专利名称：用siRNA治疗特征在于升高的眼内压的眼病的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于眼病治疗的方法和组合物；特别然而并非专门涉及青光眼的治疗。在优选实施方案中，本发明涉及RNAi技术的使用以下调眼房水(aqueous formation)形成基因和眼房水流出(aqueous outflow)基因。也提供了治疗眼病的方法和组合物。
背景技术：
RNAi作为下调基因表达的工具通过同源重组的基因寻靶通常用于确定哺乳动物中的基因功能，但是这是消耗成本和时间的方法。备选地，在用核酶或反义技术的mRNA抑制以后可以确定许多基因的功能。虽然在有些情况中是成功的，但是这些技术难以普遍应用。siRNA-定向的“击倒”的出现在体细胞遗传学中激起了革命，允许哺乳动物中的基因功能的廉价并快速的分析。
建立在mRNA水平敲除基因表达的方便并可靠的方法是过去15年在分子生物学中周期性的题目。在产生细胞或生物功能损失的努力中，已经试验了多种分子，所述分子包括，例如，反义序列、核酶、和嵌合寡核苷酸，但是这样分子的设计是基于反复试验，取决于目标基因的性质。而且，难以预知期望的效果，并且经常仅实现弱抑制(Braasch Corey，2002)。
在1990年代初该现象在植物中发现以后，1998年Andy Fire和CraigMeilo首次用线虫(Caenorhabditis elegans)虫表明dsRNA(双链RNA)可以以非常有效的方式特异并选择性抑制基因表达(Fire等，1998)。在他们的实验中，第一条链(称为有义RNA)的序列与目标信使RNA(mRNA)的相应区域的序列符合。第二条链(反义RNA)对于该mRNA是互补的。得到的dsRNA结果是远比相应的单链RNA分子(特别是，反义RNA)更有效(数个数量级)。Fire等，1998对RNA干涉命名为现象RNAi。这个有效的基因沉默机理已经显示在大多数系统发育的门之中的数个种类中起作用。
当叫作DICER的酶遇到dsRNA，并且将其切割成叫作小干扰RNAs或siRNAs的片段时，RNAi开始。这种蛋白属于RNase III核酸酶家族。当蛋白复合物聚集这些RNA残余物，并且将它们的密码用作寻找和破坏细胞中具有匹配序列的任何RNAs诸如目标mRNA的向导(综述参见Bosher & Labouesse，2000)。
RNAi现象(Akashi等，2001)可以总结如下●步骤1dsRNA识别和扫描过程。
●步骤2通过RNAse III活性分解dsRNA，并且产生siRNAs。
●步骤3siRNAs和RISC复合体中缔合因子的缔合。
●步骤4识别互补的目标mRNA。
●步骤5在与siRNA互补区域中心分解目标mRNA。
●步骤6降解目标mRNA，并且再生RISC复合体。
在将RNAi现象用作基因击倒技术的尝试中，很快意识到，哺乳动物细胞已经发展了针对病毒感染的各种保护现象，这些保护线性可以妨碍这种方法的应用。实际上，极低水平的病毒dsRNA的存在引发了干扰素应答，这导致翻译的全面非特异性抑制，其又引发了程序性细胞死亡(Williams，1997，Gil & Esteban，2000)。
在2000年，使用dsRNA的第一次尝试导致小鼠卵母细胞和早期胚胎中的3种基因的特异性抑制(MmGFP受控于延伸因子1a、E-钙黏着蛋白和c-mos)。翻译被抑制，因此，当所述胚胎继续发育时，没有观察到PKR应答(Wianny & Zemicka-Goetz，2000)。一年后，关于Ribopharma AG(Kulmbach，Germany)的研究首次证明了RNAi在哺乳动物细胞中的功能性。使用短的(20-24碱基对)dsRNAs—其叫作SIRPLEXTM—它们甚至在人细胞中特异性地关闭基因，而不起始急性期反应。后来其它的研究小组进行的类似实验(Elbashir等，2001；Caplen等.，2001)进一步证明了这些结果。
一年后，Paddison等(Paddison等，2002)尝试应用折叠成发夹结构的小RNAs来抑制特异的基因的功能。这一工作受到早先的研究的启发，早先的研究表明，线虫中的一些基因通过编码发夹结构的RNAs的RNAs而天然地调控其它基因。在各种正常的和癌症的人和小鼠细胞系中检测，短的发夹RNAs(shRNAs)能够如同它们的siRNA副本那样有效地沉默基因。此外，shRNA在体内展现出比等价双链体更少的再缔合动力学。甚至更重要的，这些作者制备了转基因细胞系，这些转基因细胞系被加工以合成在细胞分裂过程中表现出持续长久的抑制作用的shRNAs(Eurogentec)。最近，表明另一组小RNAs(也包括在21-25nt范围内)介导基因表达的下调。已经在线虫中描述了这些叫作小的瞬时调控RNAs(stRNAs)的RNAs，在线虫中，它们调控发育过程中基因表达时间。应该注意到，尽管有明显的相似性，但是stRNAs和siRNAs通过不同的作用模式发生(综述参见Banerjee& Slack，2002)。与siRNAs相反，22nt长的stRNAs在翻译起始后下调目标mRNA的表达，而不影响mRNA的完整性。最近的研究表明，最初在线虫类中描述的两种stRNAs是线虫类中存在的具有上百种其它微-RNAs(miRNAs)的大家族中的成员(Grosshans & Slack，2002)。
科学家开始将RNAi用在一些系统中，包括线虫、果蝇、锥虫和各种其它的无脊椎动物。并且，应用这种方法，一些小组最近描述了在不同的哺乳动物细胞系—特别是在Hela细胞中一的蛋白生物合成的特异性抑制，这表明RNAi是在体外用于基因沉默的广泛适用的方法。基于这些结果，RNAi已经迅速地成为确定(鉴定和分配)基因功能的公认工具。并且，应用短dsRNA寡聚核苷酸的RNA干扰将允许解释只被部分测序的基因的功能。因此，在诸如下列各项的研究中，RNAi将是不可避免的●在真核细胞中在转录后水平上抑制基因表达。在这一内容中，RNAi是快速评估基因功能和揭示无效表型的直接工具。
●研发RNAi技术用于移植后的胚胎。
●RNA干扰主要的经济显著性由其作为治疗原理的应用而建立。由于此，RNAi可以产生治疗人类疾病的基于RNA的药物。
青光眼青光眼是盲的主要原因之一。世界范围内接近15％的盲的情况由青光眼产生。最普通的类型，原发性开角型青光眼，在超过40岁的一般人群中具有1/200的发病率。
已经将青光眼简单限定为由眼内压力(IOP)持续升高超过其正常生理极限的所引起视觉组织破坏的过程。
