专利名称：作为有效的siRNA载体的高分支HK肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用siRNA通过将转染复合物与一种或多种细胞相接触而转染细胞的方法。本发明还涉及所述转染复合物及其组合物。本发明进一步涉及使用本发明的转染复合物及其组合物治疗患者的方法。
背景技术：
小干扰RNA分子(siRNA)的使用是使基因沉默并由此使相应的基因产物沉默的有效新技术。已经报道，RNA干扰(RNAi)比反义RNA独自沉默基因的效率高十倍(Rocheleau CE等人，Wnt signaling and an APC-relatedgene specify endoderm in early C.elegans embryos.Cell 1997；90707-716.)。siRNA已经用于研究蛋白质在信号传导途径中的作用，并且已经表明这些分子可以用于治疗多种其中致病蛋白过量表达的疾病(Arenz C，SchepersU.，RNA interferencefrom an ancient mechanism to a state of the arttherapeutic application？Naturwissenschaften 2003；90345-359.；Coburn GA，Cullen BR.siRNAsa new wave of RNA-based therapeutics.J AntimicrobChemother 2003；51753-756.)。为避免由较长双链RNA诱导的非特异性的基因沉默，小干扰RNA(21-23个核苷酸的双链体)，已经被用作调节子来降解靶mRNA(Fire A，Xu S，Montgomery MK，Kostas SA，Driver SE，MelloCC.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditis elegans.Nature 1998；391806-811.)。siRNA一旦进入细胞，即被掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC) ——一种导致RNA双链解旋和链分离的蛋白质-RNA复合物。然后，反义RNA指导活化的RISC来使靶mRNA退火并裂解靶mRNA(Hammond SM，Bernstein E，Beach D，HarmonGJ.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing inDrosophila cells.Nature 2000；404293-296；Reynolds A，Leake D，Boese Q，Scaringe S，Marshall WS，Khvorova A.Rational siRNA design for RNAinterference.Nat Biotechnol 2004；22326-330；Hammond SM，Boettcher S，Caudy AA，Kobayashi R，Harmon GJ.Argonaute2，a link between genetic andbiochemical analyses of RNAi.Science 2001；2931146-1150；Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，Harmon GJ.Role for a bidentate ribonuclease inthe initiation step of RNA interference.Nature 2001；409363-366.)。
病毒和非病毒载体已经被用来携带siRNA至它们的细胞溶质的mRNA靶(Simeoni F，Morris MC，Heitz F，Divita G.Insight into themechanism of the peptide-based gene delivery system MPGimplications fordelivery of siRNA into mammalian cells.Nucleic Acids Res2003；312717-2724.)。然而，迄今为止，少数肽载体已经被开发，其已经证明对siRNA高效递送至真核细胞(即，转染)是有效的。
现有技术中存在对具有足以递送治疗有效量的siRNA进入靶细胞的转染率的药剂递药系统的需求。特别地，现有技术中存在对能够递送siRNA进入细胞内的改良的递药系统的需求。现有技术中还存在对在血清中稳定而使递药系统在体外和体内都有效的载体的需求。
发明概述本发明涉及用siRNA转染细胞的方法。特别地，所述方法包括将转染复合物与一种或多种细胞接触，其中所述转染复合物包括转运聚合物和siRNA。所述转运聚合物包括组氨酸和赖氨酸。转运聚合物的例子包括但不限于H3K8b、H3K8b(+RGD)和结构上类似的类似物，具有八个末端分支和组氨酸富集的结构域，特别是那些约与H3K8b同样大小或比H3K8b小一些的聚合物。根据某些实施方案，细胞可以选自转化细胞系、重组细胞系、恶性细胞系或原代细胞系。
本发明的方法还可以包括形成转染复合物。所述方法可以进一步包括在将所述转染复合物与细胞接触之前使转染复合物在约室温下静置约15分钟至约1个半小时。
本发明进一步涉及包括siRNA和包括H3K8b或其结构类似物的转运聚合物的转染复合物。本发明进一步涉及包括这样的转染复合物的组合物。
附图简述本发明通过参考附图中所描述的其实施方案而更加容易被理解，其中
图1HK聚合物的图式结构。图1描述了这里所讨论的HK聚合物的图式结构，包括本发明的某些HK聚合物，如H3K8b。在图中，由实线连接的3个实心环代表各个聚合物的三赖氨酸核心。虚线分开聚合物中重要的结构域或基团。在高分支聚合物H3K8b中，从赖氨酸核心向外，顺序如下(1)4个组氨酸富集的结构域(H8HHHHNHHHH)；(2)4个赖氨酸(由K表示)；和(3)由R表示的8个末端HK分支。在较少分支的聚合物(H3K4b、H2K4b和HK4b)中，存在4个从三赖氨酸核心发出的末端HK分支。贯穿本申请，术语“H3K8b”指图1中所描述的结构，不含整合素(integrin)配基RGD。类似地，术语“H3K8b(-RGD)”指不含RGD的结构。
图2H3K8b是有效的siRNA载体。图2是描述β-半乳糖苷酶siRNA的几种可能的载体(Lipofectamine、DOTAP、H3K8b、H3K4b、H2K4b和HK4b)抑制SVR-bag4细胞中β-半乳糖苷酶(β-gal)表达的能力的效率的条线图，为它们抑制SVR-bag4细胞中β-半乳糖苷酶(β-gal)表达的能力。H3K8b是最有效的载体，降低了80％的表达。在只有4个末端分支的聚合物(即HK4b、H2K4b和H3K4b)中，聚合物H3K4b是最有效的siRNA载体。数据表示三次实验的平均值±标准偏差(S.D.)。P＜0.001，对照vs.H3K8b或H3K4b；**，P＜0.05，对照vs.Lipofectamine、H2K4b或HK4b(多重比较vs.对照组(Bonferroni t检验))。
图3H3K8b(+RGD)与β-半乳糖苷酶siRNA复合物显著抑制β-半乳糖糖苷酶的表达。SVR-bag4细胞用H3K8b(+RGD)与β-半乳糖苷酶siRNA的复合物(4∶1；μg∶μg比例)转染48小时，然后通过使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶染色证实了H3K8b(+RGD)与β-半乳糖苷酶siRNA的复合物显著抑制了SVR-bag4细胞的β-半乳糖苷酶活性。图3A描述了使用H3K8b(+RGD)作为部分转染复合物而转染的SVR-bag4细胞。图3B描述了未经处理的对照细胞。
图4、最佳的H3K8b∶siRNA比例。图4是描述使用不同比例的聚合物∶siRNA(wt/wt)抑制β-半乳糖苷酶的条线图。为确定对于H3K8b的最佳的聚合物∶siRNA(μg∶μg)比例，使用靶向β-半乳糖苷酶的不同比例的聚合物和siRNA转染SVR-bag4细胞。48小时后，如实施例中所描述的对β-半乳糖苷酶活性定量。在约3∶1和约6∶1之间的聚合物∶siRNA比例比其他比例更多地抑制了β-半乳糖苷酶的表达。数据表示三次实验的平均值±S.D.。
图5H3K8b(+RGD)与靶向荧光素酶的siRNA的复合物显著抑制荧光素酶活性。图5是描述使用不同载体时抑制荧光素酶的条线图。为检测H3K8b作为其他siRNA的载体的能力，使用荧光素酶表达质粒与SuperFect的复合物(2∶1载体/核酸比例)及利用H3K8b(+RGD)(4∶1)、H3K4b(4∶1)、DOTAP(4∶1)使用靶向荧光素酶的siRNA共转染恶性MDA-MB-435细胞系24小时。使用Turner 20/20光度计检测荧光素酶活性。β-半乳糖苷酶用作对照siRNA，使用H3K8b以4∶1的比例转染。数据表示三次实验的平均值±S.D.。*，P＜0.001，对照vs.H3K8b(+RGD)、H3K4b或DOTAP；**，P＜0.01，H3K8b(+RGD)vs.H3K4b或DOTAP(使用bonferroni t-检验多重比较检验的单因素方差分析(one way ANOVA))。
