专利名称：作为疫苗的重组分枝杆菌和生物活性剂的组合的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括至少两种成分的组合，这样的组合作为药物组合物的应用，其用于制备药物的应用，使用这样的组合治疗患者的方法以及制备这样的组合的方法。
现代分子医学强烈地集中在免疫原性化合物或调节患者免疫系统的化合物用于治疗这样的患者的应用。其中，代表性的疾病为肿瘤和传染病。
在两种情形中，将抗原性化合物，即将适于激发免疫应答或加强免疫应答的化合物施用到患者机体中。然而，在许多情形中，各自的化合物的应用是有限的，其需要免疫系统的增强，以便达到临床上相应水平的效率和功效。这样的增强可以通过重复施用单独的药剂或者通过使用佐剂而进行。
现有技术提供了一些佐剂，诸如矿物油、灭活的分枝杆菌(mycobacteria)、铝化合物等。
然而，本领域已知的佐剂并没有总是以足以满足医学需要的方式表现，特别是与新的治疗方案联系时，诸如应用如在国际专利申请PCT/US94/01631中描述的细胞因子表达细胞。
因此，本发明潜在的问题是提供组合物，更具体地是药物组合物，其包括至少第一成分和第二成分，其中第一成分是佐剂，以及第二成分是生物活性剂。
在第一方面，这一问题通过包括第一成分和第二成分的组合而得以解决，其中所述第一成分是细菌细胞，其包括至少一种编码吞噬溶酶体逃逸肽(phagolysosomal escape peptide)或多肽的重组核酸分子；其中所述第二成分是生物活性剂。
在一个实施方案中，所述细菌细胞是脲酶缺陷型的。
在另一个实施方案中，所述细菌细胞是分枝杆菌(Mycobacterium)细胞。
在一个优选的实施方案中，所述细胞是牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)细胞。
在一个优选实施方案中，细菌细胞的至少一种细胞脲酶亚基编码核酸被灭活。
在一个更优选的实施方案中，至少细菌脲酶C亚基-编码序列被灭活。
在一个实施方案中，所述吞噬溶酶体逃逸结构域是利斯特氏菌(Listeria)吞噬溶酶体逃逸结构域。
在一个实施方案中，所述吞噬溶酶体结构域由选自包括下列各项的组的核酸分子编码a)包括SEQ.ID.NO.1中所示的核苷酸211-1.722的核苷酸序列；b)编码同来自a)的序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列；和c)在严紧条件下与a)或b)的序列杂交的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述细菌细胞包括至少一种编码能够在哺乳动物中引发免疫应答的肽或多肽的重组核酸分子。
在一个优选实施方案中，所述肽或多肽选自自身抗原、肿瘤抗原、病毒抗原、寄生虫抗原、细菌抗原以及其免疫原性片段。
在另一个优选的实施方案中，所述肽或多肽是融合多肽片段。
在一个实施方案中，所述融合多肽包括a)来自多肽的至少一个结构域，其中所述多肽结构域能够在哺乳动物中引发免疫反应，和b)吞噬溶酶体逃逸结构域。
在一个优选的实施方案中，所述多肽是权利要求9定义的多肽或其片段。
在另一个优选实施方案中，所述吞噬溶酶体逃逸结构域是权利要求1-11中任一项所定义的吞噬溶酶体逃逸结构域的结构域。
在一个优选实施方案中，所述细菌细胞是rBCG:Hly或rBCGΔureC:Hly。
在一个实施方案中，所述生物活性剂是真核细胞，并且更优选地是表达细胞因子的遗传操作的真核细胞。
在一个优选的实施方案中，所述细胞因子选自包括白介素-2、白介素-4、白介素-12以及干扰素-γ的组。
在一个更优选的实施方案中，所述细胞同时表达两种或多种细胞因子。
在另一个更优选的实施方案中，所述细胞同时表达IL-2和干扰素-γ。
在一个优选的实施方案中，所述细胞相对于施用或者要施用所述细胞和/或组合物的受试者是自体同源的。
在一个优选的备选实施方案中，所述细胞相对于施用或者要施用所述细胞和/或组合物的受试者是同种异基因性的。
在一个优选的实施方案中，所述细胞选自包括非专职抗原呈递细胞、专职抗原呈递细胞、肿瘤细胞和树突细胞的组。
在一个更优选的实施方案中，所述肿瘤细胞是免疫原性肿瘤的细胞，并且其中所述肿瘤细胞优选地选自包括黑素瘤细胞、肾癌细胞、乳腺瘤细胞、脑瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、非小细胞肺癌、结肠癌、头颈鳞状肿瘤(head and neck squamous tumor)的组。
在一个优选的实施方案中，所述细胞是同种异基因型细胞，并且是与I类HLA匹配的。
在另一个优选的实施方案中，所述细胞表达另一种免疫分子，所述免疫分子选自包括细胞因子、黏着分子、共刺激性因子、肿瘤相关的抗原、肿瘤特异性抗原和寄生虫抗原的组。
在一个更优选的实施方案中，所述寄生虫抗原是疟原虫(Plasmodium)优选地是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的gp190/MSP1蛋白，或者是其能够在哺乳动物中引发免疫应答的片段。
在一个优选的实施方案中，所述生物活性剂是疟原虫，优选地是恶性疟原虫的gp190/MSP1蛋白，或者是其能够在哺乳动物中引发免疫应答的片段。
在一个实施方案中，所述生物活性剂是人巨细胞病毒。
在一个优选的实施方案中，所述生物活性剂是病毒颗粒或其群体(multitude)，其优选地在人巨细胞病毒感染哺乳动物细胞后释放，其中所述颗粒(a)被脂膜包围，病毒糖蛋白内含在脂膜中，和(b)不含有病毒DNA，也不含壳体。
在一个优选的实施方案中，所述颗粒包含一种融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65(UL83)的一个或多个片段以及一种或多种非pp65蛋白的一个或多个片段。
在一个优选的实施方案中，T细胞抗原pp65融合到人巨细胞病毒糖蛋白的一个或多个片段上，因而所述糖蛋白选自包括HCMV糖蛋白gH、HCMV蛋白IE1(ppUL123)和HCMV糖蛋白gB的组。
在一个优选的实施方案中，T细胞抗原融合到蛋白的一个或多个片段上，所述蛋白为除了HCMV以外的人病原体片段。
在一个优选的实施方案中，所述病原体选自包括HIV-1、HBV、HCV和流感的组。
在一个优选的实施方案中，所述颗粒包含至少两种糖蛋白的片段，所述糖蛋白是来自不同HCMV毒株的特别的糖蛋白的变体。
在一个更优选的实施方案中，两种特别的HCMV糖蛋白变体中的一种是HCMV Towne毒株的变体，另一种是HCMV Ad169毒株的变体。
在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物细胞是成纤维细胞，优选地是包皮成纤维细胞。
在一个优选的实施方案中，所述颗粒是密体。
在一个优选的实施方案中，所述生物活性剂是密体，优选地是HCMV的密体，或者本文所定义的密体。
在一个实施方案中，所述生物活性剂是分枝杆菌(Mycobacterium)的抗原，优选的是分枝杆菌亚种(Mycobacterium ssp.)的抗原。
在一个优选的实施方案中，所述分枝杆菌选自包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、M.canettii、非洲分枝杆菌(M.africanum)和副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)的组。
在一个优选的实施方案中，所述抗原是抗原85。
在第二方面，本发明潜在的问题通过包括按照本发明第一方面的组合和任选的药用载体的组合物，优选地药物组合物而得以解决。
在第三方面，本发明潜在的问题通过使用按照本发明第一方面的组合、或按照本发明第二方面的组合、或者这样的组合的每种成分用来制备药物的应用而得以解决。
在一个实施方案中，所述药物用于预防和/或治疗选自包括癌症和传染病的组的疾病。
本领域的技术人员应该理解，单独的或者组合的本发明的组合物及其成分还可以优选地用于预防疾病。在优选实施方案中，这是基于这样的事实，即，按照本发明的组合的第一成分适于引发免疫应答，并且更具体地是特异性免疫应答，在疾病表现之前，并且更具体地在疾病的临床或医学相关表现之前，其允许使单独的人或动物机体与所述疾病抗争。
在一个优选的实施方案中，所述癌症是免疫原性肿瘤，并且其中所述肿瘤优选地选自包括前列腺癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、脑癌、非小肺癌(non-small lung cancer)、结肠癌和头颈鳞状肿瘤的组。
在一个备选实施方案中，所述传染病是疟疾。
在一个优选的实施方案中，所述生物活性剂是疟原虫gp190/MSP1蛋白或其能够在哺乳动物中引发免疫应答的片段。
在一个备选实施方案中，所述传染病是HCMV感染，优选地是人HCMV感染。在一个优选的实施方案中，所述生物活性剂是本文公开的密体。
在一个备选实施方案中，所述传染病是结核病。在一个优选的实施方案中，所述生物活性剂是分枝杆菌抗原，优选地是分枝杆菌亚种的抗原。更优选地，所述分枝杆菌选自包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、M.canettii、非洲分枝杆菌和副结核分枝杆菌的组。甚至更优选地，所述抗原是抗原85。
在第四方面，本发明潜在的问题通过应用按照本发明第一方面的组合或者这样的组合的每一成分用来制备疫苗的应用而得以解决。
在第五方面，本发明潜在的问题通过用于治疗患有疾病或者需要这样的治疗的患者的方法而得以解决，所述方法包括施用按照本发明第一方面的组合、或者按照本发明第二方面的药物组合。
在第六方面，本发明潜在的问题通过用于制备药物组合优选地是按照本发明第二方面的药物组合物的方法而得以解决，所述方法包括步骤-提供细菌细胞作为第一成分，其包括至少一种编码吞噬溶酶体逃逸肽或多肽的重组核酸分子；
-提供生物活性剂作为第二成分；和-将所述第一成分和第二成分配制成药物组合物。
在第七方面，本发明潜在的问题通过用于制备药物组合优选地是按照本发明第二方面的药物组合物的方法而得以解决，所述方法包括步骤-提供细菌细胞作为第一成分，其包括至少一种编码吞噬溶酶体逃逸肽或多肽的重组核酸分子；-提供生物活性剂作为第二成分；和-独立地配制第一成分和第二成分。
在一个实施方案中，将配制的第一成分和配制的第二成分包装在一个包装中。
备选地，配制的第一成分和配制的第二成分包装在独立的包装中。
在一个更优选的实施方案中，所述包装是单一剂型或者包括多种单一剂型。
本发明人惊讶地发现，可以是革兰氏阳性或者革兰氏阴性的表达吞噬溶酶体逃逸肽或多肽的细菌细胞是一种特别有用的佐剂，其可以与生物活性剂组合应用。更具体地，本发明人已经意识到，当使用生物活性剂，以及更具体地使用其它免疫引发性生物活性剂时，牛分枝杆菌，优选地是牛分枝杆菌卡介苗(BCG)，并且更优选地是诸如编码BCG或表达吞噬溶酶体逃逸肽或多肽的的分枝杆菌，是引发免疫应答或者加强具体调控的免疫应答的适宜方式。一种引发特别优选类型的免疫应答的生物活性剂是表达至少一种细胞因子或寄生虫抗原、或者肿瘤或寄生虫抗原或病毒抗原的细胞。
不希望受到任何理论的束缚，本发明人的看法是，一旦这样的吞噬溶酶体逃逸肽可以获得，这样的吞噬溶酶体逃逸肽或多肽使得来源于细菌细胞或者生物活性剂的并且适于引发免疫应答的任何抗原更加有效。换句话说，通过允许在将细菌细胞诱陷到吞噬溶酶体中时而产生的抗原从吞噬溶酶体逃离，并且因此被呈递到免疫系统，增加了BCG特异性抗原的可及性，并且因此产生有效与本发明联系应用的优良佐剂。
这种进入I类MHC呈递途径的肽的递送可以加强已经存在的BCG-特异性免疫应答及其佐剂活性。
