神经保护性螺甾烯醇药用组合物的制作方法

专利名称：神经保护性螺甾烯醇药用组合物的制作方法
相关申请资料本申请是2003年3月14日申请的美国专利申请系列号10/389,189和2003年9月16日申请的美国专利申请系列号10/663,619的部分继续申请，这两个专利申请要求2002年3月15日申请的美国临时专利申请号60/364,140、2003年1月9日申请的美国临时专利申请号60/319,846、2004年10月14日申请的美国临时专利申请号60/618,696和2005年1月7日申请的美国临时专利申请号11/031,538的优先权。这些专利申请都通过引用结合到本文中。
背景技术：
神经细胞死亡(变性)可对个体造成潜在破坏性和不可逆的影响，其可能例如由于中风、心脏病发作或者其他大脑或脊髓局部缺血或创伤而发生。另外，与神经细胞死亡有关的神经变性性疾病包括早老性痴呆(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、亨廷顿舞蹈病(Huntington′s disease)、肌萎缩性侧索硬化、唐氏综合征(Down′sSyndrome)、中风、创伤性脑损伤、大脑缺血、大脑缺氧、癫痫发作、大脑感染性病症、脊髓震荡/切断以及科尔萨科夫精神病(Korsakoffsdisease)。
早老性痴呆(AD)是进行性神经变性性疾病，临床表现为智力功能进行性丧失。在65岁以上的人群中大约有10％受到AD困扰。在75-85岁的人群中AD的发生率为19％，在85岁以上的人群中AD的发生率为45％。AD排在心脏病、癌症和中风之后，是成人死亡的第四大主要原因。老年性痴呆(senile dementia)中大约有75％是由AD导致的。这种中枢神经系统疾病表现为多种症状，例如神经元变性、淀粉样蛋白斑发生、神经原纤维缠结、乙酰胆碱下降以及大脑皮层萎缩。AD患者起初丧失短时记忆，随后认知功能减退，最终丧失自理能力。照顾患者的费用，包括诊断、护理、家庭照顾以及工资损失在内，估计每年约为$800亿～$900亿。
早发型家族性早老性痴呆(占早老性痴呆病例的5％以下)是由APP基因的突变或者PS1和PS2基因的突变引起的。晚发型散发性早老性痴呆(占早老性痴呆病例的95％以上)尽管已发现了一些诱病因素，例如线粒体假基因CO1和CO2的突变，或例如ApoE基因的等位基因ε4，但其起源仍未知。此外，已提出了几种理论来解释该病的起源，包括淀粉样蛋白能(amyloidergic)起源、氧化应激、钙稳态破坏、线粒体功能异常/代谢下降和兴奋性氨基酸毒性。
与AD相关的严重功能减退是由于新皮质和海马区中神经炎性斑(neuritic plaque)的存在、胆碱能神经元的突触前标记物的丧失以及胆碱能神经元的丧失所致。神经炎性斑由变性轴突和神经末梢组成，经常包围着淀粉样蛋白(amyloid)核心，且通常含有反应性神经胶质成分。早老性痴呆的另一个病理特征是神经原纤维缠结，这是一种神经元内团块(mass)，由异常磷酸化τ蛋白聚合为被称作成对螺旋丝的原纤维结构发生蓄积所致。此外，神经原纤维缠结还含有高度磷酸化的神经丝蛋白。
尽管在揭示AD的病理生理学机制方面已有显著进展，但该病的起因仍不十分清楚。猜想有几个起因，例如遗传易感性(PS-1、PS-2、APP、apoE、CO1、CO2基因突变)、神经递质缺损(乙酰胆碱缺乏)、炎症、代谢降低、自由基应激或兴奋性氨基酸毒性。
根据当前对AD发病机制的了解，目前正在对几种化合物进行治疗AD的临床研究。在这些药物中引人注目的是乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂。最近，有两种AchE抑制剂——他克林及多奈哌齐已获得管理部门的批准用于治疗AD。虽然他克林对认知能力的减退提供适度的有益作用，但是由于其引起血清肝酶升高，因而也带来一些不良反应。
因此，要是有新的神经保护性药物，尤其是限制可能伴随中风、心脏病发作或者大脑或脊髓创伤发生的神经细胞死亡(变性)的程度或者对其进行治疗的药物，或者治疗神经变性性疾病如早老性痴呆、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、唐氏综合征以及科尔萨科夫精神病的药物或者任何其他上文所述病症的药物，那将是十分可取的。
早老性痴呆以称为β-淀粉样蛋白或Aβ的39-43氨基酸肽的蓄积为特征，该肽呈原纤维形式，作为细胞外淀粉样蛋白斑和神经元间沉积物而存在，也作为大脑血管壁当中的淀粉样蛋白而存在。早老性痴呆中的原纤维Aβ淀粉样蛋白沉积据认为对患者是有害的，最终会导致毒性及神经元细胞死亡，而这正是AD特有的标志。淀粉样蛋白蓄积迹象暗示它就是AD发病机制的主要诱因。
三聚体和四聚体属于淀粉样蛋白衍生的可扩散配体(ADDL)，是大约13-108kD大小的非纤维状寡聚体(Klein，Neurochem.Int.，41，345-352(2002))，在低至5-10nM的浓度下都具有强效的神经毒性特征(Lambert等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，6448-6453(1998)；Dahlgren等，J.Biol.Chem.，277(35)，32046-32053(2002))。最近的报告将ADDL描述为具有Aβ的神经毒性特征。Klein，Neurochem.Int.，41，345-352(2002)。
多种其它人类疾病也显示淀粉样蛋白沉积，并且通常累及全身器官(即位于中枢神经系统以外的器官或组织)，因淀粉样蛋白蓄积而导致器官功能障碍或衰竭。对AD和“全身性”淀粉样蛋白疾病，目前尚无药方或没有有效的治疗方法，所以患者通常从开始发病起3-10年内死亡。
尽管在AD上已做了很多研究工作，但对用于阻止AD及其它淀粉样蛋白病中发生的淀粉样蛋白形成、沉积、蓄积和/或持续的治疗方案的化合物或药物，尚知之甚少。
所以，需要有新的化合物或药物，用于阻止或逆转AD及其它淀粉样蛋白病中发生的淀粉样蛋白形成、沉积、蓄积和/或持续的治疗方案中。
因此，要是能在具有Aβ功能抑制剂活性的已鉴定现有化合物、合理修饰化合物和/或从头设计化合物的基础上，设计出新的疗法，将会是非常有益的。
此外，通过采用统称为“干细胞疗法”的方法补偿神经元损失和恢复相关的功能，来修复由AD和其他神经病症引起的大脑损害，是极其有希望的。由于能够使干细胞分化成神经元，这为神经退行性疾病和中风提供了治疗方法。已成功地将能分化成多巴胺能神经元的干细胞用于治疗罹患帕金森病的患者(T.Barberi等，NatureBiotechnology，21，1200(2003))。但是，在神经元损失量可能更大的疾病或病症，如早老性痴呆(AD)、脑中风或创伤性脑损伤中，移植分化的干细胞尽管是必需的，但可能还不足以补偿大脑损害和恢复受损功能。为获得最大的恢复效果，可能必须将移植与对原位神经发生的刺激联合进行。在成人大脑内，神经干细胞存在于室下带(SVZ)和海马齿状回(P.S.Eriksson等，Nature Medicine，4，1313(1998)；V.Silani等，Lancet，364，200(2004))，能够用药理学方法通过神经元途径诱导它们的分化，将是通向神经元替代疗法的重要一步。许多小分子如视黄酸或环巴胺(cyclopamine)已被用于在体外诱导NSC的神经元分化，但它们在体内的使用非常困难，因为它们毒性很高。地塞米松、氟西汀或格尔德霉素具有潜在危险的副作用(S.Ding等，Nature Biotech.，22，833(2004))。
因此，仍需要有一些方法，来减慢、终止或逆转神经系统疾病的进展或者改善其症状。
发明概述本发明涉及治疗、预防或减少患者发生与神经毒性、特别是β-淀粉样蛋白诱发的神经毒性有关的障碍或疾病或者相关症状的危险的方法、药盒、联合疗法和组合物。本发明化合物有一些含有共同的螺甾-5-烯-3-醇结构和具有下文公开的式(I)、式(II)或式(III)结构。
本发明涉及治疗需要用式(I)、式(II)或式(III)的神经毒性抑制剂或干细胞分化剂进行治疗的病症或障碍的方法，所述方法包括将本发明的组合物给予需要治疗的患者。更具体地说，本发明提供抑制患者脑β-淀粉样蛋白沉积物的Aβ形成或持续所致的神经毒性作用的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的式(I)、式(II)或式(III)化合物。
在一方面，本发明提供促进、维持或增强患者一种或多种选自以下的与β-淀粉样蛋白形成有关系的智力或认知特性的方法记忆力、注意力集中和短时记忆力，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的式(I)、式(II)或式(III)化合物。
在另一方面，本发明提供减轻患者一种或多种选自以下的与β-淀粉样蛋白形成有关的智力或认知结果的方法认知或记忆力减退和智力下降，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的式(I)、式(II)或式(III)化合物。
在又一方面，本发明提供治疗患者与β-淀粉样蛋白形成或持续有关的精神状态的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的式(I)、式(II)或式(III)化合物。
在再一方面，本发明提供治疗患有选自以下的神经疾病或障碍的患者的方法全脑和局部缺血性中风和出血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤(例如切除或切断)、低氧诱发或局部缺血诱发的神经细胞损伤、心博停止或新生儿窘迫引起的神经细胞损伤、癫痫、焦虑、糖尿病、多发性硬化、幻肢痛、灼痛、神经痛、带状疱疹、脊髓损害、痛觉过敏、异常性疼痛、AD、亨廷顿舞蹈病、科尔萨科夫精神病和帕金森病或者任何其他上文提及的病症，其中所述治疗包括给予所述患者治疗有效量的式(I)、式(II)或式(III)化合物。
在一个进一步的方面，本发明提供治疗患者心脏、脾脏、肾脏、肾上腺皮质或肝脏中的以称为淀粉样变性的β-淀粉样蛋白沉积为特征的疾病的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的式(I)、式(II)或式(III)化合物。
在一个进一步的方面，本发明提供诱导哺乳动物神经元前体细胞(如成体或胚胎干细胞)分化成神经元细胞或星形细胞(astrocytalcell)(如神经元和/或星形胶质细胞(astrocyte))的方法，所述方法是通过使所述神经元前体细胞在体外或体内与有效量的式(I)、式(II)或式(III)化合物接触来实施的。例如，可通过本领域现有的方法获得多潜能成体祖细胞(MAPC)。该细胞在体外分化形成神经元细胞后，将神经元细胞给予患病哺乳动物的靶部位。或者将该细胞直接给予患病哺乳动物的靶部位，同时或之后还给予分化诱导量的式(I)、式(II)或式(III)化合物，然后干细胞就在体内分化，使受损的组织再生或得到置换。
在再一个进一步的方面，本发明提供鉴定对β-淀粉样蛋白具有结合亲和性的化合物的方法，所述方法包括对与22R-羟基胆甾醇有结构同源性的已知化合物数据库进行筛选；将所述数据库中的化合物根据与22R-羟基胆甾醇的同源程度进行排序，从所述数据库中抽取出与22R-羟基胆甾醇有最高结构同源性的化合物；将所抽取的化合物按与β-淀粉样蛋白的体外结合情况进行排序；选择出具有最高体外亲和性的化合物。
在另一个方面，本发明提供通过结合β-淀粉样蛋白(Aβ)并形成稳定的无毒多聚体来抑制ADDL如Aβ三聚体和四聚体的形成的新型化合物。
在再一方面，本发明提供设计对β-淀粉样蛋白具有结合亲和性的化合物的方法，所述方法包括将22R-羟基胆甾醇绘制成两个或更多个独立结构单元(building block)；通过修饰22R-羟基胆甾醇的一个或多个单元设计新化合物，将所设计的化合物按与β-淀粉样蛋白的体外结合情况进行排序；选择出具有最高体外结合亲和性的化合物。
在一个进一步的方面，本发明提供设计对β-淀粉样蛋白具有结合亲和性的化合物的方法，所述方法包括对β-淀粉样蛋白进行作图，在计算机屏幕上构建与β-淀粉样蛋白或其片段的结构互补的化合物；将所设计的化合物按与β-淀粉样蛋白的体外结合情况进行排序；选择出具有最高体外结合亲和性的化合物。
在又一方面，本发明提供一种检测并定量生物体液中Aβ的方法，所述方法包括获取样品液；将所述样品液与可检测标记的(例如放射标记的)式(I)、式(II)或式(III)化合物一起孵育；任选在浓度递增的未标记化合物存在下；从孵育后的溶液中分离出样品并将其转移到膜上；将膜暴露于标记敏感屏(label-sensitive screen)；用成像法(例如磷成像法)分析膜的内容物，以检测Aβ的存在或定量测定生物体液中存在的Aβ含量。
再一方面，本发明提供诊断患者AD的方法，所述方法包括从患者脑内获取样品液；将所述样品液与可检测标记的式(I)、式(II)或式(III)化合物一起孵育；任选在浓度递增的未标记化合物存在下；从孵育后的溶液中分离出样品并将其转移到膜上；将膜暴露于标记敏感屏；用成像法分析所述膜的内容物，以检测Aβ的存在或定量测定生物体液中存在的Aβ含量。
因此，本发明的一个主要方面涉及治疗患者的与β-淀粉样蛋白诱发的神经毒性有关的疾病或神经变性性疾病的药用组合物。该组合物包括有效量的式(I)、式(II)或式(III)化合物和药学上可接受的载体。式(I)、式(II)或式(III)化合物在制备用于治疗一种所述疾病的药物中的用途也落入本发明范围内。对这些疾病的治疗是通过给予患者治疗有效量的本发明化合物或组合物来实现的。
本发明一个或多个实施方案的细节在下文所附说明中有阐述。根据本发明说明书和权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将会是显而易见的。