图6H3K8b(+RGD)与其他载体的比较增加了Cy3标记的siRNA的摄取效率。图6描述了在SVR-bag4细胞(一种小鼠内皮细胞系，经SV病毒转化，表达β-半乳糖苷酶)、MDA-MB-435(一种恶性乳腺癌细胞系)和C6细胞系中的转染率。使用复合有DOTAP(4∶1)、Lipofectamine(4∶1)或H3K8b(+RGD)(4∶1)的Cy3标记的siRNA转染细胞；4小时后，使用荧光显微镜100x获得影像。图6显示使用H3K8b(+RGD)作为Cy3标记的siRNA载体转染的细胞具有Cy3标记的siRNA的较高摄取。
图7由H3K8b∶siRNA复合物诱导的编程性细胞死亡和坏死。SVR-bag4细胞使用如下实施例中所细述的H3K8b与β-半乳糖苷酶siRNA的复合物所转染。实验组为未处理(A)和H3K8b∶siRNA复合物(4∶1比例；wt/wt)。细胞然后使用YO-PRO-I和PI荧光染料进行处理并使用488nm激发光通过流式细胞仪进行分析。V活力细胞；A凋亡细胞；N坏死细胞。
图8由不同载体∶siRNA复合物诱导的毒性。SVR-bag4细胞使用实施例中细述的不同的载体与β-半乳糖siRNA的复合物转染。细胞然后使用YO-PRO-I和PI荧光染料进行处理并使用488nm激发光通过流式细胞仪进行分析。通过从活力细胞组排除的细胞的百分数来确定毒性(或非活力细胞)。数据表示三次实验的平均值和S.D.。*，P＜0.05，H3Kb(+RGD)vsDOTAP；**，P＜0.001，H3K8b(+RGD)vs Lipofectamine、Lipofectamine 2000或Oligofectamine(用Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析)。转染载体∶siRNA复合物比例是4∶1(wt∶wt)，除了Lipofectamine 2000和Oligofectamine之外(其中比例为2∶1)。
图9H3K8b的重要结构域。为确定H3K8b的重要结构域，合成了几种聚合物，其改变了以下三个结构域的一个或多个(+K)H3K8b加入单赖氨酸至各个末端分支；(-HHHK)H3K8b从各个末端分支去除4个氨基酸；H3K(G)8b用甘氨酸取代组氨酸富集的结构域；H3K8b(+RGD)具有整合素配基RGD。图9描述了这些聚合物的结构。
图10，图10是显示(+K)H3K8b(+RGD)中单个赖氨酸向末端分支的加入或H3K(G)8b(+RGD)中用甘氨酸对组氨酸富集的结构域(H8)的取代显著降低了这些聚合物作为siRNA载体的能力。数据表示三次实验的平均值±S.D.。*，P＜0.001未处理的vs.Oligofectaniine、H3K8b、(-HHHK)H3K8b、H3K8b(+RGD)和(-HHHK)H3K8b(+RGD)；**，P＜0.01Oligofectaniine vs.H3K8b(+RGD)或(-HHHK)H3K8b(+RGD)(Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析)。HK聚合物和Oligofectaniine与siRNA的复合物的比例分别为4∶1和2∶1w/w。
发明的详细描述本发明的方面、优点和其他特征参考以下详细描述将变得明显，以下详细描述公开了本发明的各种非限制性实施方案。在描述本发明的实施方案中，为了清楚而采用了特定术语。然而，本发明无意限定于如此选择的特定术语。应该理解，每个特定的元素包括所有以相似方式达到相似目的的技术等同物。另外，这里的所有引文都通过引用方式整体并入本文。
本发明涉及用siRNA转染细胞。特别地，本文公开的是新型的siRNA转运复合物，包括意想不到有利的转运聚合物。本发明的方法包括将转染复合物与一种或多种细胞接触，其中所述转染复合物包括转运聚合物和siRNA。所述转运聚合物是包括组氨酸和赖氨酸的载体(HK载体)。
这里使用的单数形式可以表示一或多。本文使用的“另一”可以表示至少第二或更多。
术语“氨基酸”包括20种普通氨基酸以及“非标准氨基酸”，例如D氨基酸和化学(或生物学)生成的“普通”氨基酸的衍生物，包括例如β-氨基酸。
如果由于两种化合物之间共价或非共价相互作用两种化合物已经形成一种复合物，则一种化合物与第二种化合物是“连接的”。
术语“共聚物”指含有两个或多个类型的单元的聚合物，不论单元沿链的排列(随机、交替、嵌段、接枝)，也不论它的分子结构(线性的或分支的)。术语“组氨酸共聚物”表示包括组氨酸作为其单元类型的共聚物。术语“转运聚合物”表示包含本发明的组氨酸共聚物的聚合物。
术语“分支”包括任何单体或其线性聚合物(包括共聚物)，其在至少一个末端与分支单体的侧基共价连接。本身包括一个或多个分支单体的分支被称为“非末端分支”。不包含分支单体的分支被称为“末端分支”。“末端分支”可以包括例如对分支的n末端氨基酸的组氨酸或赖氨酸的分支的最终分化。末端分支可以包括非组氨酸或赖氨酸(例如，半胱氨酸或其他连接剂)，其帮助结合稳定剂(如PEG或HPMA)和/或靶向配基。
术语“分支的聚合物”包括含有至少一个骨架和至少一个末端分支的任何聚合物。分支的聚合物可以进一步包括一个或多个非末端分支。
术语“HK肽”、“HK聚合物”和“HK载体”意欲表示包括组氨酸和赖氨酸的转运聚合物，包括本发明涵盖的聚合物。
术语“体内”包括基于注射的治疗，不论静脉的还是局部的(例如，瘤内、肌内、皮下、气管内、静脉内或眼内直接注射入器官或气道，注射入器官的脉管，或雾化入气道)。术语“体内”还包括基于对肿瘤、组织或器官的电穿孔的治疗。
术语“脂类”作为它在本领域的术语而使用并包括具有疏水和亲水部分的任何化学物种类。亲水性特征一般从磷酸根、羧酸、硫酸根、氨基、巯基、硝基和其他类似基团的存在而得来。疏水性可以由胆固醇及其衍生物和下述基团赋予，包括但不限于长链饱和及不饱和脂肪烃基团和被一个或多个芳香族、环脂肪族或杂环基团所取代的此类基团。
术语“非阳离子脂类”指以无电荷形式、中性的两性离子形式或生理pH下的阴离子形式存在的许多脂类的任何一种。这样的脂类包括例如二乙酰磷酯酰胆碱、二乙酰磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、心肌磷脂、脑苷脂、DOPE和胆固醇。
术语“阳离子脂类”指在生理pH下带有净正电荷的许多脂类的任何一种。这样的脂类包括但不限于DODAC、DOTMA、DDAB、DOSPER、DOSPA、DOTAP、DC-胆固醇和DMRIE。另外，可用于本发明的许多商品化的阳离子脂类制剂可以获得。这些包括，例如LIPOFECTIN注册商标(可商业获得的阳离子脂质体，包括DOTMA和DOPE，来自GIBCO/BRL，Grand Island，N.Y.，USA)；LIPOFECTAMINE注册商标(可商业获得的阳离子脂质体，包括DOSPA和DOPE，来自GIBCO/BRL)；和TRANSFECTAM注册商标(可商业获得的阳离子脂质体，包括DOGS，来自Promega Corp.，Madison，Wis.，USA)。
术语“肽”包括含有至少2个氨基酸残基的直链和分支的氨基酸链以及环状氨基酸链。术语“肽”和“多肽”在这里可互换使用。
术语“药剂”包括可用于预防、延缓疾病发作或减轻疾病发作的严重度、减轻发作的疾病的严重度或者提高正常生理功能的任何治疗剂以及诊断剂，例如标志基因(GFP，荧光素酶)。“药剂”可以包括一种或多种治疗剂、一种或多种诊断剂或一种或多种治疗剂和一种或多种诊断剂的组合物。
这里使用的“药学上可接受的”本发明的药剂递送组合物的组分(如盐、载体、赋形剂或稀释剂)为一种组分，其(1)是与所述递送组合物的其他成分相容的组分，因为它能够包含在所述递送组合物中而不消除所述组合物递送药剂的能力；和(2)当所述递送组合物意欲用于治疗应用时，适用于动物(如人类)而无不当的有害副作用，如毒性、刺激和过敏反应。当副作用的危险超过所述药剂提供的益处时是“不当的”。
这里使用的术语“生理pH”被定义为在约7.2和约7.5之间的pH。
这里使用的术语“重组的”表示具有基因工程DNA的细胞，其在体外制备并包括来自宿主生物体或更常见的来自与宿主生物体相比不同种、属、科、目、纲的DNA。
术语“siRNA”作为其在本领域的术语而被使用并包括靶向mRNA的RNA双链体(每条链30个碱基或更少)。siRNA可以被化学或酶合成。根据本发明的siRNA可以被掺入RISC(RNA诱导的沉默复合物)中并然后在其中被活化。
“治疗有效量”是预防、延缓疾病发作或减轻疾病发作的严重度所必需的量，或者阻止或减轻发作的疾病的严重度所必需的量，并且还包括提高正常生理功能所必需的量。
术语“转染”在这里普遍用来指外源性化合物(如多聚核苷酸序列)导入原核或真核细胞中；该术语包括但不限于外源性核酸导入细胞，其可以导致永生(immortal)或非永生(non-immortal)细胞系中基因型的永久或临时改变。
