其编码破坏Hsp90与XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的肽的修饰形式，例如反构型肽，与细胞内化(载体)序列相连的肽、以及与载体序列相连的反构型肽。
本文公开的核酸还包括RNA和DNA两者，包括基因组DNA和合成的(如化学合成的)DNA。核酸可以是双链或单链。核酸可以用寡核苷酸类似物或衍生物(如肌苷或核苷酸硫代磷酸酯)来合成。这种寡核苷酸可以用于例如制备抗核酸酶抗性增强的核酸。
本发明还包括遗传构建物(如载体和质粒)，其包含编码本文所述肽的核酸且该核酸与能表达所述肽的转录和/或翻译序列可操作相连，例如是表达载体。选定的核酸(例如编码本文所述肽的DNA分子)与另一核酸分子(例如启动子)“可操作相连”是指，前者紧邻后者，或者处在可以由后者指导前者进行转录和/或翻译的相同位置或其它位置。
本发明还包括多种经过改造的细胞，例如转化的细胞，其包含本文所述核酸。转化的细胞是这样一种细胞，在该细胞或其祖先细胞中，利用重组DNA技术导入了编码本文所述结合Hsp90和/或在肿瘤细胞中诱导凋亡的肽的核酸。原核细胞和真核细胞，例如哺乳动物细胞(如肿瘤细胞)、酵母、真菌、细菌(如大肠杆菌(Escherichia coli))都可以作为宿主细胞。本发明所包括的经改造的细胞例如有表达存活蛋白肽的肿瘤细胞，见下文实施例。
鉴定抑制Hsp90与存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的化合物的方法本发明一些方面提供了鉴定化合物的方法，所述化合物抑制Hsp90与存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用，并因此分别抑制存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的抗凋亡活性，例如所述化合物是有机或无机小分子(分子量不到1,000Da)，寡肽，寡核苷酸，碳水化合物，抗体。这些小分子、寡肽和寡核苷酸可用于治疗以细胞增生失控和凋亡机制失活为特征的疾病，例如癌症。
受试化合物文库在一些实施方案中，本文所述筛选利用了受试化合物文库。本文中，“受试化合物”可以是任何化学化合物，例如，大分子(如多肽、蛋白复合物、糖蛋白、多糖或核酸)或小分子(如氨基酸、核苷酸或有机或无机化合物)。受试化合物的分子量可以是约10,000g/摩尔以下，5,000g/摩尔以下，1,000g/摩尔以下，或约500g/摩尔以下。受试化合物可以是天然产生的(例如，草(herb)或天然产物)、合成的或可以既有天然成分也有合成成分。受试化合物的例子有肽、肽模拟物(例如，拟肽，反构型肽，反排列肽，和反构型-反排列肽)、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、以及有机或无机化合物如杂有机化合物(heterorganic compound)或有机金属化合物(organometallic compound)。
受试化合物可以单个地筛选或者平行筛选。一个平行筛选的例子是，化学物质大文库的高通量药物筛选。这种候选化合物文库可以自制或购买，例如从Chembridge Corp.，San Diego，CA购买。文库经过设计，可以涵盖较宽范围的化合物。例如，一个文库可以包括500、1000、10,000、50,000或100,000或更多的唯一(unique)化合物。或者，事先的实验和偶然的证据(anecdotal evidence)可以提示一类能力增强的化合物。可以设计并合成文库来涵盖这类化学物质。
组合文库(combinatorial libraries)的合成是本领域已知的，已有综述(见例如Gordon et al.，J.Med.Chem.，371385-1401(1994)；Hobbes et al.，Acc.Chem.Res.，29114(1996)；Armstrong，et al.，Acc.Chem.Res.，(1996)29123；Ellman，Acc.Chem.Res.，(1996)29132；Gordon et al.，Acc.Chem.Res.，29144(1996)；Lowe，Chem.Soc.Rev.，309(1995)；Blondelle et al.，Trends Anal.Chem.，1483(1995)；Chen et al.，J.Am.Chem.Soc.，1162661(1994)；U.S.Patents No5,359,115，5,362,899，and 5,288,514；PCT Publication Nos.WO92/10092，WO93/09668，WO91/07087，WO93/20242，WO94/08051)。
化合物文库可以按照多种方法制备，其中一些方法是本领域已知的。例如，″分-合(split-pool)″策略如下将多个作为功能化、聚合物性质支持物的珠置于多个反应管中；适于固相肽合成的多种聚合物性质支持物是已知的，其中一些可以商购(例如，见M.Bodansky″Principles of肽Synthesis，″2ndedition，Springer-Verlag，Berlin(1993))。向每一等份的珠中添加不同的经活化的氨基酸的溶液，进行反应，产生多种固相氨基酸，每一反应管中一种。然后洗这些经过衍化的珠，″合并(pooled)″(即重新组合(recombined))，将合并的珠再分组，将每一等份放置在不同的反应管中。然后向每一份珠中添加另一种经活化的氨基酸。重复该合成循环，直到获得所需的肽长度。每一合成循环中所加的氨基酸残基可以随机选择；也可以通过选取氨基酸来产生″有偏好的(biased)″文库，例如在文库中抑制物的一些部分并不是随机选择的，因此可以提供与已知能与抗体相互作用的肽有已知的结构相似性或同源性的抑制物，所述部分例如抗-独特型抗体抗原结合位点。有利的是，广泛多种肽化合物、肽模拟物化合物或非-肽化合物可以按照这种方式很容易地产生。
“split-pool”策略可以产生肽文库，例如调节物文库，其可用于制备本发明受试化合物的文库。在另一例合成中，用Hobbs DeWitt et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，906909(1993))的方法创建″多样体文库(diversomerlibrary)″。其它合成方法，包括Houghten(see，e.g.，Houghten et al.，Nature，35484-86(1991))的″茶袋(tea-bag)″技术，也可以用于合成本发明化合物文库。
可以筛选化合物文库，确定文库中任一成员是否可以抑制Hsp90与存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用，如果可以，则将其鉴定为抑制化合物。筛选组合文库的方法已有文献记载(见例如Gordon et al.，J Med.Chem.，同上)。可溶性化合物文库可以通过亲和层析来筛选，利用合适的受体分离该受体的配体，然后用常规技术(例如，质谱分析、NMR等)鉴定所分离的配体。固相化合物可以如下筛选使这些化合物与可溶性受体接触，优选所述可溶性受体与可被检测的标记物(例如，荧光团、定量显色的酶(colorimetric enzyme)、放射性同位素、化学发光化合物等)偶联，以便指示配体结合。或者，可以将固相化合物选择性释放并使之扩散过膜而与受体相互作用。可用于筛选受试化合物文库的试验的例子在上文中描述。
受试化合物也可包括抗体，例如与存活蛋白，cIAP1，cIAP2或XIAP结合的抗体。适用于在本文所述方法中进行筛选的抗体包括选择性结合本文所述肽的已知抗体和新抗体(下文祥述)。
筛选方法在本文所述筛选方法中，可以用肽的肽衍生物替代该肽。例如，可以用存活蛋白(或IAP蛋白)肽的肽衍生物替代该存活蛋白(或IAP蛋白)肽。
本发明提供了鉴定能(通过抑制IAP蛋白的抗凋亡活性)诱导细胞(例如肿瘤细胞)凋亡的化合物。尽管申请人不想将所涉及的生物学机制受限于任何具体理论，但认为这种化合物可阻止Hsp90与存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2结合，并且在存活蛋白的情况中，由此而在细胞(例如肿瘤细胞)中阻止或抑制细胞增殖和/或诱导细胞死亡。
在新方法的一些方面，筛选抑制凋亡的化合物可以是从一组受试化合物中鉴定出这样的化合物，它们例如(a)结合本文所述包含Hsp90结合位点的肽，例如存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的肽，和/或(b)抑制Hsp90与存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用。结合本文所述存活蛋白肽的化合物可以用作也结合存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的Hsp90结合基序并因此抑制Hsp90与存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的化合物。这种化合物是候选的诱导凋亡的化合物，可以进一步分析它们在体外或体内诱导肿瘤细胞凋亡的能力。
在新方法的另一些方面，筛选抑制凋亡的化合物可以是从一组受试化合物中鉴定出这样的化合物，它们(a)结合本文所述包含IAP(如存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2)结合位点的肽，例如Hsp90的肽，和/或(b)抑制Hsp90与存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用。结合本文所述Hsp90肽的化合物可以用作也结合Hsp90的IAP结合基序并因此抑制Hsp90与IAP(如存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2)的蛋白-蛋白相互作用的化合物。这种化合物是候选的诱导凋亡的化合物，可以进一步分析它们在体外或体内诱导肿瘤细胞凋亡的能力。
结合本文所述存活蛋白或Hsp90肽和/或抑制Hsp90与存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的受试化合物在本文中称“候选化合物”。凋亡诱导剂是通过进一步测试发现能抑制存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的活性并诱导肿瘤细胞凋亡的候选化合物。在新的筛选方法中，可以但非必需测试候选化合物，以确定它们是否肿瘤细胞的凋亡诱导剂。本文公开的试验可以在全细胞制剂中进行和/或在离体(ex vivo)的无细胞体系中进行。
一方面，本发明包括筛选受试化合物的方法，以鉴定出结合本文所述肽的化合物。受试化合物与本文所述肽的结合可以如下检测例如，在体外将受试化合物或本文所述肽可逆地或不可逆地固定在支持物表面，例如96孔聚苯乙烯微滴板的孔表面。固定化合物(例如肽和其它小分子)的方法是本领域已知的。受试化合物结合本文所述肽的能力可以随后测定使固相受试化合物或固相本文所述肽与非固相化合物或非固相本文所述肽接触，洗支持物，测出仍结合在支持物上的非固相受试化合物或本文所述肽的量。例如，可以用本发明的肽包被微滴板，方法是将所述肽的溶液(通常是0.05-1mg/ml在1-100μl中)添加到每孔中，将板在室温-37℃的温度保温一段时间，例如0.1-36小时。从板中除去(例如滗析、吸出或晃出)过量溶液，然后用水或缓冲液洗板(一次或多次)，从而除去未结合板的肽。通常，这种肽在水中或缓冲液中。再用不含结合肽的缓冲液洗板。为了封闭板上游离的蛋白结合位点，可以用与结合多肽无关的蛋白将板封闭。例如，可以用300μl 2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的TrisTM-HCl溶液。合适的支持物包括含有指定的交联化学的支持物(例如，塑料支持物，如聚苯乙烯、苯乙烯或聚丙烯支持物，可得自Corning Costar Corp.(Cambridge，MA))。需要时，可以用珠粒，例如琼脂糖珠或sepharose珠作为支持物。然后可将受试化合物添加到已包被的板上，使其结合固相的本文所述肽(例如，37℃ 0.5-12小时)。之后如上述洗板。
本文所述肽与第二种化合物，例如上述受试化合物的结合，可以用任一种本领域已知方法来检测。例如，可以在免疫分析中使用特异性结合本文所述肽的抗体。需要时，可以标记该抗体(例如，进行荧光标记或用放射性同位素标记)并直接检测(见例如West and McMahon，J.Cell.Biol.74264，1977)。或者，可以用第二抗体进行间接检测。在另一种检测方法中，标记受试化合物(例如，用放射性同位素、荧光团、生色团等标记)并检测该标记物。在另一方法中，如果受试化合物是多肽(受试多肽)，则将其与可以可选地检测的蛋白(例如可以在紫外线下检测的绿色荧光蛋白)一起制成融合蛋白。在另一方法中，可以将受试多肽与具有可检测的酶活性的酶一起制成融合蛋白，所述酶例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。编码所有这些酶的基因已有克隆，是本领域技术人员可以获得的。需要时，融合蛋白可以包括抗原，该抗原可以通过常规方法用多克隆或单克隆抗体进行检测和测量。合适的抗原包括酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶)以及非酶多肽(例如，血清蛋白如BSA和球蛋白，以及乳蛋白如酪蛋白)。