附图简述


了本发明的一些化合物、鉴定这些化合物的方法以及证明本发明示例性化合物活性的体外和体内生物学试验的结果。
图1说明22R-羟基胆甾醇(SP222)和天然存在的衍生物的化学结构中的一些结构。
图2是描述在AD大脑样本和对照大脑样本中22R-羟基胆甾醇水平的图表。
图3A线图描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的22R-羟基胆甾醇对大鼠PC12神经元细胞生存力的作用。
图3B线图描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的胆甾醇对大鼠PC12神经元细胞生存力的作用。
图3C线图描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的孕烯醇酮对大鼠PC12神经元细胞生存力的作用。
图3D线图描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的17α-羟基孕烯醇酮对大鼠PC12神经元细胞生存力的作用。
图3E线图描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的DHEA对大鼠PC12神经元细胞生存力的作用。
图3F线图描绘在浓度递增的Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的22S-羟基胆甾醇对大鼠PC12神经元细胞生存力的作用。
图4线图描绘在Aβ1-42不存在或存在下检测的，22R-羟基胆甾醇对分化人NT2N神经元生存力的作用。
图5A线图描绘22R-羟基胆甾醇和DHEA对Aβ1-42诱发的对大鼠PC12神经元细胞的毒性的作用。
图5B线图描绘22R-羟基胆甾醇和DHEA对Aβ25-35诱发的对大鼠PC12神经元细胞的毒性的作用。
图5C线图描绘22R-羟基胆甾醇和DHEA对Aβ1-42诱发的对人NT2细胞的毒性的作用。
图5D线图描绘22R-羟基胆甾醇和DHEA对Aβ25-35诱发的对人NT2细胞的毒性的作用。
图6A是描绘22R-羟基胆甾醇对Aβ聚集的作用的考马斯蓝凝胶。
图6B是图6A的考马斯蓝染色凝胶的免疫印迹分析，描绘22R-羟基胆甾醇对Aβ聚集的作用。
图7A是通过CPBBA鉴定Aβ1-42-22R-羟基胆甾醇结合和结合位点的免疫印迹分析。
图7B是通过多克隆兔抗β-淀粉样肽抗血清鉴定图7A所示印迹上的Aβ1-42的免疫印迹分析。
图7C是鉴定Aβ上的22R-羟基胆甾醇结合位点的免疫印迹分析。
图7D是22R-羟基胆甾醇与Aβ1-2的计算对接模拟。
图7E是22R-羟基胆甾醇与Aβ17-40的计算对接模拟。
图7F是22R-羟基胆甾醇与Aβ17-40的计算对接模拟。
图7G是22R-羟基胆甾醇与Aβ1-42的计算对接模拟。
图7H是22R-羟基胆甾醇与Aβ17-40的计算对接模拟。
图7I是Aβ1-42中22R-羟基胆甾醇结合位点的定位的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
图8条形图说明将PC12细胞暴露于浓度递增的Aβ中3天，导致剂量依赖性细胞死亡。
图9A-9P是一系列的条形图，说明在0.1μM Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对大鼠PC12神经元细胞生存力的作用。
图10A-10P是一系列的条形图，说明在1.0μM Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对大鼠PC12神经元细胞生存力的作用。
图11A-11P是一系列的条形图，说明在10.0μM Aβ1-42不存在或存在下，浓度递增的22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对大鼠PC12神经元细胞生存力的作用。
图12A条形图显示Aβ暴露会引起用以评价膜电位的发光的剂量相关性减少。
图12B条形图显示22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物针对0.1μMAβ诱发的神经毒性的作用。
图12C条形图显示22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物针对1.0μMAβ诱发的神经毒性的作用。
图12D条形图显示22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物针对10.0μM Aβ诱发的神经毒性的作用。
图13A条形图显示在0.1μM、1.0μM和10.0μM Aβ诱发的神经毒性存在下，Aβ以剂量依赖性方式减少PC12细胞的ATP产生。
图13B条形图显示在0.1μM Aβ诱发的神经毒性存在下，22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对ATP的作用。
图13C条形图显示在1.0μM Aβ诱发的神经毒性存在下，22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对ATP的作用。
图13D条形图显示在10.0μM Aβ诱发的神经毒性存在下，22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物对ATP的作用。
图14线图显示在单独的Aβ存在下、在Aβ+SP233(30μM)存在下和在Aβ+SP233(50μM)存在下，细胞对锥虫蓝的摄取。
图15线图显示浓度递增的SP233对0.1μM、1.0μM和10.0μMAβ诱发的对大鼠PC12神经元细胞的神经毒性的作用。
图16线图说明SP233对MA-10间质细胞类甾醇形成的作用。
图17是条形图，通过CPBBA鉴定Aβ-SP结合和结合位点。
图18是说明22R-羟基胆甾醇(SP222)和SP233与Aβ1-42的结合能量频率的计算机对接模拟。
图19是说明22R-羟基胆甾醇(SP222)和SP233与Aβ1-42的结合概率的计算对接模拟。
图20A是在细胞培养基中在浓度递增的SP233(1μM、10μM、100μM)下24小时孵育后的Aβ聚合和ADDL形成的免疫印迹分析。
图20B条形图描绘图20A的免疫印迹分析所鉴定的Aβ单体。
图20C条形图描绘图20A的免疫印迹分析所鉴定的Aβ三聚体。
图20D条形图描绘图20A的免疫印迹分析所鉴定的Aβ四聚体。
图20E条形图描绘图20A的免疫印迹分析中的Aβ多聚体和ADDL(三聚体和四聚体的总和)形成。
图20F是在细胞培养基中在浓度递增的SP233(1μM、10μM、100μM)下72小时孵育后的Aβ聚合和ADDL形成的免疫印迹分析。
图20G条形图描绘图20F的免疫印迹分析所鉴定的Aβ三聚体。
图20H条形图描绘图20F的免疫印迹分析所鉴定的Aβ四聚体。
图20I条形图描绘图20F的免疫印迹分析所鉴定的Aβ四聚体。
图20J条形图描绘图20F的免疫印迹分析中的Aβ多聚体和ADDL(三聚体和四聚体的总和)形成。
图21.22R-羟基胆甾醇对NT2细胞分化的作用。上小图(a-d)显示与未处理对照细胞(上小图)相比，用25μM 22R-羟基胆甾醇处理3天、6天、12天的NT2细胞的形态学变化的相差显微照片(下小图，(a)是对照)。下小图(e-h)说明与未处理对照细胞相比，NT2细胞对用25μM 22R-羟基胆甾醇处理3天、6天、12天作出反应而向神经元表型(NT2N)分化的流式细胞术分析。
图22.类甾醇对NT2细胞的分化、生存力和增殖的作用。相差显微照片(a)用25μM 22S-羟基胆甾醇(中间小图)或22R-羟基胆甾醇(下小图)处理6天的NT2细胞与未处理对照(上小图)的形态学变化的比较；(b)用25μM胆甾醇(靠上面的中间小图)、孕酮(靠下面的中间小图)或DHEA(下小图)处理6天的NT2细胞与未处理对照(上小图)的形态学变化的比较；(c)使用LDH(上小图)、MTT(中间小图)和BrdU(下小图)测定来分析用22R-羟基胆甾醇、22S-羟基胆甾醇、孕烯醇酮或孕酮处理3天对NT2细胞的生存力和增殖的作用。与未处理(对照)值比较的显著性*p＜0.05、**p＜0.01和***p＜0.001。所示结果是3个独立实验的代表结果。
图23.22R-羟基胆甾醇处理对NT2细胞的神经丝蛋白表达的作用。上小图显示用25μM 22R-羟基胆甾醇处理6天的NT2细胞中神经丝蛋白NF70(a)、NF145(b)和NF200(c)表达的免疫细胞化学染色(与未处理对照相比)。所示结果是4个独立实验的代表结果；放大倍数40X。下小图对用浓度递增的22R-羟基胆甾醇处理6天的NT2细胞中NF70(d)、NF145(e)和NF200(f)的免疫印迹分析(使用特异性抗血清)和定量图像分析(与未处理对照相比)；用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)将所荷载的蛋白质量归一化。与未处理对照比较的显著性**p＜0.01和***p＜0.001。所示结果是3个独立实验的代表结果。
图24.22R-羟基胆甾醇诱导的NT2细胞分化的可能机制。(a-c)22R-羟基胆甾醇对NT2细胞中GFRα受体蛋白表达的作用。上小图显示用25μM22R-羟基胆甾醇处理6天的NT2细胞中GFRα1(a)、GFRα2(b)和GFRα3(c)表达的免疫细胞化学染色(与对照相比)。所示结果是4个独立实验的代表结果(放大倍数40X)。下小图对用25μM22R-羟基胆甾醇处理6天的NT2细胞中GFRα1(a)、GFRα2(b)和GFRα3(c)的免疫印迹分析(使用特异性抗血清)和定量图像分析(与对照相比)；用GAPDH将所荷载的蛋白质量归一化。(d)NT2细胞在分化成神经元(NT2N)表型过程中对3H-22R-羟基胆甾醇的摄取(上小图)和3H-22R-羟基胆甾醇与NT2N细胞蛋白质的相互作用(下小图)。与未处理对照比较的显著性*p＜0.05和***p＜0.001。所示结果是3个独立实验的代表结果。
图25.将小鼠胚胎畸胎瘤P19细胞、PC12大鼠嗜铬细胞瘤细胞和NT2人神经元细胞在直径13mm玻璃盖玻片上培养。当细胞达到70％铺满时，将培养基更换为含有90μM SP-224的新鲜培养基。然后，将P19细胞和PC12细胞孵育2天，再洗出SP244并更换为标准培养基。连续5天每两天更换培养基，然后将细胞进行固定用于免疫细胞化学分析。将NT2细胞进行5天的处理和10天的洗出。在这些实验条件下，三种细胞类型都显示明显的出芽现象(小图1B、D、F)，其中P19细胞观察到最为壮观的效果(小图D)。有趣的是，出芽是在洗出期间开始的，而在处理期间没有观察到细胞形状改变。同时，观察到经过处理的细胞生长停滞。
图26.在对照上没有观察到神经元标记，例外的是突触小泡蛋白，但其染色非常弱(图C)。SP-224暴露诱导了所研究的不同神经元标记——βIII微管蛋白(图A)、突触小泡蛋白(图B)、MAP2(图C)和ChAT(图D)的强烈表达。游走成神经细胞标记DCX在暴露于SP-224的P1 9细胞中也得到强烈表达(图E)。图A甚至显示了轴突样结构上的βIII微管蛋白免疫染色，其长度明显超过100μm标尺。
图27.将P19细胞处理2天，洗出30天，然后对神经元标记进行免疫标记。如βIII微管蛋白染色所示，轴突和树突的网状结构发生了极大的扩充(图A)。突触小泡蛋白标记的重要性(图B)证实，新形成的神经元建立了突触联系。
图28.研究了神经胶质标记GFAP和CNPase(它们反映SP-224使P19细胞分化成星形胶质细胞和少突神经胶质细胞的能力)的表达，以评价分化过程的最终特异性。使用这个方案—用90μM SP-224培养2天，然后在无SP-224培养基中培养5天，发现SP-224也诱导P19分化成少突神经胶质细胞(图B)，然而没有检测出阳性GFAP信号(图D)。GFAP和CNPase这两个标记在作为对照的P19细胞中没有表达。
图29.给体重300-325g的雄性Long-Evans大鼠植入微型渗透泵，泵的出口按坐标D＝3.4mm、L＝1.4mm和AP＝0.92mm尾部至前囟置入左脑室。渗透泵的罐体埋植在大鼠背部中肩胛区的皮下。将在聚丙二醇/甘油/蒸馏水(50/25/25)中增溶的375μM SP-224通过脑室内注射(i.c.v.)途径以5μl/小时灌注2周。大脑灌注结束后3周将大鼠处死。免疫组织化学检测揭示了重要的BrdU区域，证实SP-224能够诱导SVZ中的神经干细胞的自我更新(图C-G)。此外，在离SVZ的较远处(白色箭头)检测到一些BrdU阳性细胞，提示某些细胞可能已进入了迁移过程。SP-224输注还诱导了早期神经元标记DCX在SVZ细胞中的表达，证实如同在体外情况一样，SP-224能够促使存在于该区域的神经干细胞发生神经元分化(图D-H)。
发明详述虽然本发明可以以许多不同的形式来体现，但本文只讨论若干具体实施方案，不过要认识到，应将本发明公开内容仅认为是本发明原理的例证，而不能视为本发明局限于所述的实施方案。
本文所用的缩写如下5-胆甾烯-3β，22R-二醇(22R-羟基胆甾醇)；5-胆甾烯-3β，22S-二醇(22S-羟基胆甾醇)；5-胆甾烯-3β-醇(胆甾醇)；5-雄烯-3β-醇-17-酮或脱氢表雄酮(DHEA)；5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮(17α-羟基孕烯醇酮)；5-孕烯-3β-醇-20-酮(孕烯醇酮)；Ntera2/D1畸胎癌细胞(NT2)；分化人NT2神经元(NT2N)；β-淀粉样肽(Aβ)；早老性痴呆(AD)；胆甾醇-蛋白结合印迹测定(CPBBA)；视黄酸(RA)。