BCG的佐剂作用，并且更具体地是BCG或任何微生物优选任何分枝杆菌微生物(其编码或者表达吞噬溶酶体逃逸肽或多肽)的佐剂作用，是本发明人的另一个令人惊讶的发现，当引起这样的佐剂作用的微生物与另一种或第二种生物活性剂组合或共同施用时，其可以优选地得到应用。与刺激TH2免疫应答的其它佐剂不同，前文描述的佐剂，即，微生物，可以用来引发TH1免疫应答。由于它诱导细胞免疫应答，所以，目前，这样的TH1免疫应答是有效的。因此，在另一方面，本发明涉及编码和/或表达吞噬溶酶体逃逸肽的微生物的应用，其中作为佐剂的所述微生物优选地是BCG，并且更优选地是本文所述的BCG，并且最优选地是ure C-缺陷型BCG。
甚至更令人惊讶地，本发明人发现，编码和/或表达吞噬溶酶体逃逸肽的微生物，优选地BCG或其衍生物，并且更优选地是本文在其各种实施方案中所述的BCG，包括但不限于rBCG:Hly，以及最优选地是ure C-缺陷型BCG诸如BCG:rBCGΔureC:Hly及其衍生物，优于没有吞噬溶酶体逃逸肽的BCG，在这种程度上它们能够诱导对个体微生物诸如分枝杆菌特异的显著的CD8应答，并且另外，还诱导对本文公开的和/或定义的的生物活性剂代表或给出的抗原特异的显著的CD8应答。换句话说，在这一实施方案中，用作或者叫作本文的第一成分的微生物，即，其包括吞噬溶酶体逃逸肽，并且更优选地还是ureC阴性的，不限于引发微生物-特异的CD8免疫应答，这与本领域的技术人员预测的相反。
在一个优选的实施方案中，这样的吞噬溶酶体逃逸肽或多肽是L.monocytogenes的吞噬溶酶体逃逸多肽，李斯特菌溶胞素(Hly)。李斯特菌溶胞素是孔-形成的巯基活化的溶细胞素，并且负责将L.monocytogenes微生物从吞噬溶酶体空泡释放到宿主细胞的胞质中。这种逃逸作用可以转移到各种细菌细胞，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、减毒的沙门氏菌亚种(Salmonella ssp.)菌株以及分枝杆菌，如在国际专利申请PCT/EP2004/004345中所述。此外，国际专利申请WO 99/101496公开了分泌生物活性李斯特菌溶胞素融合蛋白的重组牛分枝杆菌。因此，形成按照本发明的组合物的第一成分的细菌细胞表现出孔形成机制，用于在内体膜上穿孔引起优异的免疫保护性。
本领域的技术人员应该意识到，存在一些吞噬溶酶体逃逸结构域，其中优选例如在US 5,733,151中所述的利斯特氏菌属吞噬溶酶体逃逸结构域。更优选地，所述吞噬溶酶体逃逸结构域来源于生物体L.monocytogenes，最优选地，所述吞噬溶酶体逃逸结构域由选自下列各项的核酸分子编码a)包括SEQ.ID.NO.1中所示的核苷酸211-1.722的核苷酸序列，b)编码与来自a)的序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列，和c)在严紧条件下与a)或b)的序列杂交的核苷酸序列。其中，可以用于这样的目的的其它吞噬溶酶体逃逸多肽为产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的溶血素(产气荚膜梭菌素)(O′Brien DK，等.Infect Immun.2004 Sep；72(9)5204-15)；弧菌(Vibrio)的溶血素，更特别地是创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的溶血素(Lee SE等.，Biochem BiophysRes Commun.2004 Nov 5；324(1)86-91)；B组链球菌(streptococcus)的溶血素/溶细胞素(Liu GY等.，Proc Natl Acad Sci USA.2004 Oct 5；101(40)14491-14496.Epub 2004 Sep 20)；杆菌的溶血素BL，更特别地是蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)的溶血素(Moravek M等.，FEMS Microbiol Lett.2004 Sep1；238(1)107-13)；博德特氏菌属(Bordetella)的溶血素，更特别地是百日咳博德特氏菌(Bordetella pertusis)的溶血素(Bassinet L等.，Infect Immun.2004 Sep；72(9)5530-3)；大肠杆菌(Escherichia coli)的溶血素(Wyborn NR等.，Microbiology.2004 May；150(Pt 5)1495-505)和志贺氏菌属的溶血素(Sharma K等.，Microbios.2001；106(413)31-8)。
除了SEQ ID No.1所述的核苷酸序列外，本发明还包括与其杂交的核酸序列。在本发明中，术语“杂交”如Sambrook等.(Molecular Cloning.A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，1.101-1.104)定义的那样应用。按照本发明，如果在用1 X SSC和0.1％SDS在55℃，优选地在62℃和更优选地在68℃洗涤1小时后，仍旧可以观察到阳性杂交信号，那么就使用术语“杂交”。在这样的洗涤条件下，与按照SEQ ID No.1的核苷酸序列杂交的序列是本发明优选的吞噬溶酶体逃逸结构域编码核苷酸序列。
如上文所述的编码吞噬溶酶体逃逸结构域的核苷酸序列可以直接获得于李斯特氏菌(Listeria)生物体或者任何重组资源，如含有相应的上文所述的利斯特氏菌核酸分子或其变体的重组大肠杆菌(E.coli)细胞。
应该意识到，对于按照本发明的组合物，包括至少一种编码吞噬溶酶体逃逸肽的重组核酸分子的这样的细菌细胞，并且更特别地是作为包括Hly的分枝杆菌细胞的这样的细菌细胞是特别优选的。在另一个优选的实施方案中，所述细菌细胞还是脲酶缺陷型的，更具体地是ureC缺陷型。这样的生物体还叫作BCG:rBCGΔureC:Hly或BKG。
尽管其功效还是可疑的，但是，分枝杆菌，并且更具体地是牛分枝杆菌卡介苗(BCG)已经广泛地用作预防结核病的可行性疫苗。然而，存在这样的统一意见，即，BCG可以保护以免受或者至少改善儿童全身性结核病的严重形式。
然而，已经开发了新型的BCG。本发明人发现，当与生物活性剂一起施用时，这些新型的BCG作为佐剂特别有效，并且因此可以用作按照本发明的组合的第一成分。
用作按照本发明的组合的第一成分的细菌细胞优选地是脲酶缺陷型的。由于脲酶缺陷，分枝杆菌细胞将不能在需要这样的酶活性的环境中诸如在吞噬溶酶体中存活，所以，这一特点导致增强的安全性。
脲酶缺陷性可以通过将编码脲酶亚基的一个或一些细胞核酸分子部分或者完全灭活而实现，特别是部分或者完全灭活编码脲酶亚基A的ureA，编码脲酶亚基B的ureB和/或编码脲酶亚基C的ureC。分枝杆菌特别是牛分枝杆菌和结核分枝杆菌中的ureA、ureB和ureC序列以及其所编码的蛋白由Reyrat等.(1995)和Clemens等.(1995)所述，其通过参考结合于此。
优选地，脲酶缺陷型细菌菌株通过在脲酶亚基-编码核酸序列和/或表达控制序列中删除和/或插入一个或一些核苷酸而获得。删除和/或插入可以通过同源重组、转座子插入或者其它适当方法而产生。
在一个特别优选的实施方案中，ureC序列被灭活，例如，通过构建含有被选择标记基因中断的ureC基因的自杀性载体，用所述载体转染靶点细胞，并且筛选具有脲酶阴性表型的选择标记阳性细胞进行，如Reyrat等.(同前所述)所述的那样。
按照本发明，可以将各种分枝杆菌物种用作形成按照本发明的组合物的第一成分的细菌细胞，即，牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌(M.microti)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、M.canettii、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)或偶发分枝杆菌(M.fortuitum)。可以应用展现出一种或两种前面提及的特征(即编码或表达吞噬溶酶体逃逸肽或多肽，并且是脲酶-阴性的，更优选地是ureC-阴性的)的其它微生物，优选地是胞内微生物，这也在本发明之内。
在另一个实施方案中，相应细菌细胞被减毒。在一个更优选的实施方案中，所述细菌细胞是减毒的，但是仍然是活的，并且更加特别适用于引发TH1反应。
在一个更优选的实施方案中，所述相应的细菌细胞是活的细菌细胞。
在另一个实施方案中，所述细菌细胞还包括至少一种编码能够在哺乳动物中引发免疫应答的肽或多肽的重组核酸分子。当用于本文时，术语“在哺乳动物中引发免疫应答”意指，当将这样的肽或多肽或其部分暴露于哺乳动物的免疫系统时，可以产生为B细胞介导的免疫应答的免疫应答。然而，备选地，所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答，更优选地是1类MHC-限制的CD8 T细胞应答。
更优选地，这样的肽或多肽选自包括自体抗原、肿瘤抗原、病毒抗原、寄生虫抗原、细菌抗原及其免疫原性片段的组。优选地，免疫原性片段是仍然能够引发免疫应答的这样的抗原的片段。一种特别优选的抗原是疟原虫的gp190/MSP1蛋白，如本文更详细地所述的那样。另一种特别优选的病毒抗原是本文更详细所述的HCMV的密体。另一种抗原是适于引发针对结核的免疫应答，并且更特别地是针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、M.canettii、非洲分枝杆菌和副结核分枝杆菌的免疫应答的抗原。一种特别优选的抗原是抗原85。在一个优选的实施方案中，这样的抗原是第二成分。
本领域的技术人员应该意识到，当涉及本文的抗原时，这一术语还包括其片段或突变形式。只要它这样的突变形式或片段表现出全长或野生型抗原的至少一种特征，那么，它的片段和突变形式就被视作相应的抗原。优选地，这样的特征是它引发免疫应答的能力，更优选地是当与本文所述的第一成分或佐剂组合在一起应用时引发免疫应答的能力。在一个甚至是更优选的实施方案中，这样的免疫应答是特异的CD8免疫应答。这还分别适用于多肽和蛋白。
本领域的技术人员还应该意识到，考虑到遗传密码的简并性或者考虑到使得所述序列适应各自宿主或生产生物体的密码子应用的需要，当分别提及核酸和编码多肽或蛋白的核酸时，术语还包括编码多肽或蛋白的那些核酸，其任选地是本文优选定义的其片段或突变形式。
术语多肽、蛋白或抗原来源于生物体优选地意指，相应的多肽、蛋白或抗原的氨基酸序列是相应生物体的多肽、蛋白或抗原，其中所述序列以及因此还有其相应的编码核酸可以是其片段或突变形式。
还应该意识到，所述能够在哺乳动物中引发免疫应答的肽或多肽可以是所述组合物的第二成分。所述肽或多肽是融合多肽的片段也是在本发明内。优选地，这样的融合多肽包括能够在哺乳动物中引发免疫应答的肽或多肽，或者其仍然具有这样的特性的结构域，并且所述融合多肽还包括吞噬溶酶体逃逸结构域，优选地与本发明第一成分的实施方案联系的上文所述的吞噬溶酶体逃逸结构域。如果这样的肽是细菌抗原，那么，能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽的结构域可以是来源于微生物，优选地来源于分枝杆菌属，并且更优选地来源于结核分枝杆菌或牛分枝杆菌。这一结构域具有至少6个优选地至少8个氨基酸的长度。所述免疫原性结构域优选地是天然分枝杆菌多肽的片段。然而，来源于天然免疫原性结构域的通过取代、删除和/或添加一个或一些氨基酸而修饰的免疫源性结构域也是在本发明范围内。在一个优选的实施方案中，所述结构域是疟原虫gp190/MSP1蛋白的结构域。