本发明的发明人开发了新型的包含组氨酸和赖氨酸的用于质粒转染的分支载体(见Chen QR，Zhang L，Stass SA，Mixson AJ.Branchedco-polymers of histidine and lysine are efficient carriers of plasmids.NucleicAcids Res 2001；291334-1340.)。在这些分支共聚物中，赖氨酸和组氨酸组分与质粒DNA形成复合物并部分中和质粒DNA的负电荷。另外，pKa约为6.0的组氨酸组分缓冲并帮助质粒DNA从内体小泡中的释放。通常，HK肽对递送siRNA是无效的。在本发明中，发明人已经进一步开发了这些载体，并目前已经开发了其他新型高分支HK聚合物，其是具有意想不到的效果的siRNA载体。本发明的HK聚合物是有利的，例如，因为它们毒性较小并比其他聚合物提供更有效的siRNA递送。
本发明的HK聚合物可以用于例如在体内递送siRNA至细胞的内部。然而，这些聚合物还可以具有体内应用。这些方法都包括将转染复合物与一种或多种细胞相接触以递送siRNA。所述转染复合物包括至少一个转运聚合物和siRNA。所述转运聚合物包括组氨酸和赖氨酸。
通常，被转染的细胞包括但不限于使用本发明的转染复合物在体外或体内易受siRNA细胞内递送的任何动物、植物或细菌细胞。例如，适当的细胞靶包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质化细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞、血细胞，血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞、各种干细胞或祖细胞，特别是造血干或祖细胞，例如从骨髓、脐带血液、外周血液、胎儿肝等获得的。在某些方面，所述细胞选自肺细胞、肝细胞、内皮细胞、肌细胞、皮肤细胞、造血干细胞和肿瘤细胞。
根据某些实施方案，所述细胞包括一种或多种选自转化细胞系、重组细胞系、恶性细胞系和原代细胞系。通过非限制性的例子，根据本发明的细胞可以包括选自SVR-bag4、MDA-MB-435、C6和HUVEC(人类脐静脉内皮)细胞系的一种或多种细胞。
对于基于质粒的治疗，核输入对于转录的发生是重要的，且这在几种细胞系中似乎是限速步骤(Pollard H，Remy JS，Loussouarn G，Demolombe S，Behr JP，Escande D.Polyethylenimine but not cationic lipids promotestransgene delivery to the nucleus in mammalian cells.J Biol Chem1998；2737507-7511；Zabner J，Fasbender AJ，Moninger T，Poellinger KA，Welsh MJ.Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid.JBiol Chem 1995；27018997-19007.)。因为核输入对于siRNA降解其靶mRNA是不必要的，认为本发明的聚合物在大多数细胞系中作为siRNA载体是有效的。
根据本发明转染细胞的方法还可以包括形成转染复合物和在将所述转染复合物与细胞接触之前使所述转染复合物在约室温下静置约15分钟至约1.5小时或从约15分钟至约45分钟。
根据本发明包括组氨酸和赖氨酸的转运聚合物包括有效用于转运siRNA的一种或多种HK载体，包括例如具有6-10个末端分支的聚合物。根据某些实施方案，本发明的转运聚合物包括8个末端分支和一个组氨酸富集的结构域。根据某些实施方案，所述转运聚合物包含具有序列-HHHKHHHKHHHKHHHKHHH-或其亚片段的末端分支。根据本发明的转运聚合物的非限制性例子包括选自H3K8b和结构类似物的一种或多种聚合物，如H3K8b(+RGD)、包括一种或多种其他配基的H3K8b、(-HHHK)H3K8b、(-HHHK)H3K8b(+RGD)等。
本发明的转运聚合物可以任选地包括一种或多种稳定剂。参考本公开内容，适当的稳定剂对于本领域技术人员来说将是显而易见的。根据本发明的稳定剂的非限制性例子包括聚乙二醇(PEG)或羟丙基甲基丙烯酰亚胺(HPMA)。
本发明的转运聚合物可以任选地包括一种或多种靶向配基。参考本公开内容，适当的靶向配基对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
可能有效用于siRNA转运的HK聚合物的许多模式被分离、开发和考虑。在带有4个分支的聚合物中，末端分支上的HHHK重复模式(如H3K4b)比HH(如H2K4b)或HK(如HK4b)重复模式似乎更有效增加siRNA的摄取(见图1和2，其描述了此类聚合物的结构及其效力)。结果，本发明的发明人在构建高分支H3K8b和H3K8b(+RGD)中采用了类似的模式并发现其可高效用于制备siRNA载体。
H3K8b具有8个末端分支并具有高比例的组氨酸和低比例的赖氨酸。与HHK相比，HHHK模式因较高比例的组氨酸而具有提高的缓冲能力并因较低比例的赖氨酸而具有降低的结合。缓冲酸性内涵体腔的末端分支中组氨酸数目的增加将允许内涵体裂解和DNA从内涵体脱离。类似地，H3K8b中的组氨酸富集的结构域将有望通过提高聚合物的缓冲能力而增加细胞溶质的递送。然而，用甘氨酸或截短的组氨酸富集的结构域(-HHKHH)取代组氨酸富集的结构域生成了HK聚合物，其是无效的siRNA载体。具有截短的组氨酸富集的结构域的HK聚合物不比具有甘氨酸的聚合物更有效，这表明组氨酸富集的结构域的缓冲能力可能不是该结构域的显性机制。另外，这些结果表明高分支HK肽的所有结构域(末端分支和组氨酸富集的结构域)对于有效的siRNA载体的发展都是重要的。
尽管HHK重复模式存在于H3K4b和H3K8b(+RGD)中，但N末端赖氨酸在高分支聚合物H3K8b中被去除。H3K8b的末端分支中的赖氨酸数目的减少可以导致siRNA结合减少并增加siRNA在细胞质中相对于其在细胞核中的量。通过向H3K8b的各末端分支加入单个赖氨酸(每个聚合物共8个赖氨酸)，新聚合物((+K)H3K8b(+RGD))在减少靶mRNA中的效率与H3K8b(+RGD)的效率相比显著受损。完成siRNA转运的较小的聚合物序列(即，那些不具有添加至各末端分支的赖氨酸的聚合物序列)有利于更容易合成聚合物。结合调节siRNA释放的观点符合以下发现具有对siRNA结合的增加的载体肽作为siRNA载体是较不有效的(Simeoni F，Morris MC，Heitz F，Divita G.Insight into the mechanism of the peptide-based genedelivery system MPGimplications for delivery of siRNA into mammaliancells.Nucleic Acids Res 2003，312717-2724.)。然而，具有不同结合核酸能力的大量HK载体是无效的siRNA载体。
H3K8b(-RGD)与siRNA的复合物只是在尺寸上小于H2K4b/siRNA复合物。本发明的发明人发现，尽管变化H3K8b(RGD)/siRNA的比例使ζ电势(颗粒表面电荷的量度)从正电荷改变至负电荷，但转染活性受到最低限度的影响。相比之下，复合物的摄取与聚合物复合物(polyplexe)的转染水平更密切相关。H2K4b比H3K8b(或H3K8b(+RGD))更显著增进了质粒摄取和来自转染质粒的蛋白质表达。相比之下，H3K8b比其他HK聚合物或受试的非病毒载体更有效增加了siRNA摄取(见图6)。尽管通过HK载体的核酸摄取在多数情况下与核酸的预期作用有关，但摄取与核酸作用之间的差异可能在基于质粒的系统中比在siRNA递送系统中更常存在。
根据本发明的HK聚合物的非限制性例子包括但不限于选自H3K8b、H3K8b(+RGD)、(-HHHK)H3K8b和(-HHHK)H3K8b(+RGD)的一种或多种聚合物。本领域技术人员可以在本发明范围内做出其他改变。例如，不同于RGD的配基，如靶向其他受体的配基，可以被加入本发明范围内的聚合物。另外，大小介于其间并包括16mer H3K8b聚合物和12mer(-HHHK)H3K8b聚合物的聚合物在本发明的范围之内。进一步地，第5或第6氨基酸可以从H3K8去除并依然在本发明范围之内。
下面是本发明范围内的某些化合物的命名的例子。该命名是基于国际理论与应用化学联合会(IUPAC)关于有机化合物的命名法。
H3K8bK[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]H3K8b(+RGD)K[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)](RGD)(-HHHK)H3K8b[(HHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]