本发明的一个方面涉及治疗与神经毒性有关的障碍、特别是AD的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者至少下式(I)、(II)和/或(III)化合物之一。如下所示结构的化合物(I)或其药学上可接受的盐 其中每个R1、R2、R4、R7、R11、R12、R15和R16独立地为氢、(C1-C8)烷基、羟基、氨基、羧基、氧代基、磺酸或任选嵌入以下基团的(C1-C8)烷基-NH-、-N((C1-C8)烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR′-或-NR′-C(O)-，其中R′为H或(C1-C8)烷基；R3为羟基、(C1-C6)烷基CO2-、HO2C(CH2)2CO2-、甲苯-4-磺酰氧基或苯甲酰氧基；每个R6、R8、R9、R10、R13和R14独立地为氢、(C1-C8)烷基、羟基(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基或羟基；R17为-CH(CH3)CH(OH)(CH2)2CH(CH3)2或-CH(CH3)CH(OC(＝O)CH3)(CH2)2CH(CH3)CH2N(C(＝O)CH3)2。
优选R1、R2、R4、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14和R15为H。优选R10和R13为CH3；R16优选为H或乙酰氧基。
如下所示结构的式(II)化合物或其药学上可接受的盐 其中每个R1、R2、R4、R7、R11、R12和R15独立地为氢、(C1-C4)烷基、羟基、氨基、羧基、氧代基、磺酸或任选嵌入以下基团的(C1-C6)烷基-NH-、-N((C1-C4)烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR′-或-NR′-C(O)-，其中R′为H或(C1-C8)烷基；R3为羟基、(C1-C6)烷基CO2-、HO2C(CH2)2CO2-、甲苯-4-磺酰氧基或苯甲酰氧基；每个R6、R8、R9、R10、R13和R14独立地为氢、(C1-C4)烷基、羟基(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基或羟基；R19为OH或(C1-C2)烷氧基；R20为被甲基酰胺甲基在3位取代的丁基。
优选R1、R2、R4、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14和R15为H。优选R10和R13为CH3。
如下所示结构的式(III)化合物或其药学上可接受的盐 其中每个R1、R2、R4、R7、R11、R12和R15独立地为氢、(C1-C8)烷基、羟基、氨基、羧基、氧代基、磺酸或任选嵌入以下基团的(C1-C8)烷基-NH-、-N((C1-C8)烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR′-或-NR′-C(O)-，其中R′为H或(C1-C8)烷基；R3为羟基、(C1-C6)烷基CO2-、HO2C(CH2)2CO2-、甲苯-4-磺酰氧基或苯甲酰氧基；每个R6、R8、R9、R10、R13和R14独立地为氢、(C1-C8)烷基、羟基(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基或羟基；X为O、N(H)、N(Ac)、N(甲苯-4-磺酰氧基)。
R10和R13优选为CH3。
在式(III)化合物中，R1、R2、R4、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14和R15优选为H。R1、R2或R12优选为H或OH。
R3也可为OR23，其中R23为可脱去的羟基保护基如甲苯磺酰基、甲磺酰基、三烷基甲硅烷基、THP、EtO(Et)、苄基、苄氧基羰基等。C3被羟基取代的化合物的真(C8-C22)脂肪酸酯也包括在本发明内，其中烷氧基链可包含1-2个CH＝CH单元和/或1-2个OH环氧或甲基取代基。
优选的立体异构体是3S以及10R和13S，还有20S、22S和25S，其中碳主链按螺甾烯-3-醇编号方式进行编号。因此，优选的式(III)化合物是己酸(22S，25S)-(20S)-螺甾-5-烯-3β-基酯(SP233)。注意式(I)、式(II)或式(III)所示的碳原子被氢饱和，除非另有说明。
每个术语“烷基”、前缀“烷(alk)”(如在烷氧基中)和后缀“-烷基”(如在羟烷基中)是指直链(例如丁基)或支链(例如异丁基)的C1-8烃链，除非另有说明。亚烷基、亚烯基和亚炔基分别指二价的C1-8烷基(例如亚乙基)、烯基和炔基。术语“烷基”包括环烷基、(环烷基)烷基和烷基(环烷基)烷基。类似地，术语“烯基”包括含有1-2个CH＝CH单元的烷基以及相应的环烯基部分。
具体地说，(C1-C8)烷基可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、3-戊基、己基、庚基或辛基；(C3-C8)环烷基可以是单环、双环或三环，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、双环[2.2.2]辛基(octanyl)或降冰片基(norbornyl)，以及各种萜和类萜结构。(C3-C6)环烷基(C1-C2)烷基包括前述环烷基，可以是环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、2-环丙基乙基、2-环丁基乙基、2-环戊基乙基或2-环己基乙基。环烷基环状系统是单环、双环或三环的杂环烷基任选包含1-2个硫、非过氧化物O或N(R′)以及4-5个环碳原子；如吗啉基、哌啶基、哌嗪基、茚满基、1，3-二噻烷-2-基等。任何环烷基环状系统任选包括1-3个双键或环氧部分，且任选被1-3个OH、(C1-C6)烷酰氧基、(CO)、(C1-C6)烷基或(C2-C6)炔基取代。(C1-C8)烷氧基可包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、3-戊氧基或己氧基；(C2-C6)烯基可以是乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基或5-己烯基；羟基(C1-C8)烷基或羟基(C1-C8)烷氧基可以是被1或2个OH基团取代的烷基，如羟甲基、1-羟乙基、2-羟乙基、1-羟丙基、2-羟丙基、3-羟丙基、1-羟丁基、4-羟丁基、3，4-二羟丁基、1-羟戊基、5-羟戊基、1-羟己基或6-羟己基；(C1-C6)烷基CO2可以是乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、异丁酰氧基、戊酰氧基或己酰氧基。
下表1所示为上述的一些式(I)、式(II)和式(III)化合物，都可用来实施本发明
表1.
其它可用于本发明的22R-羟基胆甾醇类似物可通过基于结构的数据库检索来鉴定。可遵循两种方法。第一种方法是基于22R-羟基胆甾醇的结构。即将22R-羟基胆甾醇细分为若干结构单元，在该数据库中检索包括22R-羟基胆甾醇的一个或多个结构单元的化合物。可根据本申请所给出的结果，制定改进的检索方案，使22R-羟基胆甾醇的22R-羟基官能团得以保留。从数据库中抽取出与22R-羟基胆甾醇具有结构相似性的化合物，在体外测试其对Aβ的结合亲和性。从中选出具有最高结合亲和性的化合物做进一步体内研究。第二种方法是基于Aβ的结构。简而言之，在基于(受体)结构的3D数据库检索中，先通过NMR分析确定靶分子Aβ的3D结构，然后通过计算机化分子对接(computerized molecular docking)，对储存有成千上万个结构各异的合成化合物和天然产物的3D结构的大型化学数据库进行检索，以鉴定出能与Aβ有效发生相互作用的小分子。
在形成Aβ的模板3D结构时，根据Aβ的起始构象给其主链上的每个原子分配一个位置，根据其每条侧链的最小能量内坐标给侧链上的各原子分配位置。这样获得的模板结构通过使模板的内能最小化加以精修。基于精修的Aβ结构，通过将一个选自化合物数据库的化合物安放在Aβ的周围，形成主-宾复合物。主-宾复合物的结构根据该复合物中的每个原子在三维参考系中所占据的位置来定义。
通过选择可安放在Aβ靶结合位点而又不与Aβ的原子发生明显不利重叠的化合物，形成几何拟合组群(geometry-fit group)。对于几何拟合组群中的每个化合物，通过使描述化合物各原子与Aβ各原子之间的相互作用的能量函数最小化，确定其与Aβ的受体位点的预测结合亲和性。能量函数的最小化是通过改变化合物的位置以获得对应于能量函数的最小值的主-宾复合物结构来实施的。对能与Aβ结合位点的各原子发生最有利能量相互作用的化合物进行鉴定，例如通过对化合物-Aβ复合物进行展示和目视检查，鉴定出最有希望的化合物候选者，以供任选做进一步的处理。
对展示的复合物进行目测检查，以建立一组用于体外试验的候选化合物。例如，对复合物进行目测检查，确定化合物对接或拟合到Aβ的受体位点或口袋(pocket)中的质量。目测为鉴定用于体外试验的化合物提供了有效的基础。
当鉴定出假定的结合化合物后，在体外和/或体内证实这种化合物特异性结合Aβ的能力。
在另一个方面，本发明提供经合理设计能结合Aβ的新型化合物。新型化合物的合理设计是基于与Aβ结合位点有关的信息进行的。对Aβ和先导化合物的结构进行分析，以构想出可能具有与Aβ结合位点发生结合的活性的化合物结构。
可将该先导化合物的结构分为设计单元，对其进行修饰并探究所作修饰对先导化合物与Aβ结合位点之间的相互作用的影响。然后合成出组合了不同设计单元的化合物，并就所鉴定的机制对其活性进行试验。这种试验在体外和/或体内按上述相同方式进行。然后将从这种试验获得的信息并入到新一轮的合理药物设计中。重复这种设计-合成-试验循环，直至鉴定出具有所需特性的先导化合物。然后将该先导化合物进行临床试验。
在另一个方面，本发明提供通过结合Aβ并形成稳定的无毒寡聚体或多聚体来抑制ADDL如三聚体和四聚体的形成的新型化合物。
本文所用的术语“治疗(动词或名词)”是指任何对患者的与神经毒性或β-淀粉样蛋白诱发的神经毒性有关的疾病或障碍的治疗，包括但不限于预防可能易患所述障碍或疾病，但尚未确诊已患所述障碍或疾病的患者发生所述障碍或疾病；抑制所述障碍或疾病，例如阻止所述障碍或疾病的发展；缓解所述障碍或疾病，例如促使所述障碍或疾病消退；或缓解由所述障碍或疾病引起的病症，例如使所述障碍或疾病的症状停止。本文所用的“神经变性性疾病”或“神经系统病理”意指包括所有上述疾病。
对患者的与神经毒性或β-淀粉样蛋白诱发的神经毒性相关的疾病或障碍而言，术语“预防(动词或名词)”是指，如果未曾发生疾病或障碍的话，没有疾病或障碍在发展，或者如果已发展了疾病或障碍的话，疾病或障碍不会进一步发展，或者该病的症状没有合乎逻辑的可观察体征。
干细胞的特征是有能力自我更新和产生能够分化成多样而又有区别的细胞谱系的子代。衍生自早期胚胎的干细胞可分化成所有的体细胞类型，但衍生自成体组织的干细胞据认为只能产生其所在组织所特有的细胞谱系。参见例如Evans等，Nature，292，154(1981)；Martin，PNAS USA，78，7634(1981)，Pedersen，Reprod.Fetil.Dev.，16，543(1994)。例如，存在于骨髓中的造血干细胞只能产生血液成分(Morrison等，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.，11，35(1994))。在成体的肠、性腺、皮肤和大脑内也鉴定出干细胞(Hull等，Development，106，619(1989)；Morrison等，Cell，88，287(1997))。已提出将神经干细胞作为有用的载体，来治疗中枢神经系统的疾病如神经变性性疾病，但由于它们缺乏可及性而用途有限。
最近有几份报告证明，一些干细胞可能具有比以前预想更高的可塑性。Eglitis和Mezey报告说，少数来自骨髓的供体细胞输注到免疫缺陷小鼠后在小鼠宿主大脑内复原为大神经胶细胞(Eglitis等，PNAS USA，94，4080(1997))。但是，没有对移入大脑的骨髓细胞的特性进行确定。Azizi等，PNAS USA，95，3908(1998)中，给大鼠脑输注人骨髓基质细胞(MSC)，所述人骨髓基质细胞如Owen，J.Cell.Sci.Suppl.，10，63(1988)和Aubin，J.Cell.Biochem.Suppl.，30，73(1998)所证实，能够扩充、自我更新和分化成多样的间充质细胞谱系。人MSC以类似于室旁星形胶质细胞的方式在大脑内迁移，但它们是否分化成神经细胞类型没有进行确定。Bjornson等，Science，238，534(1999)在相关的实验中证实，神经干细胞移植到辐射宿主造血系统后分化成髓样和淋巴样细胞谱系。这些发现合起来提示，有可能通过使用来自不同的皮肤来源的干细胞来重构组织。
为确定间充质干细胞的结局是否是神经细胞，Kopen等，PNASUSA，96，10711(1999)中，将纯化的鼠MSC群体注射入新生小鼠的侧脑室，并通过免疫组织化学检查这些细胞的结局。到注射后第12天时，MSC就迁移遍布前脑和小脑，但对宿主大脑体系结构没有造成破坏。纹状体和海马分子层当中的一些MSC表达了胶质细胞原纤维酸性蛋白，因此已分化成成熟的星形胶质细胞。MSC也集中在富含神经元的区域，包括卡耶哈岛(Islands of Calleja)、嗅球和小脑的内颗粒层。在小脑的外颗粒层当中也发现大量的MSC。另外，在脑干的网状结构当中也发现神经丝阳性供体细胞，提示MSC可能也分化成了神经元。另参见“Bone Marrow Cells as a Source of Neurons forBrain and Spinal Cord Repair，”Sanchez-Rames等，美国专利第6,528,245号；Woodbury等，J.Neurosci.Res.，61，364(2000)；Hofstetter等，PNAS，99，2199(2002)。因此，MSC在移植到新生小鼠大脑内后能够产生不同皮肤来源的分化子代。这些结果提示，天然或转基因的干细胞潜在地可用作治疗多种中枢神经系统疾病的载体，并且能增强它们在体外或体内分化成神经元细胞的能力的药物将会很有价值。