在一个实施方案中，融合蛋白由重组核酸分子，即，按照SEQ ID No.1的核酸分子编码。这一核酸分子包括信号肽编码序列，(核苷酸1-120)，编码免疫原性结构域的序列(核苷酸112-153)，肽接头编码序列(核苷酸154-210)，编码吞噬溶酶体结构域的序列(核苷酸211-1722)，另一个肽接头编码序列(核苷酸1723-1800)以及编码随机肽的序列(核苷酸1801-1870)。对应的氨基酸序列在SEQ ID No.2中显示。
在一个特别优选的实施方案中，更特别地当所述第一成分是rBCG:Hly或rBCGΔureC:Hly时，所述第二成分是生物活性剂，并且更具体地是一种遗传操作的细胞。优选地，所述遗传操作的细胞是真核细胞。更优选地，这样的遗传操作的细胞表达至少一种细胞因子。当用于本文时，细胞因子是一种影响其它细胞的行为和特征的分泌蛋白。优选的细胞因子是白介素、趋化因子、淋巴因子、单核因子和生长因子。特别优选的细胞因子是白介素和干扰素，其中优选的白介素是白介素-2、白介素-4、白介素-12，优选白介素-2，并且干扰素优选干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ，更优选地是干扰素-γ。
当优选地用于本文时，遗传操作的细胞是通过插入外源遗传物质对细胞中存在的遗传组成进行修饰的细胞。这样的遗传组成的修饰包括引入细胞中不存在的遗传物质，以便成为真正的外来核酸，或者激活一部分内源遗传物质，因而这样的内源遗传物质不存在或者是有活性的，而没有所述外源遗传物质存在，因而外源遗传物质不必是一种遗传物质，但是可以是这个范围内的任何活性物质。实现这样的修饰的方法在本领域内是公知的。例如，可以通过磷酸钙沉淀技术、病毒载体技术、电穿孔、脂质转染法、病毒载体系统诸如腺伴随病毒系统、显微注射或生物射弹方法，而将外源DNA物质引入到细胞中。这样的遗传操作的结果是所述遗传操作的细胞将能够表达以前不表达的某些基因产物。
本发明人已经发现，白介素，更具体地是白介素-2，和干扰素-γ，与作为按照本发明的组合物的第一成分而描述的细菌细胞组合共同表达，提供一种非常有效的方法来增加生物体的免疫应答，更具体地是TH1应答。具体的细胞可以选自多种细胞，诸如非专职抗原呈递细胞、专职抗原呈递细胞、肿瘤细胞和树突细胞。在这些细胞类型中，特别优选肿瘤细胞。当施用这样的肿瘤细胞时，已经引入这样的肿瘤细胞的癌症患者体会到对肿瘤接种方法的功效的增加的作用。优选地，用于这样的接种方法的细胞取自与要用按照本发明的组合物治疗的肿瘤相同的或相似的肿瘤实体。因此，其中使用国际专利申请WO 94/18995中所述的遗传操作的细胞的有益作用，还通过将所述细菌细胞用作形成按照本发明的组合的第一成分而增强。
下述属于本发明，即，所述专职抗原呈递细胞是一种树突细胞，然后其被用作本文所定义的生物活性剂，或者是所述生物活性剂的另一种成分，因而优选地在这样的实施方案中，所述生物活性剂是遗传操作的细胞，更优选地是本文所述的细胞因子表达细胞，其中所述细胞甚至更优选地同时表达两种细胞因子，并且最优选地是白介素-2和干扰素-γ。所述树突细胞优选地负荷肿瘤抗原，其中所述肿瘤是使用所述树突细胞治疗的一种肿瘤，优选地与本文所述的佐剂组合和/或以佐剂和生物活性剂诸如例如所述细胞因子共表达细胞的组合进行治疗。所述树突细胞的负荷是本领域的技术人员已知的，并且例如，在Vari和Hart((2004)，Cytotherapy6(2)111-121.)中得到描述。将这样的树突细胞，单独地或与本文所述的任何佐剂特别是BCG和BKG组合，或者与本文所述的第一和第二成分的任何组合，优选地用于治疗本文所述任何疾病。优选地这样的疾病是本文所述的任一种肿瘤疾病。
可以使用这种方法阐释的优选的肿瘤和癌症分别是具体的免疫原性肿瘤或癌症，其中诸如黑素瘤、肾癌、乳腺瘤、脑瘤、前列腺肿瘤、非小肺癌、结肠癌以及头颈鳞状肿瘤。
细胞因子的表达，并且更具体的是白介素-2和干扰素-γ的共表达允许通过所述遗传操作的细胞呈递的肿瘤抗原的增加的功效。抗肿瘤反应的提高由向相同方向运作的两种不同机制引起。在传入(afferent)方面，IFNγ分泌增加MHC和黏着分子在细胞表面的表达，这导致MHC I分子对针对CD8+T-细胞的肿瘤特异性抗原的更好的呈递，并且因此导致T细胞对肿瘤细胞的更好的识别。在传出(efferent)方面，在紧密接近肿瘤细胞处的IL-2分泌增加CD8+T-细胞的活性。在这种情况下，在一个优选的实施方案中，优选地所述表达至少一种细胞因子的遗传操作的细胞至少在某种程度上是涉及使用其用于治疗的肿瘤实体。当然，应该理解，在这种情况下可以应用其它细胞系，其中更优选地，除了如本文所述那样进行遗传操作外，所述细胞还表达要被这样治疗的肿瘤实体的某些抗原特征。
本领域的技术人员应该意识到，原则上所述遗传操作的细胞可以是自体同源的细胞。这意味着细胞取自要使用按照本发明的组合进行治疗的患者，因而所采集的细胞通常取自要被治疗的肿瘤，并且对所述细胞进行操作以成为本文所定义的遗传操作的细胞。随后，将这种细胞作为按照本发明的组合的部分再次施用给患者。
为了增加所述遗传操作的细胞的功效，这些细胞还表达另一种免疫分子。当用于本文时，免疫分子包括适于影响免疫系统的任何分子。其中，免疫分子包括细胞因子、黏着分子、共刺激性因子、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原和寄生虫抗原。
在另一个实施方案中，所述遗传操作的细胞是同种异基因的细胞。在一个优选的实施方案中，同种异基因细胞是源于相同物种然而并不是源于恰好同一个体的细胞。同种异基因细胞是来源于相同物种但是抗原性截然不同的细胞。在一个特别优选的实施方案中，所述同种异基因细胞与要治疗的肿瘤的各自细胞群相匹配。更优选地，所述匹配涉及到将一些或全部人淋巴细胞抗原(HLA)种类与要使用按照本发明的组合治疗的患者相关联。然而，可以应用不同程度的匹配。更具体地，所述匹配应该是I类HLA匹配。I类HLA包括亚类A、B和C。如果在用作按照本发明的组合物的第二成分的细胞和组成要使用所述组合物治疗的患者的肿瘤的细胞之间存在匹配，那么将给出I类HLA匹配。
应该意识到，所述匹配以及需要的这样的匹配的程度是在本领域的普通技术人员的技能范围内。一种可能的实验方法是用不同程度的匹配接种不同组的动物/患者，并且然后用肿瘤刺激以检验效果。备选地，检测可以直接对肿瘤患者进行。
一种特别优选的细胞系是LNCaP，其同时表达白介素-2和干扰素-γ，并且其被用作与按照本发明的组合联系的第二成分，更具体地，用于治疗前列腺癌，其中所述第一成分是rBCG:Hly或rBCGΔureC:Hly。
在另一个实施方案中，所述生物活性剂是寄生虫抗原，更具体地是疟原虫的gp190/MSP1蛋白。优选地，所述相应抗原来源于恶性疟原虫。优选地，所述相应抗原来源于疟原虫MSP-1蛋白的氨基酸序列，优选地来源于恶性疟原虫MSP-1蛋白的氨基酸序列。当用于本文时，术语寄生虫抗原意指全长抗原以及其片段，只要它们适于引发免疫应答，更优选地是TH1应答或TH1介导的应答，优选地在哺乳动物中引发，甚至更优选地与按照本发明的组合物相联系，其中所述第一成分更优选地分别是rBCG:Hly和rBCGΔureC:Hly。
这一实施方案在治疗疟疾中特别有用。
在本发明范围内，这样的寄生虫抗原可以由作为按照本发明的组合的第一成分的细菌细胞表达，或者由作为按照本发明的组合物的第二成分的真核细胞表达。然而，也在本发明范围内的是，所述寄生虫抗原由这样的细菌细胞表达，即，其包括由本发明的许多实施方案详细说明的至少一种编码吞噬溶酶体逃逸肽或多肽的重组核酸分子。
应该意识到，gp190/MSP由一些天然存在的结构域组成，并且意识到，单独的或组合的这样的结构域可以是本文优选应用的寄生虫抗原。gp190/MSP1暂时被视作针对疟疾的疫苗的潜在候选。然而，它的制备被视作是极端费力的，不允许这一抗原的大规模生产。考虑到这一点，潜在疟疾疫苗还没有实现可用。然而，基于国际专利申请WO 98/14583的技术教导，现在这种疟原虫抗原可以实现大量的可用。应该意识到，这样的寄生虫抗原不限于gp190/MSP1抗原，还包括在除恶性疟原虫之外的其它疟原虫物种如间日疟原虫(P.vivax)中发现的其同源染色体。所述国际专利申请的技术教导通过参考结合于此，并且允许本领域的技术人员制备这种抗原需要的任意量，以便将其作为第二成分结合到按照本发明的组合物中。例如，DNA疫苗在Grode L，Mollenkopf HJ，Mattow J，Stein M，MannP，Knapp B，Ulmer J，Kaufmann SH.Application of mycobacterial proteomicsto vaccine designimproved protection by Mycobacterium bovis BCGprime-Rv3407 DNA boost vaccination against tuberculosis.Infect Immun.2004 Nov；72(11)6471-9中得到描述。
在另一个实施方案中，所述生物活性剂是少量或一组病毒抗体或者病毒颗粒的群体，其优选地在人巨细胞病毒(HCMV)感染哺乳动物细胞后释放，其中所述颗粒(a)被脂膜包围，病毒糖蛋白内含在脂膜中，并且(b)不含有病毒DNA，也不含壳体，或者是密体，优选地是人巨细胞病毒的密体。这样的颗粒将在本文中更详细地描述，其优选地用于预防和/或治疗人巨细胞病毒的感染，所述人巨细胞病毒为β-疱疹病毒。可以使用按照本发明这一方面的组合进行治疗的一组特别相关的受试者是不得不进行骨髓移植的患者。
在免疫活性个体中，HCMV感染通常是不被注意的，其具有至多是轻微的和非特异性的症状。相反，在某些危险组中，例如，在免疫抑制性患者如AIDS患者或移植受体，以及在产前感染后，HCMV感染具有严重的表现，因此，这组成了可以使用佐剂和所述相应颗粒组合进行治疗的另一组患者。
按照国际专利申请PCT/EP 00/01794的技术教导，已经证明，所谓的HCMV密体有效地诱导免疫应答，并且最后诱导针对HCMV感染的免疫保护。在这种情况下，所述密体提供中和抗体的长期持续诱导，所述中和抗体以菌株重叠方式保护免受HCMV感染。这通过有效诱导针对HCMV的所谓的“辅助细胞反应”(CD4-阳性T淋巴细胞)而提供，以辅助抗体-分泌性B-淋巴细胞的成熟。另外，所述密体适于诱导针对HCMV的细胞毒性T细胞的形成，其中这种类型的淋巴细胞对于终止HCMV感染是至关重要的，其发生并且限制所述病毒在机体内的扩散。最后，这样的密体适合将疫苗的副作用减至最小。
密体由HCMV感染而诱导，并且释放到被感染的初级人成纤维细胞培养物的培养基中。它们是在电子显微镜下可见的结构，并且其大于90％的蛋白质体由pp65组成。它们与现有的病毒颗粒相当，即，所述病毒颗粒具有通过病毒糖蛋白修饰的细胞脂膜，并且从细胞释放出来。所述病毒糖蛋白在这一包膜中很可能是天然构象。由于密体不含病毒DNA也不含病毒壳体，所以它们是非感染性的。它们可以通过已确定的方法从细胞培养物的上层清液浓缩。使用这样的密体，特别是与本文所述的佐剂组合使用，可以实现预防性以及治疗性疫苗应用。
密体由脂膜围绕，其使得可能将所述颗粒融合到特定的哺乳动物细胞上，以便它们的内容物进入所述细胞的细胞质中。所述颗粒的膜含有代表病毒-中和抗体的主要抗原的病毒糖蛋白。此外，所述颗粒特征在于，它们不含病毒DNA也不含壳体。另外，它们含有病毒T-细胞抗原pp65(ppUL83)，其刺激T-辅助细胞的形成，并且是诱导针对HCMV的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的主要抗原。
这些特性，特别是能够诱导中和抗体和充分的细胞应答的抗原的组合，使得所述颗粒适于用作针对HCMV的疫苗。
此外，不考虑施用的途径，密体诱导Th1类型的T-辅助细胞应答，这使得它们有资格用作针对HCMV的疫苗。