H3K8b和H3K8b(+RGD)的末端分支包括以下序列(HHHKHHHKHHHKHHH)。(-HHHK)H3K8b的末端分支包括以下序列(HHHKHHHKHHH)。稳定剂(如聚乙烯二醇(PEG)或羟丙基甲基丙烯酰亚胺(HPMA))和/或靶向配基可以任选地被加入至高分支聚合物的末端分支和/或其核心。
本发明的多肽能够被化学合成并通过现有技术中公知的技术纯化。例如，分支多肽可以通过任何现有技术中已知的方法制备，所述方法用于将任何天然存在或合成的氨基酸共价连接至多肽链中任何天然存在或合成的氨基酸，所述多肽链具有能够与所述氨基酸上的氨基或羧基基团反应以与所述多肽链成为共价连接的侧链基团。特别地，具有游离氨基侧链基团的氨基酸(例如但不限于二氨基丁酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸和瓜氨酸)能够被掺入多肽以便氨基酸能够随其形成分支，例如通过形成从所述残基至所述游离氨基侧基的多肽键。或者，具有游离羧基侧链基团的氨基酸(例如但不限于谷氨酸、门冬氨酸和高瓜氨酸)能够被掺入多肽以便氨基酸能够随其形成分支，例如通过形成从所述残基至所述游离羧基侧基的多肽键。形成侧链的氨基酸能够通过任何类型的共价键被连接至多肽链中氨基酸的侧链基团，所述共价键包括但不限于多肽键、酯键和二硫键。
例如但非限制性，分支多肽能够如下制备(1)从主多肽链分支的氨基酸能够被制备为N-α-叔-丁氧羰基(N-α-tert-butyloxycarbo-nyl)(Boc)保护的氨基酸五氟苯基(Opfp)酯，此分支氨基酸所连接的主链内残基可以是N-Fmoc-α-γ-二氨基丁酸(N-Fmoc-α-γ-diaminobutyric acid)；(2)Boc保护的氨基酸与二氨基丁酸的偶联的实现可以通过向含有150ml DMF和2.25ml吡啶和50mg二甲基氨基吡啶的烧瓶中加入5克各前体并使溶液混合24小时；(3)然后可以从150ml偶联反应液中提取多肽，方法是通过在1升分液漏斗将反应液与400ml二氯甲烷(DCM)和200ml 0.12N的盐酸混合，并使各相分开，保留底部水层并使用200ml 0.12N盐酸再次提取上层两次；(4)含有多肽的溶液的脱水可以通过加入2-5克硫酸镁，滤出硫酸镁，并蒸发剩余溶液至体积约2-5ml；(5)然后二多肽(dipolypeptide)可以通过加入乙酸乙酯和随后2体积己烷而被沉淀，然后过滤收集沉淀并使用冷己烷洗涤两次；和(6)得到的滤液可以被冷冻干燥以获得光粉末(light powder)形式的想要的二多肽。通过该方法制备的分支多肽在分支的氨基酸位置上具有二氨基丁酸的取代。使用N-Fmoc偶联形式的氨基酸或氨基酸类似物，可以类似于上述过程制备含有不同于二氨基丁酸的氨基酸或氨基酸类似物取代物的分支多肽。
转运聚合物的多肽也可以由病毒DNA编码并被表达在病毒表面。或者，组氨酸能够使用水溶性二碳酰亚胺通过酰胺键共价连接于蛋白质。
HK转运聚合物还可以包括多肽—“合成单体”共聚物。在这些实施方案中，转运聚合物骨架可以包括共价连接的多肽片段和合成单体或合成聚合物的片段。合成单体或聚合物可以是生物相容的和/或生物可降解的。合成单体的例子包括含有至少一个用于结合多肽的反应位点的乙烯化(ethylenically)或乙炔化(Acetylenically)不饱和单体。适当的单体以及用于制备多肽—“合成单体”共聚物的方法在Nowinski等人的题为″Polymerizable compounds and methods for preparing synthetic polymers thatintegrally contain polypeptides″的美国专利第4,511,478号中有所描述，其在这里通过引用并入本文。当转运共聚物包含分支聚合物时，合成单体或聚合物可以被掺入骨架和/或分支。此外，骨架或分支可以包括合成单体或聚合物。最后，在该实施方案中，分支单体可以是分支氨基酸或分支合成单体。分支合成单体可以包括例如含有至少一个取代反应性侧基的乙烯化或乙炔化不饱和单体。
根据本发明的siRNA的非限制性例子是靶向Raf-1序列5’-AAUGUCCACAUGGUCAGCACC-3’(SEQ ID 1)的siRNA。本发明还包括其他形式的siRNA。
本发明的体外递送方法可以包括例如(i)从受治疗者中取出细胞；(ii)通过将所述细胞与含有siRNA和HK聚合物的递送组合物(转染复合物或含有这种转染复合物的组合物)接触而将siRNA导入细胞；和(iii)将所述细胞再导入所述受治疗者。
对于基于局部注射(例如瘤内、肌内、腹膜腔内、心内和雾化的治疗)的体内治疗，组氨酸和非组氨酸氨基酸的整体含量可以使分支的转运聚合物整体上可溶于水。当分支的转运聚合物由氨基酸组成时，分支的转运聚合物可以被设计使得组氨酸和非组氨酸亲水氨基酸(即，具有带电荷或不带电荷的极性侧链的氨基酸)的含量使分支的转运聚合物可溶于水。在这些实施方案中，组氨酸和非组氨酸亲水性氨基酸可以占分支的转运聚合物中氨基酸的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。或者，可以通过将亲水性基团(即，可溶性配基、可溶性药剂，等)共价连接于转运聚合物而使不溶于水的分支转运聚合物可溶于水。当药剂是核酸(一般负电荷)并希望与转运聚合物非共价连接时，非组氨酸氨基酸可以选自具有中性亲水性侧链的氨基酸(例如，丝氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)和具有在生理pH下带正电荷的侧基的氨基酸(例如，赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸)，且可以是赖氨酸。当考虑到水溶性分支转运聚合物和水溶性药剂(例如DNA)的非共价连接时，HK转运聚合物和siRNA在注射之前不需要被连接。虽然药物递送复合物在注射前形成是优选的，但转运聚合物和siRNA可以被顺序(以任一顺序)或同时注入(通过局部注射)以在注射位置形成药物递送组合物。
本发明还涉及形成转染复合物的方法，例如通过将siRNA与HK转运聚合物混合。在转染复合物中，转运聚合物与siRNA的比例可以是约0.5∶1(wt/wt)至约24∶1(wt/wt)，或约0.5∶1(wt/wt)至约24∶1(wt/wt)，或约0.5∶1(wt/wt)至约6∶1(wt/wt)，或约3∶1(wt/wt)至约6∶1(wt/wt)。
本发明进一步涉及转染复合物，其包括siRNA和HK转运聚合物。根据本发明的转运复合物可以包括本发明的任何HK聚合物。根据本发明的转染复合物的非限制性例子包括选自H3K8b、H3K8b(+RGD)、(-HHHK)H3K8b和(-HHHK)H3K8b(+RGD)的一种或多种聚合物。
根据本发明的转运HK聚合物可以通过本领域技术人员已知的方法合成。作为非限制性的例子，这里讨论的某些HK聚合物可以被如下合成。在马里兰大学的Biopolymer Core Facility可以被用来在Ranin Voyager固相合成器(PTI，Tucson，AZ，USA)上合成例如下述HK聚合物(1)H2K4b(83mer；分子量11137Da)；(2)H3K4b(71mer；分子量9596Da)；(3)HK4b(79mer；分子量10896Da)；4)H3K8b(163mer；分子量23218Da)；(5)H3K8b(+RGD)(166mer；分子量23564Da)；(6)(-HHHK)H3K8b(131mer；分子量18901Da)；(7)(-HHHK)H3K8b(+RGD)(134mer；分子量19243Da)；(8)((K+)H3K8b(+RGD)(174mer；分子量24594Da)。某些分支聚合物的结构在图1和9中显示。具有4个分支的聚合物(例如H3K4b、HK4b)可以通过现有技术已知的方法合成。对于具有8个末端分支的高分支聚合物的合成的序列可以是如下(1)RGD或其他配基(如果存在)；(2)3-赖氨酸核心；(3)组氨酸富集的结构域；(4)赖氨酸的添加；和(5)末端分支。RGD序列可以首先通过仪器随后通过与(fmoc)-赖氨酸-(Dde)(赖氨酸核心)的三次人工偶联而被合成。(Dde)保护基团可以在自动脱保护循环过程中被去除。然后可以通过仪器将包含组氨酸富集结构域的活化的氨基酸连续加至赖氨酸核心。(fmoc)-赖氨酸-(fmoc)氨基酸被加至组氨酸富集的结构域并然后去除fmoc保护基团。然后可以将末端分支的活化的氨基酸加至该赖氨酸的α和ε氨基。通过现有技术已知的方法将肽从树脂裂解并沉淀。