因此，本发明方法的另一个方面提供诱导哺乳动物(例如人)的神经元前体细胞分化成神经元细胞或星形细胞(包括成熟神经元)的方法，所述方法是通过使所述神经元前体细胞在体外或体内与有效量的式(I)、式(II)和/或式(III)化合物接触来实施的。因此，本发明化合物能被用来预调理(pre-condition)或启动神经元前体细胞在体外的分化，所述神经元前体细胞如神经元干细胞、间充质干细胞、骨髓基质细胞(MSC)、多潜能成体干细胞或胚胎干细胞。干细胞一旦定型于神经元谱系，可将其给予神经变性性疾病患者的靶部位(如在中枢神经系统中)。在另一种方法中，干细胞和有效分化量的式(I)、式(II)或式(III)化合物可同时给予(例如一起或在非常短的时间内相继给予)受累患者的靶部位。当然，将本发明化合物直接给予患者，能促使患者体内神经元前体细胞储备(包括未定型成体干细胞)受到刺激并分化成定型神经前体细胞或分化成成熟的功能神经元细胞。对这种神经生长或修复的刺激预期可导致神经变性性疾病得到有效治疗。
“MAPC”或多潜能成体祖细胞，是指源自非胚胎组织、但在分化时能产生所有三种胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系的细胞。这种细胞在美国专利申请系列号10/048,757和10/467,963中已得到充分的表征，对于这两个专利申请对MAPC及其分离(特别是从人体组织的分离)的描述内容，通过引用结合到本文中。MAPC在细胞表面标记表达方面已得到充分的表征，其在GlyA、CD44、CD45和HLA的细胞表面表达上是阴性的。
其他公开通常称为“干细胞”的多潜能谱系定型细胞或未分化细胞的参考文献，包括美国专利第6,090,625号、第5,827,735号(间充质干细胞)、第6,200,806号、第5,843,780号；已公布的美国申请号20030008392(胚胎干细胞)、20030013910(多潜能非胚胎干细胞)；20030073234(克隆人胚胎干细胞系)、20030161817(来自脐带基质的全能干细胞)、20020142457、20021060509和20020164794。
此外，可对干细胞进行遗传改变，使它们包含额外拷贝的一个或多个编码目标蛋白质的基因，或者过量表达内源基因。遗传改变的干细胞可含有编码能增加氨基酸(如L-DOPA)合成的酶类的DNA，该DNA处于指导重组蛋白强表达的启动子的控制之下。Schwartz等人使用表达L-DOPA的转基因BSC来治疗受6-羟基多巴胺损害的小鼠大脑。参见Human Gene Therapy，10，2539(1999)。或者，在条件迫使要求对酶的表达进行高度控制的调节或定时的情况下，该细胞可表达能受诱导型启动子或其他控制机制调节的基因。
可用于本发明方法的干细胞可进行遗传修饰以包含分离的异源DNA，所述遗传修饰是通过多种本领域技术人员公知的方法将分离的异源DNA或RNA引入到干细胞中来实施的。这些方法通常分为以下四大类(1)病毒转移，包括例如使用DNA或RNA病毒载体，如反转录病毒(包括慢病毒)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、新培斯病毒和牛乳头瘤病毒；(2)化学转移，包括磷酸钙转染方法和DEAE葡聚糖转染方法；(3)膜融合转移，例如使用荷载DNA的膜小泡如脂质体、红细胞空胞(ghosy)和原生质体；(4)物理转移技术，如微注射、电穿孔或直接“裸”DNA转移。
干细胞或它们的定型子代可与本发明的化合物一起通过定位注射来给予，包括通过导管给药、全身注射、腹膜内注射、颅内或脊髓内注射、肌内、肝内、胃肠外给药、动脉内注射、注射到侧脑室中或胎盘内注射来给予。注射可指向多个部位，如创伤或其他伤害的部位。
与干细胞的治疗应用有关的一个重要问题是为获得最佳效果所需的细胞数量。在最近对人自身单核骨髓细胞的研究中，使用了1-4×107个细胞的经验剂量，结果鼓舞人心。但是，各种不同的情形可能要求对注射到目标组织中的细胞数量进行最优化。例如参见美国专利第6,767,531号，该专利公开了用自身干细胞移植来实施骨髓置换的技术。因此，所要给予的细胞数量须针对进行治疗的患者加以变化。在一个优选的实施方案中，可将约104～108、更优选105～107、最优选3×107个本发明干细胞和任选50-500μg/kg/天的细胞因子给予人类患者。但是，可根据每个患者的个体因素，包括其体型、年龄、靶器官和自底物开始发生不需要的积累起的时间，来精确确定可认为是有效剂量的剂量。因此，本领域技术人员从本公开说明书和本领域常识出发，可容易地确定剂量。
要注意到，人患者治疗的时间通常比小鼠或其他实验动物要长，治疗的时间长度与疾病过程和药物有效性的时间长度相称。剂量可以是单剂量，或者是持续数天时间的多剂量。因此，本领域技术人员可通过本公开说明书和本文所引述文献中的技术及本领域常识，将剂量从实验动物(例如大鼠、小鼠、犬等)放大到人类。治疗的时间长度通常与疾病过程和药物有效性的时间长度及所治疗的患者相称。
可以将有效量的本发明干细胞和/或有功效化合物与药学上可接受的载体一起，配制成药用组合物后进行给药，以治疗与神经毒性有关的疾病。“有效量”或“药理上有效量”是指给受治疗患者赋予治疗作用所需的化合物量。Freireich等，Cancer Chemother.Rep.，50，219(1966)中，描述了动物和人的剂量相互关系(以每平方米体表面积毫克计)。体表面积可按患者的身高和体重粗略确定。参见例如Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardley，New York，1970，537。如下文所充分教导，有效剂量可基于这样的本发明化合物体外浓度，该体外浓度被发现能有效抑制Aβ在相当于其在人AD患者体内的已知浓度的浓度下的毒性。可用于刺激模型神经元细胞系的本发明化合物剂量在下文中公开。本领域技术人员认识到，有效剂量也要根据给药的途径、赋形剂的使用和任选与其它治疗药物的联合用药来加以变动。
活性成分的毒性和治疗功效可通过标准的药学方法确定，例如通过测定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中具有治疗有效性的剂量)来确定。毒性作用与治疗作用的剂量比率为治疗指数，其可表示为LD50/ED50的比率。优选显示大治疗指数的化合物。虽然可以使用显示毒副作用的化合物，但应该注意要设计递药系统，来将这种化合物靶向患病组织的部位，以使对未受影响的细胞的潜在损害最小，从而降低副作用。
本发明的方法、药盒、联合疗法以及药用组合物包括所述化合物的晶型(例如多晶型物)、对映异构体、异构体和互变异构体及其药学上可接受的盐。示例性的药学上可接受的盐可用以下酸制备甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、甲磺酸、硬脂酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸(扑姆酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羟基乙磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、藻酸(algenic acid)、b-羟基丁酸、半乳糖二酸以及半乳糖醛酸。
术语“前体药物”是指通过体内代谢过程的转化而引起药理作用结果的药物或化合物(活性部分)。通常认为前体药物是这样的药物前体，其在患者用药和随后吸收后，经过某些过程(例如代谢过程)转化为有活性或活性更强的物质。该转化过程产生的其它产物易被身体处理掉。前体药物上通常具有使其活性没那么强和/或给药物赋予溶解性或一些其它性质的化学基团，如酯基或酰基。该化学基团一旦从前体药物切下，就产生出活性更强的药物。前体药物可设计成可逆药物衍生物，用作修饰药物以促使药物转运至部位特异性组织。到目前为止，前体药物的设计是旨在增加治疗性化合物的有效水溶性，以便靶向到水为主要溶剂的区域。例如Fedorak等，Am.J.Physiol，269G210-218(1995)描述了地塞米松-β-D-葡糖苷酸。McLoed等，Gastroenterol.，106，405-413(1994)描述了地塞米松-丁二酸酯-右旋糖苷。Hochhaus等，Biomed.Chrom.，6，283-286(1992)描述了地塞米松-21-硫苯甲酸钠和地塞米松-21-异烟酸酯。另外，J.Larsen和H.Bundgaard，Int.J.Pharmaceutics，37，87(1987)描述了对N-酰基磺酰胺作为潜在前体药物衍生物的评价。J.Larsen等，Int.J.Pharmaceutics，47，103(1988)描述了对N-甲基磺酰胺作为潜在前体药物衍生物的评价。例如Sinkula等，J.Pharm.Sci.，64，181-210(1975)也描述了前体药物。前体药物也可用作合成中间体，用于通过本领域公知的合成相互转换制备其他式(I)、式(II)或式(III)化合物。例如有关可用来使各螺甾烯醇取代基相互转换的方法，参见I.T.Harrison，Compendium ofOrganic Synthetic Methods，Wiley-Interscience(1971)。
术语“衍生物”是指这样的化合物，它是从另一结构类似的化合物出发将其一个原子、分子或基团用另一原子、分子或基团进行取代或置换而产生的。例如某种化合物的氢原子可被烷基、酰基、氨基等取代，生成该化合物的衍生物。
“血浆浓度”是指物质在血浆或血清中的浓度。
“药物吸收”或“吸收”是指药物从给药部位进入体循环，例如进入患者的血流的过程。
“生物利用度”是指活性部分(药物或代谢物)被吸收进入全身循环并在体内的药物作用部位可利用的程度。“代谢”是指药物在体内的化学转化过程。
“药效动力学”是指决定相对于作用部位的药物浓度所观察到的生物反应的因素。
“药代动力学”是指决定药物作用部位达到并维持合适的药物浓度的因素。
“血浆半衰期”是指血浆药物浓度从最大浓度减少50％所需要的时间。
在本发明公开说明书中使用术语“约”是指“近似”，包括在实施相关技术的过程中可能会出现的参数变动。也就是说，使用术语“约”，则表明在所述范围外的剂量也可能是有效和安全的，并且这种剂量也被本发明范围所涵盖。
术语“可测量血清浓度”指给药后被吸收进入血流的治疗药物的血清浓度(通常以每ml、dl或L血清的mg、μg或ng治疗药物来测量)。
术语“药学上可接受的”在本文中作形容词使用，指其所修饰的名词对象适合用于药品中。药学上可接受的盐包括金属离子和有机离子。更优选的金属离子包括但不限于合适的碱金属(Ia族)盐、碱土金属(IIa族)盐和其它生理上可接受的金属离子。示例性的离子包括常见化合价的铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌。优选的有机离子包括质子化叔胺和季铵阳离子，其中部分包括三甲胺、二乙胺、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因。示例性的药学上可接受的酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲磺酸、乙酸、甲酸、酒石酸、马来酸、苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸、琥珀酸、乳酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、丙酮酸丁酮二酸、富马酸、丙酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸等。
本发明组合物通常以药用组合物的形式给药。这些药用组合物可通过任何合适的途径给药，包括但不限于口服、鼻胃、直肠、透皮、胃肠外(例如皮下、肌内、静脉内、髓内和皮内注射或输注技术给药)、鼻内、经粘膜、植入、阴道、局部、口腔和舌下给药。这些制剂按常规可含有缓冲剂、防腐剂、渗透促进剂、配伍载体和其它治疗性或非治疗性成分。
本发明还包括应用包含本发明的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂的药用组合物的方法。本文所用的术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。将这些介质和物质用于可摄取物质是本领域众所周知的。任何常规的介质或物质，除不能与组合物配伍的外，其使用都是可以设想到的。还可将辅助活性成分掺入到所述组合物中。在制备本发明的组合物时，组合物可与药学上可接受的赋形剂混合，用所述赋形剂稀释或包裹在载体当中，所述组合物可呈胶囊剂、小药囊剂或其它容器的形式。可用于制备本发明组合物的载体材料为任何在药剂学上常用的赋形剂，应根据与活性药物的配伍性和所需剂型的释放分布曲线(release profile)特性加以选择。