在鉴定与本文所述肽结合的受试多肽的多种方法中，可以采用传统的鉴定蛋白/蛋白相互作用的双-杂交体试验(two-hybrid assays，见例如Chien etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578，1991；Fields et al.，U.S.Pat.No.5,283,173；Fields and Song，Nature，340245，1989；Le Douarin et al.，NucleicAcids Research，23876，1995；Vidal et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9310315-10320，1996；and White，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9310001-10003，1996)。一般而言，双-杂交体方法涉及重建转录因子的两个可分离的区。一种融合蛋白包含本文所述肽且该肽与转录因子(如Gal4)的转录激活区或DNA结合区融合。另一种融合蛋白包含受试多肽且该多肽与转录因子的DNA结合区或转录激活区融合。一旦在单个细胞(如酵母细胞或哺乳动物细胞)中相遇，其中一种融合蛋白包含转录激活区而另一种融合蛋白包含DNA结合区。因此，本文所述肽与受试多肽结合导致重建转录因子。转录因子的重建可以通过检测基因(即报告基因)的表达来检测，该基因与结合转录因子DNA结合区的DNA序列可操作相连。实施多种双杂交体方法的试剂盒可以商购(例如从Clontech；Palo Alto，CA购买)。
另一方面，本发明包括筛选受试化合物的方法，以鉴定抑制Hsp90与存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用的化合物。一种高通量筛选能调节蛋白-蛋白相互作用的化合物的方法见Lepourcelet et al.，Cancer Cell，591-102(2004)，其全文引入本文作参考。通常，提供第一种蛋白。该第一种蛋白是(i)存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2或本文所述肽，或者(ii)该第一种蛋白是结合存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的Hsp90肽。提供第二种蛋白，它不同于第一种蛋白并带有标记。该第二种蛋白是(i)存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2或本文所述肽，或者(ii)结合存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的Hsp90肽。提供受试化合物。使所述第一种蛋白、第二种蛋白以及受试化合物彼此接触。测定与第一种蛋白结合的标记物的量。可以通过结合的标记物的量来评估第一种蛋白与第二种蛋白之间蛋白-蛋白相互作用(例如结合)的变化，它表明该化合物可以用于抑制Hsp90肽与存活蛋白、XIAP、cIAP1、cIAP2或本文所述肽的蛋白-蛋白相互作用。在一些实施方案中，这种变化是相对于不添加所述受试化合物时的相同反应而评估的。
在一些实施方案中，所述第一种蛋白附着在固体支持物上。固体支持物的例子有琼脂糖等树脂、珠、多孔板。在一些实施方案中，所述方法在接触步骤之后包括洗涤步骤，以便将结合的标记物与未结合的标记物分开。
在一些实施方案中，将多个受试化合物与所述第一种蛋白和第二种蛋白接触。不相同的受试化合物可以同组(in groups)或分别(separately)与其它化合物接触。在一些实施方案中，每一种受试化合物与不同孔中的第一种蛋白和第二种蛋白都进行接触。例如，所述方法可以筛选上文所述受试化合物文库。文库可以包括，例如天然产物、有机化学物质、肽、和/或经修饰的肽，包括例如D-氨基酸、非常规氨基酸和N-取代的氨基酸。通常，文库采取适于在多孔板例如96孔板中筛选的形式。这种试验尤其可用于自动进行多孔检测，其中的多数步骤可以由计算机控制并由自动设备(roboticequipment)进行操作。文库也可以是其它形式，例如固定在固体支持物上和可以释放到微滴(microdroplet)中的合成化学文库。
在一些实施方案中，第一种蛋白是存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2或本文所述肽，第二种蛋白是Hsp90肽。在另一些实施方案中，第一种蛋白是Hsp90或其生物活性片段，例如含有SEQ ID NO21的氨基酸残基1-272、可结合存活蛋白的片段，第二种蛋白是存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2或本文所述肽。被第一种蛋白附着的固体支持物可以是SEPHAROSETM珠、闪烁亲近测定(scintillation proximity assay，SPA)珠(内含闪烁体的微球体)或多孔板。SPA珠可以在无需洗涤步骤的测定，例如闪烁亲近测定中使用。SEPHAROSETM珠可以在包含洗涤步骤的测定中使用。第二种蛋白可以用能被检测到的标记物标记，所述标记物例如放射性标记物、荧光试剂、生物素、肽标签或酶片段。第二种蛋白也可以用125I或3H等进行放射性标记。
在一些实施方案中，用与第一种蛋白或第二种蛋白化学偶联或者与之表达为融合蛋白的酶的酶活性来检测结合的蛋白。本发明因此还包括结合试验，其中使用标准的免疫学方法检测结合的蛋白。
在另一些实施方案中，第一种蛋白与第二种蛋白的相互作用通过供体荧光团与受体荧光团之间的荧光共振能量转移(FRET)来检测，所述供体荧光团与第一种蛋白共价连接(例如是，与本文所述肽化学偶联的荧光基团或与本文所述肽相连而表达为绿色荧光蛋白(GFP)嵌合蛋白的GFP的变体)，所述受体荧光团与第二种蛋白共价连接，当第一种蛋白与第二种蛋白发生蛋白-蛋白相互作用，使所述荧光团靠得足够近时，供体发射光谱和受体激发光谱出现合适的重叠，导致产生有效的非放射性能量转移。或者，可以将供体荧光团和受体荧光团两者都偶联在同一肽例如存活蛋白肽的每一末端。游离的肽由于在供体位点和受体位点之间的分子内FRET导致荧光强度淬灭，因此具有较高的FRET效力。通过与Hsp90结合，肽-染料偶联物的分子内FRET降低，供体信号增强。在另一实施方案中，用荧光极化(fluorescence polarization，FP)监控两种蛋白之间的相互作用。例如，荧光标记的肽快速旋转，具有较弱的荧光极化。当与蛋白结合后，复合物的旋转变慢，荧光极化增强。
在另一些实施方案中，蛋白-蛋白相互作用通过重建酶例如beta-半乳糖苷酶的结构域来检测(见Rossi et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，948405-8410(1997))。
在另一些实施方案中，蛋白-蛋白相互作用通过第一种蛋白和第二种蛋白的适当嵌合构建体的荧光比例成像(fluorescence ratio imaging)来评估(Bacskai et al，Science，260222-226(1993))或通过改良的双杂交体试验来评估(Fearon et al，Proc.Nat’l.Acad.Sci USA，897958-7962(1992)；Takacs et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9010375-10379(1993)；Vidal et al，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，9310315-10320(1996)；Vidal et al，Proc.Nat’l Acad.Sci USA，9310321-10326(1996))，这种改良试验利用了第一种蛋白和第二种蛋白的适当构建体，且所述构建体通过修饰适于进行高通量测定，因此可以检测抑制第一种蛋白/第二种蛋白相互作用的化合物。这些实施方案的好处是，在测定时确保作为调节剂的化合物的细胞通透性。
例如，在一种试验中，但并非仅仅在该试验中，存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2，其肽或其片段吸附在ELISA板上。然后将吸附的多肽暴露于受试化合物，接着暴露于Hsp90或其肽(可选将其与报告肽例如谷胱甘肽S转移酶融合)。洗涤ELISA板，用抗-Hsp90抗体(或选择性结合该报告肽的抗体)检测结合的蛋白。所述抗体可以直接检测或用第二抗体间接检测。干扰蛋白-蛋白相互作用的化合物在ELISA板中产生的抗体信号降低。
II.抗体本发明的特征在于纯化的或分离的抗体，其与存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2(或其肽衍生物)的肿瘤凋亡诱导肽结合，例如，特异性结合。这样的抗体抑制Hsp90分别与存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2的蛋白-蛋白相互作用。抗体“特异性结合”具体抗原(例如本文所述存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2肽)是指，在样品(例如包含本文所述存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2肽的生物样品)中，该抗体结合所述抗原的表位，但不实质结合不含有该抗体结合的表位的其它分子。本发明的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、以及用Fab表达文库产生的分子。
本发明的抗体包括抗本文所述肽的抗体。这样的抗体可以如下制备分离或合成本文所述肽(例如，SEQ ID NO2，3，4或5或图22中的肽)，可选地使所述肽与佐剂卵清蛋白偶联，将所述肽注射到动物体内，产生多克隆抗体。
本文中术语“抗体”是指一种蛋白，其包括至少一个(例如两个)重链(H)可变区(本文中缩写VH)和至少一个(例如两个)轻链(L)可变区(本文中缩写VL)。VH和VL区可进一步分为超变区，也称″互补决定区″(″CDR″)，其间间插更保守的区，称″框架区″(FR)。框架区和CDR的范围已有明确限定(见Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，FifthEdition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，and Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.，196901-917)。每一个VH或V由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端到羧基端按照下列顺序排列FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
抗-存活蛋白，抗-XIAP，抗-cIAP1或抗-cIAP2抗体可以再分别包括重链恒定区和轻链恒定区，从而形成免疫球蛋白重链和轻链。所述抗体可以是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链组成的四聚体，其中重链和轻链通过例如二硫键相连。重链恒定区由CH1，CH2和CH3这三个区组成。轻链恒定区由CL这一个区组成。重链可变区和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合区。抗体恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一种成分(Clq)。
抗体的“抗原结合片段”是指全长抗体上保留与抗原多肽或其部分特异性结合的能力的一或多个片段。抗-存活蛋白，抗-XIAP，抗-cIAP1或抗-cIAP2抗体的抗原结合片段的例子包括但不限于(i)Fab片段，是由VL、VH、CL和CH1区组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，是两个Fab片段在铰链区以二硫键连接而成的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1区组成；(iv)Fv片段，由抗体单个臂的VL和VH区组成；(v)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature，341544-546)，由VH区组成；以及(vi)单独的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的VL和VH两个区可以由不同基因编码，但可以将它们用重组方法通过合成性接头连在一起，所述接头确保这两个区组成单一一条蛋白链，在该链中，VL和VH区配对形成单价分子(即单链Fv(scFv)；参见，例如Bird et al.(1988)Science，242423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-5883)。这种单链分子也包括在抗-存活蛋白抗体、抗-XIAP抗体、抗-cIAP1抗体、或抗-cIAP2抗体的术语中。这些抗体片段可以用本领域技术人员已知的常规技术获得。
为了制备抗体，可以使用存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2或其与Hsp90结合的片段或肽，例如通过重组技术或肽合成技术产生的那些(见例如SolidPhase Peptide Synthesis，同上；Ausubel et al.，同上)。一般而言，可以使多肽偶联载体蛋白，如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，见例如Ausubel et al.，同上，将其与佐剂混合，注射到宿主哺乳动物中。“载体”是指这样一种物质，其使与之偶联的分子稳定、和/或帮助或增强与之偶联的分子的转运或免疫原性。