作为非限制性的例子，本发明的聚合物可以进行如下分析。聚合物可以首先通过高效液相色谱(HPLC；Beckman，Fullerton，CA，USA)并且如果HPLC揭示聚合物的纯度为95％或更高则可以不被进一步纯化。聚合物可以例如使用System Gold操作软件，使用具有二元溶剂系统的Dynamax21-4×250mm C-18反相制备柱在HPLC柱上进行纯化。检测可以在214nm下进行。聚合物的进一步分析可以例如使用Voyager基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)和氨基酸分析(AAA Laboratory Service，Boring，OR，USA)来进行。转染试剂如SuperFect(Qiagen，Valencia，CA)、Oligofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)和Lipofectamine(Invitrogen)可以根据生产商的说明书来使用。DOTAP脂质体可以通过现有技术已知的方法来制备。
本发明进一步涉及包括本发明的转染复合物的组合物。这种组合物可以包括例如一种或多种与HK聚合物和/或siRNA连接的细胞内递送组分。所述细胞内递送组分可以包括例如脂类(如阳离子脂类)、过渡金属或对于本领域技术人员来说显而易见的其他组分。
在某些实施方案中，本发明的组合物包括适当的载体，如药学上可接受的载体。在这些实施方案中，这些载体可以是或不是病毒或脂质体组分。在这些实施方案中，由转运聚合物和siRNA形成的复合物可以在pH约5.0和7.4之间是稳定的。
在某些实施方案中，转染复合物组合物包括转运聚合物(其可以作为细胞内递送组分)和siRNA。在这些实施方案中，转运聚合物可以作为细胞内递送组分而不需要其他递送组分，或者可以与其他递送组分结合起作用。
在其他实施方案中，转染复合物组合物可以包括(i)转运聚合物，(ii)至少一种与所述转运聚合物连接的细胞内递送组分，和(iii)与细胞内递送组分和/或转运聚合物连接的siRNA。制备这些组合物的方法可以包括将(i)和(ii)组合至足以使转运聚合物与siRNA连接成稳定复合物的时间。组分(i)、(ii)和(iii)可以适当载体提供，如药学上可接受的载体。在包括不同于转运聚合物的细胞内递送组分的实施方案中，转运聚合物可以通过非共价或共价相互作用与细胞内递送组分(如脂质体)相互作用。
转运聚合物可以通过非共价或共价相互作用与siRNA相互作用。或者，在整个复合物环境中，转运聚合物不需要与siRNA直接相互作用，而转运聚合物可以与细胞内递送组分相互作用，所述细胞内递送组分又与siRNA相互作用。
本发明的细胞内递送组分可以是转运聚合物本身。当不同于转运聚合物的细胞内递送组分被使用时，这种递送组分可以是病毒或非病毒组分。适当的病毒性细胞内递送组分包括但不限于反转录病毒(如鼠白血病病毒、禽类慢病毒属)、腺病毒和腺伴随病毒、单纯性疱疹病毒、鼻病毒、仙台病毒和痘病毒类。适当的非病毒性细胞内递送组分包括但不限于脂类和各种基于脂类的物质，如脂质体和微胶粒，以及各种现有技术已知的聚合物。
适当的脂类包括但不限于磷酸甘油酯、神经鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰卵磷脂、双亚油酰磷脂胆碱、鞘糖脂、兼性脂类。脂类可以是单层或多层脂质体形式。
细胞内递送组分可以包括但不限于阳离子脂类。许多这样的阳离子脂类是现有技术已知的。已经制备了多种阳离子脂类，其中二酰基甘油或胆固醇疏水基团通过代谢可降解的酯键与阳离子首基相连，例如1，2-二(油酰氧基)-3-(4-′-三甲基铵)丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-(4′-三甲基铵)丁酰-sn-甘油(DOTB)、1，2-二油酰基-sn-丁二酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)和胆固醇基(4′-三甲基铵)丁酸酯(ChoTB)。其他适当的脂类包括但不限于阳离子非pH敏感脂类，如1，2-二油酰-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(DORI)、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)和1，2-二肉豆蔻氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)。其他非pH敏感阳离子脂类包括但不限于O，O′-二月桂基-N-[p-(2-三甲基铵乙基氧)苯甲酰]-N，N，N-三甲基氯化铵、Lipospermine、DC-胆固醇(3β[N-(N′N″-二甲基氨基乙烷)羰基]胆固醇)、脂多(L-赖氨酸)、含有N-(α-三甲基铵乙酰基-二月桂基-D-谷氨酸氯化物的阳离子多层脂质体(TMAG)、TransfectACE TM(DDAB(双十八烷基二甲基溴化铵)和DOPE的比例为1∶2.5(w∶w))(Invitrogen)和lipofectAMINETM(DOSPA(2，3-油酰氧-N-[20([2，5-二[(3-氨基-丙基)氨基]-1-氧戊]氨基)乙基]-N，N-二甲基-2，3-二(9-十八碳烯基氧基)-1-丙基三氟乙酸铵)与DOPE的比例为3∶1(w∶w))(Invitrogen)。其他适当的脂类在Wolff等人题为″Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for deliveringbiologically active compounds″的美国专利第5,965,434号中有所描述。
可以根据本发明使用的阳离子脂类包括但不限于那些在生理学上可相容的环境中形成脂质体的脂类。适当的阳离子脂类包括但不限于选自下述的的阳离子脂类1，2-二油酰基氧丙基-3-三甲基溴化铵；1，2-二肉豆蔻氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；二甲基二十八烷基溴化铵；1，2-二油酰基-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)；3βN-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨甲酰]胆固醇(DC-胆固醇)；1，2二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱；1，2-二肉豆蔻-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱；[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-氯化铵(DOTMA)；1，3-二油酰氧基-2-(6羧精基)丙酰胺(DOSPER)；2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺-羧基酰胺)乙基]-N，N，二甲基-1-丙基三氟乙酸铵(DOSPA)；和1，2-二肉豆蔻氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)。
阳离子脂类可以与一种或多种辅助脂类(如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE))一起使用以增强转染。这些辅助脂类在阳离子脂质体中的摩尔百分比为约5-50％。另外，能够延长阳离子脂质体体内半衰期的PEG化脂类可以约0.05-0.5％的摩尔百分比存在。
根据本发明的组合物可以可选地包括一种或多种组分以提高转染、保护试剂或提高递送复合物的稳定性。例如，稳定化合物如聚乙二醇可以与脂类或转运聚合物共价连接。
根据本发明的组合物可以包括pH在约4和7.7之间的适当的缓冲溶液。优选地在中和酸性溶液至pH在约5.0和7.4之间的两个小时内，施用所述组合物。所述组合物的各种组分可以冷冻干燥并使用pH为约5.0和7.4之间的缓冲液重新溶解成原来的浓度。聚合物的稳定性和溶解性可以在弱酸性溶液中保持，特别是在与大的荷负电的大分子(如DNA)复合时。
本发明的组合物可以包括树状聚合物(dendrimer)。细胞内递送组分和siRNA可以一起包括在树状聚合物-siRNA复合物中。
本发明的组合物还可以适当地包括各种现有技术中已知的增强递送的组分。例如，所述组合物可以包括一种或多种已知的使细胞核或配基经受受体介导的细胞内吞作用等的化合物。例如，所述配基可以包括分裂内涵体的融合病毒肽，使核酸避免溶酶体降解。增强递送的组分的其他例子包括但不限于以维持表达的核蛋白、腺病毒颗粒、转铁蛋白、表面活性剂B、抗血栓调节蛋白、插入试剂、血球凝集素、去唾液糖蛋白(asialglycoprotein)、氯喹、秋水仙碱、整合素配基、LDL受体配基和病毒性蛋白(例如整合酶、LTR元件、rep蛋白、oriP和EBNA-I蛋白)或与细胞表面蛋白相互作用的病毒组分(例如ICAM、HA-I、MLV的gp70-磷酸盐运载体和HIV的gpl20-CD4)。增强递送的组分可以与转运聚合物、细胞内递送组分或药剂共价或非共价连接。例如，可以通过共价连接-RGD-或-NGR-基序来靶向至肿瘤脉管系统的递送。这可以使用肽合成器或通过用水溶性二碳二亚胺(例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)与转运聚合物上的氨基或羧基偶联来实现。这两种方法都是本领域技术人员已知的。