举例来说，选择以下药用赋形剂作为实例(a)粘合剂，例如阿拉伯胶、海藻酸及其盐、纤维素衍生物、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、硅酸镁铝、聚乙二醇、树胶、多糖酸、皂土、羟丙基甲基纤维素、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸酯、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、预胶化淀粉、乙基纤维素、黄芪胶、糊精、微晶纤维素、蔗糖或葡萄糖等。
(b)崩解剂，例如淀粉、预胶化玉米淀粉、预胶化淀粉、纤维素、交联羧甲基纤维素、淀粉羟乙酸钠、交联聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、藻酸钙-藻酸钠复合物、粘土、藻酸盐、树胶或淀粉羟乙酸钠以及任何在片剂制剂中使用的崩解剂。
(c)填充剂，例如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉、右旋葡萄糖、葡萄糖结合剂、右旋糖苷、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠、聚乙二醇等。
(d)表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠、司盘-80、吐温-80、聚山梨酯、polaxomer、胆汁盐、甘油单硬脂酸酯、PluronicTM系列(BASF)等。
(e)增溶剂，例如柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、马来酸、戊二酸碳酸氢钠和碳酸钠等。
(f)也可使用稳定剂例如抗氧化剂、缓冲剂或酸等。
(g)润滑剂，例如硬脂酸镁、氢氧化钙、滑石粉、硬酯酰富马酸钠、氢化植物油、硬脂酸、glyceryl behapate、硬脂酸镁、硬脂酸钙和硬脂酸钠、硬脂酸、滑石粉、蜡、Stearowet、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、DL-亮氨酸、聚乙二醇、油酸钠或十二烷基硫酸钠等。
(h)湿润剂，例如油酸、甘油单硬脂酸酯、司盘-80、司盘-20、三乙醇胺油酸脂、吐温-80、吐温-20、油酸钠或十二烷基硫酸钠等。
(i)稀释剂，例如乳糖、淀粉、甘露糖醇、山梨糖醇、右旋葡萄糖、微晶纤维素、磷酸氢钙、蔗糖基稀释剂、糖粉、硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物、乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂、肌醇、水解谷类固形物、直链淀粉、粉状纤维素、碳酸钙、甘氨酸或皂土等。
(j)抗粘着剂或助流剂，例如滑石粉、玉米淀粉、DL-亮氨酸、十二烷基硫酸钠以及硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸钠等。
(k)药学上可配伍的载体包括阿拉伯胶、明胶、胶态二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精合剂、甘油、硅酸镁、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、硬脂酰乳酸钠、卡拉胶、单甘油酯、二甘油酯或预胶化淀粉等。
此外，药物制剂在例如Remington′s The Science and Practice ofPharmacy(2000)中也有论述。有关药物制剂的另外论述可在Liberman，H.A.和Lachman，L.(编著)，Pharmaceutical Dosage Forms，MarcelDecker，New York，N.Y.，1980中查到。包含本发明组合物的片剂或颗粒剂可包薄膜衣或肠溶衣。
本发明除了可用于治疗人之外，还可用于其它患者，包括牲畜、爬行动物、鸟类、外来动物和饲养动物(包括哺乳动物、啮齿动物等)。哺乳动物包括灵长类动物(例如猴或狐猴)、马、犬、猪或猫。啮齿动物包括大鼠、小鼠、松鼠或豚鼠。
本发明药用组合物在表明需要给予神经毒性抑制剂的场合中有用。已发现这些组合物在治疗老年性认知减退和/或痴呆(例如AD)上特别有效。
为治疗神经变性性疾病，可用本发明组合物来提供一剂本发明化合物，该剂的量足够引起治疗反应(如Aβ诱发的细胞毒性的降低)，例如提供约5ng至约1000mg、或约100ng至约600mg、或约1mg至约500mg、或约20mg至约400mg的一剂。通常，剂量有效量的范围在约0.0001mg/kg体重至1500mg/kg体重、更优选1-1000mg/kg体重，更优选约1-150mg/kg体重，最优选约50-100mg/kg体重。给药剂量可分为每天一剂至约四剂，或者每天尽量多个剂量以诱发治疗效果。举例来说，本发明组合物的剂量单位通常可含有例如约5ng、50ng、100ng、500ng、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg的本发明化合物。可对剂型加以选择，以适应所需的用以获得规定剂量的给药频率。众所周知，所给予的组合物单位剂型的量和用以治疗病症或障碍的剂量方案要取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、性别和医学病症、病症或障碍的严重程度、给药途径和给药频率，可能大不相同。
在本发明的一个实施方案中，组合物以治疗有效量给予患者，也就是说，所给予的组合物量在一段时间后能使本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量，以引起所需的治疗作用。举例来说，在空腹成年人(通常至少空腹10小时)中给予组合物，以在给药后约5分钟使本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量。在本发明的另一个实施方案中，在给予患者组合物后约10分钟本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量。在本发明的另一个实施方案中，在给予患者组合物后约20分钟本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量。在本发明的又一个实施方案中，在给予患者组合物后约30分钟本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量。在本发明的还又一个实施方案中，在给予患者组合物后约40分钟本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量。在本发明的一个实施方案中，在给予患者组合物后约20分钟至约12小时，本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量。在本发明的另一个实施方案中，在给予患者组合物后约20分钟至约6小时，本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量。在本发明的又一个实施方案中，在给予患者组合物后约20分钟至约2小时，本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量。在本发明的还又一个实施方案中，在给予患者组合物后约40分钟至约2小时，本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量。在本发明的又一个实施方案中，在给予患者组合物后约40分钟至约1小时，本发明化合物在患者血清中达到治疗有效剂量。
在本发明的一个实施方案中，本发明组合物以适合使本发明化合物的血清浓度达到半数最大剂量的剂量给予。举例来说，给予患者本发明组合物后，在患者体内达到了约0.01nM至约1000nM、或约0.1nM至约750nM、或约1nM至约500nM、或约20nM至约1000nM、或约100nM至约500nM、或约200nM至约400nM的血清浓度。
本发明组合物在给药后约5分钟至约24小时的一段时间里，以本发明化合物药物治疗的方式提供治疗作用，这使得如有需要可以一天一次或一天两次给药。在本发明的一个实施方案中，组合物以这样的剂量给予患者，该剂量适合在组合物给予患者后约10分钟、20分钟、30分钟或40分钟，使本发明化合物在患者体内的平均血清浓度达到半数最大剂量，所述半数最大剂量为至少约1μg/ml；或至少约5μg/ml；或至少约10μg/ml；或至少约50μg/ml；或至少约100μg/ml；或至少约500μg/ml；或至少约1000μg/ml。
为引起治疗作用所需的治疗药物的量，可根据例如药物向血清的吸收速率、药物的生物利用度和治疗疾病的功效，通过实验来确定。但要认识到，本发明治疗药物针对任何具体患者的具体剂量水平取决于多种因素，包括所使用的具体化合物的活性、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食(包括例如患者是处于空腹还是饱腹状态)、给药时间、排泄速率、药物组合、所治疗的具体疾病的严重程度和给药形式。一般可对治疗剂量进行滴定测定，以使安全性和功效最优化。通常，在体外和/或体内试验初步得到的量效关系可对患者给药合适剂量提供有用的指导。在动物模型上的研究结果，通常可用以对按本发明治疗胃肠道障碍或疾病的有效剂量提供指导。就治疗方案而言，应该认识到，所要给予的剂量会取决于好几个因素，包括所给予的具体药物、给药途径、具体患者的状况等。一般而言，需要给予患者这样的化合物量，该量能有效获得与所发现的在体外有效的浓度相当的血清水平，时间长达能有效引起治疗作用。因此，若发现化合物在例如200nM的半数最大有效剂量下显示出体外活性，则药物(组合物)需要给予的量为，能有效提供约200nM半数最大有效剂量体内浓度，时间长达能有效引起所需的治疗作用，例如治疗与高β-淀粉样蛋白诱发的神经毒性或其他本领域技术人员选择作为合适度量的指标有关的障碍。这些参数的测定完全在本领域技术人员技能范围内。这些需要考虑的事项在本领域众所周知，而且在平常的教科书中有描述。
为了测量并确定所要递送给患者的本发明化合物的有效量，可用标准的测定技术来测量本发明化合物的血清浓度。
本发明组合物在给予患者后约30分钟至约24小时的一段时间里能提供治疗作用。在一个实施方案中，组合物在约30分钟里提供这种治疗作用。在另一个实施方案中，组合物在约24小时时间里提供治疗作用，这使得可以一天给药一次，以改进患者的顺应性。
本发明的方法、药盒和组合物还可与别的治疗或预防神经变性性疾病所必需的药物联合使用(“联合疗法”)，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂(即加兰他敏，盐酸多奈哌齐(donezepil)。当与本发明联合使用即进行联合疗法时，可实现相加效应或协同作用，结果不希望的副作用即使不能全部减少或消除，也会减少或消除很多。这些药物副作用范围的减少，一般归结于例如联合给药时要达到治疗作用所需的剂量减少了。
术语“联合疗法”包括将本发明组合物和别的治疗或预防神经变性性疾病所必需的药物对患者的联合给药，纳入具体治疗方案中的一部分，所述具体治疗方案是旨在通过这些用于治疗神经变性性疾病的治疗药物的协同作用来提供有益效果的。联合疗法的有益效果包括但不限于由治疗药物的组合所产生的药代动力学或药效动力学方面的协同作用。这些联合用药的治疗药物的给药，通常在确定的时间内进行(根据所选择的组合，通常基本上同时进行给药或者相隔数分钟、数小时、数天、数周、数月或数年给药)。“联合疗法”通常并不意在包括将这些治疗药物中的两种或更多种作为相互独立的各单一治疗方案的一部分进行的给药，所述各单一治疗方案会偶然和任意地导致发生本发明的组合。“联合疗法”意在包括这些治疗药物的序贯给药(即每种治疗药物在不同时间给予)以及这些治疗药物或至少这些治疗药物中的两种的基本同时用药。基本同时用药可例如这样实现给予患者具有固定比例的每种治疗药物的一片片剂或一粒胶囊剂，或者给予多颗的每种治疗药物单一胶囊剂或片剂。可通过任何合适的途径，来实现每种治疗药物的序贯给药或基本同时给药。本发明组合物可口服或鼻胃给药，而联合疗法中的其它治疗药物可通过任何对该具体药物合适的途径给药，包括但不限于口服途径、经皮途径、静脉内途径、肌内途径或通过粘膜组织的直接吸收。例如将本发明组合物口服或鼻胃给药，而联合疗法中的其他治疗药物可口服或经皮给药。治疗药物给药的顺序并不是非常重要。“联合疗法”还包括上述治疗药物进一步与其它生物活性成分(例如但不限于镇痛药)联合给药，和包括进一步与非药物疗法(例如但不限于外科手术)联合应用。
组成联合疗法的各治疗性化合物可以为复合剂型，或者为旨在进行基本同时给药的各独立剂型。组成联合疗法的各治疗性化合物，也可与通过要求进行两步给药的方案来给药的两个治疗性化合物的任一个序贯给药。因此，某个方案可能要求将治疗性化合物进行序贯给药，同时间隔给予单独的活性药物。多个给药步骤之间的时间可例如从几分钟至几小时至几天，这取决于每种治疗性化合物的特性如功效、溶解度、生物利用度、血浆半衰期及治疗性化合物的动力学曲线；以及取决于食物摄取的影响及患者的年龄和病况。靶分子浓度的昼夜节律性变化也可决定最佳剂量间隔。联合疗法的各治疗性化合物无论同时、基本同时还是序贯给药，都可能涉及到这样的方案，例如该方案要求一种治疗性化合物通过口服途径给药，而另一种治疗性化合物则通过口服途径、经皮途径、静脉内途径、肌内途径给药或通过粘膜组织直接吸收。联合疗法的各治疗性化合物无论是单独还是一起通过口服、通过吸入喷雾、直肠、局部、口腔、舌下或胃肠外(例如皮下、肌内、静脉内和皮内注射)给药，每个这种治疗性化合物都须包含在由药学上可接受的赋形剂、稀释剂或其它制剂成分制成的合适药用制剂中。