越来越清楚，许多形式的青光眼具有遗传成分，并且更多的当前研究集中在识别染色体区域和促进青光眼的基因。可能是OAG的病因学是多因素的，由超过一种基因中的突变的组合和至今未经确认的环境因素产生。关于青少年和成年人发作的OAG，已经识别了数个基因座。然而，仅已知一种基因，即染色体1q21-q31上的GLClA基因座处的肌纤蛋白/TIGR(小梁网可诱导的糖皮质激素反应)基因。在全世界的人种学多样的人群中已经识别了超过三十种该基因的突变。研究显示了它仅导致了总OAG的大约5％(见Wirtz Samples，2003，和Khaw等，2004a中的评论)。
发病机制虽然升高的水平可能不同，但是大多数的青光眼的特征在于升高的IOP。在那些青光眼中，其中所述升高最初是低的(即，开角型青光眼、黑色素细胞青光眼)并且一些继发性青光眼、视网膜神经节细胞和视神经损害发展缓慢。在闭角型青光眼中IOP的突然高度升高经常致使眼盲，无疑主要由于在筛板水平的轴浆流中止。
在人的研究中，已经广泛地接受，组织坏死在青光眼发生的视神经盘损害的引发或进行中起作用。视网膜神经节细胞退化可以是坏死，但是由IOP的升高触发细胞凋亡的可能性是似乎合理的，并且认为一氧化氮和谷氨酸的各自作用在所述疾病的进行期间是相关的(对于这个问题上最近的综述见Osborne等，2003)。
治疗虽然数种病因学涉及青光眼综合征，但是疗法选择中绝对的决定因素是虹膜角膜角之内压力的原发性和/或诱导的改变量。
虽然升高的IOP导致青光眼中神经元损害的病理生理的机理是未知的，但是当前的治疗包括针对降低这种压力的药物治疗或外科手术。
可以利用四种类型的药物尝试医药抑制升高的IOP眼房水形成抑制剂(在它们之中有碳酸酐酶抑制剂、β-肾上腺素能阻滞剂、或α2-肾上腺素能受体激动剂)；缩瞳剂(即拟副交感神经药-胆碱功能药物-、或抗胆碱酯酶抑制剂)；眼色素层巩膜流出增强剂；和高渗试剂(穿过睫状体上皮之内的血液/水屏蔽产生渗透压梯度)。将全部四种用于青光眼的治疗中，前三种通常作为急诊治疗和长期的控制，而所述高渗试剂作为急诊和手术前治疗是宝贵的。第五类药物，神经保护试剂，正在开始出现为对于医药治疗的重要的可能添加物。实际上，NOS和谷氨酸水平在青光眼中升高并且它们涉及视网膜神经节细胞坏死或细胞凋亡的观察增加了神经保护治疗和甚至是神经再生的可能性。因而氨基酸激发拮抗剂NOS抑制剂、谷氨酸受体拮抗体、细胞凋亡抑制剂和钙通道封阻剂是将来青光眼治疗的发展中的全部潜在的选择物。所述钙通道可以减少微循环对视神经头部的削弱效果，同时在小梁细胞水平潜在增加流出的可能性。
在参考文献中给出了多种眼病和它们的治疗的评论，特别是在Bunce(2005)、Costagliola(1995，2000)、Cullinane(2002)、Sakaguchi(2002)、Shah(2000)、和Wang(2005)中。
目前我们的现有治疗肯定达不到目的并且与流出可能性的评价、治疗的精确监控和外科技术的复杂性有关的实际困难全部组合而困扰预后；全部青光眼中占优势的因素是视网膜神经节细胞的退化，因而通过有效的低眼压的神经保护是我们使用的任何治疗的基本需要(对于在这个问题上的最近综述，见Khaw等2004b)。
发明概述在本发明中发明人描述了用于治疗眼病症的方法，特征在于改变动物包括人中的IOP。特别是，眼病症可以包括青光眼、葡萄膜炎、和炎症。所述方法基于基因表达的下调，所述基因涉及眼中的眼房水(aqueous)形成或眼房水流出。可以通过双链核酸部分的使用影响下调，命名为siNA或小干涉的NA，其定向于干涉多种候选基因的mRNA表达。尽管修饰的核酸或类似的化学合成的实体也包括在本发明的范围内，但是所述siNA优选是siRNA。
本发明的优选实施方案涉及siNA的局部施用。本发明的实施方案也提供了供治疗眼病症用的药物组合物。本发明可以使用在局部眼治疗、涉及青光眼发病机制的目标基因、还有化学合成的实体治疗动物(包括人)疾病的用途的领域内。
除青光眼的治疗之外，本方法也适于治疗所述眼的前房的其它疾病。特别是，所述方法可以应用于疾病的治疗，其特征在于改变眼中的眼房水形成或流出。可以治疗的病症实例包括局部病症诸如感染或炎症，和一般病症诸如葡萄膜炎或全身疾病的表现。另外，本发明的某些实施方案提供用于糖尿病性视网膜病的治疗。
发明详述目标基因本发明中，本发明发明人限定一系列目标基因，其表达水平可以改变IOP。这些基因可以属于涉及眼房水形成的基因的组或者涉及眼房水流出的基因的组。这里是我们的目标基因系列●碳酸酐酶II、IV和XII●肾上腺素能药受体β1和2以及αIA、IB和ID●乙酰胆碱酯酶●环加氧酶1和2●腺苷三磷酸酶α1、α2、α3、β1、β2●内皮性白细胞粘着分子I(ELAM-1)●血管紧张素系统血管紧张素II、血管紧张素II转化酶类(ACEI和ACEII)、血管紧张素II受体(ATR1和ATR2)和肾素●CochlinsiNA的设计尽管RNAi的机制尚未已知，但是产生特异性的dsRNA寡核苷酸所需的步骤是清楚的。已经表明，长度为21-26个核苷酸的dsRNA双链体链在产生RNA干扰中最有效。选择基因内部正确的同源区域也是重要的。当考虑产生用于RNAi的dsRNA时，诸如距起始密码子的距离、G/C含量和腺苷二聚体的位置的因素是重要的。然而，这样做的一个后果是人们可能需要检测一些不同的序列，以发现最有效的RNAi，并且这可能是花费大的。
在1999年，Tuschl等揭示了siRNAs的沉默机制，表明它们的效率是双链体的长度、3′末端突出端长度和这些突出端的序列的函数。基于这一奠基性的工作，Eurogentec推荐靶点mRNA区域，以及因而应该使用下述指导方针选择siRNA双链体的序列由于RNAi依赖建立复杂的蛋白相互作用，因而，明显地，mRNA靶点应该完全没有不相关的结合因子。在这一情况下，由于它们可能更富含调控蛋白结合位点，所以应该避免5′和3′不翻译区(UTRs)和临近起始密码子的区域。因此，siRNA的序列选择如下●在mRNA序列中，选择位于AUG起始密码子下游或终止密码子上游50-100nt的区域。
●在这一区域，寻找下述序列AA(N19)，CA(N19)。
●计算每个确定序列的G/C百分数。理想地，G/C含量为50％，但是它必须小于70％并且大于30％。
●优选地，避免含有下列重复的序列AAA，CCC，GGG，TTT，AAAA，CCCC，GGGG，TTTT。
●还进行按照mRNA二级结构的可接近性预测。
●还使用最适合前述标准的核苷酸序列进行BLAST(即，NCBI ESTs数据库)，以确保只有一种基因将被失活。
为了将结果的解释最大化，当使用siRNAs时，应该进行下列预防措施●总是在独立的实验中检测有义和反义单链。
●尝试零乱的(scramble)siRNA双链体。这应该具有与你们的siRNA相同的核苷酸组成，但是缺少与任何其它基因(包括你们的基因)的显著序列同源性。