在另一个实施方案中，描述了含有融合蛋白的密体或相应颗粒，其中所述融合蛋白一方面包括病毒T-细胞抗原pp65(ppUL83)或蛋白的一个或多个片段，另一方面包括一种或多种其它蛋白的一个或多个片段。
由于这种融合蛋白在所述颗粒中大量存在，所以，这使得可以将所述颗粒的抗原性最优化。另外，已知细胞和体液免疫应答的抗原在一个分子中的表达可以显著地增加抗原性。Pp65和其它蛋白的多个片段可以直接融合在一起，但是，例如，还可能在各个片段之间存在4个接头序列，所述接头序列并不是所包含的蛋白之一的天然成分。由于为了影响所述抗原的特性而有意克隆或者结合，所以可以出现这种类型的序列。然而，所述融合蛋白优选地不含不是融合部分之一的成分的外源序列。在这样的实施方案中，所述融合蛋白由pp65的一个或多个片段以及一种或多种其它蛋白的一个或多个片段组成。
完整的pp65或其一个或多个片段可以存在于融合蛋白中，这适用于下文提及的所有实施方案。为了本申请的目的，陈述“pp65(组成)的融合蛋白”不应该理解成限于完整的pp65。融合蛋白中存在的蛋白的“片段”或“部分”包括至少6个，优选地至少8个，最优选地至少9，15或20个衍生得到其的蛋白的连续氨基酸。
一个优选的实施方案包括pp65(ppUL83)和病毒糖蛋白gB或gH的一个或多个中和表位的融合蛋白。这种类型的颗粒可以按照国际专利申请PCT/EP 00/01794所述而产生。通过抗原-特异性的吸收，所述融合蛋白可以进入糖蛋白-特异性B细胞，其在II类MHC情形中又能够呈递糖蛋白和pp65的表位。另外，在II类MHC情形中也可以通过专职抗原-呈递细胞(APC)呈递部分所述融合蛋白。在这两种情形中，结果是针对pp65和针对病毒糖蛋白的TH反应的有效刺激。这些TH细胞能够刺激糖蛋白-特异性B细胞，其在II类MHC情形中呈递pp65和病毒糖蛋白的肽，以形成同源和异源的中和抗体。另外，如同感染性病毒体，这种类型的颗粒可以被吸收到细胞中，并且可以通过外源负荷到I类MHC途径而引入pp65肽。不同于死的疫苗，这实现针对HCMV的CTL应答的刺激。
在另一个优选的实施方案中，所述颗粒含有融合蛋白，所述融合蛋白由pp65和HCMV的另一种蛋白IE1蛋白(ppUL123)的一个或多个片段组成。特别地，要被呈递的IE1蛋白的片段是在天然感染过程中在人中针对其形成细胞毒性T细胞的那些片段。在一些情形中，IE1蛋白的肽通过除pp65肽之外的不同I类MHC分子呈递。IE1的这样的其它“CTL”表位的加入意欲保证，在免疫后，表达不同I类MHC分子的接种的受试者能够以一种尽可能全面的方式产生针对HCMV的CTL。
在另一个优选的实施方案中，所述颗粒含有这样的融合蛋白，即，其由pp65、HCMV糖蛋白的一个或多个中和表位以及IE1的一个或多个CTL表位组成。pp65与中和表位和CTL表位的融合意欲保证，对于由接种的受试者以尽可能全面的方式(即，通过在I类MHC模式上不同的人的最大数目)同时形成中和抗体和CTL。
在另一个优选的实施方案中，所述颗粒含有pp65和另一种人病原体的一个或多个表位的融合蛋白。适当部分的其它人病原体是在人中针对其形成中和抗体的抗原。与使用分离的“中和一种抗原”相比，可以通过将这样的“中和抗原”与T-细胞抗原pp65融合而预测免疫应答(抗体应答)的显著增加。应该提及的这样的“中和抗原”的实例是下列各项的表面蛋白乙型肝炎病毒(从HBsAG区域)、丙型肝炎病毒(例如E2)、人免疫缺陷病毒(HIV，从Env区域)、流感病毒(血凝素、神经氨酸酶、核蛋白)或其它病毒病原体。其它适宜的人病原体是细菌，诸如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、百日咳博德特氏菌、结核分枝杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)及其它。最后，来自真核病原体如疟原虫(疟疾)的抗原可以与pp65融合。
在另一个优选的实施方案中，所述颗粒含有pp65与其它病原体蛋白的一个或多个片段的融合蛋白，当天然感染这些病原体时，在人中针对所述病原体产生CTL。可以提及的这样的CTL表位的实例是下列各项的蛋白片段HIV-1、HBV、HCV或流感病毒。这样的流程的目的是在人中利用密体的独特免疫原性特性来产生针对异源病原体的保护性CTL。
在另一个优选的实施方案中，所述颗粒含有这样的融合蛋白，即，其由pp65、异源病原体的一个或多个中和表位以及同一病原体的一个或多个CTL表位组成。这种融合意欲保证接种的受试者能够形成针对这一病原体的保护性抗体和CTL。
另外，本发明涉及包含至少两种不同的糖蛋白的病毒颗粒，其中所述糖蛋白为来自不同HCMV毒株的相同糖蛋白的变体。
一个优选的实施方案恰好包含两种变体，一种变体对应HCMV Towne毒株，和另一种变体对应HCMV Ad169毒株。所述优选的实施方案包含Towne毒株和Ad169毒株的糖蛋白gB。
在被感染的细胞中，这两种蛋白可以以相同的效率结合到重组密体的膜上。这样的重组密体适合诱导针对这两种原型HCMV毒株的不仅是毒株-重叠性而且是毒株-特异性的中和免疫应答。
最后，本发明还涉及一种方法，通过这种方法制备完全没有感染性病毒的病毒颗粒。当优选地用于本文时，术语没有感染性病毒意指，在检测水平上，这样获得的制剂是非-感染性的。如果颗粒是从已经感染了HCMV的细胞群体产生的，那么，在纯化所述颗粒的过程中，将存在一直携带感染性病毒颗粒的危险。这代表了疫苗的一种缺点。
本发明的方法将这种危险最小化。为了这一目的，最初产生一种携带重要基因的缺失的HCMV毒株。这意味着所述基因功能的缺失。在大多数情形中，这基于功能基因产物的不存在，但是也可能以使得HCMV不再存活的方法方式扰乱调控基因序列的功能。这可以通过改变HCMV的核酸序列而发生，例如，通过点突变、实际删除、插入或者其它突变而发生。这种缺陷型病毒只可以在表达在HCMV中已经被删除的基因的细胞中复制，并且因此，使得病毒体的组装可行。目前，初级成纤维细胞代表用于HCMV体外复制的唯一合理允许的系统。到目前为止，只在反转录转移方法的辅助下，这样的细胞的稳定转染已经成为可能。然而，如果使用这样的细胞来产生疫苗，那么这是一个严重的缺点。本发明的方法可以获得稳定转染的细胞，其可以不用反转录基因转移但是在其中也可以复制HCMV而产生。
一个优选的实施方案包括已经稳定转染了主要壳体蛋白基因UL86的人包皮成纤维细胞。所述转染优选地在引起非常高的转染效率的包含脂质的辅助下进行。在一个优选实施方案中，将可以从Roche Diagnostics，Mannheim购买的“Fugene试剂”用于转染。
其主要壳体蛋白基因UL86已经被删除的缺陷型病毒可以在这些细胞中复制。如果“非互补性”成纤维细胞感染了这种缺陷型病毒，那么可以从其中分离没有感染性病毒颗粒的病毒疫苗颗粒。
生产本发明没有感染危险的颗粒的另一种可能是在没有感染HCMV的细胞中重组所述颗粒。为了这一目的，编码所述颗粒成分的所有基因必须在这些细胞中进行表达。为了这一目的，这些基因必须插入到所述细胞中。
对于这一目的，优选使用被杆状病毒感染的昆虫细胞。将编码所述颗粒的多肽成分的基因克隆到杆状病毒表达载体中。重组杆状病毒产生后，通过各种病毒共感染昆虫细胞，优选地感染Sf9细胞。所述基因在昆虫细胞中表达，并且得到的多肽组合给出需要的颗粒。最后，昆虫细胞释放所述颗粒。这代表产生可以用作疫苗的非感染性颗粒的一种可能性。
一种备选的可能是在HCMV主要IE启动子/增强子(MIEP)的控制下，将重建密体必需的成分克隆到重组杆状病毒中。已表明，重组杆状病毒能够感染更高等的真核细胞，诸如例如，哺乳动物细胞，并且在强真核启动子诸如MIEP的控制下，外来基因在这样的细胞中强烈地表达。这样的方法的优点在于，密体抗原性蛋白的任何重要的修饰，诸如糖基化，可以以比在昆虫细胞中更自然的方式发生在哺乳动物细胞中。另外，存在许多这样的已经核准用于疫苗生产的细胞系。
在另一个实施方案中，所述生物活性剂是一种抗原呈递细胞，其中这样的抗原呈递细胞呈递适于引发针对结核的免疫应答的抗原，并且更具体地适于引发针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、M.canettii、非洲分枝杆菌和副结核分枝杆菌的免疫应答的抗原。在一个优选的实施方案中，所述抗原呈递细胞是微生物，更具体地是选自包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、M.canettii、非洲分枝杆菌和副结核分枝杆菌的的组的微生物。包括细菌细胞作为第一成分以及这样的抗原呈递细胞或这样的抗原本身作为第二成分或作为生物活性剂的按照本发明的组合，可以优选地用于预防和/或治疗结核病。优选地所述抗原是抗原85。
在本发明范围内的是，以本文公开的各种形式的按照本发明的组合物的第一成分，以及特别是在其各种实施方案如rBCG:Hly和rBCGΔureC:Hly中具有吞噬溶酶体逃逸结构域的微生物，其发挥作用，并且因此可以用作佐剂，这意味着它是增强要被治疗或者需要治疗的患者的免疫状态的原因，更优选地，所述免疫状态是关于TH1的，并且甚至更优选地所述免疫状态特征在于TH1应答的增加，因而与未治疗的个体相比较，这样的TH1应答增加了。
当在本文中公开时，由于它是提供患者的特异性生物、生化、生理或医学反应的试剂，在这种情况下，所述第二成分优选地在物理上与第一成分不同，或者在物理上与第一成分分离。第一和第二成分在物理上分离的事实允许所述两种成分的独立的或分别的施用。如果所述生物活性剂是表达细胞因子的遗传操作的细胞，并且更优选地这样的细胞是癌症细胞，那么，所述特异性免疫应答是针对由这样遗传操作的细胞而引入的抗原的。然而，必须意识到，由于它们的作用模式，如同由所述第一成分已经提供的那样，所述细胞因子提供全面有利的作用，这也可以被视为佐剂作用。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括按照本发明的组合，并且任选地包括药用载体、稀释剂或佐剂或其它赋形剂。优选地，这样的载体、稀释剂、佐剂和赋形剂是惰性的，并且是无毒的。在它的各种实施方案中，所述药物组合物适于以各种方式施用。这样的施用包括全身性的和局部施用，以及口服、皮下、肠胃外、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、intrategral以及眼内施用。一种优选的药物组合物是含有所述第一和第二成分的水性或生理缓冲液。
本领域的技术人员应该意识到，要施用的药物组合物的量取决于个体患者的临床状况、施用的位点和方法、施用的时间安排、患者年龄、性别、体重以及执业医生所知的其它因素。因此，用于预防和/或治疗目的的药物有效用量由医学领域中已知的考虑而确定。优选地，所述用量有效获得这样的改善，其包括但不限于改善疾病状况，或者提供更快的康复，改善或者消除症状以及被医学领域的技术人员选作适当的测定的其它指示。
在一个优选的实施方案中，按照本发明的药物组合物可以包括其它药物活性化合物。
优选地配制所述药物组合物，以提供单剂量施用或者多剂量施用。
在一个实施方案中，所述第一成分和第二成分本身或者作为药物组合物的部分或者作为药物组合物而同时提供，作为单一的制剂或者分别作为独立的制剂。在独立制剂的情形中，第一制剂含有第一成分，并且第二制剂含有第二成分。在优选实施方案中，所述第一和所述第二制剂分别配制成本文所述的任何药物制剂。
也在本发明范围内，分别独立地施用所述第一和第二成分。优选地，第一和第二成分之间的时间差异分别为大约1小时或小于1小时，优选地约30分钟或更少，并且更优选地大约15分钟或更少。
应该意识到，也在本发明范围内的是，所述第一或第二成分或者两种成分可以以本文所述的多种形式用于预防本文所述的任何疾病。
本发明将通过参考附图和实例而进一步举例说明，本发明的其它特点、实施方案和优点可以取自所述附图和实例，其中