对于口服给药，药用组合物可含有所需量的式(I)、式(II)或式(III)化合物，并且可例如为以下剂型片剂、硬胶囊剂或软胶囊剂、锭剂、扁囊剂、药片(troche)、调剂用散剂、颗粒剂、混悬剂、酏剂、液体制剂或任何其它合理地适用于口服给药的剂型。举例来说，可将这种药用组合物制成含有预定量活性化合物的分立剂量单位的形式，例如片剂或胶囊剂。这种口服剂型还可含有例如缓冲剂。片剂、丸剂等，另外还可用肠溶衣制备。
适合口腔或舌下给药的药用组合物包括例如含活性化合物和矫味基质(例如蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)的锭剂，和含活性化合物和惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)的软锭剂。
供口服给药的液体剂型可包括药学上可接受的含有本领域常用的惰性稀释剂(例如水)的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。这种组合物还可包含例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂以及甜味剂、矫味剂和香味剂。
合适的液体剂型的实例包括但不限于含活性化合物和β-环糊精或β-环糊精的水溶性衍生物的水性溶液剂，所述β-环糊精的水溶性衍生物例如磺丁基醚β-环糊精；七(2，6-O-二甲基)-β-环糊精(heptakis-2，6-di-O-methyl-beta-cyclodextrin)；羟丙基-β-环糊精和二甲基-β-环糊精。
本发明的药用组合物也可通过(静脉内、肌内、皮下)注射给药。这种注射用组合物可使用例如盐水、葡萄糖或水作为合适的载体材料。必要时，可用合适的酸、碱或缓冲剂调节组合物的pH值。组合物中也可包含合适的填充剂、分散剂、湿润剂或悬浮剂，包括甘露醇和聚乙二醇(例如PEG 400)。合适的胃肠外用组合物还包括在注射瓶中冻干的活性化合物。注射前，可加入水溶液溶解该组合物。
药用组合物可以栓剂等剂型给药。这种直肠制剂优选含有活性化合物，其总量例如约0.075％w/w至约75％w/w、或约0.2％w/w至约40％w/w、或约0.4％w/w至约15％w/w。在这种组合物中可使用载体材料，例如可可脂、可可油和其它油类及聚乙二醇栓剂基质。如果需要，也可使用其它载体材料，例如包衣材料(例如羟丙基甲基纤维素薄膜包衣材料)和崩解剂(例如交联羧甲基纤维素钠和交联聚乙烯吡咯烷酮)。
主题化合物可以是游离的，或包封在微胶囊、胶体药物递送系统(例如脂质体、微乳状液和粗乳状液)中。
这些药用组合物可通过任何合适的药剂学方法制备，所述方法包括将本发明活性化合物和一种或多种载体材料混合在一起的步骤。一般而言，组合物是将活性化合物与液体或微细固体载体或这二者非常均匀地混合在一起，然后必要时可将产物成形。例如，可通过将所述化合物的粉末或颗粒，任选与一种或多种辅助成分一起，进行压制或模制来制备片剂。可将自由流动的化合物例如粉末或颗粒，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂一起在合适的机器中混合，压制后制成压制片剂。可将用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物，在合适的机器中模压制成模制片剂。
本发明化合物的片剂也可用常规的包衣材料例如OpadrTM白色YS-1-18027A(或其它颜色)包衣，包衣的重量分数可占包衣片总重的约3％。本发明的组合物可配制成在使用本领域公知的方法将它给予患者后，它能得到快速释放、缓慢释放或延迟释放。
当赋形剂充当稀释剂时，它可为固体、半固体或液体材料，担当活性成分的溶媒(vehicle)、载体(carrier)或介质(medium)。因此，组合物可以为片剂、咀嚼片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(以固体形式或在液体介质中)、软明胶胶囊剂和硬明胶胶囊剂以及无菌包装的散剂。
在本发明的一个实施方案中，制备过程可使用一种或多种以下方法(1)干混；(2)直接压片；(3)研磨；(4)干法或非水制粒；(5)湿法制粒；或(6)熔融。Lachman等，The Theory and Practice of IndustrialPharmacy(1986)。
在本发明的另一个实施方案中，通过将本发明的治疗药物与药用赋形剂混合，形成含有治疗药物和赋形剂的均质混合物的固体预配制组合物，来制备固体组合物例如片剂。当将这些预配制组合物称为均质时，意指治疗药物均匀分散在整个组合物中，使得所述组合物可容易地再分为同等有效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将此固体预配制组合物再分成本文所述类型的单位剂型。
压制片为通过压缩含有活性成分和赋形剂的制剂制备而成的固体剂型，所选的赋形剂应能帮助加工和改善成品的性能。术语“压制片”通常是指供口服摄入的单纯未包衣片剂，其可通过一次压制制备而成，或通过预压紧轻敲(pre-compaction tapping)后进行最后压制制备而成。
可以给本发明片剂或丸剂进行包衣或用其它方法配炼，以提供具有长效作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内层剂量成分和外层剂量成分，后者为覆盖前者的包层(envelope)形式。有多种材料可用作这种肠溶层或包衣，包括许多高分子酸(polymeric acid)以及高分子酸与诸如紫胶、鲸蜡醇、醋酸纤维素等材料的混合物。
对于需要连续给予本发明组合物来治疗神经变性性疾病的患者来说，适合使用长期缓释植入物。本文所用的“长期”释放是指所述植入物制作和安放成能递送治疗水平的活性成分长达至少30天，优选60天的时间。长期缓释植入物是本领域普通技术人员众所周知的，包括一些上述释放系统。
在本发明的另一实施方案中，治疗神经变性性疾病的化合物以盛有一种或多种本发明治疗性化合物的药盒或包装的形式提供。本发明这些治疗性化合物可以药盒或包装物的形式包装，其中安排了每小时、每天、每周或每月(或其它周期)的剂量，以便适当进行序贯给药或同时给药。本发明还提供盛有多个单独包装的剂量单位的药盒或包装物，该剂量单位适合连续每天给药，每个剂量单位包含至少一种本发明的治疗性化合物。这一药物递送系统可用来帮助给予本发明治疗性化合物的各种实施方案的任何一种。在一实施方案中，所述系统包括供每天或每周给药的多个剂量。药盒或包装还可装有用于联合疗法的药物，以帮助所述剂型的适当给药。药盒或包装还可装有一套为患者提供的说明书。
现参考以下详细描述的实施例对本发明做进一步的说明，其中Aβ1-42和Aβ肽片段购自American Peptide Co.(Sunnyvale，CA)。多克隆兔抗β-淀粉样肽(目录号71-5800)得自Zymed Laboratories(SanFrancisco，CA)。[22-3H]R-羟基胆甾醇(比活为20Ci/mmol)由AmericanRadiolabeled Chemical公司(St Louis，MO)合成。胆甾醇、22R-羟基胆甾醇、22S-羟基胆甾醇、孕烯醇酮、17α-羟基孕烯醇酮、孕酮、脱氢表雄酮(DHEA)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)。细胞培养用品购自GIBCO公司(Grand Island，NY)，细胞培养塑料器具得自Coming公司(Corning，NY)。电泳试剂和材料由Bio-Rad公司(Richmond，CA)供应。所用的所有其他化学药品均为分析纯，可从多个商业来源获得。
实施例I组织样品所有人体组织样品均购自哈佛脑组织资源中心(Harvard BrainTissue Resource Center，Belmont，MA)。用于类固醇测定的样品在液氮中速冻或被动(passively)冷冻。脑海马和额皮层样品取自19名患者，即12名AD患者(6男6女)和7名同年龄对照患者(4男3女)。AD患者根据哈佛组织资源中心(Harvard Tissue Resource Center)分类为患有“严重AD”。所有患者的平均年龄为，AD患者74.6±7.2岁，对照患者73.4±10.5岁。平均死后间隔时间(mean post-mortem interval)AD患者为10.2小时，对照患者为14.7小时。人体组织的使用规程获得了Georgetown University Internal Review Board批准。
22R-羟基胆甾醇的纯化与测定样品按现有文献的描述进行提取和反相HPLC纯化。Brown等，J.Neurochem.74，847-859(2000)。收集含22R-羟基胆甾醇的流分(22R-羟基胆甾醇的保留时间＝55分钟)，用胆甾醇氧化酶测定法测定22R-羟基胆甾醇的水平。Gamble等，J.Lipid Res.19，1068-1070(1978)。
细胞培养、细胞毒性和生存力测定按现有文献的描述培养大鼠PC12细胞。Yao等，Brain Res.889，181-190(2001)。人NT2前体(Ntera2/D1畸胎瘤)细胞得自Stratagene公司(La Jolla，CA)，并按供应商的说明进行培养。分化人NT2神经元(NT2N)取自用视黄酸处理后的NT2前体细胞。Andrews，Dev.Biol.，103，285-293(1984)。将Aβ溶于培养基中，以聚集体形式(在4℃下放置过夜)或可溶形式(含寡聚体例如二聚体和四聚体)使用，这两种形式是按现有文献的描述用电泳法来检查出的。Yao等，Brain Res.(2001)。按现有文献的描述，用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)试验(Trevigen，Gaithersburg，MD)测定Aβ及Aβ片段的细胞毒性。出处同上。细胞生存力按现有文献的描述用锥虫蓝排除法进行测定。出处同上。概括地说，对于这些研究，细胞在浓度递增的Aβ存在或不存在下用类固醇处理72小时。培养结束时，细胞用PBS洗涤三次，与0.1％锥虫蓝染色液在室温下一起孵育15分钟。用PBS洗涤三次后，将0.1N NaOH加入到细胞中，用Victor定量检测分光光度计(EGG-Wallac，Gaithersburg，MD)在450nm处定量测定锥虫蓝染色情况。相同的样品按Bradford方法(Bradford，Anal.Biochem.72，248-254(1976))在590nm处检测考马斯蓝染色情况，以测定细胞蛋白质水平。
胆甾醇-蛋白质结合印迹测定(CPBBA)将纯化的Aβ1-42蛋白(50μM)或各种Aβ片段(50μM)和3H-22R-羟基胆甾醇单独、或者在20μl体积的浓度递增的未标记22R-羟基胆甾醇存在下，于37℃培养24小时。培养结束时，样品用1.5％琼脂糖(I-B型)凝胶电泳分离，再转移到10XSSC缓冲液中的硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上。将膜暴露于氚敏屏(tritium-sensitive screen)，用Cyclone Storage phosphor system(PackardBioScience，Meridien，CT)进行磷光成像分析。用OptiQuant软件(Packard)进行图像光密度分析。这一方法使Aβ复合物得以分离、显现和鉴定，所述Aβ复合物在非变性条件下掺入了放射性标记的胆甾醇(Yao，Z.和Papadopoulos，V.，已提交的手稿)和22R-羟基胆甾醇。低分子量未掺入的22i-羟基胆甾醇在电泳过程中分离除去。
Aβ聚集测定将细胞培养基中纯化的Aβ1-42蛋白(50mM)单独、或在浓度递增的22R-羟基胆甾醇存在下，于37℃孵育24小时。孵育结束时，将蛋白质在4％-20％梯度丙烯酰胺-双丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE分离(在125V电压下2小时)。蛋白质用考马斯蓝染色来显现。通过免疫印迹分析对各种Aβ进行鉴定。Yao，Z.等，Brain Res.(2001)。
免疫印迹分析然后用含有22R-羟基胆甾醇-Aβ肽复合物的膜检测Aβ水平。所述膜通过将硝酸纤维素与5％牛奶一起孵育进行封闭，然后用ECL试剂(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)处理以便进行Aβ免疫检测。Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，1267-1272(2001)。抗Aβ抗体和第二抗体分别按0.2μg/ml和1∶5000稀释度使用。
肽建模和22R-羟基胆甾醇对接用由Aβ1-40Met(O)(MMDB标识号7993 PDB标识号1BA)的溶液结构(由CD和NMR光谱测定产生的数据获得)生成的Aβ结构，完成22R-羟基胆甾醇与Aβ17-40和Aβ25-35的计算机对接。Watson等，Biochemistry，37，12700(1998)。将Met(O)SME 35残基用Met置换，保留相邻骨架双面角，抽取残基17-40的坐标。运用Alchemy 2000程序(Tripos，St.Louis，MO)显出22R-羟基胆甾醇结构。对接是用MonteCarlo模拟退火(Li，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001))并按修订版的Autogrid/Autodock实施完成的。Morris等，J.Comput.Chem.19，1639-1662(1998)。在大约109个构象中鉴定出最小能量的构象。执行5轮100次运行，每轮都从配体与靶标的随机初始相对位置和方向开始。每次运行由100个退火循环组成，使用了约2×104个改进步骤。用1.7GHz、1GB RAM个人电脑和改进的程序计算，总的计算时间约为15分钟。