●如果可能，用2种独立的siRNA双链体击倒(knock-down)相同的基因，以控制沉默方法的特异性。
实际上，将每种选择的基因作为核苷酸序列输入到预测程序中，所述程序考虑到上述所有的变化，用于设计最佳的寡核苷酸。这种程序扫描任何mRNA核苷酸序列的易受siRNAs靶向的区域。这种分析的输出是可能的siRNA寡核苷酸的得分。最高得分用来设计双链寡核苷酸(尽管其它长度也是可能的，典型地21bp长)，其典型地通过化学合成制备。
除了siRNA之外，还可以使用修饰的核苷酸。我们计划检测本领域内公知的一些化学修饰物。这些修饰物目的是增加siNA的稳定性或可用性。适宜的修饰物的实例在下文参考的出版物中描述，每一份出版物通过参考结合于此。
研究表明，用脱氧核糖核苷酸取代具有2个核苷酸3′-突出端的21-mersiRNA双链体的3′-末端核苷酸突出端片段，对RNAi活性没有不利作用。已经报道用脱氧核糖核苷酸取代siRNA每端多达4个核苷酸是很好耐受的，而用脱氧核糖核苷酸完全取代导致没有RNAi活性(Elbashir 2001)。另外，Elbashir等.还报道了用2′-O-甲基核苷酸取代siRNA完全消除了RNAi活性。
可以使用WO2005/044976中所述的亲和力修饰的核苷。这一公布描述了包括修饰的核苷的寡核苷酸，以便具有对于靶点mRNA和/或互补siNA链中它们的互补核苷酸的增加的或减少的亲和力。
GB2406568描述了备用的修饰的寡核苷酸，其被化学修饰，以提供针对降解的提高的抗性或提高的吸收。这样的修饰的实例包括硫代磷酸核苷酸间键合、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-氟核糖核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸和反向脱氧碱性(deoxyabasic)残基结合。
WO2004/029212描述了被修饰以增强siRNA的稳定性或增加靶向效率的寡核苷酸。修饰包括siRNA两个互补链之间的化学交联，和siRNA一条链3’末端的化学修饰。优选的修饰为内部修饰，例如，糖修饰、核碱基修饰和/或骨架修饰。描述了2′-氟修饰的核糖核苷酸和2′-脱氧核糖核苷酸。
WO2005/040537还描述了可以用于本发明的修饰的寡核苷酸。
如应用dsNA和修饰的dsRNA一样好，本发明可以应用短的发夹NA(shNA)；siNA分子的两条链可以通过接头区连接，接头可以是核苷酸接头或非核苷酸接头。
除了与靶点区域完美互补的siNA之外，简并的siNA序列也可以用来靶向同源区域。WO2005/045037描述了靶向这样的同源序列的siNA分子的设计，例如，通过结合非规范的碱基对，例如错配和/或摇摆(wobble)碱基对，其可以提供其它的靶点序列。在确定错配的实例中，非规范碱基对(例如，错配和/或摇摆碱基)可以用来产生靶向多于一种基因序列的siNA分子。在一个非限制性实例中，非规范碱基对诸如UU和CC碱基对用来产生能够靶向使共享序列同源性的靶点不同的序列的siNA分子。这样，使用本发明的siNAs的一个优点是，单一的siNA可以设计成包括与在同源基因之间保守的核苷酸序列互补的核酸序列。在这种方法中，单一的siNA可以用来抑制多于一种基因的表达，而不是使用多于一种的siNA分子来靶向不同的基因。
本发明优选的siNA分子是双链的。本发明的siNA分子可以包括平端的，即，不包括任何突出核苷酸的末端。在一个实施方案中，本发明的siNA分子可以包括一个或多个平端。在优选实施方案中，siNA分子具有3′突出端。本发明的siNA分子可以包括具有n个核苷酸(5≥n≥1)的3′突出端的双链体核酸分子。Elbashir(2001)表明，当含有3′-末端二核苷酸突出端时，21个核苷酸的siRNA双链体是最活跃的。
为了促进从动物到人临床研究的转换，进一步筛选了候选寡核苷酸的种间序列保守性。在本发明的优选实施方案中，使用保守寡核苷酸；这允许单一寡核苷酸序列用于动物模型和人临床试验。
图1显示了与通过备选剪接产生的P2RX7转录物对应的GenBank登记号。在这些基因的一些中，备选的剪接产生在外显子含量上不同的一族转录体。本发明容许各自转录体形式的单独定向。
RNAi针对其而选择的寡核苷酸序列在图2中显示。显示的序列是由siNA靶向的DNA序列。因此，本发明将应用具有与指示DNA序列互补序列的NA双链体。
在图2中显示的序列不是限制性的。事实上，靶点DNA不必必要地在AA或CA之后。此外，靶点DNA可以由包含在图2中的侧连以任何邻近序列的序列组成。
体外和动物研究获得siRNA双链体使用适当保护的核糖核苷氨基磷酸酯(phosphoramidites)和常规DNA/RNA合成仪，优选地化学合成RNAs。用2′-脱氧或2′-O-甲基寡核糖核苷酸取代siRNA双链体的一条或两条链，消除了蝇提取物中的沉默作用(Elbashir等.2001)。然而，在哺乳动物中，用2′-O-甲基寡核糖核苷酸取代有义siRNA似乎是可能的(Ge等.2003)。
最便利地，siRNAs从商业RNA寡聚物合成供应商获得，其出售不同质量和价格的RNA-合成产物。一般地，21-nt RNAs不是很难合成的，并且易于以适合RNAi的质量提供。
RNA合成试剂的供应商包括Proligo(Hamburg，Germany)、DharmaconResearch(Lafayette，CO，USA)、Glen Research(Sterling，VA，USA)、ChemGenes(Ashland，MA，USA)和Cruachem(Glasgow，UK)、Qiagen(Germany)、Ambion(USA)和Invitrogen(Scotland)。早先常规的RNA合成公司具有目标确认的许可有资格提供siRNAs。特别地，我们的siRNA供应商是Ambion，、Dharmacon和Invitrogen，这些公司提供siRNA传统常规的化学合成服务，并且提供用HPLC纯化的siRNA，并且以干燥形式与没有Rnase的水一起递送。RNAi和siRNA方法的主要的基于网络的来源，以及其它siRNA相关产物和服务的链接，可以在上述提及的供应商的网页上找到。
当用单链RNA分子操作时，退火步骤是必要的。严格地，所有的操作步骤都应该在无菌、没有Rnase的条件下进行。为了使RNAs退火，寡聚物必须通过260纳米(nm)处的UV吸收而进行定量。然后，将基于Elbashir等.(2001)的下述流程用于退火●独立地将每种RNA寡聚物等分并且稀释到50μM浓度。
●将30μl每种RNA寡聚物溶液和15μl5×退火缓冲液组合。终缓冲液浓度为100mM醋酸钾，30mM HEPES-KOH pH7.4，2mM醋酸镁。终体积是75μl。