本发明的组合物可以适当地包括过渡金属离子，如锌离子。本发明的复合物中过渡金属的存在可以提高转染率。
本发明进一步包括用于检测用于转染入细胞中的有效的siRNA载体的测定法。这些测定法包括将siRNA与转运聚合物混合以形成转染复合物；将所述转染复合物与一种或多种细胞接触；和检测细胞内siRNA活性的存在或不存在。在某些实施方案中，使siRNA针对β-半乳糖苷酶。
本发明还提供了包括使用本发明的复合物或组合物治疗疾病的方法。特别地，提供了通过给患者施用治疗有效量的本发明的复合物或组合物来治疗患病患者的方法。还包括通过给患者施用由这里公开的方法所转染的细胞来治疗患病患者的方法。可使用所述复合物、组合物和方法治疗的遗传和/或非肿瘤性疾病的例子包括但不限于以下腺苷脱胺酶缺乏症、嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症、有p47phox缺陷的慢性肉芽肿性疾病、具HbS的镰状细胞、β-珠蛋白生成障碍性贫血、范康尼氏贫血、家族性高胆固醇血症、苯丙酮尿症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、载脂蛋白E缺乏、血友病A和B、肌肉萎缩症、纤维囊泡症、帕金森症、色素性视网膜炎、溶酶体贮存病(例如粘多糖1型、Hunter、Hurler和Gaucher)、糖尿病性视网膜病、人免疫缺陷病毒病病毒性感染、获得性贫血、心脏及外周血管疾病和关节炎的疾病。在一些上述疾病例子中，治疗基因可以编码遗传或获得性疾病的替代酶或蛋白质、反义或核酶分子、诱饵分子或自杀基因产物。
使用siRNA的体外和体内基因治疗还可用于癌症。这些针对癌症的siRNA应用包括但不限于1)减少生长因子的表达，减少增进细胞循环的蛋白质(如Raf-1、PI-3激酶)，生长因子受体(例如EGFR、Her-2)，或对肿瘤的支持细胞关键的蛋白质(例如，用于肿瘤内皮细胞的VEGF、VEGFR1-2)；2)靶向或减少抗细胞凋亡的因子(例如，BCL-2)的表达；和3)靶向那些减少针对肿瘤的免疫活性的蛋白质或酶。
本发明还提供了体外基因治疗的方法，其包括(i)从所述患者取出细胞；(ii)通过将所述细胞与转染复合物或含有本发明的这种转染复合物的组合物接触而将核酸(如siRNA)递送至所述细胞内部；和(iii)给所述患者施用包含所述核酸(如siRNA)的所述细胞。
重组细胞可以使用本发明的复合物来生成。生成的重组细胞可以通过现有技术已知的各种方法被递送至受治疗者。在某些实施方案中，注射重组细胞，例如皮下注射。在其他实施方案中，重组皮肤细胞可以作为皮肤移植物被应用到患者。重组血液细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)优选地由静脉注射。所述细胞还可以被包入适当的载体中，然后植入受治疗者(见，例如，Dionne等人的PCT公开WO92/19195，日期为1992年11月12日)。施用细胞的量取决于现有技术中已知的多种因素，例如预期效果、受治疗者状态、嵌合多肽的表达率等，并且容易由本领域技术人员测定。
下述实施例描述了本发明的特定实施方案。这里列出的实施例意于说明性并不应该以任何方式用来限制所要求的发明的范围。正如对本领域技术人员将是显而易见的，各种变化和修改是可能的并被认为在所描述的发明的范围之内，并且可以被本领域技术人员所实施而不背离本发明精神。
实施例实施例1方法通过本领域技术人员已知的方法在Ranin Voyager合成器(PTI，Tucson，AZ)上合成几种分支聚合物。然后根据它们递送siRNA进入SVR-bag4细胞、MDA-MB-435细胞和C6细胞的能力来筛选这些聚合物。在确定一个聚合物H3K8b为有效的siRNA载体并使用流式细胞仪考察其毒性后，合成其他的聚合物来测定对siRNA转运重要的结构域。然后分别使用N4亚微米颗粒尺寸分析仪(Submicron Particle Size Analyzer)和Delsa 440 SXζ电势分析仪(Zeta Potential Analyzer)来计算HK∶siRNA复合物的尺寸/ζ电势。
细胞系MDA-MB-435(一种恶性乳腺癌细胞系)、C6(大鼠神经胶质瘤细胞系)、C6/lacZ(表达β-半乳糖苷酶的C6系)和SVR-bag4(小鼠内皮细胞系，被SV病毒转化，其表达β-半乳糖苷酶)保存在含有约10％胎牛血清和约20mM谷胺酰胺的杜尔贝科氏最低必需培养基(DMEM)中。
转染剂HK聚合物和其他载体马里兰大学的生物聚合物核心实验室在Ranin Voyager合成器(PTI，Tucson，AZ)上合成了HK聚合物。所述分支的聚合物的结构在图1和9中所示。然后使用HPLC纯化聚合物。转染剂SuperFect(Qiagen)、Oligofectamine(Invitrogen)和Lipofectamine(Invitrogen)根据生产商的说明书来使用。如这里所述制备DOTAP。
siRNAsiRNA复合体以及它们的靶如下1)荧光素酶siRNA，有意义链为5′-CUU ACG CUG AGU ACU UCG A dTdT-3′(SEQ ID 2)，反义链为5′-U CGA AGU ACU CAG CCU AAG dTdT-3′(SEQ ID 3)(靶5′-CTT ACGCTG AGT ACT TCG-3′(SEQ ID 4))；和2)β-半乳糖苷酶(β-gal)siRNA，有意义链为5′-CAG UUG CGC AGC CUG AAU G dTdT-3′(SEQ ID 5)，反义链为5′-CAG UUG CGC AGC CUG AAT G dTdT-3′(SEQ ID 6)(靶5′-AAC AGUUGC GCA GCC UGA AUG-3′(SEQ ID 7))。关于siRNA输入研究，Cy3-标记的siRNA(有意义链为5′-CGU ACG CGG AAU ACU UCG A-dTdT-3′(SEQID 8)，反义链为5′-T CGA AGU AUU CCG CGU ACG-dTdT-3′(SEQ ID 9))购自Darmacon。
siRNA转染开始，将3×104SVR-bag4细胞铺板入每孔含有约500μl添加10％血清的DMEM的24孔板中。约24小时后，当细胞约有40％融合时，将转染复合物加入培养基。制备载体与siRNA(除非另有说明，比例4∶1)的复合物，siRNA(2μg)于OptiMEM中与载体(约8μg)快速混合好并在室温下静置约30分钟。OptiMEM中聚合物/DNA复合物的总体积为约50μl，并将该复合物滴加至在约0.5ml DMEM/10％血清中的细胞。
对于Lipofectamine 2000，转染方法类似，除了载体∶siRNA比例是2∶1；另外，Oligofectamine∶siRNA比例是2∶1并且在培养基换为DMEM/10％FCS之前将复合物加入0.5ml DMEM中的细胞维持4小时。
β-半乳糖苷酶染色和活性检测。在β-半乳糖苷酶siRNA转染SVR-bag4细胞后约48小时，通过使用β-半乳糖苷酶染色和检测试剂盒(Invitrogen)如生产商的说明来测定β-半乳糖苷酶的细胞内水平。从被转染细胞去除生长培养基，然后用PBS洗涤。对于染色，细胞在室温下固定约10分钟并用PBS洗涤2次；将X-gal染色溶液加至细胞并在约37℃下培育约6小时。为测定β-半乳糖苷酶活性，将裂解缓冲液(约50ml)加至各细胞，然后将所述细胞冻融3个循环。然后将β-半乳糖苷酶的底物ONPG与细胞一起在37℃下培育30分钟。使用1M碳酸钠溶液终止反应并在420nm下测定吸光度，将β-半乳糖苷酶特异活性记录为水解的ONPG的纳摩尔数/min/mg蛋白裂解物。
使用荧光素酶表达质粒和靶向荧光素酶的siRNA共转染。将约1×105MDA-MB-435细胞铺板入24孔板后约24小时以达到约70％的融合，使用质粒和siRNA共转染这些细胞。同时分别制备荧光素酶表达质粒(Promega，Madison，Wi)与SuperFect的复合物(2∶1)，和siRNA(靶向荧光素酶的mRNA)与几种载体中的一种的复合物。然后将这两种复合物一起加入至细胞；约24小时后，细胞经PBS洗涤并随后用约100μl的1×被动裂解缓冲液(Promega Corp)裂解。使用BCA蛋白质检测试剂盒(Pierce)检测蛋白质浓度。使用直流电Turner 20/20光度计(Turner Design，Sunnyvale，CA)测定荧光素酶活性。使用重组荧光素酶(Promega，Madison，WI)作为标准将相对光单位转换为荧光素酶的皮克(pg)数。每个浓度检测双份并进行三次独立实验。
结果在稳定表达了β-半乳糖苷酶的内皮细胞系(SVR-bag4)中，siRNA与H3K8b聚合物的复合物抑制了β-半乳糖苷酶表达超过80％。相似地，H3K8b与靶向荧光素酶的siRNA的复合物抑制了MDA-MB-435细胞中的荧光素酶表达。相比之下，作为有效的质粒载体的聚合物H2K4b不是有效的siRNA载体。在抑制其靶的最佳浓度下，H3K8b∶siRNA复合物具有最低的毒性。组氨酸富集的结构域和H3K8b末端臂的长度似乎影响siRNA的递送。然而，尺寸和表面电荷没有表现出影响递送siRNA。