统计用INSTAT 3.00程序包(GraphPad，San Diego，CA)，按照单向方差分析(ANOVA)和非配对学生氏t检验进行统计分析。
结果如图2所示，人脑内源性22R-羟基胆甾醇经HPLC纯化后，用胆甾醇氧化酶测定法测定其水平。报告的数据为12名AD和7名相同年龄对照组样品的两次重复测定的平均值±SEM。图2显示，AD患者脑海马标本中的22R-羟基胆甾醇水平与相同年龄组对照组相比减少60％(p＝0.04)。AD患者脑额皮层标本中的22R-羟基胆甾醇水平与相同年龄组相比也减少50％，不过并不显著。
用指定浓度的Aβ1-42，在浓度递增的22R-羟基胆甾醇(图3A)、胆甾醇(图3B)、孕烯醇酮(图3C)或17α-羟基孕烯醇酮(图3D)、DHEA(图3E)或22S羟基胆甾醇(图3F)不存在或存在下，处理PC12细胞24小时。所示结果为平均值±SD(n＝6-12)。用线粒体黄递酶测定MTT法，测定22R-羟基胆甾醇拯救大鼠PC12神经元细胞免于Aβ诱发的细胞毒性的能力。
分别在5.0μM和50μM Aβ存在下，Aβ1-42诱发的剂量依赖性神经毒性分别导致26％(p＜0.001)和40％(P＜0.001)细胞死亡(图3A)。浓度递增的22R-羟基胆甾醇不影响PC12细胞生存力，尽管在10μM和100μM的22R-羟基胆甾醇存在下出现非显著性提高(图3A)。22R-羟基胆甾醇能够拯救所有细胞免于25μM Aβ诱发的细胞毒性(P＜0.001)，能够拯救50％(p＜0.01)的在50μM Aβ存在下垂死的细胞(图3A)。有趣的是，22R-羟基胆甾醇只有与Aβ同时存在时才有效。PC12细胞用22R-羟基胆甾醇预处理后用Aβ处理，无法对细胞提供任何保护(数据未显示)。
用22R-羟基胆甾醇的前体胆甾醇(图3B)或其代谢物孕烯醇酮(图3C)，重复不出22R-羟基胆甾醇的神经保护性作用。相反，单独的胆甾醇和孕烯醇酮都对细胞有毒性。而且，胆甾醇的存在加重了低浓度Aβ的毒性作用。单独的17α-羟基孕烯醇酮也对细胞有毒性(图3D)。100μM DHEA对细胞生存力有积极作用。相同浓度的DHEA防止5μM(p＜0.001)Aβ诱发的细胞毒性，但对50μM无效(图3E)。22R-羟基胆甾醇的作用是立体专一性的，因为22S-羟基胆甾醇不仅不能防止Aβ诱发的神经毒性，而且在100μM浓度下还有神经毒性(图3F)。
应指出的是，在所介绍的研究中，使用的是聚集的Aβ(放置过夜，4℃)。在另外的试验中，将可溶性Aβ(含寡聚体)直接加入到PC12细胞中，发现其有毒性(数据未显示)。22R-羟基胆甾醇还有防止Aβ寡聚体诱发的毒性(未显示)。
22R-羟基胆甾醇的神经保护性作用并不局限于PC12细胞，而在分化人NT2N神经元中也可以重现(图4)。用25μM Aβ1-42在22R-羟基胆甾醇存在或不存在下，处理分化人NT2N神经元72小时。25μMAβ会抑制50％(p＜0.001)的人神经元生存力，而1μM和10μM的22R-羟基胆甾醇防止Aβ诱发的毒性分别达50％(p＜0.01)和100％(p＜0.001)(图4)。为评价22R-羟基胆甾醇是否能拯救人NT2细胞免于其它毒性损害，用5mM谷氨酸盐在1-50μM 22R-羟基胆甾醇存在或不存在下，处理NT2细胞3天。用MTT测定法测定发现，谷氨酸盐引起细胞生存力下降30％，而22R-羟基胆甾醇的存在并不能保护细胞(数据未显示)。
MTT测定所获得的结果用锥虫蓝染料排除测定法进一步证实。用浓度递增的Aβ1-42(图5A)或Aβ25-35(图5B)，在100μM 22R-羟基胆甾醇或DHEA存在或不存在下，处理PC12细胞72小时。用浓度递增的Aβ1-42(图5C)或Aβ25-35(图5D)，在25μM 22R-羟基胆甾醇或DHEA存在或不存在下，处理NT2细胞72小时。生存力水平用材料与方法中描述的锥虫蓝测定法进行测定。结果以每总细胞蛋白的锥虫蓝染色细胞相对于未处理对照细胞的倍数表示。所示结果为平均值±SD(n＝6-12)。图5A和图5C显示22R-羟基胆甾醇能拯救大鼠PC12细胞(图5A)和人NT2细胞(图5C)免于Aβ1-42诱发的细胞死亡。相反，DHEA只能保护大鼠PC12细胞免于Aβ1-42诱发的细胞死亡，但不能保护NT2细胞(图5A和图5C)。22R-羟基胆甾醇和DHEA都不能拯救PC1 2和NT2细胞免于Aβ25-35诱发的细胞死亡(图5B和图5D)。
还检测了22R-羟基胆甾醇改变Aβ聚集的能力。将细胞培养基中的纯化Aβ1-42蛋白(50 μM)单独、或在浓度递增的22R-羟基胆甾醇存在下，于37℃孵育24小时。孵育结束时，用SDS-PAGE分离蛋白，并用考马斯蓝显现(图6A)。所形成的各种Aβ用抗Aβ多克隆抗血清进行免疫印迹鉴定(图6B)。在凝胶的顶部可观察到Aβ聚集，而在对照培养基泳道不存在聚集。图6A和图6B显示22R-羟基胆甾醇不影响Aβ聚集，该聚集是通过对考马斯蓝染色的凝胶(图6A)进行的免疫印迹分析(图6B)鉴定出来的。所有样品(包括对照培养基)都有一100kDa条带被所用的Aβ多克隆抗血清所识别，这可能反映了抗血清的非特异结合。
然后研究了22R-羟基胆甾醇的作用机制。鉴于22R-羟基胆甾醇只在Aβ存在下才有神经保护作用，用新方法(CPBBA法)探索了22R-羟基胆甾醇与Aβ之间的直接相互作用。将放射性标记的22R-羟基胆甾醇与Aβ1-42在37℃下共孵育24小时，证明存在可被Aβ的特异性抗体(图7B)所识别的高分子量放射性标记条带(图7A)。22R-羟基胆甾醇对Aβ1-42的放射性标记的特异性，通过用未标记的22R-羟基胆甾醇进行的竞争性研究来证明(图7A)。如对放射性标记的Aβ1-42的图像分析所示(图7A)，在这些研究中，50μM和200μM的22R-羟基胆甾醇抑制放射性标记的22R-羟基胆甾醇与50μM Aβ1-42的结合分别达50％和90％。通过对放射性标记的Aβ1-42的免疫印迹分析，对各孵育反应和CPBBA中等量加样的Aβ1-42进行评价(图7B)。应指出的是，尽管观察到在50-200μM 22R-羟基胆甾醇存在下对Aβ1-42的放射性标记减少，但在各泳道存在的Aβ1-42的量没有差异。这些数据表明，在非变性条件下，22R-羟基胆甾醇与Aβ发生结合。用CPBBA和各种Aβ合成肽，将Aβ中的22R-羟基胆甾醇结合位点定位于Aβ的氨基酸17-40(图7C和图7E)。有趣的是，在22R-羟基胆甾醇存在下保持其神经毒性的肽Aβ25-35(图7B和图7D)，并不结合22R-羟基胆甾醇(图7C)。用计算对接模拟进一步证实了这些数据。对接结果显示，Aβ17-40形成一个口袋，22R-羟基胆甾醇在该处可对接(图7D)。氨基酸G29A30I31所形成的口袋捕获到22R-羟基胆甾醇的C27-29原子。R取向可以发生22R-羟基胆甾醇对接，而S取向却不能。用Aβ25-35进行的类似研究表明，尽管在19-36区域存在一些氨基酸，但Aβ25-35与22R-羟基胆甾醇的对接能(-6.0510kcal/mol)比Aβ17-40(-8.6939kcal/mol)和Aβ1-42(-9.6960kcal/mol)高，提示该类固醇不与Aβ25-35结合，这与CPBBA数据相符。
讨论在本研究中，发现在AD患者脑标本中的22R-羟基胆甾醇的水平比相同年龄对照组低。22R-羟基胆甾醇的水平在海马中显著降低，海马是大脑的边缘系统中的一个结构，对学习和记忆等认知功能至关重要，它在AD中受到影响。Aβ的生理功能是调控胆甾醇转运(Yao等，FASEB，16，1677-1679(＿＿)。根据这项发现，22R-羟基胆甾醇的减少可能是因为AD患者大脑内Aβ过量生成(Roher等，J.Biol.Chem.，286，3072-3083(1993)；Younkin，J.Physiol.，92，289-292(1998))，阻断了胆甾醇的运输或减少了细胞对胆甾醇的摄取，从而影响用于神经类固醇形成的底物胆甾醇的可利用率，导致AD患者大脑内的22R-羟基胆甾醇合成减少。另外，AD大脑标本中孕烯醇酮和DHEA从胆甾醇的从头合成增加，也会使AD中可利用的22R-羟基胆甾醇中间体耗竭。AD海马中出现孕烯醇酮和DHEA水平增加(Brown等，Neurobiology of Aging，24，57-65(2003))，是由Aβ诱发的(Brown等，J.Neurochem.，74，847-859(2000))。也有可能的是，Aβ诱发的胆甾醇运输减少和胆甾醇代谢增加这两个事件都发生在AD中，而导致22R-羟基胆甾醇水平降低。
对于这些研究，均采用已确立的大鼠PC12神经元细胞模型。然而，22R-羟基胆甾醇的神经保护性作用并不局限于啮齿动物神经元，在人NT2和NT2N神经元细胞中也发现该作用。NT2细胞是人畸胎瘤细胞的克隆系，源自NT2细胞的NT2N是有丝分裂期后的、终末分化的神经元，具有与中枢神经系统神经元一致的细胞表面标记。Andrews，Dev.Biol.(1984)。发现22R-羟基胆甾醇以剂量依赖性方式保护大鼠和人的神经元免于Aβ诱发的毒性，其对PC12和NT2T细胞的IC50分别为10μM和3μM。用22R-羟基胆甾醇处理细胞，使用25μM浓度时可给细胞提供针对Aβ肽的完全保护，使用50μM浓度时针对该肽提供50％的神经保护作用。
用检测蓝甲的形成的MTT测定法，除对22R-羟基胆甾醇的作用进行研究外，还研究了参与胆甾醇代谢的各种类固醇的神经保护特性。这些在Aβ诱发的PC12神经毒性方面进行了测试的类固醇，除了22R-羟基胆甾醇和DHEA外，其它都有毒性。DHEA对啮齿动物神经元的神经保护性作用与先前的研究一致。Kimonides等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，1852-1857(1998)；Cardounel等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，222，145-149(2000)。但是，与22R-羟基胆甾醇相反，DHEA对Aβ诱发的人NT2细胞死亡不起作用，提示22R-羟基胆甾醇的作用不具有种特异性，可能因为这种类固醇与Aβ直接发生相互作用。发现胆甾醇(22R-羟基胆甾醇的前体)具有神经毒性。而在碳22(R)位存在羟基，不仅解除了胆甾醇的毒性作用，而且还能防止Aβ诱发的神经毒性。22R-羟基胆甾醇的对映体22S-羟基胆甾醇无活性，而且在高浓度时具有神经毒性，这一观察结果进一步证实22R-羟基胆甾醇作用的特异性。
用新的测定法(CPBBA)证实了22R-羟基胆甾醇与Aβ之间的直接相互作用。该测定法使放射性标记的类固醇与Aβ或Aβ肽片段之间在非变性条件下的直接互相作用得以研究和显现。放射性标记的22R-羟基胆甾醇能与Aβ结合，而未标记的22R-羟基胆甾醇会取代该结合的类固醇。CPBBA表明，22R-羟基胆甾醇能结合Aβ1-42和Aβ17-40，但几乎不能与Aβ1-40发生相互作用。对纯化的淀粉样蛋白斑的质谱分析揭示，Aβ1-42是淀粉样蛋白沉积物的主要成分，因此认为Aβ1-42是AD发病机制的主要元凶。Roher等，J.Biol.Chem.(1993)；Younkin，Physiol.(1998)。据认为，40个氨基酸的较短型Aβ没有病理作用(Brown等，J.Neurochem.(2000))，并且在AD大脑内较少(Roher等，J.Biol.Chem.(1993)；Younkin，S.G.，J.Physiol.(1998))。根据报道的Aβ结构进行的计算建模模拟表明，当羟基为R取向时，氨基酸19-36会捕获22-R羟基胆甾醇的侧链。有趣的是，已知具有毒性作用的肽Aβ25-35(Schubert等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，1989-1993(1995))即使在22R-羟基胆甾醇存在下，仍保留其神经毒性特征。计算建模模拟和CPBBA未能证实22R-羟基胆甾醇和肽Aβ25-35之间的相互作用，提示是Aβ1-42和Aβ17-40的三维构象而非一级氨基酸序列，赋予氨基酸19-36与22R-羟基胆甾醇发生相互作用的能力。
22R-羟基胆甾醇与Aβ1-42的氨基酸17-40结合，导致啮齿动物和人的神经元细胞受保护/拯救免于Aβ1-42诱发的细胞毒性和细胞死亡。22R-羟基胆甾醇起作用而阻断Aβ的神经毒性作用的确切机制尚不得而知。但是，本文给出的数据表明它不影响Aβ聚合。22R-羟基胆甾醇与Aβ1-42的结合可能改变Aβ单体或多聚体的构象而使其无活性，或者阻止Aβ与细胞发生相互作用或激活介导其毒性作用的胞内机制。因此，除因AD大脑内Aβ1-42生成增加外，AD患者大脑内22R-羟基胆甾醇水平比相同年龄对照组低，也会导致大脑针对A1-42诱发的神经毒性的能力降低/丧失。这一点可能对于早老蛋白1样家族性早老性痴呆(FAD)患者尤其正确，这类患者的Aβ1-42水平最高。Borchelt等，Neuron，17，1005-1013(1996)。
实施例II材料Aβ1-42肽购自American Peptide Co.(Sunnyvale，CA)。22R-羟基胆甾醇(SP222)购自Sigma公司(St.Louis，MO)。[22-3H]R-羟基胆甾醇(比活为20Ci/mmol)由American Radiolabeled Chemical公司(St Louis，MO)合成。22R-羟基胆甾醇衍生物(SP223-238)购自Interbioscreen公司(Moscow，Russia)。细胞培养用品购自GIBC0公司(Grand Island，NY)，细胞培养塑料器具得自Corning公司(Corning，NY)和PackardBio Sciences Co.(Meriden，CT)。