●将所述溶液在90℃温育1分钟，将管离心15秒，在37℃静置1小时，然后在环境温度下使用。所述溶液可以在-20℃冷冻保存，并且冷冻-解冻可达5次。siRNA双链体的终浓度通常为20μM。
备选地，已经退火的dsRNA可以从供应商那里购买。
还可以使用化学修饰的核酸。例如，WO03/070744给出了可以使用的修饰类型的总观点，它的内容通过参考结合于此。特别要注意的是这一公布的第11-21页。其它可能的修饰如上文所述。有经验的人应该直到可以结合到RNA分子中的其它类型的化学修饰。
体外系统为了检验所述siRNA干涉的特异性，采用表达所述目标基因的不同细胞培养。用于这些实验的细胞是兔非着色睫状体上皮细胞NPE、人睫状体上皮细胞OMDC、和人胚肾细胞HEK293。用相应的siRNA双链体温育所述细胞，并且进行所述目标基因表达下调的分析。为了将siRNA击倒与培养细胞中的特定表型相联系，有必要证明目标蛋白质的减少或至少证明目标mRNA的减少。
靶点基因的mRNA水平可以通过实时定量PCR(qRT-PCR)进行定量。此外，蛋白水平可以以本领域公知的各种方法确定，诸如使用针对不同靶点的特异性抗体的蛋白质印迹分析允许对靶点蛋白减少的直接监测。
siRNA双链体的转染本领域众所周知技术的数个实例如下本发明发明人可以利用阳离子的脂质进行siRNA双链体的单一转染，诸如RNAiFect转染试剂(Qiagen)和Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)并且在转染后24、48和72小时检测沉默作用。
典型的转染方案可以如下进行对于6-孔板的一个孔，本发明发明人利用100nM作为siRNA的终浓度转染。在RNAiFect方案后，在转染的前一天，本发明发明人将3ml的适当生长培养基中的每孔接种2-4×105细胞，所述生长培养基含有DMEM、10％血清、抗生素和谷氨酰胺，并且在正常生长条件(37℃和5％CO2)下温育细胞。转染那天，细胞必须30-50％汇合。本发明发明人将15μl的20μM的siRNA双链体(相当于100nm终浓度)稀释在85μl的Buffer EC-R中，得到100μl的终体积，并通过涡流混合。对于复合体形成，本发明发明人将19μl的RNAiFeet转染试剂加入到稀释的siRNA并通过移液管或涡流混合。在将所述样品在室温下温育10-15分钟而形成转染复合体以后，本发明发明人将所述复合体逐滴加入到细胞中，所述细胞具有2ml新鲜的低抗生素生长培养基。在旋涡所述板以确保转染复合体均匀分布以后，本发明发明人在它们的正常生长条件下温育所述细胞。第二天，除去所述复合体并加入新鲜的和完全生长培养基。为了监控基因沉默，在转染后24、48和72小时收集细胞。Lipofectamine2000试剂的方案是相当类似的。转染的前一天，本发明发明人在3ml的适当生长培养基中每孔接种2-4×105细胞，所述生长培养基含有DMEM、10％血清、抗生素和谷氨酰胺，并且在正常生长条件(37℃和5％CO2)下温育细胞。在转染当天，细胞必须30-50％汇合。本发明发明人将12.5μl20μM的siRNA双链体(相当于100nm终浓度)稀释在250μl的DMEM中，得到262.5μl的终体积，并混合。同样，将6μl的Lipofectamine 2000在250μl的DMEM中稀释并混合。在室温下温育5分钟以后，将稀释的寡聚体和稀释的Lipofectamine合并以容许在室温下的20分钟温育期间形成复合体。然后，本发明发明人将所述复合体逐滴加入到细胞中，所述细胞具有2ml新鲜的低抗生素生长培养基，并通过来回摇动所述板而轻轻混合，以确保转染复合体的均匀分布。本发明发明人在它们的正常生长条件下温育所述细胞并且在次日除去所述复合体并加入新鲜的和完全的生长培养基。为了监控基因沉默，在转染后的24、48和72小时收集细胞。
转染效率可以取决于细胞类型，但是也取决于传代次数和细胞的汇合。形成siRNA-脂质体复合体的时间和方式(例如，倒置相对旋转)也是关键的。低转染效率是不成功沉默作用的最常见的原因。良好的转染是一个重要的问题，并且需要仔细检验要应用的每种新细胞系。转染效率可以通过转染报道基因，例如CMV-驱动的EGFP-表达质粒(例如，来自Clontech)或B-Gal表达质粒，然后在第二天通过相差和/或荧光显微镜方法评估而检测。
检测siRNA双链体取决于靶点蛋白的丰度和寿命(或周转)，在1-3天后或者甚至以后，击倒表型可以变得明显。在没有观察到表型的情形中，蛋白的耗尽可以通过免疫荧光或蛋白质印迹而观察到。
转染后，从细胞提取的总RNA级分用DNase I预处理，并且使用随机引物用于反转录。为了控制前-mRNAs的扩增，使用覆盖至少一个外显子-外显子连接的特异的引物对进行PCR扩增。还需要非靶点mRNA的RT/PCR作为对照。mRNA的有效耗尽而靶点蛋白的无法检测的减少可能表明，在细胞中可能存在稳定蛋白的大储存库。备选地，实时PCR扩增可以用于以更精确的方法检测mRNA的减少或消失。实时反转录(RT)PCR最特异性的、灵敏地和可重现性地定量模板的初始量。实时PCR监测在反应过程中发射的荧光，作为在每一PCR循环中扩增子产生的指示。这种信号与反应中PCR产物的量成正比例增加。通过记录每一循环中发射的荧光量，可以在指数期监测PCR反应，在指数期，PCR产物量的第一次显著增加与靶点模板初始量相关。
为了证实在所述细胞培养中识别的差异表达基因的干涉模式，根据制造商的规程进行qRT-PCR。对于定量的RT-PCR(qRT-PCR)，将接近250ng的总RNA用于反转录，接着是在含有Master SYBR Green I的反应混合物中用各自基因的特定引物的PCR扩增。基本PCR条件包含在91℃下30分钟的初始步骤，接着是在95℃下5秒、在62℃下10秒和在72℃下15秒的40个循环。使用对应于各自目标基因的特定引物序列。将b-肌动蛋白mRNA的定量用作数据标准化的对照。在所述样品中，当选择的内源性/内部的对照是更大量的并保持恒定，与总RNA成比例时，相对基因表达比较运行得最好。通过利用不变的内源对照作为活性参考物，mRNA目标的定量可以对于加入到各自反应的总RNA的数量标准化。
药物制剂本发明可以包括一种或多种siNA分子的同时施用。这些种类可以选择靶向一种或多种靶点基因。