结论因此，认为复杂程度和序列特异性都是用于开发siRNA的HK载体的因素。特别地，本发明的发明人发现某些具有8个末端分支和组氨酸富集结构域的分支HK聚合物(H3K8b和类似的结构类似物)是有效的siRNA载体。
实施例2摄取实验如上所述使用载体(DOTAP，Lipofectamine，或H2K4b，或H3K8b)与Cy3-标记的siRNA的复合物来转染细胞；约4小时后，使用Diaphot-TMD荧光显微镜，100×(Nikon，Tokyo，Japan)获得影像。
流式细胞仪。按生产商的关于Vybrant Apoptosis Assay#4(分子探针)的说明，来测定使用H3K8b∶siRNA复合物转染后的细胞毒性。在转染之前24小时，将2×105SVR-bag4细胞铺板于12孔板的各孔中。使用表达β-半乳糖苷酶的siRNA(约2μg)与载体(H3K8b，DOTAP，Lipofectamine，8μg；Oligofectamine，Lipofectamine 2000；4μg)的复合物转染所述细胞。然后约24小时后收集细胞，在冷1×PBS中洗涤，并将细胞悬浮于约1mlPBS中。向该悬浮液中加入约1μl的绿色荧光染料母液(YO-PRO-1)和约1μl的红色荧光母液(碘化丙啶)。在冰上培育约30分钟之后，通过FACScan(BectonDickinson，San Jose，Ca)使用488nm激发光分析那些具有活力的细胞、坏死的细胞和/或凋亡的细胞的数目。然后在扣除未处理组的无活力的细胞之后，从不同的载体∶siRNA复合物计算无活力的细胞的百分数(见图7和8)。
图8中描述的数据表示三次实验的平均值和S.D.；**P＜0.001，H3K8b(+RGD)vs.Lipofectamine、Lipofectamine2000或Olifofectamine(使用Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析(ANOVA))。复合物中转染载体∶siRNA的比例是4∶1(w/w)，除了使用Lipofectamine2000和Oligofectamine的复合物中的比例为2∶1。
DNA-HK聚合物复合物的尺寸和ζ电势的检测。与前述转染复合物类似制备HK聚合物、H3K8b(-RGD)和H2K4b(24或48μg)与质粒DNA(约12μg)的复合物。在聚合物复合物于Opti-MEM(约300μl)中静置约30分钟后，将约950μl Hepes缓冲液(约20mM，pH约7.5)加入至微孔中。通过在N4亚微米颗粒尺寸分析仪(Beckman Coulter，Hialeah，FL)上测量在约90度角的光散射来测定各种复合物的颗粒尺寸。将颗粒尺寸记录为从Unimodal分析得到的平均尺寸，所述分析使用仪器生产商提供的软件进行。使用Delsa 440 SX仪器(Coulter)来检测ζ电势(颗粒表面电荷的量度)。根据颗粒在电场中的可动性而测量ζ电势值。每个数据点代表三次测量的平均值±S.D.。
结果H3K8b是有效的siRNA载体。合成了几种HK肽并将其作为siRNA进入细胞的载体检验。这些作为siRNA载体试验的HK肽的代表在图1中显示。在图2中，比较了这些HK载体在递送靶向于SVR-bag4细胞中表达的β-半乳糖苷酶(β-gal)的siRNA的效率。具有4个末端分支的载体不是特别有效的siRNA载体，适当地除了H3K4b。值得注意的是，如H2K4b的肽，有效的质粒载体，不是成功的siRNA载体。具有8个末端分支的H3K8b聚合物是最有效的siRNA载体，其减少细胞内靶约80％。与其他HK聚合物比较，它是高分支的并具有最高百分比的组氨酸和最低百分比的赖氨酸。H3K8b用于质粒转染比H2K4b的效率小约5倍。β-半乳糖苷酶染色证实了H3K8b与β-半乳糖苷酶siRNA的复合物显著抑制了SVR-bag4细胞中的β-半乳糖苷酶活性(图3)。
还测定了用于减少β-半乳糖苷酶表达的H3K8b∶siRNA的比例。所述比例从约0.5∶1至约6∶1(wt∶wt)或在约3∶1和约6∶1之间变化(图4)。3∶1 wt∶wt的比例相当于约1.7 N(+)∶P(-)的比例。接下来，发现SVR-bag4细胞的β-半乳糖苷酶染色被H3K8b(+RGD)与β-半乳糖苷酶siRNA的复合物显著抑制(图3)。另外，在稳定表达β-半乳糖苷酶的C6细胞系中，H3K8b与β-半乳糖苷酶siRNA的复合物抑制了约60％的β-半乳糖苷酶的表达。
实施例3经由H3K8b介导的荧光素酶siRNA递送的荧光素酶活性的显著抑制。本发明的发明人接下来测定了H3K8b(+RGD)在转运靶向恶性细胞系、MDA-MB 435细胞中转染的荧光素酶的siRNA中的效率(图5)。使用荧光素酶表达质粒与SuperFect的复合物连同靶向荧光素酶的siRNA与载体H3K8b(+RGD)、H3K4b或DOTAP之一的复合物共转染这些细胞。结果显示，与H3K8b∶β-半乳糖苷酶siRNA对照相比，H3K8b(+RGD)∶Luc siRNA复合物是最有效的，抑制了约90％荧光素酶活性。因此，在表达β-半乳糖苷酶的SVR-bag4细胞中和在使用MDA-MB-435细胞的共转染实验中，H3K8b(+RGD)都是最有效的siRNA载体。
实施例4H3K8b(+RGD)介导的siRNA递送在几种细胞系中是高效的。为测定H3K8b(+RGD)作为有效的siRNA载体的机制，检测了H3K4b(+RGD)∶siRNA在三种细胞系(SVR-bag4、MDA-MB-435和C6细胞)中的摄取。这些细胞然后用Cy3标记的siRNA与DOTAP(4∶1比例；载体(mg)/siRNA(mg)比例)、Lipofectamine(4∶1)或H3K8b(+RGD)(4∶1)的复合物进行转染。如图6所示，使用H3K8b(+RGD)载体的siRNA荧光比使用DOTAP和Lipofectamine基团要强很多。另外，由H3K8b(+RGD)向细胞内转运的siRNA荧光比包括H2K4b和HK4b在内的其他HK载体更强(数据未显示)。在三种细胞系中，由H3K8b递送的Cy3标记的siRNA显示了分离的荧光焦点和外周分布。通过HK载体的SiRNA的摄取与预期效果有关。
使用H3K8b(+RGD)∶siRNA复合物观察到最低的毒性。在使用YO-PRO-I和PI染料对转染的SVR-bag4细胞群进行染色后，凋亡细胞显示绿色荧光，死亡细胞显示红色和绿色荧光，活力细胞显示很少或没有荧光。H3K8b(+RGD)与β-半乳糖苷酶siRNA(H3K8b(+RGD)∶siRNA；4∶1wt/wt比例)的复合物与未处理的细胞相比显示了最小的毒性(图7)，具有最小的细胞凋亡和/或细胞死亡。包括Oligofectamine和Lipofectaniine 2000在内的其他siRNA载体对细胞明显具有更多的毒性(图7)。在双重转染实验中，将细胞群分成活力组(V)、凋亡组(A)和坏死(N)组。对于未处理的细胞，活力细胞、凋亡细胞和坏死细胞的比例分别是95.79、1.65和1.75；对于H3K8b∶siRNA复合物，活力细胞、凋亡细胞和坏死细胞的比例分别是91.99、2.22和1.39。因此，来自HK∶siRNA复合物的细胞凋亡和/或细胞死亡少于约5％。数据表示三次实验的平均值。
实施例5H3K8b的结构域。在某些实施方案中，本发明的发明人开发了下述几种有助于转运siRNA的H3K8b的结构域1)末端分支(例如，HHHKHHHKHHHKHHH)，其可能与siRNA结合；2)组氨酸富集核心(H8)；和3)结合整合素的结构域。将整合素结合配基(+RGD)添加至H3K8b可以增强siRNA的转运和效力。为考察这些对siRNA输入而言可能重要的区域，本发明的发明人合成了几种HK聚合物，其中改变了H3K8b的结构域(见例如，图9)。将-RGD添加至H3K8b(例如H3K8b(+RGD))稍微提高了siRNA在SVR-bag4细胞(图10)和在MDA-MB-435细胞中的效力，观察到，使用H3K8b(+RGD)作为siRNA载体与H3K8b比较提高siRNA效力20％。当将几种氨基酸从H3K8b或H3K8b(+RGD)的末端分支去除时，siRNA的转运聚合物的效力最低限度地降低(约25％)。因此，存在对截短运载siRNA的H3K8b的末端分支的长度的耐受性。
当将一个赖氨酸添加至各末端分支(每个聚合物8个额外的赖氨酸)时，分支HK聚合物作为siRNA载体的效力显著降低。
在另外一个实施方案中，使用甘氨酸取代H8结构域，结果显示了siRNA的效力降低约3倍。
H3K8b∶siRNA复合物的最佳比例(wt∶wt)是在约2∶1和约4∶1之间。值得注意的是，H3K8b作为siRNA进入SVR-bag4细胞的载体比Oligofectamine更好。
实施例6HK∶siRNA复合物的尺寸和ζ电势。本发明的发明人接下来比较了H3K8b和H2K4b与β-半乳糖苷酶siRNA的复合物的尺寸和电势。虽然H3K8b是有效的siRNA载体，而H2K4b不是有效的siRNA载体。值得注意的是，H3K8b和H2K4b聚合物都缺乏整合素配基RGD。如表1所示，H3K8b复合物的尺寸适当地小于H2K4b复合物。