图1显示与对照相比，当组合施用BKG和疫苗时，描述表示为CD8+Tet+T细胞的免疫应答的图表；图2-4显示预防性肿瘤接种的免疫方案；图5-7显示用于治疗性肿瘤接种的免疫方案；和图8和9是描述当使用不同肽刺激时，不同免疫方案对IFN-γ阳性CD8 T细胞数目的影响的图表。
实施例1使用BKG作为肿瘤疫苗的佐剂。
在这一实施例中，描述确定BKG作为肿瘤疫苗的佐剂的适合性的实验。当在本文提及时，BKG表达来自单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)(Hly)的吞噬溶酶体逃逸肽，并且还是ureC缺陷型的。这样修饰的BCG在本文也叫作rBCG:ΔureC:Hly。
基本地，患者和动物模型分别必须通过标准接种流程进行接种，所述标准接种流程也叫作致敏增强流程。随后，将动物置于肿瘤刺激下。在这样的条件下，在肿瘤刺激后，具有BKG/肿瘤细胞接种的动物将不会发展肿瘤，或者可以比接受肿瘤接种但是没有BKG作佐剂的动物更久地抵抗肿瘤刺激。与接受肿瘤接种但是没有BKG作佐剂的患者相比，具有BKG/肿瘤细胞接种的患者可以更久地抵抗他们的肿瘤。
如果没有相反地指明，使用下列材料和方法细胞使用下列细胞系J558mOVA(表达OVA并且将其结合在细胞膜上的J558-细胞)，J558sOVA(表达OVA并且将其分泌到环境中的J558-细胞)和EL-4OVA(表达OVA的EL-4-细胞)。开始将细胞培养物保持在G418-压力下14天。支原体检测是阴性的。在初始传代增加细胞数目后，将3种细胞系以10×106的分量用DMSO冷冻，并且在第一次用于动物之前在液N2中保存至少7天。
细菌将所用的细菌标记BKG(rBCGΔureC:Hly)；也叫作“BKG”。BKG生长在7H9完全培养基中，并且在10％甘油/PBS中冷冻。所述细菌可以被解冻和再冷冻一次(但是只在没有之前的稀释时再冷冻)。
对于初级接种和接着的2次增强-接种，将19,3μl＝1×106BKG注射到小鼠中。
疫苗制备将冷冻的细胞解冻，并且在无菌DMEM培养基中洗涤两次。随后，将细胞重悬在无菌DMEM中并且计数。总的注射体积是100μl(按照Tabelle 1制备)。在注射之前，将细胞在无菌注射器中辐射(150 Gy γ辐射)。体外对照在辐射之前和辐射之后，分别从解冻的细胞每种细胞系移出一等分，并且放到细胞培养物中。这些对照表明解冻后(未辐射的细胞)良好的复苏，并且在辐射后多于14天没有细胞增殖。
小鼠C57/B6雌鼠，12周龄(在6周龄分送，并且在检测实验室中饲养6周)；s.c.接种100μl；25G针头；尾巴底部；7天后，在常规麻醉下，取出0,3ml血液用于免疫监测(OVA的四聚体)。小鼠的使用得到各自的权威的公认。
BKG exp.#1的时间表第0天 初级接种(致敏)第7天 第一次血液收集第28天第一次增强接种(1st增强)第35天第二次血液收集第53天第二次增强接种(2st增强)第60天第三次血液收集第74天肿瘤刺激将所用小鼠分成2个实验组和1个对照组●疫苗组加BKG(n＝9)亚组#1.1，#1.3和#1.5(见表1)●疫苗组减BKG(n＝9)亚组#1.2，#1.4和#1.6●对照组(n＝2) 亚组#1.7表1亚组和注射的疫苗
笼养动物S2-条件，IVC-笼，2笼；3-4天时间间隔更换。
FACS分析
进行FACS-运行，以便以不知情的方式检测SIINFEKEL-特异性T细胞的数量。在将细胞成分分类之后，将血浆冷冻，并且保存在-80℃以备进一步的评估。
体外实验的平行细胞培养物 产生用于接种和肿瘤刺激的细胞在动物实验内使用细胞的体外对照在FACS实验中用作对照的细胞的细胞培养物，产生四聚体载体学 为IL-2、IFNγ和OVA重组设计载体(SINvector)。这一载体用来产生与LNCaP-IL-2-IFNγ细胞相对应的小鼠肿瘤细胞系。
结果图1中描述的免疫学监测的第一结果表明存在这样的趋向，即，在具有BKG作为佐剂的小鼠组中比没有佐剂的动物组有更高数量的T细胞能够识别OVA-肽。这说明BKG是肿瘤接种的佐剂，其增强针对所述疫苗的免疫反应。
实施例2最优化使用BKG的肿瘤接种治疗方案下述是用于将实施例1列出的治疗观念的施用方案最优化的流程，以便允许本领域的技术人员将本文公开的基本治疗方案最优化。如果没有相反指明，材料和方法同上述实施例1所列出的一样。
方案1使用表达IL-2、IFNγ和卵清蛋白的稳定的三重-转染的J558(H2Kb)细胞系，将3种不同剂量的这些细胞注射到小鼠(C57 BL/6(H2Kb))中，即5×106个细胞，10×106个细胞和15×106个细胞。对于每一剂量，小鼠组由5只动物组成，并且它们的注射方案如下致敏免疫和每30天的3次增强；其中注射有或无BKG(1×106CFU)而发生。对动物进行免疫学检验，检验它们是否表现出卵清蛋白-特异的免疫应答，并且特别地是否表现出由BKG介导的免疫应答的增加。
方案2这一试验由一系列预备实验(“预备实验1-7”)和4个主要实验(“实验1-4”)组成。
预备实验1有或无BKG作为佐剂，接种肿瘤的剂量发现。
将总共14组小鼠(每组由5只小鼠组成)(C57 BL/6(H2Kb))用增加剂量的接种肿瘤免疫(14组中每2组接受相同剂量的接种肿瘤)。所述接种肿瘤由辐射的表达卵清蛋白的同种异基因J558肿瘤细胞(H2Kb)组成，其通过s.c.注射。在7组中，将肿瘤细胞与剂量为1×106CFU的BKG一起注射。一周以及5，9和13周后，从动物采取0.5ml血液，并且通过ELISA、细胞内细胞因子染色或四聚体染色方法检测卵清蛋白-特异的免疫反应。使用总共7种有或无BKG的不同的接种肿瘤细胞剂量。所述剂量分别为0,1×106，0,5×106，1,0×106，5,0×106，10,0×106，50,0×106，100×106，其中与人类临床试验相对应使用具有10×106-300×106个细胞的优选范围的剂量。在总共2个对照组中的小鼠不接受接种肿瘤。一个对照组接受BKG注射。
预备实验2检测肿瘤B16OVA黑素瘤的剂量发现在这一试验中，4组小鼠(C57 BL/6(H2Kb))接受增加剂量的检测肿瘤(B16OVA黑素瘤s.c.)。监测肿瘤的生长到肿瘤体积达到2cm。一旦达到这一肿瘤体积，将小鼠处死，收集和保持血液和肿瘤物质用于体外分析。如果不存在肿瘤生长，12周后将小鼠处死。同样，每组由5只小鼠组成，其中使用4种不同的检测肿瘤细胞剂量，即1,0×106个细胞，5,0×106，10,0×106和50,0×106个细胞。
预备实验3确定佐剂剂量基于在预备实验1中确定的剂量，变化BKG的剂量，其中佐剂的剂量与用于预备实验1的剂量相比，以10，100和1000以及0,1，0,01和0,001的系数而变化。在1周以及5，9和13周后，从动物采集0.5ml血液，并且通过ELISA、细胞内细胞因子染色或四聚体染色方法而检测卵清蛋白-特异的免疫反应。
预备实验4关于施用模式的研究在预备实验1中确定的接种肿瘤细胞的剂量和在预备实验3中确定的BKG的剂量随着施用模式而变化。施用模式为静脉内、皮内、腹膜内和身体同侧的s.c.。对于每种施用模式，BKG的剂量是预备实验3中定义的剂量的1倍，0.1倍或0.01倍。本文所检测的施用模式类似于用于人的潜在的临床应用，并且随着最先与佐剂接触的免疫系统的compartment而不同。在1周以及5，9和13周后，从动物采集0.5ml血液，并且通过ELISA、细胞内细胞因子染色或四聚体染色方法而检测卵清蛋白-特异的免疫反应。
预备实验5关于免疫方案的研究使用在预备实验1中确定的接种肿瘤细胞的剂量和在预备实验3中确定的BKG剂量，检验下述免疫方案1.免疫方案1 单次同时注射接种肿瘤和佐剂(对照组)2.免疫方案2 本方案与一些疾病如麻疹的预防性免疫相对应，其中有3次基本的免疫和1次增强，其中所述基本免疫在开始时、2周和4周后进行，并且再过6周后施行增强。
3.免疫方案3 本方案与证明对于治疗性接种是重要的方案相对应，所述治疗性接种以不同的接种时间间隔与疫苗的当前应用一起使用。更具体地，可以确定下列3种亚方案。
免疫方案3a 每3周接种(在12周后进行最后的血液取样并处死)；免疫方案3b 每6周接种(在25周后进行最后的血液取样并处死)；免疫方案3c 每12周接种(在43周后进行最后的血液取样并处死)。
重复所有3种免疫方案，其中佐剂BKG的剂量为在预备实验3中确定的剂量，或者所述剂量的10倍或0.1倍。
预备实验6有或无BKG的接种肿瘤(TRAMP)的剂量发现将总共12组TRAMP小鼠(Jackson Laboratory Lines Nos.003135)接种0.1倍，1倍和10倍剂量的文献中定义的TRAMP-C1接种肿瘤细胞(5×106个细胞)。所述接种肿瘤细胞没有任何遗传修饰(wtTRAMP)而进行使用，或者作为IL-2/IFNγ转染细胞进行使用。使用5×105，5×106和5×107个TRAMP细胞，对小鼠进行s.c.免疫。6组接受作为活性佐剂的1×106CFUBKG以及肿瘤细胞。免疫后1周和之后每6周后，取样0.5ml血液，并且通过ELISA、细胞内细胞因子染色或四聚体染色而确定TRAMP-C1-特异的免疫反应。为了监测疾病的进展，每12周进行CT。为了避免不必要的折磨，在32-35周龄，将患有无影响的(uneffected)前列腺癌疾病的TRAMP小鼠处死。为了研究由于接种是否可以观察到疾病进展的变化，小鼠应该观察到第40周。
预备实验7关于佐剂剂量的研究在预备实验6中确定的接种肿瘤细胞的剂量随着BKG剂量而变化(在预备实验6中确定的BKG剂量的0.1倍、1倍和10倍)。与预备实验6相似，检测了wtTRAMP-C1和遗传加工的IL-2/IFNγ-TRAMP-C1细胞。免疫后1周和随后的每6周，从动物采集0.5ml血液样品，并且通过ELISA、细胞内细胞因子染色或四聚体染色而确定TRAMP-C1特异的免疫反应。每12周进行一次CT，以便监测疾病的进展。在第40周进行最后的血液取样和处死。
实验1使用卵清蛋白系统的预防性肿瘤接种以在预备实验1确定的剂量，将C57BL/6小鼠(H2Kb)用接种肿瘤细胞，即，辐射的卵清蛋白-表达同种异基因J558肿瘤细胞(H2Kb)进行免疫。一些动物接受活性佐剂BKG(在预备实验3中确定的剂量)和接种肿瘤。一周后，从动物采集0.5ml血液样品，并且通过ELISA、细胞内细胞因子染色或四聚体染色而确定卵清蛋白特异的免疫反应。再过4周后，通过使用与预备实验2中确定的剂量相应的肿瘤细胞剂量，s.c.注射表达卵清蛋白的B16肿瘤细胞并且规律地控制肿瘤生长的方法，而确定免疫系统针对活的肿瘤细胞的反应性。
另外，将BKG对肿瘤-特异性免疫反应增加的影响与野生型BCG细菌相比较。作为一种施用模式，在预备实验4中确定的最佳模式与在预备实验5中确定的2种最优免疫方案组合应用，所述最优免疫方案包括最佳致敏增强方案和最佳连续应用方案。
实验2使用卵清蛋白系统的治疗性肿瘤接种与在实验1中报道的预防性肿瘤免疫相反，使用在预备实验2中确定的剂量，通过s.c.注射未辐射的检测肿瘤细胞，而在C57BL/6小鼠(H2Kb)中生成肿瘤生长。一旦肿瘤具有0.5cm的直径，检测实验1中描述的接种方案。当肿瘤达到2cm的直径时，停止检测。然而，动物监测持续最多1年。为了反映发生的免疫学过程，每4周从小鼠采样0.5ml血液，以确定实验1中定义的免疫应答。
实验3预防性肿瘤接种(TRAMP)在第6到第7周，TRAMP小鼠首次表现出上皮内瘤形成，从第15周开始表现出显著的前列腺癌临床图片。开始时，这样的前列腺癌是局部限制性的，但是从第24周开始，大约10％的动物发生了转移，并且从第32-35周开始，可以预计严重的疾病病况。预防性肿瘤接种从第5周开始。使用无佐剂和有佐剂的接种肿瘤细胞的单次注射。致死性辐射的TRAMP-C1细胞用作接种肿瘤细胞，其是来源于TRAMP小鼠的前列腺癌细胞系。接种肿瘤细胞没有进行遗传加工(wtTRAMP)而应用或者作为IL-2/IFNγ-转染的细胞而应用。另外，检测预备实验中确定的两种最佳免疫方案(致敏增强方案和长期方案)。为了控制Pca发展，每12周动物应该进行CT。可以确定下列各组HV3.1没有接种(对照组)HV3.2只s.c.接种肿瘤(wtTRAMP-C1细胞)