本发明的siNA分子及其制剂或组合物可以直接或表面局部地(例如，局部地)施用到眼，这通常是本领域已知的。例如，siNA分子可以包括施用给受试者的递送载体，其包括脂质体。在药用制剂中可以存在载体和稀释剂及它们的盐。核酸分子可以通过本领域的技术人员已知的各种方法施用到细胞，这些方法包括，但不限于，包封到脂质体中，通过离子电渗疗法，或者通过结合其它载体，诸如可生物降解的聚合物、水凝胶、环式糊精聚(乳酸-共-乙二醇)酸(PLGA)和PLCA微球、可生物降解的微胶囊、和生物黏附性微球，或者通过蛋白质载体而施用。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子还可以与聚乙烯亚胺及其衍生物诸如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物一起配制或复合。
本发明的siNA分子可以与膜分解剂和/或阳离子脂质或辅助脂质分子络合。
可以用于本发明的递送系统包括，例如，水性和非水性凝胶、乳膏剂、多样乳剂、微乳剂、脂质体、软膏剂、水性和非水性溶液、洗液、气溶胶、碳水化合物碱和粉剂，并且可以包含赋形剂诸如增溶剂，渗透增强剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和亲水聚合物(例如聚亲碳物质(polycarbophil)和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药用载体是脂质体或透皮增强剂。
本发明的药物制剂是适合施用例如全身或局部施用到细胞或受试者的形式，所述受试者包括例如人。适合的形式部分取决于应用或者进入的途径，例如，口服、透皮或者通过注射。其它因素在本领域内是已知的，并且包括这样的考虑，诸如防止所述组合物或制剂行使其作用的毒性和形式。
本发明还包括用于储存或施用而制备的组合物，其在药用载体或稀释剂中包括药物有效量的需要的化合物。治疗应用的可用载体或稀释剂在制药领域内是公知的。例如，可以提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。另外，可以施用抗氧化剂和混悬剂。
药物有效剂量是预防、抑制疾病状态发生或者治疗(在某种程度上减轻症状，优选所有症状)疾病状态所需要的剂量。药物有效剂量取决于搅拌类型、所用的组合物、施用途径、要治疗的哺乳动物类型、考虑中具体哺乳动物的物理特征、协同药物治疗、以及医学领域的技术人员应该意识到的其它因素。
一般地，施用在0.1mg/kg和100mg/kg体重/天之间的量的活性成分。
本发明的制剂可以以单位剂量制剂施用，其包括常规的无毒药用载体、佐剂和/或载体。制剂可以是适于口服应用的形式，例如，作为片剂、药片、锭剂、水性或油性混悬液、可分散的粉剂或粒剂、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。意欲用于口服使用的组合物可以按照本领域已知的关于药物组合物制备的任何方法进行制备，并且这样的组合物可以包含一种或多种这样的甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂，以提供药学上美观和可口的制剂。片剂在与适于制备片剂的无毒药用赋形剂的混合物中含有活性成分。
这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂；诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如，玉米淀粉或褐藻酸；结合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是没有涂层的或者它们可以通过已知技术涂层。在一些情形中，这样的涂层可以通过已知技术制备，以延缓崩解和在胃肠道中的吸收，并且由此在更长的时间段提供持续不变的作用。例如，可以应用时间延缓物质，诸如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
口服使用的制剂还可以作为硬明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者作为软明胶胶囊存在，其中活性成分与水或油性介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性混悬液在与适于制备水性混悬液的赋形剂的混合物中含有活性物质。这样的赋形剂是混悬剂，例如羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散或湿润剂可以是天然存在的磷脂如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物如十七烷基乙烯氧基十六烷醇，或环氧乙烷与衍生于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合物诸如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烯与衍生于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。所述水性混悬液还可以包含一种或多种防腐剂如乙基、或正丙基对羟基苯甲酸，一种或多种着色剂，和一种或多种甜味剂诸如蔗糖或糖精。
油性混悬液可以通过将活性成分悬浮在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油或者悬浮在矿物油诸如液体石蜡中而配制。油性混悬液可以含有增稠剂如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。可以加入甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂诸如抗坏血酸而保存。
适于通过加入水而制备水性混悬液的分散粉剂和粒剂，在与分散剂或湿润剂、混悬剂和一种或多种防腐剂的混合物中提供活性成分。适当的分散剂或湿润剂或混悬剂通过上文已经提及的那些而示例。还可以存在其它赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以是油-在-水的乳剂形式。油相可以是植物油或矿物油或这些油的混合物。适宜的乳化剂可以是天然存在的树胶如阿拉伯树胶或西黄蓍胶，天然存在的磷脂如大豆、卵磷脂，以及衍生于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。所述乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以与甜味剂如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖一起配制。这样的制剂还可以含有缓和剂、防腐剂和调味剂以及着色剂。所述药物组合物可以是无菌注射水性或油质混悬液的形式。