表1HK聚合物的尺寸和ζ电势
类似地，使用Opti-MEM(300μl)制备作为转染复合物的HK聚合物(48μg或96μg)与质粒DNA(12μg)的复合物。在聚合物复合物静置30分钟后，加入约950μl的Hepes缓冲液(pH 7.5，20mM)。分别使用N4型亚微米颗粒尺寸分析仪和Delsa 440 SXζ电势分析仪检测尺寸和表面电荷。各数据点表示三次测量的平均值。
由于H3K8b∶siRNA复合物具有较大的组氨酸∶赖氨酸比例(其中组氨酸在生理pH下具有较少电荷)，其ζ电势与H2K4b∶siRNA复合物相比降低。虽然以2∶1比例制备的H3K8b∶siRNA和以4∶1比例制备的H2K4b∶siRNA的ζ电势是相似的，但它们运转siRNA的能力是显著不同的。而且，虽然ζ电势通过改变H3K8b∶siRNA的比例而从正变为负，但通过改变H3K8b∶siRNA比例的经由这些正到负对lacZ mRNA的抑制与经由这些具有不同电荷的复合物对lacZ mRNA的抑制是相似的。对于H3K8b聚合物∶β-半乳糖苷酶siRNA复合物，在2∶1和6∶1之间的比例是最好的并相似地抑制了细胞内β-半乳糖苷酶水平。
实施例7合成了几种聚合物，其改变了H3K8b的一个或多个结构域，H3K8b(+RGD)添加了整合素配基RGD；(+K)H3K8b(+RGD)添加了单个赖氨酸至各末端分支；H3K(G)8b(+RGD)用单个甘氨酸(用G表示)取代了组氨酸富集的结构域；(-HHHK)H3K8b或(-HHHK)H3K8b(+RGD)从各末端分支去除了氨基酸。H3K8b的这些修饰的示意图在图9中描述。由实线连接的三个实心环表示3赖氨酸核心，且K表示赖氨酸，其中两个末端分支是接合的。
含有整合素配基的H3K8b的有效类似物H3K8b(+RGD)能够显著抑制细胞内β-半乳糖苷酶的表达。另外，测定了H3K8b(+RGD)与靶向荧光素酶的siRNA的复合物抑制了荧光素酶在MDA-MB-435细胞中的表达。在抑制其靶的最佳浓度下，H3K8b(+RGD)∶siRNA复合物具有最小的毒性。相比之下，siRNA的载体如Oligofectamine和Lipofectamine 2000明显毒性更大。
向(+K)H3K8b(+RGD)的末端分支添加单个赖氨酸或用甘氨酸取代H3K(G)8b(+RGD)中的组氨酸富集结构域(H8)显著降低了这些聚合物作为siRNA载体的能力。
图10中描述的数据表示三次实验的平均值±S.D.；**P＜0.01未处理的vs.Oligofectamine、H3K8b、(-HHHK)H3K8b、H3K8b(+RGD)和(-HHHK)H3K8b(+RGD)，**P＜0.01，Oligofectamine vs.H3K8b(+RGD)或(-HHHK)H3K8b(+RGD)(使用Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析)。复合物中HK聚合物和Oligofectamine与siRNA的比例分别是4∶1和2∶1(w/w)。
如图10中所示，H3K8b(+RGD)比Oligofectamine和lipofectamine 2000有利地作为siRNA进入SVR-bag4细胞的载体；H3K8b(+RGD)和Lipofectamine 2000作为siRNA载体分别降低了81.9±0.1％和74.2±0.4％的β-半乳糖苷酶(P＝0.053；Mann-Whitney秩和检验)。
虽然通过特定实施方案及其应用的方式描述了本发明，但可以做出大量修改和改变而不背离本发明的精神和范围。所附权利要求的范围不限于所描述的特定实施方案。
权利要求
1.一种使用siRNA转染细胞的方法，其包括将转染复合物与一种或多种细胞相接触；其中所述转染复合物包括转运聚合物和siRNA，且其中所述转运聚合物包括组氨酸和赖氨酸。
2.权利要求1所述的方法，其中所述转运聚合物包括6-10个末端分支。
3.权利要求2所述的方法，其中所述转运聚合物包括至少一种具有序列-HHHKHHHKHHHKHHHHKHHH-或其亚片段的末端分支。
4.权利要求1所述的方法，其中所述转运聚合物包括至少一种稳定剂。
5.权利要求1所述的方法，其中所述稳定剂包括PEG。
6.权利要求1所述的方法，其中所述转运聚合物包括靶向配基。
7.权利要求1所述的方法，其中所述聚合物包括一种或多种选自H3K8b、H3K8b(+RGD)、(-HHHK)H3K8b和(-HHHK)H3K8b(+RGD)的聚合物。
8.权利要求1所述的方法，其中所述聚合物包括H3K8b。
9.权利要求1所述的方法，其中所述聚合物包括H3K8b(+RGD)。
10.权利要求1所述的方法，其中所述聚合物包括(-HHHK)H3K8b。
11.权利要求1所述的方法，其中所述聚合物包括(-HHHK)H3K8b(+RGD)。
12.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种细胞包括一种或多种选自转化细胞系、重组细胞系、恶性细胞系和原代细胞系的细胞。
13.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种细胞包括一种或多种选自SVR-bag4、MDA-MB-435、C6和HUVEC细胞系的细胞。
14.权利要求1所述的方法，其中所述siRNA靶向Raf-1序列。
15.一种使用siRNA转染细胞的方法，其包括将siRNA与包含组氨酸和赖氨酸的转运聚合物混合以形成转染复合物；使所述转染复合物在约室温下静置约15分钟至约1.5小时；和将所述转染复合物与一种或多种细胞接触。
16.一种制备转染复合物的方法，其包括将siRNA与包含组氨酸和赖氨酸的转运聚合物混合；其中所述转运聚合物包含6-10个末端分支。
17.权利要求16所述的方法，其中所述转运聚合物与所述siRNA的比例是约0.5∶1(wt/wt)至约24∶1(wt/wt)。
18.权利要求16所述的方法，其中所述聚合物包含至少一个具有序列-HHHKHHHKHHHKHHHKHHH-或其亚片段的末端分支。
19.权利要求16所述的方法，其中所述聚合物包括一种或多种选自H3K8b、H3K8b(+RGD)、(-HHHK)H3K8b和(-HHHK)H3K8b(+RGD)的聚合物。
20.一种转染复合物，其包括siRNA和包含组氨酸和赖氨酸的转运聚合物；其中所述转运聚合物包含约6至约10个末端分支。
21.权利要求20所述的转染复合物，其中所述聚合物包括一种或多种选自H3K8b、H3K8b(+RGD)、(-HHHK)H3K8b和(-HHHK)H3K8b(+RGD)的聚合物。
22.权利要求20所述的转染复合物，其中所述siRNA靶向Raf-1序列。
23.权利要求20所述的转染复合物，其中所述转运聚合物与所述siRNA的比例是约0.5∶1(wt/wt)至约24∶1(wt/wt)。
24.一种组合物，其包含权利要求20所述的转染复合物。
25.一种治疗患有一种或多种疾病的患者的方法，其包括给所述患者施用治疗有效量的一种转染复合物；其中所述转染复合物包括siRNA和转运聚合物，且其中所述转运聚合物包含组氨酸和赖氨酸并具有约6至约10个末端分支。
26.权利要求25所述的方法，其中所述一种或多种疾病包括一种或多种遗传或非肿瘤性疾病。
27.权利要求25所述的方法，其中所述一种或多种疾病包括一种或多种选自下述的疾病腺苷脱胺酶缺乏症、嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症、p47phox缺陷的慢性肉芽肿性疾病、具HbS的镰状细胞、β-珠蛋白生成障碍性贫血、范康尼氏贫血、家族性高胆固醇血症、苯丙酮尿症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、载脂蛋白E缺乏、血友病A和B、肌肉萎缩症、纤维囊泡症、帕金森症、色素性视网膜炎、溶酶体贮存病、糖尿病性视网膜病、人免疫缺陷病毒病病毒性感染、获得性贫血、心脏及外周血管疾病和关节炎。
28.权利要求25所述的方法，其中所述一种或多种疾病包括癌症。
29.一种用于治疗患有一种或多种疾病的患者的方法，其包括给所述患者施用已经通过权利要求1所述方法用siRNA转染的细胞。
30.一种用于治疗患有一种或多种疾病的患者的方法，其包括从所述患者取出细胞；通过将所述细胞与一种转染复合物接触而将siRNA递送至所述细胞；和给所述患者施用包含siRNA的所述细胞；其中所述转染复合物包括siRNA和转运聚合物，且其中所述转运聚合物包含组氨酸和赖氨酸并具有约6至约10个末端分支。
全文摘要
本发明涉及使用siRNA通过将转染复合物与一种或多种细胞相接触而转染细胞的方法，其中所述转染复合物包括转运聚合物和siRNA。所述转运聚合物可以包括例如H
文档编号A61K31/70GK101060849SQ200580039448
公开日2007年10月24日 申请日期2005年11月17日 优先权日2004年11月17日
发明者阿奇博尔德·米克森 申请人:巴尔的摩马里兰大学