通常，为了制备抗体，用抗原多肽注射多种宿主动物。合适的宿主动物的例子有兔、小鼠、豚鼠和大鼠。多种佐剂可以用于增强免疫应答，取决于宿主物种，包括但不限于，弗氏佐剂(Freund′s)(完全佐剂和不完全佐利)、矿物胶佐剂如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic polyols、聚阴离子、肽、油性乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯、BCG(bacilleCalmette-Guerin)以及小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。这类方法导致从被免疫的动物的血清产生多克隆抗体，即一群不均一的抗体分子。抗体可以从该宿主动物的血液纯化获得，例如用亲和层析法，其中将结合Hsp90的多肽抗原固定在树脂上。
本发明还包括抗本文所述存活蛋白肽、XIAP肽、cIAP1肽或cIAP2肽的单克隆抗体。单克隆抗体(mAb)是抗具体抗原的一群均一的抗体分子，可以用本文所述肽(例如，SEQ ID NO2，3，4或5或图25的肽)和标准杂交瘤技术(见例如Kohler et al.，Nature，256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.，6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.，6292，1976；Hammerling et al.，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，NY，1981；Ausubel etal.，同上)来制备。
通常，单克隆抗体可以用任何能产生抗体分子的技术来制备，所述技术例如通过连续培养的细胞系产生抗体分子的技术，参见Kohler et al.，Nature，256495，1975，美国专利4,376,110；人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor etal.，Immunology Today，472，1983；Cole et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，802026，1983)；以及EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96，1983)。这样的抗体可以是任一类免疫球蛋白IgG，IgM，IgE，IgA，IgD，及其任一亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。
多克隆抗体或单克隆抗体产生后，可以用标准技术在免疫分析(如Western印迹或免疫沉淀分析)中测试它们结合(例如特异性结合)存活蛋白、XIAP、cIAP1或cIAP2的能力，参见Ausubel et al.，同上。特异性结合存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2并抑制Hsp90与存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2之间蛋白-蛋白相互作用的抗体可以用于本发明。例如，这样的抗体可以用于在肿瘤细胞中诱导凋亡。
或者或此外，可以重组制备抗体，例如通过噬菌体展示或通过组合方法(combinatorial method)制备，见例如Ladner et al.美国专利5,223,409；Kanget al.国际公开文本WO 92/18619；Dower et al.国际公开文本WO 91/17271；Winter et al.国际公开文本WO 92/20791；Markland et al.国际公开文本WO92/15679；Breitling et al.国际公开文本WO 93/01288；McCafferty et al.国际公开文本WO 92/01047；Garrard et al.国际公开文本WO 92/09690；Ladner etal.国际公开文本WO 90/02809；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology，91370-1372；Hay et al.(1992)Hum.Antibod Hybridomas，381-85；Huse et al.(1989)Science，2461275-1281；Griffths et al.(1993)EMBO J.，12725-734；Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.，226889-896；Clackson et al.(1991)Nature，352624-628；Gram et al.(1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，893576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology，91373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nuc.Acid Res.，194133-4137；Barbas et al.(1991)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，887978-7982。
抗体可以是完全的人抗体(fully human antibody)(例如，在经过遗传改造可以由人免疫球蛋白序列产生抗体的小鼠中产生的抗体)或非-人抗体，例如啮齿类(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类(例如猴)、骆驼、驴、猪或禽的抗体。
所述抗体可以有在非-人生物如大鼠或小鼠中产生的可变区或其一部分，例如CDR。所述抗体还可以是嵌合抗体，CDR-移植型抗体或人源化抗体。所述抗体还可以在非-人生物如大鼠或小鼠中产生，然后在例如可变区框架区或恒定区中进行修饰，降低其在人体中的抗原性。
制备“嵌合抗体”的技术(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851，1984；Neuberger et al.，Nature，312604，1984；Takeda et al.，Nature，314452，1984)可以用于将具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有合适生物学活性的人抗体的基因连接。在嵌合抗体中，不同部分来自不同动物物种，例如具有来自小鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体。
或者，制备单链抗体的技术(美国专利4,946,778和4,704,692)经过改良，可以用于制备抗本文所述肽的单链抗体。将Fv区的重链片段和轻链片段通过氨基酸桥联，得到单链多肽，可以制备出单链抗体。
在一个实施方案中，可以将编码本文所述抗体例如单链抗体的重组载体用基因疗法技术导入细胞中，使所编码的抗体在细胞内表达，与胞内标靶结合，从而抑制其功能。改造这类胞内抗体(“intrabodies”)的方法是已知的。该技术已成功应用在本领域中(见Richardson and Marasco，1995，TrendsBiotechnol.，13306-310的综述)。
识别并结合特异性表位的抗体片段可以用已知技术产生。例如，这类片段可包括，但不限于F(ab′)2片段和Fab片段，前者可以通过用胃蛋白酶消化抗体分子而产生，后者可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生。或者，可以构建Fab表达文库(Huse et al.，Science，2461275，1989)，从而能快速简便地辨别具有所需特异性的单克隆Fab片段。
本发明还包括抗-独特型抗体，其可模拟存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2(或其肽衍生物)的肿瘤凋亡诱导肽的活性。制备这些抗体可以是，针对一群结合存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2(或其肽衍生物)的肿瘤凋亡诱导肽的抗体，筛选与其抗原结合区结合的抗体。这些抗-独特型抗体可以在本文所述诱导凋亡的方法中使用。
医学化学一旦鉴定出目标化合物(或试剂)，可以用医学化学的常规原理制备该化合物的衍生物。可以对衍生物筛选改进的药理学特性，例如效力、药物动力学、稳定性、溶解度和清除特性。对于上述测定中负责化合物活性的部分(moieties)，可以通过研究结构-活性关系(SAR)来描绘，本领域常常如此实践。药物化学领域技术人员可以修饰候选化合物或试剂(即先导化合物)上的一些部分，并测量该修饰对于该化合物或试剂的效力的影响，从而制得具有增强的能力的衍生物。例如见Nagarajan et al.(1988)J.Antibiot.，411430-8。而且，如果该化合物或试剂的生物化学标靶是已知的或者是确定的，可以依据该标靶和该化合物的结构来设计并优化衍生物。用于此目的的分子建模软件可以购买得到(例如从Molecular Simulations，Inc.购买)。
IV.药物组合物抑制Hsp90与存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2之间蛋白-蛋白相互作用的化合物和试剂、肽、及抗体(本文中都可称为“活性化合物”或“受试化合物”)可以掺入药物组合物中。这样的组合物通常包括活性化合物和可药用载体。“可药用载体”可以包括与给药方式相容的溶剂、分散介质(dispersion media)、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。也可以在组合物中补充活性化合物。
药物组合物经过配制使其与其想要采用的给药途径相容。给药途径的例子有非胃肠道途径，例如静脉、皮内、皮下、口服(例如吸入(inhalation))、经皮(transdermal)(局部表面(topical))、经粘膜(transmucosal)、以及直肠给药。非胃肠道、皮内或皮下用药的溶液或悬浮液可以包括以下成分无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、固定的油(fixed oil)、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其它合成性溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯类(methylparabens)；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠(sodium bisulfite)；螯合剂如乙二氨四乙酸；缓冲液如乙酸、柠檬酸或磷酸缓冲液以及调节渗涨度(tonicity)的试剂如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱来调节，如盐酸或氢氧化钠。非胃肠道用药的制剂可以容纳在由玻璃或塑料制成的安瓿(ampoule)、一次性注射器、或者多剂量小瓶(multiple dose vial)中。
适于注射用药的药物组合物含有无菌水溶液(水溶性)或分散体(dispersion)以及可以现场制作出(extemporaneous preparation)无菌注射液或分散体的无菌粉末。静脉用药时，合适的载体包括生理盐水、抑菌水(bacteriostatic water)、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况中，所述组合物必需是无菌的、且必需具有简便注射所需的流动性。它在制备和贮存条件下必需稳定、且必需保存在抗细菌和真菌等微生物污染的条件下。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、聚丙二醇和液态聚乙二醇等)、以及它们的合适混合物。合适的流动性(proper fluidity)可以通过以下方法维持例如，利用卵磷脂等包衣，在分散体的情况中维持所需的粒径，以及利用表面活性剂。微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂预防，例如，对羟基苯甲酸类(parabens)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚(phenol)、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等。在多种情况中，优选所述组合物含有等渗剂，例如糖(sugar)、聚醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。注射用组合物中含有延迟吸收剂例如单硬脂酸铝或明胶，可以实现延长吸收时间的效果。