这种混悬液可以使用上文提及的那些适当的分散剂或湿润剂和混悬剂按照已知技术进行配制。
无菌注射制剂还可以是在肠胃外适用的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可以应用的可用载体和溶剂中，有水、Ringer′s溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的、不挥发的油可以便利地用作溶剂或混悬介质。为了这一目的，可以应用任何温和的不挥发油，包括合成的单酸-或二脂酰甘油酯。另外，脂肪酸诸如油酸用于制备注射剂。
本发明分核酸分子还可以以栓剂形式施用，例如，用于药物的直肠投药。这些组合物可以通过将药物与适当的无刺激性赋形剂混合而制备，所述无刺激性赋形剂在常温下是固体的但是在直肠温度下是液体的，并且因此将在直肠中熔融而释放所述药物。这样的物质包括可可油和聚乙二醇。
本发明的核酸分子可以在无菌介质中进行肠胃外施用。取决于所用的载体和浓度，药物可以悬浮或者溶解在赋形剂中。有利地，佐剂诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂可以溶解在载体中。
应该理解，用于任何具体的受试者的具体的剂量水平取决于各种因素，包括所用的具体的化合物的活性、年龄、体重、综合健康、性别、饮食、施用时间、施用途径、和排泄速度、药物组合以及正在进行治疗的具体疾病的严重性。
对于施用给非人动物，组合物还可以添加到动物饲料或饮用水中。可以方便地配制动物饲料和饮用水组合物，以便动物在其饮食中摄取治疗适当量的组合物。还可以方便地将所述组合物作为添加到饲料或引用水中的预混合料存在。
本发明的核酸分子还可以与其它治疗化合物组合施用给受试者，以提高综合治疗效果。应用多种化合物治疗一种指征可以增加有利效果而减少副作用的存在。
备选地，本发明的某些siNA分子可以在细胞内从真核启动子表达。能够表达siNA分子的重组载体可以被递送到并且保持在目标细胞内。备选地，可以使用提供核酸分子的瞬时表达的载体。当需要时，这样的载体可以重复施用。一旦表达，所述siNA分子与靶点mRNA相互作用，并且产生RNAi反应。SiNA分子表达载体的递送可以是全身的，诸如通过静脉内或肌内施用，通过施用给从受试者移植的靶点细胞然后再引入受试者，或者通过允许引入需要的靶点细胞的任何其它方法进行递送。
动物研究新西兰兔是用来研究IOP的实验平台中的金标准。它易于操作并且它具有大眼睛，在大小上类似于人的器官。另外，测量IOP的现有装备不适于用在具有小眼睛的动物诸如小鼠或大鼠中。最后，兔具有IOP(约23mmHg)，其可以利用局部商业的低血压的药物疗法降低直到它的值的40％。因而，虽然可以产生兔青光眼模型(例如，外科阻塞巩膜静脉或人为闭塞所述小梁网)，本发明发明人已经使用了正常血压的兔，因为，在本发明发明人手中，可以容易并可重复地测量IOP的药理学降低。
实验规程使用正常血压的新西兰白兔(雄性，2-3kg)。将所述动物保存在具有食物和水自由入口的单独笼中。将它们进行人为的12小时光/暗循环，以避免IOP的不受控制的昼夜摆动。依照European Communities CouncilDirective(86/609/EEC)和Association for Research in Vision andOphthalmology关于Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research的声明进行动物操作和治疗。
典型地通过在角膜表面上滴入小体积(一般是40μL)施用所述药物。将对侧的眼单独用载体处理并且可以用作各自实验中的对照，以免对于另一只眼存在交感现象。应当取消在相同动物中的多重实验。
利用接触眼压计(TONOPEN XL，Mentor，Norwell，Massachusetts)进行IOP测量。TonoPen眼压计是很方便的，这是由于它的可靠性和小尺寸。将所述眼压计的传感器精巧地施加到角膜表面进行该仪器的测量。已经证明这装置是用于在兔中测量3至30mm Hg范围内的眼内压所选择的眼压计(Abrams等，1996)。全部测量属于这个时间间隔眼内压的平均基线值是17.0±0.39mm Hg(n＝100)。因为IOP从夜间至白昼改变，所以全部实验是同时进行的以容许IOP更稳定并且容许与载体处理的客观比较。为了避免使所述动物受苦，将兔局部麻醉(oxibuprocaine/丁卡因，0.4％/1％，在盐溶液中(1/4体积比)。将所述溶液施用(10μl)至所述角膜，之后进行眼内压的各自测量。将siRNA或盐水以40μl的体积局部施用至所述角膜。
用于在兔中的siRNA施用的标准规程如下。在四个连续日期间，每天将终体积为40μl的siRNA在盐溶液(0.9％重量/体积)的剂量施用至一个眼。将相对的眼作为对照并且在相同的时间点将40μl的无菌盐水(0.9％重量/体积)滴在其上。在各自施用以前测量IOP并且在10天期间在滴注之后的2h、4h和6h测量。在第二和第三天之间观察到最大反应。为了比较siRNA与其它减血压化合物的效果，检定了Xalatan(拉坦前列素0.005％)和Trustop(多佐胺2％)并且在相同条件下测量眼内压。
结果实施例1体外检定。
为了利用RNAi技术确定涉及青光眼的不同目标的抑制，第一步是在细胞培养中进行实验。对于每个目标，根据前述的规则利用特定的软件设计数个siRNAs。将所述siRNAs应用于细胞培养，诸如NPE、OMDC和HEK293。根据标准规程，通过实时PCR和半定量的PCR分析siRNAs对所述目标基因的效果。利用肌动蛋白作为持家基因将所述基因目标转录水平是标准化。下面的表I显示对于上述一些目标基因的实时PCR实验的代表性结果。所述值表示siRNA对每个基因表达干涉的曾经与对照细胞进行标准化的百分比的平均值和它们的标准偏差。相比于所述对照细胞，在24和48h时间点的不同转录水平都在siRNA治疗以后显著减少。在所述表中包括一些测试的不同siRNAs和在所述目标基因干涉中的不同功效。表中所用的siRNAs相应于图2中给出的所列人siRNA目标，如下。
AC2siRNA1对于人SEQ.ID.73同源的兔序列siRNA2对于人SEQ.ID.54相同的兔序列siRNA3对于人SEQ.ID.66相同的兔序列PTGS1siRNA1对于人SEQ.ID.353同源的兔序列siRNA2对于人SEQ.ID.369同源的兔序列PTGS2siRNA1对于人SEQ.ID.426相同的兔序列siRNA2对于人SEQ.ID.421同源的兔序列siRNA3对于人SEQ.ID.477同源的兔序列