HV3.3s.c.BKG疫苗(wtTRAMP-C1细胞+BKG)HV3.4s.c.BCG疫苗(wtTRAMP-C1细胞+BCG)HV3.5只有接种肿瘤(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV3.6BKG疫苗(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV3.7BCG疫苗(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV3.8只有接种肿瘤(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫HV3.9BKG疫苗(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫HV3.10 BCG疫苗(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫HV3.11 只s.c.接种肿瘤(IL2/IFNγ-TRAMP-C1细胞)HV3.12 s.c.BKG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP-C1细胞+BKG)HV3.13 s.c.BCG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP-C1细胞+BCG)HV3.14 只有接种肿瘤(IL2/IFNγ-TRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV3.15 BKG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV3.16 BCG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV3.17 只有接种肿瘤(IL2/IFN γ-TRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫HV3.18 BKG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫HV3.19 BCG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫组HV3.2-HV3.4和HV3.11-HV3.13的免疫方案如图2所述，数字代表1小鼠的出生；第-5周2接种；时间0(5周龄的小鼠)31周后血液取样47周后血液取样
513周后血液取样和CT619周后血液取样725周后血液取样和CT831周后血液取样937周后血液取样和CT1040周后血液取样和小鼠的处死组HV3.5-HV3.7和HV3.14-HV3.16的免疫方案如图3所述，数字代表1小鼠的出生；第-2周2接种；时间0(致敏I)31周后血液取样42周后接种(致敏II)54周后接种(致敏III)(在6周龄)65周后血液取样710周后接种(增强接种)(在12周龄)8增强接种后1周血液取样和CT9增强接种后7周血液取样10增强接种后13周血液取样和CT11增强接种后19周血液取样12增强接种后25周血液取样和CT13增强接种后28周血液取样(在40周龄)和小鼠的处死组HV3.8-HV3.10和HV3.17-HV3.19的免疫方案如图4所述，数字代表1小鼠的出生；第-2周2第1次接种；时间031周后血液取样46周后第2次接种(接种的时间间隔在预备实验5中确定)51周后血液取样
612*周后第3次接种71周后血液取样和CT818*周后第4次接种91周后血液取样1024*周后第5次接种111周后血液取样和CT1230*周后第6次接种131周后血液取样146周后血液取样1540周后血液取样和小鼠的处死*接种的时间间隔取决于预备实验5的结果实验4治疗性肿瘤接种(TRAMP)在15周龄，所有的TRAMP小鼠发展了前列腺肿瘤，其在第32周完全发展并且对动物引起临床问题。因此，动物应该在第24周进行免疫。一旦实现一条终止标准，就停止实验。最多动物应该监测40周。为了监测免疫学过程，每6周从小鼠采集0.5ml血样，并且每12周，联系实验1所述研究免疫应答，并且使用成像方法，诸如CT。使用与联系实验3所述的相同的肿瘤细胞。
检测了下列各组。
HV4.1 没有接种(对照组)HV4.2 只s.c.接种肿瘤(wtTRAMP-C1细胞)HV4.3 s.c.BKG疫苗(wtTRAMP-C1细胞+BKG)HV4.4 s.c.BCG疫苗(wtTRAMP-C1细胞+BCG)HV4.5 只有接种肿瘤(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV4.6 BKG疫苗(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV4.7 BCG疫苗(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV4.8 只有接种肿瘤(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫HV4.9 BKG疫苗(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫HV4.10 BCG疫苗(wtTRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫
HV4.11 只s.c.接种肿瘤(IL2/IFNγ-TRAMP-C1细胞)HV4.12 s.c.BKG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP-C1细胞+BKG)HV4.13 s.c.BCG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP-C1细胞+BCG)HV4.14 只有接种肿瘤(IL2/IFNγ-TRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV4.15 BKG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV4.16 BCG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP)作为预备实验5中确定的致敏增强HV4.17 只有接种肿瘤(IL2/IFNγ-TRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫HV4.18 BKG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫HV4.19 BCG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作为预备实验5中确定的长期免疫图5显示用于组HV4.2-HV4.4和HV4.11-HV4.13的免疫方案1，数字代表1小鼠的出生26周后血液取样312周后血液取样和CT418周后血液取样524周后接种625周后血液取样和CT730周后血液取样836周后血液取样和CT940周后血液取样和小鼠的处死图6显示用于组HV4.5-HV4.7和HV4.14-HV4.16的免疫方案2，数字代表
1小鼠的出生26周后血液取样312周后血液取样和CT418周后血液取样524周后接种(致敏I)625周后血液取样和CT726周后接种(致敏II)828周后接种(致敏III)930周后血液取样1034周后接种(增强接种)1136周后血液取样和CT1240周后血液取样和小鼠的处死图7显示用于组HV4.8-HV4.10和HV4.17-HV4.19的免疫方案3，数字代表1小鼠的出生26周后血液取样312周后血液取样和CT418周后血液取样524周后接种(致敏I)625周后血液取样和CT730周后接种(致敏II)831周后血液取样936周后接种(致敏III)1037周后血液取样和CT1142周后接种(致敏IV)1243周后血液取样和小鼠的处死接种的时间间隔优选地取决于预备实验5的结果。
实验3治疗前列腺癌的组合物适于治疗前列腺癌的组合物包含作为第一成分的BCG，其表达单核细胞增生利斯特氏菌(Hly)的吞噬溶酶体逃逸肽并且是ure C-缺陷型的。这样的修饰BCG在本文中还叫作rBCG:ΔureC:Hly。所述组合物包含作为第二成分的遗传加工的LNCaP细胞。这些细胞是表达重组白介素-2(IL2)和干扰素-γ(IFNγ)的前列腺癌细胞。优选地，这样的LNCaP细胞以大约等摩尔的方式表达两种细胞因子。这种LNCaP细胞如在国际专利申请WO 94/18995中所述。将这样的重组前列腺癌细胞用γ射线辐射，以便破坏它们在使用之前的复制能力。
将两种成分悬浮在磷酸缓冲盐溶液中，并且准备给患者施用。所述组合物含有1×106个BCG细胞和1×106个LNCaP细胞，包含在50μl中。i.v.注射所述组合物。为了检测功效，进行ELISPOT分析。这样的ELISPOT分析如在Mollenkopf H.J.，Dietrich G.，Fensterle J.，Grode L.，Diehl K.D.，Knapp B.，Singh M.，O’Hagan D.T.，Ulmer J.B.，和Kaufmann S.H.Enhancedprotective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine by adsorption onto cationicPLG microparticles.Vaccine.2004 Jul 29；22(21-22)2690-5中所述。
在一个备选的治疗方案中，前面提及的组合物施用一次，之后再仅施用LNCaP细胞。在这一范围内，所述第一和第二成分可以以不同的频率和按照不同的时间模式进行施用，这是本发明的基本原理。
登记临床检测组织学和临床肿瘤病期以及进行这样的治疗的患者的健康状况。一个替代的参数是PSA水平的进程(course)以及具有有利的PSA水平进程的患者人数。
由于给患者施用独特的组合，将观察到PSA水平和提高的存活率的有利进程，与没有佐剂，即只施用LNCaP细胞时观察到的效果相比，其更高。
实验4使用BKG作为HCMV疫苗的佐剂本实例报道本文所述的作为佐剂的BKG和HCMV密体的成功组合，以便诱导针对人巨细胞病毒感染的细胞免疫。更具体地，据报道，所述细胞免疫可以在短时间内诱导。在进行骨髓移植的患者中，这样快速的HCMV免疫诱导特别重要，所述骨髓移植很经常地伴随着威胁生命的HCMV感染。对于移植患者，由于没有时间按照标准实践进行更长时间的接种，所以存在对快速产生细胞免疫的需求。
使用下列接种方案抗原 密体剂量20μg/动物免疫方案D第0/7/21天C第0/7天B第0天佐剂 剂量1×106/动物免疫方案第0天组的结构
在最后一次免疫后，分别每8和9天进行准备。