将所需量的活性化合物加入合适的溶剂中，并根据需要加入一或多种上文列举的成分，然后过滤除菌，可获得无菌注射液。一般而言，将活性化合物加入无菌赋形剂(vehicle)中，并在该赋形剂中含有基础分散介质以及所需的来自上文所列的其它成分，可以制得分散体。在可制成无菌注射液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是，真空干燥和冷冻干燥，这样可以从事先过滤除菌的溶液得到活性成分加其它所需成分的粉末。
口服组合物通常含有惰性稀释剂或可食用的载体。为了进行口服治疗性用药，可以将活性化合物掺入赋形剂中，以片剂、锭剂(troche)或胶囊剂例如明胶胶囊的形式来用药。口服组合物也可以利用作为漱口水的流体载体来制备。可药用结合剂和/或辅料也可以包括在组合物中。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含以下任一种成分或具有相似性质的化合物结合剂(binder)如微晶体纤维素、西黄芪胶(gum tragacanth)或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂(disintegrating agent)如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂(lubricant)如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂(glidant)如胶体二氧化硅；增甜剂(sweetening agent)如蔗糖或糖精；或调味剂(flavoring agent)如薄荷(peppermint)、水杨酸甲酯(methyl salicylate)或桔子汁调味剂(orangeflavoring)。
为通过吸入(inhalation)方式用药，运送的化合物采用气溶胶形式，所述气溶胶从压力容器或含有合适推进物(propellant)例如二氧化碳等气体的布洒器(dispenser)或喷雾器(nebulizer)中喷出。
系统用药也可以利用经粘膜(transmucosal)或经皮途径。经粘膜或经皮用药时，在配制剂中使用适于穿透屏障的穿透剂(penetrant)。这类穿透剂是本领域通常已知的，包括例如经粘膜用药时的清洁剂(detergent)、胆盐(bile salt)和梭链孢酸(fusidic acid)衍生物。经粘膜用药可以利用鼻喷(nasal spray)或栓剂(suppositories)进行。经皮用药时，将活性化合物配制在本领域已知的软膏(ointment)、药膏(salve)、胶(gel)或霜(creams)中。
也可以将所述化合物制成栓剂(例如，用常规栓剂基质如可可脂(cocoabutter)及其它甘油酯来制)或保留灌肠剂(retention enemas)以备直肠运送。
在一个实施方案中，将活性化合物与保护该化合物免于从机体快速清除的载体一起配制，例如控释配制剂，包括植入体和微囊化运送体系。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙酯、聚酸酐(polyanhydrides)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、胶原、聚原酸酯(polyorthoester)、和聚乳酸。制备这类配制剂的方法是本领域已知的。所述物质也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc购得。脂质体悬浮液(包括用抗病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的那些脂质体)也可以用作可药用载体。这些可以按照本领域已知的方法制备，例如见美国专利4,522,811。
有利的是，将口服组合物或非胃肠道组合物配制成可以很容易地用药并且保持药剂均一性(uniformity of dosage)的剂量单位形式(dosage unitform)。本文中剂量单位形式是指，适合对接受治疗的受试者一次用量的物理不连续单位(physically discrete unit)；每一单位含有预定量的活性化合物和所需的可药用载体，该预定量是经过计算可以产生所需治疗效果的量。
这类化合物的毒性和疗效可以在细胞培养或试验动物中用标准药学方法测定，例如测定LD50(导致群体中50％死亡的剂量)和ED50(导致群体中50％有疗效的剂量)。将毒性比疗效的比例作为治疗指数，可表示为LD50/ED50。优选治疗指数较高的化合物。具有毒性副作用的化合物也可以使用，但应小心设计运送体系，将这样的化合物靶向受累组织，例如骨或软骨，将对未受累细胞的潜在危害降至最低，从而减小副作用。
从细胞培养试验和动物研究获得的数据可以用于配制人用的剂量范围。这类化合物的剂量(dosage)优选在具有ED50且无毒性或毒性很小的循环浓度范围内。所述剂量可以在该范围内根据所用剂型和用药途径来变动。对于在本发明方法中使用的任何化合物，其治疗有效量可以根据细胞培养试验来初步估计。动物模型中的用量可以配制为，使循环血浆浓度达到包括细胞培养中测定的IC50的范围(即受试化合物半数最大抑制(half-maximalinhibition)症状的浓度)。这样的信息可以用于更精确测定人用有效剂量。血浆水平可以通过例如高效液相色谱来测量。
本领域技术人员可以理解，有一些因素会影响有效治疗病人所需的剂量和耗时，这样的因素包括但不限于，接受治疗的病人的类型，疾病的严重程度，在先的治疗，该病人的总体健康状况和/或年龄，以及同时存在的其它疾病。而且，用治疗有效量的蛋白、多肽、抗体或其它化合物治疗病人，可以包括单一一次治疗，或者，优选包括一系列治疗。
本文所述肽的有效剂量范围是约0.001-30mg/kg体重，例如约0.01-25mg/kg体重，例如约0.1-20mg/kg体重。抗体的有效剂量是0.1mg/kg体重(通常为0.1mg/kg-20mg/kg)。通常，部分结构来源于人的抗体(partially humanantibodies)和完全的人抗体(fully human antibodies)在人体内比其它抗体具有更长的半衰期。相应地，用量较少和用药次数较少都是可能的。脂质化等修饰可以用于使抗体稳定并增强摄入和组织穿透。使抗体脂质化的方法可参见Cruikshank et al.((1997)J.Acquired Immune Deficiency Syndromes andHuman Retrovirology 14193)。
如果所述化合物是小分子，剂量举例包括mg或μg小分子/kg受试者或样品重量(例如，约1μg/kg-约500mg/kg，约100μg/kg-约5mg/kg或约1μg/kg-约50μg/kg。还应理解，小分子的合适剂量取决于该小分子调节表达或活性方面的潜力。在将一或多种所述小分子对动物(例如人)用药以调节本发明多肽或核酸的表达或活性时，医师、兽医或研究人员可以例如先开出相当低的剂量，随后增加剂量，直至产生合适的反应。还应理解，任何具体动物受试者的特定剂量水平取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性，该受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别、以及饮食，用药耗时，用药途径，排泄速度，任何联用药物，以及表达或活性需要调节的程度。
编码本文所述多肽的核酸分子可以插入载体中，用作基因治疗的载体。基因治疗载体可以通过如下方式运送至受试者例如，静脉注射，局部施用(见例如美国专利5,328,470)或三维立体定位注射(stereotactic injection)(见例如Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057)。基因治疗载体的药用制剂可以将该基因治疗载体包括在可接受的稀释剂中，或者将基因运送载体包埋在慢释放基质中。备选地，可以由重组细胞制备完整无损的完整基因运送载体，例如逆转录病毒载体，此时，药用制剂可以包括一或多种能产生该基因运送体系的细胞。
药物组合物可以与用药说明一起，容纳在容器、包装(pack)或配药器(dispenser)中。
治疗方法存活蛋白的最显著特征之一，是其在癌症组织中的表达不同于其在正常组织中的表达。回顾″癌-胎(onco-fetal)″抗原，存活蛋白在胚器官和胎儿器官中强表达，但在绝大多数终末分化的正常组织中检测不到。据报道表达存活蛋白的成年人正常组织包括，胸腺、CD34+骨髓-衍生的干细胞(低水平)、基底集落上皮(basal colonic epithelium)，但不包括基底角质细胞。而在肺、乳房、结肠、胃、食管、胰腺、肝、子宫、卵巢和脑部的肿瘤中，已经证实存活蛋白明显过量表达。存活蛋白还在与以下疾病有关的肿瘤组织中过表达何杰金氏病(Hodgkin’s disease)、大细胞非-何杰金淋巴瘤(large cellnon-Hodgkin’s lymphomas)、白血病、脊髓发育不良综合症伴有难治的贫血(myelodysplastic syndrome with refractory anemia)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)、软组织肉瘤、黑素瘤以及非-黑素瘤皮肤癌症。在针对整个基因组范围的搜索中，存活蛋白被鉴定为在结肠、肺、脑、乳腺的癌症和黑素瘤中是位居第四的高水平表达的″转录组(transcriptome)″，但该蛋白在相同器官的正常组织中的表达检测不到或者可以检测到但水平很低。见Velculescu，et al.，Nat.Genet.，23，387-388(1999)。
抑制Hsp90与存活蛋白之间蛋白-蛋白相互作用的候选化合物，例如本文所述肽、肽衍生物、及小分子，可以用于治疗失控细胞增生如癌症的方法中。所述肽和肽衍生物可以对诊断患有癌症例如本文所述任一种癌症的病人给药。例如，本文所述肽、肽衍生物和小分子可以用于治疗肺、乳腺、结肠、直肠、胃、食管、胰腺、肝、膀胱、子宫、卵巢、头颈部或脑部肿瘤患者。在另一些例子中，本文所述肽和肽衍生物可以用于治疗何杰金氏病、大细胞非-何杰金淋巴瘤、白血病、脊髓发育不良综合症伴有难治的贫血、神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤、软组织肉瘤、黑素瘤或非-黑素瘤皮肤癌症。
实施例实施例1存活蛋白与Hsp90相互作用进行数项实验，证实存活蛋白与Hsp90之间的蛋白-蛋白相互作用。人宫颈癌HeLa细胞和B淋巴瘤Raji细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)获得，按照供应商的说明维持在培养基中。为了进行Western印迹，将12％十二烷基硫酸钠(SDS)胶转移到尼龙膜，用1-5μg第一抗体保温。抗存活蛋白的兔多克隆抗体从NOVUS Biologicals(Littleton，CO)获得；抗Hsp90的单克隆抗体(mAb)从BD-Transduction Laboratories(目录号H38220；Lexington，KY)获得；抗微管蛋白的单克隆抗体从Sigma获得。第一抗体用辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的第二抗体(Amersham，Piscataway，NJ)和化学发光试剂盒(Amersham)显色。
图1A显示，存活蛋白与Hsp90和微管蛋白有相互作用。收集1.5×108HeLa细胞，用经过冰冷却的TrisTM-缓冲盐水(TBS)洗一次，在2倍体积的裂解缓冲液(TBS pH 7.4，1％TritonTMX-100，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，加另外的蛋白酶抑制物)中4℃裂解1小时。细胞裂解物在4℃、15,000g离心30分钟后澄清，然后上样至0.5ml SepharoseTM4B(Amersham Pharmacia)，该柱已经过溴化氰(CNBr)活化且已与5mg抗存活蛋白多克隆抗体偶联。用空树脂作对照。用裂解缓冲液充分洗柱后，加洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH2.5)，收集0.5ml的级分，用1M TrisTMpH 8.0中和。样品在TBS中透析，在12％SDS胶上分离，通过考马斯亮兰染色和Western印迹进行分析。Western印迹鉴定出90kDa的Hsp90和55kDa的微管蛋白，它们与存活蛋白一起被洗脱下来，见图1A。
图1B显示存活蛋白和Hsp90的免疫共沉淀。将不同步生长(asynchronously growing)的B淋巴瘤Raji细胞(5×105)裂解，如上述离心使之澄清。将上清和重悬的细胞团(pellet)与存活蛋白(图中标示为存活蛋白)或对照、非-结合IgG(图中标示为IgG)抗体(2.5-5μg/ml)在4℃免疫沉淀16小时。添加50μl 50∶50蛋白A或蛋白G浆液(slurry)，使免疫复合物沉淀。从细胞团沉淀的免疫复合物(P)或从上清沉淀的免疫复合物(S)用抗Hsp90抗体或抗存活蛋白抗体通过Western印迹进行分析，见图1B。
图1C显示存活蛋白和Hsp90的体内pull-down结果。收获不同步生长的HeLa细胞的培养物，或者收获经过paclitaxel(TaxolTM)(2μM，Sigma)处理而同步在有丝分裂过渡期(synchronized at the mitotic transition)的HeLa细胞。将细胞提取物与SepharoseTM(图中标示为“Sepharose”)或存活蛋白-SepharoseTM(图中标示为“存活蛋白”)一起保温，用Western印迹分析细胞团或上清(25％的反应)中共结合的(co-associated)Hsp90。将不同步生长的培养物的样品标示为“None”，将经过TaxolTM处理的细胞的样品标示为Taxol。这些结果证实了存活蛋白与Hsp90之间的蛋白-蛋白相互作用。