表IsiRNA治疗减少目标基因转录水平。从用不同siRNA治疗24和48h的细胞制备RNA。通过实时PCR利用特定引物分析所述样品。所述值显示不同转录物相对于细胞对照的平均表达水平，所述转录物标准化至肌动蛋白。
图3显示用于一些上述目标的一些典型的半定量的凝胶。每个目标基因的基因表达的减少取决于siRNA沉默中的效率。对于每个目标，将通过体外研究获得的最有效的siRNA施用至所述动物模型。从用不同siRNAs治疗的细胞制备RNA。利用特定的引物通过半定量的PCR分析所述样品。所述图显示对于β肾上腺素能受体2表达(A)及其它对于乙酰胆碱酯酶表达(B)的典型半定量的凝胶。MMW标记物；C对照细胞；TC转染对照；1siRNA1；2siRNA2；3siRNA；NC阴性对照。每个目标的表达水平取决于siRNA沉默中的功效。在所述图中使用的siRNAs相应于图2中给出的人目标，如下板A(β肾上腺素能受体2)1对于人SEQ.ID.122同源的兔序列2对于人SEQ.ID.125相同的兔序列3对于人SEQ.ID.139同源的兔序列板B(乙酰胆碱酯酶)1对于人SEQ.ID.162同源的兔序列2对于人SEQ.ID.177同源的兔序列实施例2体内检定。
在siRNA治疗应用之前，确认体内检定以确定正确的siRNA递送。
将那些通过体外检定选择的siRNAs应用到动物模型，接着是上面描述的规程。为了避免由于昼夜节律循环引起的IOP波动的效果，同时进行全部施用。为了确定siRNA效果，如前面提到的那样测量眼内压(IOPs)。
因为青光眼病理学提出眼内压的增加，所以目的是获得在siRNA施用之后眼内压水平的减少。
与对照和同样用商业药物(拉坦前列素和多佐胺)相比，对于不同目标的大部分结果显示IOP水平的显著减小并且用载体单独处理的动物(阴性对照)在它们的IOP基线中不存在任何显著的变化。所述数据概括在表II中，其中值表示在siRNA治疗以后曾经标准化的IOP减少的最大百分比的平均值和它们的标准偏差。IOP的减小对于全部治疗目标是统计上显著的。这些结果表明siRNAs和商业的药物以类似的方式起作用，减少IOP水平约20％，虽然siRNAs还存在更保持的效果。沿着所述实验规程，没有在所述动物中观察到副作用。用于这些实验的siRNAs相应于图2中给出的人目标如下AC2对于人SEQ.ID.73同源的兔序列AC4对于人SEQ.ID.5相同的兔序列AC12对于人SEQ.ID.522相同的兔序列ADRB1对于人SEQ.ID.105相同的兔序列ADRB2对于人SEQ.ID.139同源的兔序列ADRA1A对于人SEQ.ID.546同源的兔序列ADRA1B对于人SEQ.ID.619同源的兔序列ACHE对于人SEQ.ID.189同源的兔序列PTGS1对于人SEQ.ID.322同源的兔序列PTGS2对于人SEQ.ID.426相同的兔序列SELE对于人SEQ.ID.262同源的兔序列ACE1对于人SEQ.ID.866同源的兔序列AGTR1对于人SEQ.ID.705同源的兔序列AGTR2对于人SEQ.ID.774相同的兔序列ATP1A1对于人SEQ.ID.1399相同的兔序列ATP1B2对于人SEQ.ID.1820相同的兔序列
表IIsiRNAs对血压正常的新西兰兔中的IOP还原的影响。所述值表示对所述对照(仅有载体的对侧的眼)的IOP还原的百分比的均值和它们的标准误差(SEM)。
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权利要求
1.siNA在药物制备中的用途，所述药物用于治疗眼病症的方法中，所述方法包含目标基因在需要治疗的患者中的减量表达，所述基因选自包含眼房水形成基因和眼房水流出基因的组。
2.权利要求1的用途，其中所述眼病症的特征在于所述患者中改变的眼内压(IOP)。
3.权利要求1或2的用途，其中所述眼病症选自包含青光眼，感染；炎症，葡萄膜炎，和全身疾病的表达的组。
4.任何在前权利要求的用途，其中所述眼病症是青光眼。
5.任何在前权利要求的用途，其中所述眼病症是糖尿病性视网膜病。
6.任何在前权利要求的用途，其中所述目标基因表达在所述患者眼睛中是下调的。
7.任何在前权利要求的用途，其中所述目标基因选自包含下列基因的组碳酸酐酶II、IV和XII；肾上腺素能受体β1和2以及α1A、1B和1D；乙酰胆碱酯酶；环加氧酶1和2；腺苷三磷酸酶α1、α2、α3、β1、β2；内皮性白细胞粘着分子I(ELAM-I)；血管紧张素系统血管紧张素II，血管紧张素II转化酶类(ACE I和ACE II)，血管紧张素II受体(ATR1和ATR2)和肾素；Cochlin。
8.任何在前权利要求的用途，其中所述siNA是siRNA。
9.权利要求8的用途，其中所述siRNA是dsRNA。
10.权利要求8的用途，其中所述siRNA是shRNA。
11.任何在前权利要求的用途，其中所述siNA包含修饰的寡核苷酸。
12.任何在前权利要求的用途，其中将所述siNA局部施用至患者的眼睛。
13.权利要求12的用途，其中将所述siNA施用至患者的角膜。
14.任何在前权利要求的用途，其中使用多个种类的siNA。
15.权利要求14的用途，其中所述多个种类是靶向相同mRNA种类的。
16.权利要求14的用途，其中所述多个种类是靶向不同mRNA种类的。
17.任何在前权利要求的用途，其中所述siNA是靶向选自SEQ ID 1至SEQ ID 1829的序列的。
18.权利要求17的用途，其中所述目标基因是碳酸酐酶IV，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 1至SEQ ID 46的序列的。
19.权利要求17的用途，其中所述目标基因是碳酸酐酶II，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 47至SEQ ID 98的序列的。
20.权利要求17的用途，其中所述目标基因是β肾上腺素能受体1，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 99至SEQ ID 109的序列的。
21.权利要求17的用途，其中所述目标基因是β肾上腺素能受体2，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 110至SEQ ID 160的序列的。
22.权利要求17的用途，其中所述目标基因是乙酰胆碱酯酶，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 161至SEQ ID 190的序列的。
23.权利要求17的用途，其中所述目标基因是ELAM-1(选择蛋白E)，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 191至SEQ ID 318的序列的。