结果在图8和9中描述，其中图9是描述当用HCMV-特异性肽混合物(来自JPT Peptide Technologies GmbH，Berlin，Germany)刺激时，每105个CD8+T细胞IFN-γ-阳性细胞的数目的图表。所述序列来自HCMV pp65蛋白。它是138种表现出11个氨基酸重叠的肽(每种15个氨基酸)的混合物(预混合物)。图8是与图9相似的图表，其中当用非特异性对照肽刺激时，确定CD8+T细胞的代表性数目。如果在初始接种时将BKG用作佐剂，在每一情形中，可以从所述图得出每105CD8的IFN-γ-阳性细胞的数目。T细胞显著地增加。最显著的增加可以在组B2和C2中观察到。这意味着，用BKG与密体组合的基本接种，其中密体在第0天和7天后施用，已经足以显著地增加IFN-γ-阳性细胞的数目。这证实了本发明潜在的令人惊讶的发现，当组合密体和BKG时，可以诱导针对HCMV的细胞免疫。
实验5治疗和预防疟疾的组合物用于治疗和预防疟疾的组合物包括作为第一成分的rBCG:ΔureC:Hly和作为第二成分的疟疾抗原gp190/MSP1。应该意识到，所述抗原可以作为肽或者更大的肽、多肽或甚至是蛋白的片段而存在。
在50μl PBS缓冲液中，所述组合物包括50μg的MSP1蛋白和大约1×106rBCG:ureC:Hly。将所述组合物s.c.施用给小鼠。免疫后，收集免疫小鼠的脾和血液并且用于分析方法中。
使用ELISPOT技术(Mollenkopf H.J.，同前所述)和裂殖子侵入-抑制检测(Merozoite invasion-inhibition assay)(Blackman等.1990 J.Exp.Med.Volume 172 P379-382)，再监测接种过程的进展。在用MSP-1特异性肽刺激后，我们预测提高的免疫刺激和IFN-γ分泌。我们还预测由从免疫小鼠收集的血清诱导的侵入-抑制。IFN-γELISPOT和裂殖子-抑制结果与保护性有关。
在说明书、权利要求、序列表和/或附图中公开的本发明的特征，独立地和以它们的任何组合，可以是以其各种方式实现本发明的材料。
序列表<110>疫苗工程管理有限公司<120>细菌细胞和生物活性剂的组合<130>V 10001 PCT<140>
<141>
<150>
<151>
<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1881<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述重组核酸分子<220>
<223>包括吞噬溶酶体结构域(211-1722 nt)和终止密码子(1879-1881)的CDS<400>1atgacagacg tgagccgaaa gattcgagct tggggacgcc gattgatgat cggcacggca60gcggctgtag tccttccggg cctggtgggg cttgccggcg gagcggcaac cgcgggcgcg120ttctcccggc cggggctgcc ggtcgagtac ctgcagtctg caaagcaatc cgctgcaaat180aaattgcact cagcaggaca aagcacgaaa gatgcatctg cattcaataa agaaaattca240atttcatcca tggcaccacc agcatctccg cctgcaagtc ctaagacgcc aatcgaaaag300aaacacgcgg atgaaatcga taagtatata caaggattgg attacaataa aaacaatgta360ttagtatacc acggagatgc agtgacaaat gtgccgccaa gaaaaggtta caaagatgga420aatgaatata ttgttgtgga gaaaaagaag aaatccatca atcaaaataa tgcagacatt480caagttgtga atgcaatttc gagcctaacc tatccaggtg ctctcgtaaa agcgaattcg540gaattagtag aaaatcaacc agatgttctc cctgtaaaac gtgattcatt aacactcagc600attgatttgc caggtatgac taatcaagac aataaaatcg ttgtaaaaaa tgccactaaa660tcaaacgtta acaacgcagt aaatacatta gtggaaagat ggaatgaaaa atatgctcaa720gcttatccaa atgtaagtgc aaaaattgat tatgatgacg aaatggctta cagtgaatca780caattaattg cgaaatttgg tacagcattt aaagctgtaa ataatagctt gaatgtaaac840ttcggcgcaa tcagtgaagg gaaaatgcaa gaagaagtca ttagttttaa acaaatttac900tataacgtga atgttaatga acctacaaga ccttccagat ttttcggcaa agctgttact960aaagagcagt tgcaagcgct tggagtgaat gcagaaaatc ctcctgcata tatctcaagt1020gtggcgtatg gccgtcaagt ttatttgaaa ttatcaacta attcccatag tactaaagta1080aaagctgctt ttgatgctgc cgtaagcgga aaatctgtct caggtgatgt agaactaaca1140aatatcatca aaaattcttc cttcaaagcc gtaatttacg gaggttccgc aaaagatgaa1200gttcaaatca tcgacggcaa cctcggagac ttacgcgata ttttgaaaaa aggcgctact1260tttaatcgag aaacaccagg agttcccatt gcttatacaa caaacttcct aaaagacaat1320gaattagctg ttattaaaaa caactcagaa tatattgaaa caacttcaaa agcttataca1380gatggaaaaa ttaacatcga tcactctgga ggatacgttg ctcaattcaa catttcttgg1440gatgaagtaa attatgatcc tgaaggtaac gaaattgttc aacataaaaa ctggagcgaa1500aacaataaaa gcaagctagc tcatttcaca tcgtccatct atttgccagg taacgcgaga1560aatattaatg tttacgctaa agaatgcact ggtttagctt gggaatggtg gagaacggta1620attgatgacc ggaacttacc acttgtgaaa aatagaaata tctccatctg gggcaccacg1680ctttatccga aatatagtaa taaagtagat aatccaatcg aatatgcatt agcctatgga1740agtcagggtg atcttaatcc attaattaat gaaatcagca aaatcatttc agctgcagtt1800ctttcctctt taacatcgaa gctacctgca gagttcgtta ggcgcggatc cggaattcga1860
agcttatcga tgtcgacgta g 1881<210>2<211>626<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述核酸序列1相应的氨基酸序列<400>2Met Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu Met1 5 10 15Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala20 25 30Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val35 40 45Glu Tyr Leu Gln Ser Ala Lys Gln Ser Ala Ala Asn Lys Leu His Ser50 55 60Ala Gly Gln Ser Thr Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Ser65 70 75 80Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr85 90 95Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly100 105 110Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val115 120 125Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile130 135 140Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile145 150 155 160Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val165 170 175Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val180 185 190Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn195 200 205Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn210 215 220Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln225 230 235 240Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala245 250 255Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala260 265 270
Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys275 280 285Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Asn Val Asn290 295 300Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr305 310 315 320Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala325 330 335Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser340 345 350Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val355 360 365Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys370 375 380Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu385 390 395 400Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys405 410 415Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro Ile Ala Tyr420 425 430Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile Lys Asn Asn435 440 445Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Lys Ile450 455 460Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn Ile Ser Trp465 470 475 480Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val Gln His Lys485 490 495Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser500 505 510Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr Ala Lys Glu515 520 525Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile Asp Asp Arg530 535 540Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr545 550 555 560Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile Glu Tyr Ala565 570 575Leu Ala Tyr Gly Ser Gln Gly Asp Leu Asn Pro Leu Ile Asn Glu Ile580 585 590Ser Lys Ile Ile Ser Ala Ala Val Leu Ser Ser Leu Thr Ser Lys Leu595 600 605
Pro Ala Glu Phe Val Arg Arg Gly Ser Gly Ile Arg Ser Leu Ser Met610 615 620Ser Thr62权利要求
1.一种包括第一成分和第二成分的组合，其中所述第一成分是细菌细胞，其包括至少一种编码吞噬溶酶体逃逸肽或多肽的重组核酸分子；其中所述第二成分是生物活性剂。
2.按照权利要求1的组合，其中所述细菌细胞是脲酶-缺陷型的。
3.按照权利要求1或2的组合，其中所述细菌细胞是分枝杆菌细胞。
4.按照权利要求3的组合，其中所述细胞是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)细胞。
5.按照权利要求1-4中任一项的组合，其中所述细菌细胞的至少一种细胞脲酶亚基编码核酸被灭活。
6.按照权利要求5的组合，其中至少细菌脲酶C亚基-编码序列被灭活。
7.按照权利要求1-6中任一项的组合，其中所述吞噬溶酶体逃逸结构域是利斯特氏菌吞噬溶酶体逃逸结构域。
8.按照权利要求1-7中任一项的组合，其中所述吞噬溶酶体结构域由选自包括下列各项的组的核酸分子编码a)包括SEQ.ID.NO.1中显示的核苷酸211-1.722的核苷酸序列；b)编码同来自a)的序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列；和c)在严紧条件下与a)或b)的序列杂交的核苷酸序列。
9.按照权利要求1-8中任一项的组合，其中所述细菌细胞包括至少一种编码能够在哺乳动物中引发免疫应答的肽或多肽的重组核酸分子。
10.按照权利要求9的组合，其中所述肽或多肽选自自体抗原、肿瘤抗原、病毒抗原、寄生虫抗原、细菌抗原以及它们的免疫原性片段。
11.按照权利要求9或10的组合，其中所述肽或多肽是融合多肽的片段。
12.按照权利要求11的组合，其中所述融合多肽包括a)来自多肽的至少一个结构域，其中所述多肽结构域能够在哺乳动物中引发免疫应答，和b)吞噬溶酶体逃逸结构域。
13.按照权利要求12的组合，其中所述多肽是权利要求9定义的多肽或其片段。
14.按照权利要求12或13的组合，其中所述吞噬溶酶体逃逸结构域是权利要求1-11中任一项定义的吞噬溶酶体逃逸结构域的结构域。
15.按照权利要求1-13中任一项的组合，其中所述细菌细胞是rBCG:Hly或rBCGΔureC:Hly。
16.按照权利要求1-15中任一项的组合，其中所述生物活性剂是真核细胞，并且更优选地是表达细胞因子的遗传操作的真核细胞。
17.按照权利要求16的组合，其中所述细胞因子选自包括白介素-2、白介素-4、白介素-12和干扰素-γ的组。
18.按照权利要求17的组合，其中所述细胞同时表达两种或多种细胞因子。
19.按照权利要求18的组合，其中所述细胞同时表达IL-2和干扰素-γ。
20.按照权利要求16-19中任一项的组合，其中所述细胞相对于施用或者要施用所述细胞和/或组合物的受试者是自体同源性的。
21.按照权利要求16-19中任一项的组合，其中所述细胞相对于施用或者要施用所述细胞和/或组合物的受试者是同种异基因性的。
22.按照权利要求16-21中任一项的组合，其中所述细胞选自包括非专职抗原呈递细胞、专职抗原呈递细胞、肿瘤细胞和树突细胞的组。
23.按照权利要求22的组合，其中所述肿瘤细胞是免疫原性肿瘤，并且其中所述肿瘤细胞优选地选自包括黑素瘤细胞、肾癌细胞、乳腺瘤细胞、脑瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、非小细胞肺癌、结肠癌和头颈鳞状肿瘤的组。
24.按照权利要求16-23中任一项的组合，其中所述细胞是同种异基因型细胞，并且是与I类HLA匹配的。
25.按照权利要求16-24中任一项的组合，其中所述细胞表达另外的免疫分子，所述免疫分子选自包括下列各项的组细胞因子、黏着分子、共刺激性因子、肿瘤相关的抗原、肿瘤特异性抗原和寄生虫抗原。
26.按照权利要求25的组合，其中所述寄生虫抗原是疟原虫，优选恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的gp190/MSP1蛋白，或其能够在哺乳动物中引发免疫应答的片段。
27.按照权利要求1-15中任一项的组合，其中所述生物活性剂是疟原虫，优选恶性疟原虫的gp190/MSP1蛋白，或其能够在哺乳动物中引发免疫应答的片段。
28.按照权利要求1-15中任一项的组合，其中所述生物活性剂是人巨细胞病毒。
29.按照权利要求1-15中任一项的组合，其中所述生物活性剂是病毒颗粒或其群体，其优选地在人巨细胞病毒感染哺乳动物细胞后释放，其中所述颗粒(a)被脂膜包围，病毒糖蛋白内含在脂膜中，并且(b)不含病毒DNA，也不含壳体。
30.按照权利要求29的组合，其中所述颗粒包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T-细胞抗原pp65(UL83)的一个或多个片段以及一种或多种非pp65蛋白的一个或多个片段。
31.按照权利要求30的组合，其中所述T-细胞抗原pp65与人巨细胞病毒糖蛋白的一个或多个片段融合，其中所述糖蛋白选自包括HCMV糖蛋白gH、HCMV蛋白IE1(ppUL123)和HCMV糖蛋白gB的组。
32.按照权利要求30的组合，其中所述T-细胞抗原融合到蛋白的一个或多个片段上，所述蛋白为除了HCMV以外的人病原体片段。
33.按照权利要求32的组合，其中所述病原体选自包括HIV-1、HBV、HCV和流感的组。
34.按照权利要求29-33的组合，其中所述颗粒包含至少两种糖蛋白的片段，所述糖蛋白是来自不同HCMV毒株的特别的糖蛋白的变体。
35.按照权利要求34的组合，其中两种特别的HCMV糖蛋白变体中的一种是HCMV Towne毒株的变体，另一种是HCMV Ad169毒株的变体。
36.按照权利要求29-35中任一项的组合，其中所述哺乳动物细胞是成纤维细胞，优选地是包皮成纤维细胞。
37.按照权利要求29-36中任一项的组合，其中所述颗粒是密体。
38.按照权利要求1-15中任一项的组合，其中所述生物活性剂是密体，优选地是HCMV的密体，或者按照权利要求37的密体。
39.按照权利要求1-15中任一项的组合，其中所述生物活性剂是分枝杆菌的抗原，优选地是分枝杆菌亚种的抗原。
40.按照权利要求39的组合，所述分枝杆菌选自包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、M.canettii、非洲分枝杆菌(M.africanum)和副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)的组。
41.按照权利要求39和40的组合，其中所述抗原是抗原85。
42.组合物，优选地药物组合物，其包括按照权利要求1-41中任一项的组合，以及任选地药用载体。
43.按照权利要求1-41中任一项的组合，按照权利要求42的组合物或者这样的组合的每一成分用于制备药物的应用。
44.按照权利要求43的应用，其中所述药物用于治疗和/或预防选自包括癌症和传染性疾病的组的疾病。
45.按照权利要求44的应用，其中所述癌症是免疫原性肿瘤，并且更优选地选自包括前列腺癌、黑素瘤、肾癌、乳腺瘤、脑瘤、非小肺癌、结肠癌、和头颈鳞状肿瘤的组。
46.按照权利要求44的应用，其中所述传染性疾病是疟疾。
47.按照权利要求46的应用，其中所述生物活性剂是疟原虫的gp190/MSP1蛋白或其能够在哺乳动物中引发免疫应答的片段。
48.按照权利要求44的应用，其中所述传染性疾病是HCMV感染。
49.按照权利要求48的应用，其中所述生物活性剂是在任一前述权利要求中定义的密体。
50.按照权利要求44的应用，其中所述传染性疾病是结核病。
51.按照权利要求50的应用，其中所述生物活性剂是分枝杆菌的抗原，优选地是分枝杆菌亚种的抗原。
52.按照权利要求51的应用，其中所述分枝杆菌选自包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、M.canettii、非洲分枝杆菌和副结核分枝杆菌的组。
53.按照权利要求51或52的任一项的应用，其中所述抗原是抗原85。
54.按照权利要求1-41中任一项的组合或者这样的组合的每一成分用于制备治疗性和/或预防性疫苗的应用。
55.一种治疗患有疾病并且需要这样的治疗的患者的方法，其包括施用按照权利要求1-41中任一项的组合或按照权利要求42的药物组合。
56.一种制备药物组合，优选地按照权利要求42的药物组合物的方法，其包括步骤-提供细菌细胞作为第一成分，其包括至少一种编码吞噬溶酶体逃逸肽或多肽的重组核酸分子；-提供生物活性剂作为第二成分；和-将所述第一成分和第二成分配制成药物组合物。
57.一种制备药物组合，优选地按照权利要求42的药物组合物的方法，其包括步骤-提供细菌细胞作为第一成分，其包括至少一种编码吞噬溶酶体逃逸肽或多肽的重组核酸分子；-提供生物活性剂作为第二成分；和-独立地配制第一成分和第二成分。
58.按照权利要求57的方法，其中所配制的第一成分和所配制的第二成分包装在一个包装中。
59.按照权利要求57的方法，其中所配制的第一成分和所配制的第二成分包装在独立的包装中。
60.按照权利要求58和59中任一项的方法，其中所述包装是单一剂型或包括多个单一剂型。
全文摘要
本发明涉及包括第一成分和第二成分的组合，其中所述第一成分是细菌细胞，其包括至少一种编码吞噬溶酶体逃逸肽或多肽的重组核酸分子；其中所述第二成分是生物活性剂。
文档编号A61K39/39GK101048178SQ200580036326
公开日2007年10月3日 申请日期2005年10月16日 优先权日2004年10月21日
发明者阿尔布雷希特·劳费尔, 贝恩德·艾泽勒, 莱安德·格罗德 申请人:疫苗工程管理有限公司