实施例2存活蛋白的正确折叠是与Hsp90结合所要求的重组存活蛋白(r-存活蛋白)(10mg/ml)或重组Hsp90(r-Hsp90)(10μg/ml)用碳酸氢盐缓冲液pH 9.5(100μl/孔)在塑料微滴板的孔(ImmulonTM-2，Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)中4℃固定18小时，进行ELISA实验。结合的蛋白用3％明胶37℃封闭1小时，用洗涤缓冲液(TBS pH 7.4，0.1％TweenTM，0.1％BSA)洗涤，然后与不同浓度的待测蛋白在37℃保温1小时，确定是否该待测蛋白与固相蛋白结合。
GST-Hsp90(氨基酸1-732)、重组GST-存活蛋白、GST-存活蛋白(C84A)在大肠杆菌(E.coli)中表达，并与谷胱甘肽珠(Sigma)结合。Hsp90α用PCR克隆到pGex-4T3(Amersham Pharmacia Biotech.)中。缺乏GST框的纯化的r-存活蛋白通过用凝血酶(Sigma，20U/ml在50mM TrisTMpH 7.4，150mMNaCl，5mM MgCl2，2.5mM CaCl2，1mM DTT中)消化相应GST融合蛋白而获得。将20μg与谷胱甘肽珠结合的GST或GST融合蛋白(20μl)在结合缓冲液(10mM TrisTMpH 7.5，10mM EDTA，100mM NaCl，0.1％TritonTM，1mMDTT和多种蛋白酶抑制物)中洗两次，在含有递增量(5μg，10μg，20μg，40μg)的r-存活蛋白的100μl结合缓冲液中，室温(RT)保温2.5小时，然后洗5次。结合的蛋白以及四分之一未结合的蛋白在12％SDS胶上分离，用GelCodeBlue Stain Reagent(Pierce)染色。
在一个实验中，含有经过封闭的固相r-存活蛋白的孔与r-Hsp90或重组CD11b整联蛋白区(I-区)一起保温，洗10次，再与抗-Hsp90 mAb(1μg/ml)或对照非-免疫IgG(1μg/ml)在37℃保温1小时。再洗10次，然后分析第一抗体的结合添加偶联了生物素的兔抗-小鼠IgG，在37℃保温1小时，之后添加链霉亲和素-碱性磷酸酶，用磷酸对硝基苯(Zymed Laboratories，South San Francisco，CA)作为底物，测定OD405的吸光度。图2A显示了这些实验的定量结果rHsp90以剂量依赖方式与固相r-存活蛋白结合；而作为对照的I区不结合r-存活蛋白。
在另一实验中，固相r-Hsp90存活蛋白与递增浓度的r-存活蛋白或重组表达型存活蛋白Cys84→Ala突变体(存活蛋白(C84A))混合。存活蛋白(C84A)除去了BIR中的锌配位层(Zinc coordination sphere)，产生不折叠的分子。结合的蛋白通过ELISA用多克隆抗-存活蛋白检测，并通过OD405的吸光度定量，方法如上所述。结果见图2B，存活蛋白和Hsp90可以彼此结合，但存活蛋白(C84A)不折叠型突变体不结合Hsp90。
这些结果表明，Hsp90以剂量依赖方式结合存活蛋白，且Hsp90与存活蛋白的结合不仅仅是对类似于不折叠型蛋白的存活蛋白区的非特异性伴侣蛋白应答。这些结果还表明，存活蛋白要求有正确的折叠才与Hsp90相互作用。因此，Hsp90-存活蛋白复合体不参与促进存活蛋白的降解，而恰恰相反，参与维持存活蛋白的稳定性。
实施例3存活蛋白与Hsp90的N末端结合对于全长Hsp90α(SEQ ID NO21；氨基酸1-732)或三种片段N-Hsp90(SEQ ID NO21的氨基酸1-272)，M-Hsp90(SEQ ID NO21的氨基酸273-617)，以及C-Hsp90(SEQ ID NO21的氨基酸629-732)，将编码它们的核苷酸序列利用BamHI克隆位点经PCR克隆至pGex-4T3(Pharmacia Biotech.)和pFLAG-CMV 6c(Sigma)中。全长Hsp90或各个Hsp90片段的GST融合体在大肠杆菌中表达，并与谷胱甘肽珠(Sigma)结合。缺乏GST框的纯化的重组存活蛋白按照实施例2所述而获得。
图3A显示存活蛋白/Hsp90体外pull-down实验结果。递增浓度的r-存活蛋白(30，100和300ng/50μl反应物)与SepharoseTM-GST-Hsp90(10μg/50μl反应物)或与融合至N-Hsp90，M-Hsp90或C-Hsp90区的GST一起保温。将反应物离心，使SepharoseTM-GST融合体沉淀。蛋白结合通过用Western印迹分析沉淀(结合者)或上清(未结合者)来确定。图3A显示，存活蛋白仅与全长Hsp90或与含有Hsp90的ATP结合区的N-Hsp90片段(氨基酸1-272)结合。
图3B显示，存活蛋白与Hsp90的N末端区在体内发生免疫共沉淀。HeLa细胞用图中标示的FLAG-Hsp90 N，M或C区转染，使蛋白与抗FLAGmAb(Sigma，目录号F3165，St.Louis，MO)进行免疫沉淀，免疫复合物用抗存活蛋白多克隆抗体或抗FLAG mAb通过Western印迹分析共结合的存活蛋白。图3B显示，仅N-Hsp90片段能与存活蛋白发生免疫沉淀。
这些结果表明，存活蛋白与含有ATP酶区的Hsp90 N-末端结合。
实施例4Hsp90与IAP家族其它成员相互作用从HeLa细胞(TRI ReagentTM，Molecular Research Center Inc.)提取RNA，进行逆转录(SuperScriptTMFirst Strand Synthesis System for RT-PCR，Invitrogen)，获得XIAP和XIAP杆状病毒IAP重复区(BIR)(BIR1，Met 1至Ser 123；BIR2，Arg 124至Pro 260；BIR3，Ser 261至Gln 336)的cDNA，PCR扩增，克隆至pcDNA3载体(Invitrogen)中。在有35S标记的甲硫氨酸(Amersham)存在的情况下，用TNTTMQuick Coupled Transcription/TranslationSystem(Promega)，对pcDNA3-XIAP和pcDNA3-XIAP BIR区进行体外翻译，取2，5和8μl反应物与10μgGST或上述GST蛋白一起保温。
图4A显示，cIAP1，cIAP2和XIAP都与Hsp90结合。将Raji细胞提取物与抗cIAP1，cIAP2，XIAP的抗体或与作为对照的非结合IgG(IgG)进行免疫沉淀(如上述)。抗XIAP，cIAP1和cIAP2的抗体分别从BD-TransductionLaboratories(目录号610763)，BD-PharMingen(目录号556533，San Diego，CA)以及Santa Cruz Biotechnology(目录号sc-7944；Santa Cruz)获得。免疫复合物(P)和未结合的物质(S)用抗-Hsp90通过Western印迹进行分析(上图)。图4A显示，cIAP1，cIAP2以及XIAP免疫复合物(P)可以沉淀Hsp90，但对照IgG不可以。各种IAP的可比免疫沉淀(comparable immunoprecipitation)也通过Western印迹证实。
图4B显示Hsp90与各种IAP蛋白的体外相互作用。所述各种IAP蛋白包括，存活蛋白，XIAP，cIAP1，cIAP2，以及仅含有三个BIR区并跨残基1-292的截短型XIAP(t-XIAP)，在有35S-甲硫氨酸存在的情况下，对这些蛋白进行体外转录和翻译，在pull-down实验中与SepharoseTM-GST或SepharoseTM-GST-Hsp90混合，结合的蛋白通过放射自显影观察。
这些结果表明，Hsp90与(a)cIAP1，(b)cIAP2和(c)XIAP之间存在蛋白-蛋白相互作用。
实施例5Hsp90控制存活蛋白及其它IAP蛋白的稳定性按照实施例1所述，维持细胞，并进行Western印迹。
图5A显示，Hsp90的ATP酶环的抑制物格尔德霉素(GA)诱导IAP蛋白降解。HeLa细胞用指定浓度的格尔德霉素(GA)处理24小时后，通过Western印迹分析IAP水平的变化。用1μM GA处理使存活蛋白，XIAP和cIAP2相对于未处理对照，稳定状态水平(steady-state level)下降。Hsp90和β-肌动蛋白的水平不受GA处理影响。
图5B显示有GA存在时蛋白酶体抑制对存活蛋白稳定性的影响。在有或无5μM蛋白酶体抑制物乳胱素存在的情况下，用1μM GA对HeLa细胞提取物处理30小时，通过Western印迹分析存活蛋白或β-肌动蛋白水平的变化。抗肌动蛋白抗体从Sigma获得。经乳胱素和GA处理后，存活蛋白水平等同于或高于未处理的细胞的水平，表明存活蛋白在GA处理期间发生了蛋白裂解。在该实验中，β-激动蛋白水平不受处理的影响。
图5C显示，在有GA时的XIAP降解，被蛋白酶体介导，但不被活化的caspases介导。在无(None)或有蛋白酶体抑制物乳胱素或广谱caspase抑制物ZVAD-fmk的情况下，将HeLa细胞提取物暴露于指定浓度的GA，然后收集细胞提取物。XIAP表达因有GA造成的Hsp90抑制而丢失，这种丢失被乳胱素逆转，但不被ZVAD-fmk逆转，可参见图5C所示XIAP的Western印迹(*表示非特异性泳带)。
这些结果表明，Hsp90功能是存活蛋白，cIAP1，cIAP2和XIAP的稳定表达所要求的。因此，有可能本文所述肽/抗体/化合物的凋亡诱导效应被它们阻止存活蛋白，cIAP1，cIAP2，和/或XIAP与Hsp90相互作用的能力介导，至少是部分介导，从而降低这些抗-凋亡蛋白的稳定性和表达。
实施例6鉴定XIAP的Hsp90结合位点pcDNA3-XIAP和pcDNA3-XIAP BIR区如实施例4所述进行体外翻译。图6显示Hsp90和分离的XIAP BIR片段之间的体外相互作用，显示了与BIR氨基-末端(BIR1)的选择性结合。GST-Hsp90或GST与35S体外翻译的XIAP或其单个的杆状病毒IAP重复区BIR1，BIR2和BIR3混合。将反应物离心，与细胞团结合的蛋白通过放射自显影检测。图6显示，仅有全长XIAP和分离的BIR1片段与GST-Hsp90结合。
这些结果鉴定出，BIR1含有XIAP的Hsp90结合区。XIAP的氨基酸Met1至Ser123的序列(含BIR1)是MTFNSFEGSKTCVPADINKEEEFVEEFNRLKTFANFPSGSPVSASTLARAGFLYTGEGDTVRCFSCHAAVDRWQYGDSAVGRHRKVSPNCRFINGFYLENSATQSTNSGIQNGQYKVENYLGS (SEQ ID NO27)实施例7鉴定存活蛋白(K79-K90)的Hsp90结合位点图7显示，鉴定了抑制存活蛋白与Hsp90相互作用的存活蛋白序列的合成肽。ELISA实验基本如实施例2所述，有以下变动20μg/ml每种重组存活蛋白肽(表达在大肠杆菌中)与2.5mg/ml Hsp90在4℃预保温16小时。使全长存活蛋白结合微滴板的孔并进行封闭，之后将Hsp90和存活蛋白肽的预保温混合物添加到这些孔中，37℃保温1小时。洗孔后，孔用第一抗体保温，再次洗涤后，如上述定量结合的抗体。每一实验重复三次，示出标准偏差。具有12个氨基酸的存活蛋白肽包括赖氨酸79-赖氨酸90(K79-K90；SEQ ID NO3)对于Hsp90-存活蛋白结合相互作用是特别有效的抑制物。
这些结果与将Hsp90结合位点分配在存活蛋白的K79-K90区中的结果一致，可作为抑制Hsp90-存活蛋白相互作用的化合物的筛选方法的一个工作实施例。
实施例8鉴定存活蛋白-Hsp90相互作用的抗体拮抗剂小鼠抗-存活蛋白单克隆抗体(mAb)8E2和58从NOVUS Biologicals(Littleton，CO)获得。图8A显示，在竞争实验中，mAb 8E2抑制存活蛋白-Hsp90的蛋白-蛋白相互作用，mAb 58无此抑制作用。将R-存活蛋白(300ng)与3mg小鼠抗存活蛋白单克隆抗体mAb 58或8E2在50ml结合缓冲液中22℃预保温1小时。然后，在该缓冲液中添加5mg GST-Hsp90或GST-N-Hsp90，将GST离心，通过存活蛋白的Western印迹检测与Hsp90结合的蛋白。单克隆抗体8E2减少了被任一种GST融合蛋白沉淀的存活蛋白的量。
图8B显示，向细胞内添加mAb 8E2，可以体内置换(in vivo displacement)存活蛋白-Hsp90相互作用，使存活蛋白表达下调。为了进行这些实验，在有BuoPORTERTM蛋白转染试剂(Gene Therapy Systems，San Diego，CA)存在的情况下，向HeLa细胞(2×105)中添加5μg抗存活蛋白mAb 8E2或58或小鼠IgG在OptiMEMTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的溶液。4小时后，向细胞中添加100μg/ml环己酰亚胺，用Western印迹分析90分钟内(第0，30，60和90分钟时)的存活蛋白表达(图8B，上图)。抗体上样的效率(90％)用FITC-偶联IgG(5μg)和荧光显微镜检测定。将蛋白量参照β-肌动蛋白水平进行标准化，并定量(图8B，下图)。图8B显示，mAb 8E2介导对Hsp 90-存活蛋白相互作用的破坏，这抑制了存活蛋白表达/稳定性。
这些结果表明，mAb 8E2抑制存活蛋白-Hsp90的蛋白-蛋白相互作用，并因此降低存活蛋白表达。