24.权利要求17的用途，其中所述目标基因是前列腺素内过氧化物合酶1，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 319至SEQ ID 374的序列的。
25.权利要求17的用途，所述目标基因是前列腺素内过氧化物合酶2，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 375至SEQ ID 491的序列的。
26.权利要求17的用途，所述目标基因是碳酸酐酶XII，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 492至SEQ ID 538的序列的。
27.权利要求17的用途，所述目标基因是α肾上腺素能受体1A，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 539至SEQ ID 598的序列的。
28.权利要求17的用途，所述目标基因是α肾上腺素能受体1B，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 599至SEQ ID 634的序列的。
29.权利要求17的用途，所述目标基因是肾上腺素能受体1D，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 635至SEQ ID 646的序列的。
30.权利要求17的用途，所述目标基因是血管紧张素原，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 647至SEQ ID 694的序列的。
31.权利要求17的用途，所述目标基因是血管紧张素II受体类型1，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 695至SEQ ID 749的序列的。
32.权利要求17的用途，所述目标基因是血管紧张素II受体类型2，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 750至SEQ ID 807的序列的。
33.权利要求17的用途，所述目标基因是血管紧张素I转化酶1，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 808至SEQ ID 939的序列的。
34.权利要求17的用途，所述目标基因是血管紧张素I转化酶2，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 940至SEQ ID 1139的序列的。
35.权利要求17的用途，所述目标基因是肾素，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 1140至SEQ ID 1196的序列的。
36.权利要求17的用途，所述目标基因是cochlin，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 1197至SEQ ID 1307的序列的。
37.权利要求17的用途，所述目标基因是腺苷三磷酸酶α1，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 1308至SEQ ID 1500的序列的。
38.权利要求17的用途，所述目标基因是腺苷三磷酸酶α2，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 1501至SEQ ID 1606的序列的。
39.权利要求17的用途，所述目标基因是腺苷三磷酸酶α3，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 1607至SEQ ID 1705的序列的。
40.权利要求17的用途，所述目标基因是腺苷三磷酸酶β1，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 1706至SEQ ID 1780的序列的。
41.权利要求17的用途，所述目标基因是腺苷三磷酸酶β2，并且所述siNA是靶向选自SEQ ID 1780至SEQ ID 1829的序列的。
42.一种眼病症的治疗方法，所述方法包含施用siNA而在患者中下调目标基因的表达，所述目标基因选自包含眼房水形成基因和眼房水流出基因的组。
43.权利要求42的方法，其中所述眼病症选自包含青光眼，感染；炎症，葡萄膜炎，和全身疾病的表达的组。
44.权利要求42的方法，其中所述眼病症是青光眼。
45.权利要求42的方法，其中所述眼病症是糖尿病性视网膜病。
46.权利要求42的方法，其中所述目标基因选自包含下列基因的组碳酸酐酶II、IV和XII；肾上腺素能受体β1和2以及α1A、1B和1D；乙酰胆碱酯酶；环加氧酶1和2；腺苷三磷酸酶α1、α2、α3、β1、β2；内皮性白细胞粘着分子I(ELAM-I)；血管紧张素系统血管紧张素II，血管紧张素II转化酶类(ACE I和ACE II)，血管紧张素II受体(ATR1和ATR2)和肾素；Cochlin。
47.权利要求42的方法，其中所述siNA是siRNA。
48.权利要求47的方法，其中所述siRNA是dsRNA。
49.权利要求47的方法，其中所述siRNA是shRNA。
50.权利要求42的方法，其中所述siNA包含修饰的寡核苷酸。
51.一种用于眼病症治疗的分离的siNA分子，其特征在于在所述患者中改变的眼内压(IOP)，所述siNA对于选自SEQ ID 1至SEQ ID 1829的核苷酸序列是互补的。
52.分离的siNA分子在制备用于眼病症治疗的药物中的用途，所述分子具有对于选自SEQ ID 1至SEQ ID 1829的核苷酸序列互补的序列。
53.一种药物组合物，所述组合物包含具有对于选自SEQ ID 1至SEQID 1829的核苷酸序列互补的序列的siNA。
全文摘要
公开了利用RNA干涉用于治疗眼病症的序列和规程。目标基因选自负责眼房水流动或眼房水流出的那些，而特别优选的要治疗的病症包括青光眼和葡萄膜炎。
文档编号A61P27/06GK101076590SQ200580036349
公开日2007年11月21日 申请日期2005年8月23日 优先权日2004年8月23日
发明者安娜·I·希门尼斯, 安吉拉·塞斯托, 何塞·P·罗曼, 伊雷妮·加斯孔, 贡萨洛·冈萨雷斯·德·布伊特拉格 申请人:西伦蒂斯私人股份公司