实施例9抗体对存活蛋白-Hsp90相互作用的破坏在体内导致诱导凋亡和有丝分裂缺陷图9A显示，mAb 8E2诱导凋亡标志物caspase-9的裂解。这些实验使用了YUSAC-2黑素瘤细胞系，该细胞系已经被适应于野生型存活蛋白表达的系统(Tet-Off system)稳定转染。存活蛋白的适应表达(Conditionalexpression)通过从培养基中除去四环素来诱导，见Grossman et al.(2001)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，98635。用BioPORTERTM蛋白转染系统向YUSAC-2细胞内添加mAb 8E2或IgG(见实施例8)，在无四环素(Tet-)或有四环素(Tet+)的情况下，添加caspase底物，通过流式细胞术分析细胞的caspase-3/7活性。该实验受两个参数影响caspase水解荧光性caspase底物的活性(X-轴)以及经碘化丙锭染色观察到的非通透细胞中浆膜完整性的丢失。见Kim et al.，(2003) Lancet，362205。数据为三个独立实验的均值±S.D.。插图显示caspase-9在抗存活蛋白mAb 8E2或58转导的HeL细胞中的蛋白裂解加工。图中指示了Western印迹观察到的caspase-9原型或裂解型的位置。这些数据表明，mAb 8E2诱导caspase 9裂解。
图9B显示，将mAb 8E2添加到HeLa细胞中引起有丝分裂缺陷，可通过荧光显微镜检观察。在HeLa细胞中添加抗存活蛋白mAb 8E2或58或IgG(阴性对照)，将这些细胞用抗β-微管蛋白抗体染色，通过荧光显微镜检进行分析。图9B中箭头指明经mAb 8E2-转导的培养物中的多核细胞，与这些细胞中凋亡介导性细胞死亡的诱导一致。
图9C概括了添加mAb 8E2，mAb 58或IgG的细胞中的有丝分裂缺陷。有丝分裂指数量化了处于有丝分裂期间的细胞的百分比，通过在放大400x的至少5个视野(平均有100个细胞/视野)中，计数有丝分裂的HeLa细胞的数量来计算。数据为四个独立实验的均值±均值的标准误差(SEM)。添加了mAb 8E2的HeLa细胞有明显不同的有丝分裂指数和多核表现，都指示凋亡诱导作用。
这些结果表明，抗体可以用于破坏存活蛋白-Hsp90的蛋白-蛋白相互作用，并因此在癌细胞中诱导凋亡。
实施例10存活蛋白肽序列79-90及相关序列与Hsp90的相互作用图10A显示在存活蛋白肽柱上通过亲和层析分离Hsp90/Hsp70复合体。将含有Hsp90结合位点的存活蛋白Ile74-Leu87肽(SEQ ID NO4)固定在SulfolinkTMCoupling Gel(Pierce，Rockport，IL)上，用于分级分离Raji细胞提取物。用图中指明的抗体通过Western印迹鉴定出流过物(flow through，FT)或洗脱物(eluate，E)中的蛋白。Hsp90和Hsp70明显结合含有Ile74-Leu87残基的存活蛋白肽。抗-Hsp70抗体从Abcam，Cambridge，MA获得(目录号ab6535)。
图10B显示含有Hsp90结合位点的存活蛋白肽序列与Hsp90的物理结合，通过质子共振测定。合成野生型存活蛋白肽77-91(SEQ ID NO22)或相应的C84A突变体77-91肽(HKKHSSGAAFLSVKK；SEQ ID NO23)，其带有N-末端生物素，将它们固定在经过链霉亲和素包被的芯片(chip，SA5)上，这些芯片购自Biacore Inc.(Piscataway，NJ)。然后，将60ml悬浮在10mMHEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％polysorbate-20，1mM DTT中的递增浓度的(100nM-10μM)纯化r-Hsp90注射到上述固相肽表面。维持恒定流速20ml/min，之后维持解离相300秒。每次解离相之后，用10ml 1MNaCl/50mM NaOH使表面再生。再生仅10分钟后，开始新一轮注射，以确保彻底除去NaCl和NaOH。收集的数据用Biacore Inc.的Biaeval 3.0软件包分析。
传感图(图10B)显示存活蛋白肽与Hsp90的结合，是通过测量分析物流过芯片表面期间表面质子共振的增加、扣除仅有生物素的表面所发出的非特异性信号而测定的。野生型(SEQ ID NO22)或C84A(SEQ ID NO23)肽的结合速率(on-rate)相似，但野生型肽的解离速率(off-rate)低10倍，导致较高结合亲和力(KD±SEM＝8.38×10-8±3.5×10-9M)。
图10C显示经诱变的存活蛋白肽的功能分析，用于鉴定存活蛋白-Hsp90相互作用所必需的氨基酸(His 80-Cys 84；SEQ ID NO2)。合成指定的来自存活蛋白核心序列Ile79-Leu87(SEQ ID NO24)的合成肽，它们在每一指定位置有单个丙氨酸取代(丙氨酸扫描诱变)。将这些肽按照指定的递增浓度分别固定在塑料微滴板上，与重组Hsp90一起保温，用抗Hsp90抗体通过ELISA测定与多种底物的结合，通过OD405的吸光度来定量。数据为两个独立实验的均值±S.D.，它们证实，存活蛋白核心序列的氨基末端氨基酸His 80，Ser 81，Ser 82，Gly 83和Cys 84对于Hsp90结合很重要。相反，未发现野生型肽序列与该序列侧翼残基Lys 79，Ala 85，Phe 86和Leu 87被丙氨酸取代后的序列有差异。
这些结果表明本文公开的肽与Hsp90结合，并鉴定了该结合所必需的氨基酸残基。
实施例11基于存活蛋白K79-L87中的Hsp90结合位点开发细胞通透肽为了对caspase-依赖性细胞死亡和浆膜完整性的丢失进行多参数分析，在HeLa，MCF-7或经遗传改造的HCT116细胞(从ATCC获得)中添加递增浓度的细胞通透型对照倒序肽或存活蛋白肽，37℃培养24小时后，收获细胞，通过流式细胞术分析细胞活力(碘化丙锭，红道(red channel))以及活性caspase-3的活性(CaspaTagTM，Intergen，Purchase，NY，绿道(green channel))。
将触角足载体序列的第三个α-螺旋与含有Hsp90结合位点的存活蛋白肽序列K79-L87的氨基末端融合，合成出细胞通透肽(存活蛋白细胞通透肽)，产生P31存活蛋白肽(SEQ ID NO19；图21)。另外合成对照肽(RQIKIWFQNRRMKWKKSKLACFSHG；SEQ ID NO25)，其中触角足通透肽(RQKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO29)与倒序的存活蛋白K79-L87序列(对照)融合。合成的对照肽和存活蛋白肽都有氨基末端生物素部分，并且都通过HPLC分析纯度和均一性。将这些肽以150μM终浓度与亚汇合(subconfluent)的HeLa细胞在37℃保温6小时。收获细胞，用链霉亲和素-PE染色，通过相差显微镜检(图中标示为相差)或荧光显微镜检进行分析。图11A显示存活蛋白肽(SEQ ID NO19)和倒序对照肽(SEQ ID NO25)两者的有效内化。
图11B通过分析各个细胞的荧光，量化了图11A的观察结果。实验条件基本同图11A，区别是，通过荧光显微镜检分析25个细胞中对照肽或存活蛋白肽向胞内穿透的情况。通过宽视野荧光显微镜检(Olympus，JAPAN)，用63X物镜从6个随机视野中获得13个光学区域(optical sections，333±50nm)。测量每个细胞时，获得细胞轮廓外侧区域的荧光值，将其作为本底从总测量值中扣除(通常为细胞荧光总测量值的5-10％)。在每一全细胞动态图(full cell profile)中或者在整个群体内，用MetamorphTM软件(MolecularDevices Corporation，Sunnyvale，CA)或IP Lab软件(3.5.4版，Scanalytics，Fairfax，VA)计算每一光学区域的荧光强度(整合光学强度，IOD)。结果表明，对照肽和存活蛋白细胞通透肽变体都积累在靶细胞内侧，它们的穿透效率没有差别。
这些结果表明，合成了新的存活蛋白细胞通透肽衍生物。
实施例12存活蛋白细胞通透肽有两个Hsp90结合位点可在肿瘤细胞中诱导凋亡为通过亚二倍体DNA含量确定凋亡，将不同肿瘤细胞系与浓度递增的细胞通透性倒序对照肽(SEQ ID NO25)或存活蛋白肽(SEQ ID NO19)一起保温，24小时后收获(包括悬浮物和贴壁细胞)，在70％乙醇中固定，用10μg/ml碘化丙锭加100μg/ml RNA酶A和0.05％TritonTMX-100的PBS液，pH7.4染色。通过流式细胞术分析培养物中的DNA含量。为了通过比色定量细胞活力，使用了MTT实验。将不同肿瘤细胞系与浓度递增的细胞通透性反构型-反排列对照倒序肽P4或存活蛋白-特异性P3肽一起在37℃保温24小时，用Bruffs培养基洗2次，加入5mg/ml MTT((4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，Sigma，St.Louis，MO)。通过在OD405处的比色吸光度的损失来分析细胞活力的降低。
图12A显示，存活蛋白细胞通透肽(SEQ ID NO19)在HeLa细胞中诱导凋亡，这可通过亚二倍体DNA含量测出。将HeLa细胞与图中所示递增浓度的细胞通透对照肽(倒序)或存活蛋白肽一起，在37℃保温24小时，收获细胞，通过碘化丙锭染色和流式细胞术测定亚二倍体DNA含量，以便进行分析。将HeLa细胞暴露于存活蛋白细胞通透肽，导致细胞活力大大降低，表现为亚二倍体DNA含量增加。
图12B显示存活蛋白细胞通透肽(SEQ ID NO19)与现有化疗药的比较。将HeLa细胞与化疗药TaxolTM(10μM)、或阿霉素(adriamycin，300nM)、或细胞通透对照肽或存活蛋白肽一起保温，24小时后收获细胞，通过流式细胞术测量亚二倍体DNA含量，以此分析凋亡诱导效应。用图中所示浓度的两种化疗药处理，并没有导致细胞活力大幅下降。相反，存活蛋白细胞通透肽而不是对照肽穿透到细胞内，导致出现一大群含有亚二倍体DNA的细胞(凋亡的细胞)。
这些结果表明，本文所述细胞通透肽衍生物在癌细胞中诱导凋亡。
实施例13存活蛋白细胞通透肽序列在宫颈癌HeLa细胞中诱导Caspase-依赖型凋亡图13显示，HeLa细胞(带有无功能的p53)与图中所示递增浓度的对照肽(SEQ ID NO25)或存活蛋白细胞通透肽(SEQ ID NO19)一起保温后，对caspase活性的诱导。在与上述肽保温24小时后收获细胞，通过DEVD酶活性分析caspase活性(X-轴，绿色荧光)并同时通过碘化丙锭染色分析细胞膜完整性(Y-轴，红色荧光)。右上四分之一象限中的细胞对应的是caspase活性升高、细胞膜完整性丢失的群体(凋亡群体)。
这些结果通过其它方式(means)表明，本文所述肽衍生物在癌细胞中诱导凋亡。
实施例14存活蛋白细胞通透肽在乳腺癌MCF-7细胞中诱导Caspase-依赖型凋亡按照实施例13所述进行实验，不同的是，在乳腺癌MCF-7细胞(野生型p53)中添加细胞通透对照肽(SEQ ID NO25)或存活蛋白细胞通透肽(SEQID NO19)，之后通过多参数流式细胞术来分析细胞中caspase活性的诱导和细胞膜完整性的丢失。结果见图14，表明存活蛋白细胞通透肽在不同类型肿瘤细胞(HeLa和MCF-7)中以可比的效率(comparable effiefficiency)和类似的机制(caspase-依赖型)诱导凋亡。
这些结果通过其它方式表明，本文所述肽衍生物在不止一种类型的癌细胞中诱导凋亡。
实施例15存活蛋白细胞通透肽在肿瘤细胞中诱导的凋亡与p53无关在这些实验中，将带有野生型p53(p53+/+)或纯合失活的p53(p53-/-)的HCT116结直肠癌细胞(Bunz et al.，Science，2821497-1501(1998)))与150mM细胞通透对照肽(SEQ ID NO25)或存活蛋白细胞通透肽(SEQ ID NO19)一起保温，24小时后收获细胞，通过多参数流式细胞术来分析细胞中caspase活性的诱导和细胞膜完整性的丢失。结果见图15，其表明，因存活蛋白细胞通透肽所致高caspase活性且丢失细胞膜完整性的细胞数在p53+/+和p53-/-HCT116细胞组中没有区别。这证明，p53不参与介导不同类型肿瘤细胞中由存活蛋白细胞通透肽诱导的凋亡反应。
这些结果通过其它方式表明，本文所述肽衍生物在不止一种类型的癌细胞中诱导凋亡，并且这种凋亡与p53无关。
实施例16存活蛋白细胞通透肽穿透到细胞内导致抑制Hsp90功能、降解Hsp90客户蛋白并激活Caspase活性为确定在胞内添加存活蛋白细胞通透肽，是否可以重复出破坏存活蛋白-Hsp90相互作用的mAb 8E2在体内使存活蛋白水平变得不稳定的效应(图8)，在HeLa细胞中添加图中所示递增浓度的细胞通透对照肽(SEQ IDNO25)或存活蛋白细胞通透肽(SEQ ID NO19)，24小时后收获细胞，分析Hsp90客户蛋白即存活蛋白和Akt的稳定性。抗Akt多克隆抗体从CellSignaling Technology获得(目录号9272)。
图16的Western印迹结果表明，存活蛋白细胞通透肽导致低水平的存活蛋白和Akt，对照倒序肽没有这种效果。此外，存活蛋白细胞通透肽导致32kD的caspase-3原型的表达下降，说明有caspase的蛋白裂解激活并伴有caspase-依赖型细胞死亡。在细胞通透对照倒序肽的情况中，未观察到caspase-3原型表达的改变。用β-肌动蛋白使加样量标准化。
这些结果表明，本文所述肽衍生物抑制存活蛋白-Hsp90的蛋白-蛋白相互作用，并因此在癌细胞中减少存活蛋白的表达和引起caspase-依赖型凋亡。
实施例17制备并鉴定活性存活蛋白肽序列K79-L87的肽模拟物变体为了增加细胞通透性存活蛋白K79-L87序列的体内稳定性，我们合成了一些肽模拟物变体，其中细胞通透性触角足序列和存活蛋白活性序列K79-L87的合成使用了D-氨基酸(反构型序列)以及反向排列(反排列序列)。将对照倒序肽和存活蛋白肽序列都合成为反构型-反排列变体，并称为P3(存活蛋白；KKWKMRRNQFWVKVQRLFACGSSHK-CONH2)和P4(对照倒序肽；KKWKMRRNQFWVIWQRGHSFCALKS-CONH2)肽(见图21)。为测试这些反构型-反排列的细胞通透序列在癌细胞中诱导凋亡的能力，将一组肿瘤细胞系与图中所示递增浓度的P3(存活蛋白)或P4(对照)反构型-反排列细胞通透肽一起保温，然后用MTT试验分析细胞活力。图17的结果显示，P3序列在所测试的所有肿瘤细胞系中诱导了剂量-依赖性细胞活力下降(HeLa宫颈癌；MDA-MB231(Calvo et al.，Br.J.Cancer，48683-8(1983))乳腺癌；MCF-7乳腺癌；PANC-1(从ATCC获得)胰腺癌)。P3活性与p53状态无关。相反，在相同递增浓度的细胞通透反构型-反排列P4对照肽的情况下，在所测试的任一类型的细胞中都没有观察到细胞活力的降低。
这些结果表明，本文所述反构型-反排列肽衍生物在多种不同类型的癌细胞中引起凋亡。
实施例18存活蛋白K79-L87序列的肽模拟物变体(P3)具有对抗较宽范围内多种类型肿瘤细胞的特异性抗-肿瘤活性但不影响正常细胞的活力为研究实施例17所述反构型-反排列序列P3和P4的特异性，我们将多种肿瘤细系与细胞通透反构型-反排列肽P3和P4(150μM)一起保温，24小时后，用台盼兰(trypan blue，Sigma)排除法对培养物进行染色。那些不能将兰色染料排除在细胞外的细胞就是丧失细胞活力和浆膜完整性的细胞。
图18的结果证实，在大多数所测试的肿瘤细胞中，P3反构型-反排列存活蛋白肽的穿透使细胞活力迅速丢失HCT116结直肠癌，HeLa宫颈癌，MCF-7乳腺癌，PANC-1胰腺癌，PC3前列腺癌。另一方面，用反构型-反排列对照肽P4进行类似的保温反应(comparable incubation reactions)，结果并未使肿瘤细胞活力下降。而且，无论是存活蛋白P3还是对照肽P4，都未导致正常肺成纤维细胞LU18的活力下降，说明P4的促凋亡活性具有肿瘤细胞特异性。
这些结果表明，本文所述反构型-反排列肽衍生物的广谱抗-凋亡活性特异于癌细胞，不影响非癌细胞。这些结果支持了本文所述肽衍生物可以用在治疗方法中治疗癌症患者的观点。
实施例19P3肽体外抑制肿瘤发生，通过不依赖贴壁的细胞生长和存活来测量为了在软琼脂上形成集落，将2×104个经过适应(adapted)的乳腺癌MCF-7细胞悬浮在36mm组织培养板中的1.5ml DMEM中，该DMEM中添加了10％FBS和0.35％bactoagar(Becton Dickinson，Sparks，MD)，该组织培养板底层为1.5ml 0.75％琼脂-生长培养基。将这些板在37℃、5％CO2培养箱中保温2-5周。生成的集落用0.005％结晶紫(Sigma)染色，并用立体显微镜(dissecting microscope)在高倍视野下计数。
图19显示，生长培养基中有75或150μm存活蛋白P31肽(SEQ IDNO19)可彻底抑制癌细胞的不依赖贴壁细胞生长和存活(相对于等量对照倒序肽(SEQ ID NO25))。图19中上一排的两个平板没有肉眼可见的细胞集落。
这些结果表明，含有存活蛋白Hsp90-结合基序的存活蛋白肽是肿瘤细胞体外增殖的高效抑制物。
实施例20反构型-反排列P3存活蛋白肽的体内抗-肿瘤活性将MCF-7细胞注射到免疫受损动物的肋腹(flank)，建立乳腺癌异种移植模型。对8周龄雌性CB17 SCID/米色鼠(beige mice)(Taconic Farms，Germantown，NY)肋腹皮下注射2.5×106个指数生长的肿瘤适应MCF-7细胞在200μl无菌PBS，pH 7.4中的溶液。肿瘤生长用测径器在两维方向上(in thetwo dimensions)测量，将肿瘤假定为球体，用公式宽2×长/2计算肿瘤体积。在4个月的观察期内，肿瘤被限制在局部，未影响动物存活。当肿瘤大小达到～50mm3时，将动物随机分组(每组7或8只动物)，给予盐水(每日一次，200μl)或反构型-反排列P3存活蛋白-衍生的肽模拟物(50mg/kg/i.p./日)。处理3周后将动物处死。盐水或P3肽处理组的动物的肿瘤体积每日用测径器测量，处理21日后处死动物。图20的数据显示，在处理期内，P3肽比盐水更有效减缓肿瘤体积增长的速率。
在第二个模型中，将事先经过体内适应的乳腺癌MCF-7细胞注射到SCID/米色鼠中。注入的细胞产生快速指数生长的肿瘤，其不依赖雌激素的补加，也不受盐水给药的影响(图28)。在为期23日(图28)或11日的处理期间，给予反构型-反排列P3存活蛋白-衍生的肽模拟物(50mg/kg/ip./日)抑制了这些更具侵袭性(more aggressive)的肿瘤的生长。
在处理结束时回收MCF-7肿瘤，通过免疫组织化学分析Hsp90客户蛋白的表达(Ambrosini et al.，Nat.Med.，39177-21(1997)；Basso et al.，Oncogene，211159-66(2002))。盐水处理组的肿瘤细胞群体中有广泛的存活蛋白和Akt标记。相反，存活蛋白肽处理组的肿瘤细胞中，Akt水平几乎彻底消失，存活蛋白的表达也大大减少。
这些结果表明，存活蛋白肽和含有存活蛋白Hsp90结合基序的肽衍生物是肿瘤细胞体内增殖的有效抑制物。
实施例21存活蛋白肽诱导的凋亡是肿瘤细胞特异性的图22A和22B比较了P31(SEQ ID NO19)或P33(SEQ ID NO25)对肿瘤细胞系(图22A)和正常细胞系(图22B)的凋亡的影响。肿瘤细胞系DU145(前列腺癌，圆形)、PC3(前列腺癌，三角)或HeLa(宫颈癌，方块)用图中所示递增浓度的P31肽(实心)或对照P33肽(空心)处理，24小时后收获细胞，用MTT比色试验分析细胞活力。正常细胞(右图)HFF(人包皮成纤维细胞，方块)，HGF(人成纤维细胞，三角)或WS-1(人表皮细胞，圆形)用P31肽(实心)或P33对照倒序肽处理，24小时后收获细胞，用MTT比色试验分析总体细胞活力。所有细胞系从ATCC获得。结果见图22A和22B，证实，P31肽在所有三种癌细胞系中有效诱导细胞死亡，但在所有三种正常细胞中都未诱导细胞死亡。对照P33肽在癌细胞或正常细胞中都未诱导细胞死亡。
实施例22P31-介导的凋亡是剂量依赖型的图23显示，用多参数流式细胞术分析膜联蛋白V标记和碘化丙锭染色得知，P31肽(SEQ ID NO19)在HeLa细胞中以剂量依赖方式诱导凋亡。HeLa细胞培养物用图中所示递增浓度的P31(存活蛋白)或P33(对照；SEQ IDNO25)肽处理，37℃保温8小时后收获细胞，通过多参数流式细胞术分析膜联蛋白V标记(X-轴，为凋亡标记物)和碘化丙锭染色(Y-轴，为细胞死亡标记物)。结果表明，P31肽以剂量依赖方式诱导凋亡，而P33对照肽无此效果。
实施例23P31肽特异性结合Hsp90的氨基端图24A和24B鉴定了P31肽上结合Hsp90 N末端区的位置。Hsp90 N-端或C-端重组片段按照实施例3所述来制备。ELISA实验按照实施例2所述进行，区别是，将图中所示递增浓度的P31肽(方块；SEQ ID NO19)或对照P33肽(圆形；SEQ ID NO25)固定在塑料微滴板中，与图中所示Hsp90 N-端片段和C-端片段一起保温。洗板后，不同Hsp90片段分别与固相肽的结合用抗Hsp90抗体检测。抗Hsp90 N-端片段和C-端片段的抗体分别从BD/Transduction Laboratories和Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)获得。结果见图24A和24B，表明P31肽特异性结合Hsp90 N端，表现为OD405比P33肽增加。
实施例24存活蛋白肽的分子建模存活蛋白反构型-反排列肽LFACGSSHK(全部为D氨基酸)的结构用长时间标度分子动力学(long time scale Molecular Dynamics，MD)模拟在明显(explicit)水溶剂中建模。肽模拟物表现出显性构型，在G83-S84有一个转角，总体上为β-发卡几何形状(图25A)。在MD模拟中，肽模拟物停靠在Hsp90的ATP结合位点中(图25B)。该复合体的几何形状与Hsp90-GA复合体的高度相关，其中的转角区与GA的袢环骨架(ansa ring backbone)非常相似(Stebbins et al.，Cell，89239-50(1997))。存活蛋白肽模拟物与Hsp90形成18个预测的氢键，涉及H86、S85、S84的侧链，G83的羰基，以及K87和C82的侧链。
实施例25用存活蛋白K79-L87肽处理PC3前列腺癌细胞导致Hsp90客户蛋白丢失存活蛋白影响Hsp90客户蛋白在肿瘤细胞中的稳定性和功能。PC3细胞不经处理，或暴露于75和150μM存活蛋白肽(SEQ ID NO19)(或对照倒序肽；SEQ ID NO25)维持8小时，经处理后，进行针对Hsp90客户蛋白存活蛋白，AKT和CDK-6的免疫印迹。Western印迹显示，存活蛋白细胞通透肽，而不是倒序肽，引起多个Hsp90客户蛋白在PC3细胞中消失，包括存活蛋白、Akt、CDK-4和CDK-6(图26A)。而Hsp90、Hsp70和PCNA水平不受影响(图26A)。
另外还测试了经存活蛋白肽处理的PC3细胞的端粒酶活性，该活性需要Hsp90(Holt et al.，Genes Dev.，13817-26(1999))。细胞如上述进行处理，用抗Hsp90抗体进行免疫沉淀，通过对免疫沉淀物进行TRAP试验来测定端粒酶活性(Kim and Wu，Nucleic Acids Res.，252595-7(1997))。端粒酶活性通过端粒产物梯来指示。如图26B所示，在该试验中，在免疫沉淀之前用存活蛋白肽进行处理，消除了端粒酶活性。
这些结果表明，存活蛋白肽影响Hsp90客户蛋白在肿瘤细胞中的稳定性和功能。
实施例26体内抑制肿瘤生长将前列腺癌PC3细胞(2.5×106)注射到免疫受损SCID/米色鼠肋腹，使其形成可触知的肿瘤(35-50mm3)。将动物随机分成两组(6只动物/组)，接受盐水或细胞通透反构型-反排列存活蛋白K79-L87肽P3(50mg/kg/日/i.p.)。用测径器以12日的处理间隔时间测量肿瘤生长。在该系统中，所述存活蛋白肽模拟物大大降低肿瘤生长速率(图25A)。
为确定存活蛋白肽模拟物是否在细胞内积累，对肋腹携带PC3肿瘤的动物腹腔注射盐水或细胞通透反构型-反排列K79-L87存活蛋白肽P3。1小时后，处死动物，小心取出肿瘤，通过荧光显微镜检分析肿瘤实质中的肽积累。肿瘤细胞显示胞内荧光，说明这些细胞摄入并积累存活蛋白肽模拟物(图25B)。
实施例27AML细胞系中的存活蛋白活性分析存活蛋白-Hsp90通路在急性粒细胞白血病(AML)细胞系中的表达和功能。Western印迹显示，存活蛋白在四种AML细胞系U937、K-562、THP-1和HL-60中大量表达(图29A)。细胞通透存活蛋白P31肽(SEQ IDNO19)处理导致HL-60细胞的剂量依赖性完全细胞杀伤(通过台盼兰排除法测出)，倒序P33肽(SEQ ID NO25)无此效果(图29B)。在其它AML细胞系中也获得类似结果。
另外还测试存活蛋白短肽在AML细胞系中的活性。将触角足载体序列的第三个α-螺旋与存活蛋白肽序列K79-G83的氨基末端融合，合成出存活蛋白细胞通透短肽(SEQ ID NO20)。经MTT试验测得，在AML细胞系中，这种短肽降低细胞活力的活性比P31肽强很多(图29C，D)。倒序对照肽(RQIKIWFQNRRMKWKKSGKHS；SEQ ID NO28)无此效果(图29C，D)。这些试验中使用了大量细胞(4×105)，以便产生全长存活蛋白肽的50％杀伤效力。
在AML中更详细鉴定K79-G83存活蛋白肽的抗-肿瘤活性。将K79-L87(SEQ ID NO19)和K79-G83肽(SEQ ID NO20)与AML细胞一起保温，用MTT测量细胞活力。K79-L87和K79-G83存活蛋白肽都有效杀伤所测试的所有AML细胞系，但对照倒序肽(SEQ ID NO25和SEQ ID NO28)无此效果(图30)。
与抗-肿瘤活性的功能性结果一致，存活蛋白序列K79-L87和K79-G83在体外与重组Hsp90可比结合(comparably bound)，并抑制重组存活蛋白与Hsp90的剂量依赖型结合(图31)。
实施例28用高通量筛选鉴定存活蛋白肽-Hsp90相互作用的小分子拮抗剂用高通量筛选(HTS)鉴定存活蛋白肽-Hsp90相互作用的小分子拮抗剂。采用了两种实验策略来进行筛选荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer，FRET)和荧光极化(fluorescence polarization，FP)。按照本领域已知方法制备存活蛋白肽并用染料分子标记。这种肽-染料偶联物的结构略图见图32。在该分子中，存活蛋白肽的任一末端的位点都用荧光素(FI；供体)或罗丹明(Rh；受体)标记。
游离肽具有较高的FRET效力，这是由于供体与受体位点之间的分子内FRET引起荧光强度的淬灭。通过与Hsp90结合，所述肽-染料偶联物的分子内FRET减弱，供体信号增强。根据相对供体荧光(FI)的变化，通过非线性回归拟合(non-linear regression fitting)获得结合解离常数(KD)。
利用FRET进行的总体HTS策略如下来自化学文库、竞争结合Hsp90的抑制物使存活蛋白肽-染料偶联物被释放，形成其天然折叠构象。这导致在抑制物浓度递增的情况下，FRET效力增强、供体荧光强度减弱、受体信号增强。用FI的相对荧光强度作为抑制物浓度的函数，通过拟合作图来获得该抑制物的结合解离常数Ki。
为了进行筛选，优化信噪比，使得用50μM终浓度的用于鉴定一级热点(primary hit)的化合物在存活蛋白肽-染料偶联物内获得FRET最大信号。进行对照实验，以便检测针对FRET效力的任何溶剂影响。
在另一例中，用FP监控存活蛋白肽-Hsp90相互作用。荧光素-标记的存活蛋白肽快速旋转，表现出低水平荧光极化。相反，与Hsp90结合使旋转速度减慢，荧光极化增加。用各向异性(anisotropy，r)定量荧光极化，将其定义为，平行荧光强度和垂直强度和总荧光之间的差异的比。用r作为蛋白浓度的函数，通过拟合作图获得相互作用的KD值。
HTS实验中使用的化学文库从Chem.Bridge Corporation(San Diego，CA)获得，通过计算机多样化和药物样特性分析，选出330,000个小分子化合物。通过利用各种筛选指标(filter)，包括溶解度曲线图、LogP、离子负荷、可旋转键数据、极性表面积计算、以及杂原子数，选出一个多样化群体，有30,000个分子。将这些分子溶于DMSO中至5mM浓度，然后分配在多个96-孔板中。所有板都用条形码标记，从而能方便地辨别这些小分子。
一级筛选的目的是，鉴定出竞争性抑制存活蛋白-Hsp90相互作用的化合物。用上述二元FRET/FP方法，快速方便地筛选整个文库，分离出1-3％的一级热点化合物，相当于来自所述文库的300-900个分子。在二级筛选中测试这些一级热点化合物，鉴定出具有存活蛋白肽-样特性的先导分子(leadmolecule)。为提高二级筛选的特异性，平行测试Hsp90 N-区突变体和野生型Hsp90，所述突变体(SEQ ID NO21的N51A，S52A或S113A取代变体)与存活蛋白肽的结合减弱(Plescia et al.，Cancer Cell，7457-68(2005))。
在三级筛选中，每一种所选化合物各合成20mg，测定它们抑制Hsp90的IC50值。在三级筛选中，使用两种独立的实验结果(readout)(i)对Hsp90ATP酶活性的抑制(酶抑制实验)，和(ii)对存活蛋白-Hsp90相互作用的抑制(蛋白-蛋白相互作用实验)。第一组实验中，在有4μg重组Hsp90存在的情况下，测试各种化合物在96孔板上浓度递增时，对MDCC-标记的磷酸结合蛋白(PBP，1μM)的相对荧光发射进行的调节。用GA(60μM)作为这些实验中的对照。第二组实验中，将递增浓度的所选化合物与网织红细胞提取物(100μl)混合，与重组存活蛋白(0.5μg)一起保温，再用对照IgG或抗Hsp90抗体进行免疫沉淀。在有各种化合物存在时存活蛋白与Hsp90的差异结合，通过Western印迹测定，并通过密度计量术定量。将网织红细胞提取物与存活蛋白肽或倒序肽事先保温，用作对照。
实施例29确认存活蛋白肽-Hsp90相互作用的小分子拮抗剂所鉴定的结合Hsp90的化合物，根据结构相似性分为多个结构类型，根据相对IC50值(对结合亲和力的粗略度量)分为Hsp90功能的强效抑制物和弱效抑制物。每种化合物各合成50mg。首先从每一种结构类型制备“最强效”抑制物，通过荧光各向异性鉴定它们对Hsp90的结合亲和力。在这些实验中，结合Hsp90的化合物用荧光素标记，测定它们对野生型或突变型Hsp90 N-区的结合亲和力。在染料和化合物之间使用多种接头(6-12碳)，使得所述化合物的活性不受影响。或者，将Hsp90用染料分子标记，未标记的结合Hsp90的化合物也用于这些实验。
接着，在基于细胞的研究中，测试所确认的化合物对细胞活力和凋亡的影响。在这些实验中，将递增浓度的各种化合物与肿瘤细胞系包括AML细胞(1×107/ml)或正常人成纤维细胞一起，在37℃按照递增的时间段(0.5-36小时)进行保温。用台盼兰排除法分析细胞的浆膜完整性，用MTT试验分析细胞的活力，用氨基三氟甲基香豆素(aminotrifluoromethylcoumarin，AFC)荧光分析来测定细胞的溶酶体通透性，通过测定线粒体功能紊乱以及多参数流式细胞术分析DEVD酶活性/膜联蛋白V和PI标记来确定细胞的凋亡。
进一步研究所述化合物结合Hsp90并抑制伴侣分子功能的特异性。首先，浓度递增的化合物通过亲和层析来分析对Hsp90与γ-磷酸-偶联型ATP-Sepharose结合的竞争性抑制，另通过荧光极化来测试对Hsp90或Hsp70的不同结合。其次，将肿瘤细胞包括AML细胞与浓度递增的所选化合物一起保温0.5-36小时，收获细胞，通过Western印迹来分析Hsp90客户蛋白(例如存活蛋白，Akt，CDK-4，CDK-6，c-Raf-1和c-Src)的丢失，通过对Hsp90免疫沉淀物进行TRAP试验来分析端粒酶活性。将正常细胞或肿瘤细胞系与17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)(5-10μM)、或与存活蛋白细胞通透肽或倒序肽一起保温，作为这些确认实验的对照。
实施例30体内测试存活蛋白肽-Hsp90相互作用的小分子拮抗剂测试对肿瘤细胞系具有活性的小分子存活蛋白肽模拟物在人AML异种移植模型中的体内效力。将HL-60细胞(5×106)悬浮在无菌PBS，pH 7.4中，总体积100μl，将其注射到8-10周龄CB-17 SCID/米色鼠(20-25g)的尾静脉中。每日观察动物的总体疾病表现(麻痹(paralysis)，昏睡(lethargy)，卷毛(ruffled fur))，这些表现在移植的10-14日后逐渐变成临床明显水平，如果一直不给予治疗，在3-5周内100％死亡。为促进骨髓移植，这些动物从直线加速器(linear accelerator)接受预适应性亚致死剂量的辐射(350R)。HL-60细胞在脾脏和骨髓中的积累，用抗人HLA抗体按照一周一次(at weeklyintervals)在重建后进行免疫组织化学分析来确定。移植当时，动物按照短期(15日)或长期(50日)方案，腹腔给予小分子存活蛋白肽模拟物，剂量为0.01-50mg/kg。对照动物注射盐水。用经处理的动物比对照动物存活率的增加来确定效力。
其它实施方案可以理解，尽管本发明已经在说明书中详细描述，但上述描述只是为了举例说明定义在所附权利要求书中的本发明范围，并不想对本发明的范围作任何限制。其它方面、优势和变动都包括在所附权利要求的范围内。
权利要求
1.分离的存活蛋白肽片段，具有11个或更少的氨基酸，包含5个氨基酸的序列His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO2)，可抑制Hsp90与存活蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用。
2.权利要求1的肽片段，其中所述片段是9个氨基酸或更少。
3.分离的多肽，其抑制Hsp90与存活蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用，其包含权利要求1或2的肽片段，且该肽片段与促进所述多肽的细胞通透性的肽内化序列相连。
4.权利要求3的肽，其中所述内化序列选自Tat序列，触角足序列，transportin序列或transportan序列。
5.一种肽模拟物，其为权利要求1-4之一的肽片段或多肽的肽模拟物。
6.权利要求5的肽模拟物，其中所述肽模拟物具有一或多个以下特征(a)所述肽模拟物是一种反构型-肽，其包含一种序列，该序列中，该肽的氨基酸从氨基到羧基的排列是反向的；(b)所述肽模拟物是一种反排列-肽，其中有一或多个D-氨基酸替代了L-氨基酸；和(c)所述肽模拟物包含一或多个人工氨基酸类似物。
7.制备肿瘤生长抑制物的方法，包括获得先导化合物，其为权利要求1-4之一的肽；利用医学化学研发与候选的诱导凋亡的化合物结构类似的受试物；可选地测定该受试物是否抑制肿瘤细胞生长；和将该受试物与药物载体一起配制成肿瘤生长抑制物。
8.鉴定候选的诱导凋亡的化合物的方法，包括将受试化合物、Hsp90肽以及凋亡蛋白抑制物(IAP)肽在足以确保相互作用的条件下混合足够的时间；和检测受试化合物是否抑制Hsp90肽与IAP肽之间的相互作用；其中抑制Hsp90肽与IAP肽之间相互作用的受试化合物是候选的诱导凋亡的化合物。
9.权利要求8的方法，其中所述IAP肽是存活蛋白肽。
10.权利要求8的方法，其中所述相互作用是结合。
11.权利要求8的方法，其中所述IAP肽是存活蛋白肽，且存活蛋白肽和Hsp90肽都位于细胞中。
12.权利要求11的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
13.制备肿瘤生长抑制物的方法，包括实施权利要求8-12之一的方法；利用医学化学研发与候选的诱导凋亡的化合物结构类似的受试物；可选地测定该受试物是否抑制肿瘤细胞生长；和将该受试物与药物载体一起配制成小分子的肿瘤生长抑制物。
14.鉴定凋亡诱导物的方法，包括将肿瘤细胞与权利要求8-12之一所述方法鉴定出的候选的诱导凋亡的化合物接触；和检测一或多种凋亡标记物的有无；其中使细胞表现出一或多种凋亡标记物的候选诱导凋亡的化合物是凋亡诱导物。
15.鉴定肿瘤生长抑制物的方法，包括将一或多种肿瘤细胞与权利要求8-12之一所述方法鉴定出的候选的诱导凋亡的化合物接触；和测量所述肿瘤细胞的增殖；其中当一种候选的诱导凋亡的化合物使所述肿瘤细胞的增殖相对于未接触所述化合物的一或多种肿瘤细胞的增殖而言受到抑制，则该化合物是肿瘤生长抑制物。
16.治疗受试者的肿瘤的方法，包括鉴别需要治疗肿瘤的受试者；和对该受试者施用药物组合物，所述组合物包含权利要求1-6之一的肽或权利要求7或8的肽模拟物。
17.治疗受试者的肿瘤的方法，包括鉴别需要治疗肿瘤的受试者；和对该受试者施用药物组合物，所述组合物包含权利要求8-12，14和15之一的方法鉴定出的化合物或受试物。
18.权利要求17的方法，其中所述对受试者施用的化合物或受试物是抑制Hsp90与存活蛋白之间蛋白-蛋白相互作用的抗存活蛋白抗体。
19.抗-存活蛋白抗体，其特异性结合权利要求1-4之一的肽。
20.核酸，其编码权利要求1-4之一的肽。
21.细胞，其含有权利要求20的核酸。
22.抗-存活蛋白抗体，其特异性结合权利要求5或6的肽模拟物。
23.权利要求2的肽，其中所述肽含有氨基酸序列Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu(SEQ ID NO24)。
24.权利要求4的肽，其中所述肽含有氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKKKHSSGCAFL(SEQ ID NO19)。
25.权利要求6的肽模拟物，其中所述肽模拟物含有D-氨基酸序列(D-Leu)-(D-Phe)-(D-Ala)-(D-Cys)-(D-Gly)-(D-Ser)-(D-Ser)-(D-His)-(D-Lys)。
26.权利要求1的肽，其中所述肽选自His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO2)；Lys-Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu(SEQ ID NO5)；Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO6)；His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO7)；Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO8)；Lys-Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys(SEQ ID NO9)；His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe(SEQ ID NO10)；His-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO14)；Lys-His-Ser-Ser-Gly-Cys-Ala-Phe-Leu(SEQ ID NO24)；和Lys-His-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO26)。
27.分离的XIAP肽，其与Hsp90结合且具有以下氨基酸序列MTFNSFEGSKTCVPADINKEEEFVEEFNRLKTFANFPSGSPVSASTLARAGFLYTGEGDTVRCFSCHAAVDRWQYGDSAVGRHRKVSPNCRFINGFYLENSATQSTNSGIQNGQYKVENYLGS(SEQ ID NO27)。
28.抑制细胞中存活蛋白多肽与热休克蛋白Hsp90之间的蛋白-蛋白相互作用的方法，该方法包括将有效量的权利要求1-6之一所述肽或肽模拟物导入所述细胞中。
29.权利要求1-4，23，24和26之一所述肽在治疗受试者肿瘤中的用途。
30.权利要求5，6和25之一所述肽模拟物在治疗受试者肿瘤中的用途。
31.权利要求1-4，23，24和26之一所述肽在制备用于治疗受试者肿瘤的药物组合物中的用途。
32.权利要求5，6和25之一所述肽模拟物在制备用于治疗受试者肿瘤的药物组合物中的用途。
全文摘要
本文提供了抑制Hsp90与存活蛋白，XIAP，cIAP1或cIAP2等IAP蛋白相互作用的化合物，以及鉴定和应用这类化合物的方法。
文档编号A61K38/04GK101065138SQ200580032164
公开日2007年10月31日 申请日期2005年7月25日 优先权日2004年7月23日
发明者达里奥·C·奥尔蒂里, 珍妮特·普莱西亚, 惠特妮·萨尔兹 申请人:马萨诸塞大学