22R-羟基胆甾醇衍生物的计算机筛选运用ISIS软件(Information Systems，Inc.，San Leandro，CA)，在天然存在的实体的Interbioscreen Database数据库中筛选含22R-羟基胆甾醇结构的化合物。选出和测试过的22R-羟基胆甾醇(SP222)及衍生物(SP223-238)的结构示于图1，这些化合物的代号、化学名称和来源均见表1。
细胞培养和处理将得自ATCC(Manassas，VA)的PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤神经元)在不含谷氨酰胺但补充了10％胎牛血清和5％马血清的RPMI 1640培养基中，37℃和5％CO2下进行培养。Yao Z，Drieu K和PapadopoulosV.，The Gingko biloba extract EGb 761 rescues PC12 neuronal cells fromβ-amyloid-induced cell death by inhibiting the formation of β-amyloid-derived diffusible neurotoxic ligands(银杏叶提取物EGb 761通过抑制β-淀粉样蛋白衍生的可扩散神经毒性配体的形成，拯救PC12神经元细胞免于β-淀粉样蛋白诱发的细胞死亡)，Brain Res.，889，181-190(2001)。将细胞接种到96孔板(8×104细胞/孔)上。经孵育过夜后，将浓度递增的聚集Aβ(0.1μM、1μM和10μM)加入到存在或不存在指定浓度的待测SP化合物的所述细胞中。经过72小时孵育后，检测各种参数和细胞生存力的标记物。将小鼠MA-10肿瘤间质细胞在37℃下，维持在5％CO2下的补充5％热灭活胎牛血清和2.5％马血清的DMEM/Ham’s F12(Biofluids，Rockville，MD)培养基中。将细胞以2.5×104细胞/孔的密度接种到96孔板上过夜。在0.2ml/孔的无血清培养基中，细胞用指定浓度的各种SP化合物刺激2小时。收集培养基，通过放射免疫测定法对孕酮生成进行检测。
MTT细胞毒性测定用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测定法(Trevigen，Gaithersburg，MD)评价Aβ的细胞毒性。概括地说，将10μl的MTT溶液加入到在100μl培养基中培养的细胞中。经过4小时孵育后，加入100μl去污剂，将细胞在37℃下孵育过夜。用Victor定量检测分光光度计(EGG-Wallac，Gaithersburg，MD)，在600nm和690nm处定量检测甲蓝形成，结果以(DO600-DO690)表示。虽然MTT测定法是广泛用于评价Aβ处理的神经元细胞中的细胞毒性的，但这里提示，在各种类固醇存在下得到的结果，可能反映了导致MTT甲胞吐和损失增加的Aβ依赖性小泡再循环。Liu Y和Schubert D，Steroidhormones block amyloid fibril-induced 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)formazan exocytosisrelationship toneurotoxicity(类固醇激素阻断淀粉样蛋白原纤维诱发的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)甲胞吐与神经毒性的关系)，J.Neurochem.，19，1639-1662(1998)。为此，使用另外的细胞毒性和细胞生存力测定法。
锥虫蓝细胞生存力测定用我们前述的锥虫蓝排除法测定细胞生存力。Yao等，The Gingkobiloba extract EGb 761 rescues PC12 neuronal cells from β-amyloid-induced cell death by inhibiting the formation of β-amyloid-deriveddiffusible neurotoxic ligands(银杏叶提取物EGb 761通过抑制β-淀粉样蛋白衍生的可扩散神经毒性配体的形成，拯救PC12神经元细胞免于β-淀粉样蛋白诱发的细胞死亡)，Brain Res.，889，181-190(2001)。概括地说，在浓度递增的Aβ存在或不存在下，用SP化合物处理细胞72小时。孵育结束时，细胞用PBS洗涤三次，然后与0.1％锥虫蓝染色液在室温下孵育15分钟。用PBS洗涤三次后，将0.1N NaOH加入到细胞中，用Victor定量检测分光光度计在450nm处定量检测锥虫蓝。
膜电位的测定还用发光试剂盒CytoLiteTM(Packard BioScience Co.)，按照生产商的建议，评价细胞生存力。概括地说，将细胞在96孔板中培养处理，经过72小时孵育后，将25μl激活剂(Activator)溶液加入到细胞中，随后加入150μl放大剂(Amplifier)溶液。用TopCount NXTTM计数器(Packard BioSciences Co.)检测发光，检测前有5分钟预计数延迟时间。
细胞ATP水平的测定用ATPLite-MTM发光测定法(Packard BioSciences Co.)测定细胞ATP浓度。对于这种测定法，在黑色96孔ViewPlateTM上培养细胞，用TopCount NXTTM计数器(Packard Biosciences Co.)按照生产商的建议测定ATP浓度。
放射免疫测定用抗孕酮抗血清(ICN，Costa Mesa，CA)，按照生产商推荐的条件，通过放射免疫测定法测定MA-10细胞的孕酮产生。通过每孔中蛋白质的量将孕酮产生进行归一化。运用MultiCalc软件(EG&GWallac，Gaithersburg，MD)，分析放射免疫测定数据。
22R-羟基胆甾醇-蛋白质结合印迹测定(CPBBA)将纯化的Aβ(50μM)和3H-22R-羟基胆甾醇单独、或者在20μl体积的100μM未标记22R-羟基胆甾醇(SP-222)或各种22R-羟基胆甾醇衍生物存在下，于37℃孵育8小时或24小时。孵育结束时，样品用1.5％琼脂糖(I-B型)凝胶电泳分离(在非变性条件下)，再转移到10XSSC缓冲液中的硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上。将所述膜暴露于氚敏屏，并用Cyclone Storage phosphor system(Packard BioScience)进行磷光成像分析。用OptiQuant软件(PackardBioScience)进行图像光密度分析。该方法使Aβ复合物得以分离、显现和鉴定，所述Aβ复合物在非变性条件下掺入了放射性标记的胆甾醇(Yao Z.和Papadopoulos V.，Function of β-amyloid in cholesteroltransporta lead to neurotoxicity(β-淀粉样蛋白在胆甾醇转运中的功能导致神经毒性)，FASEB J.，16，1677-1679(2002))和22R-羟基胆甾醇(Yao等，J.Neurochem.，83，1110-1119(2002))或22R-羟基胆甾醇衍生物。低分子量未掺入的22R-羟基胆甾醇和衍生物在电泳过程中分离除去。
肽建模与对接模拟用由Aβ1-40Met(O)(MMDB标识号7993，PDB标识号Id1BA)的溶液结构(由CD和NMR光谱测定产生的数据获得)初始化的Aβ结构，完成22R-羟基胆甾醇及其16个衍生物与Aβ1-42的计算机对接。Watson，A.A.，Fairlie，D.P.和Craik，D.J.，Solution structure ofmethionine-oxidized amyloid beta-peptid(1-40)(甲硫氨酸氧化的淀粉样β-肽(1-40)的溶液结构)。Does oxidation affect conformational switching？(氧化会影响构象转换吗？)，Biochem.，37，12700-12706(1998)。将Met(O)SME 35残基用Met置换，保留相邻骨架双面角，附加I41和A42残基。然后运用Alchemy 2000程序(Tripos，St.Louis，MO)使该结构的能量最小化。22R-羟基胆甾醇衍生物结构也用Alchemy 2000生成。按现有文献的描述，用Monte Carlo模拟退火完成分子对接。Li等，Cholesterol binding at the cholesterol recognition/interaction aminoacid consensus(CRAC)of the peripheral-type benzodiazepine receptorand inhibition of steroidogenesis by an HIV TAT-CRAC peptide(外周型苯并二氮杂受体的胆甾醇识别/相互作用氨基酸共有区(CRAC)中的胆甾醇结合和HIV TAT-CRAC肽对类固醇生成的抑制)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，1267-1272(2001)，按修订版的Autogrid/Autodock实施。Morris等，Distributed automated docking of flexible ligands toproteinsparallel applications of AutoDock 2.4(柔性配体与蛋白质的分布式自动对接AutoDock 2.4的并行应用)，J.Comput.Chem.，19，1639-1662(1998)。对于每一个化合物/Aβ对，要评价大约108个构象才选出一个最小能量构象。执行3轮100次运行，每轮都从配体相对于靶标的随机初始相对位置和方向开始。每次运行由100个退火循环组成，使用了约2×104个改进步骤。用1.7GHz、1GB RAM个人电脑，每个配体/靶标对的平均计算时间约为21/2小时。
统计分析用INSTAT 3.00(GraphPad，San Diego，CA)，按照单向方差分析(ANOVA)和非配对学生氏t检验进行统计分析。
结果将PC12细胞暴露于浓度递增的Aβ达3天，导致剂量依赖性细胞死亡(图8)，最高达50％的细胞，这与我们先前的数据相符。Yao等，J Neurochem.，83，1110-1119(2002)；和Yao等，The Gingko bilobaextract EGb 761 rescues PC12 neuronal cells from β-amyloid-induced celldeath by inhibiting the formation of β-amyloid-derived diffusibleneurotoxic ligands(银杏叶提取物EGb 761通过抑制β-淀粉样蛋白衍生的可扩散神经毒性配体的形成，拯救PC12神经元细胞免于β-淀粉样蛋白诱发的细胞死亡)，Brain Res，889，181-190(2001)。为与AD的脑内Aβ浓度相近，使用0.1-10μM Aβ浓度。进行神经保护特性试验的化合物是在浓度30μM和50μM下检测的(图9-15)。
图9-11显示用MTT测定法(NADPH黄递酶活性的测量方法)所测出的，先导化合物22R-羟基胆甾醇(SP222)和含22R-羟基胆甾醇结构的化合物(SP223-238)对Aβ诱发的神经毒性的作用。图9-11显示了这些化合物分别对0.1μM、1.0μM和10.0μM Aβ诱发的神经毒性的作用，以NADPH黄递酶活性的抑制百分率表示。100％抑制水平对应于单独给予Aβ所诱发的蓝甲形成的减少。
SP222能保护PC12细胞针对0.1μM和1μM Aβ的神经保护作用，但对10μM Aβ下只提供有限的神经保护作用。应指出的是，观察到SP-222对高浓度Aβ的作用可变性很大，这取决于所用细胞的传代情况。SP228、SP229、SP233、SP235、SP236、SP237和SP238显示有针对0.1μM Aβ的神经保护活性，但只有SP233、SP235、SP236和SP238比SP222发挥明显更强有力的作用(图9A-9P)。SP233、SP236和SP238保持其针对1μM Aβ诱发的毒性的神经保护特性(图10A-10P)，但只有SP233和SP238在10μM Aβ存在下仍保持这种特性(图11A-11P)。
MTT测定法所获得的结果，通过对SP222、SP233、SP235、SP236和SP238应用评价膜电位的Cytolite测定法加以证实。图12A显示Aβ暴露诱发用以评价膜电位的发光的剂量相关性减少。尽管SP222能针对0.1μM Aβ的保护(图12B)，但它未能针对两个最高浓度的Aβ的保护(图12C和图12D)。如所测得的发光的增强所示，所用的各种SP化合物显示比SP222明显更好的神经保护作用。用MTT测定法所观察到的SP233和SP238对10μM Aβ的神经保护作用(图11)，通过在相同条件下提高信号进行重复(图12D)。
对在SP222-SP238化合物存在或不存在下用浓度递增的Aβ处理的PC12细胞中的ATP水平(线粒体功能的指标)进行测定(图13A-13D)。Aβ以剂量依赖性方式减少PC12细胞产生ATP；测得在0.1μM、1.0μM和10μM Aβ存在下ATP水平分别下降18％、22％和25％(p＜0.001，ANOVA法；图13A)。在所测试的化合物中，只有SP233和SP236能够逆转0.1μM和1.0μM Aβ诱导的ATP水平降低(图13B和图13C)。在10μM Aβ存在下，没有发现SP化合物对ATP合成的有益作用。
细胞的锥虫蓝摄取是用于评价有希望的SP233化合物对Aβ诱发的毒性的影响的第四个试验(图14)。正如所料，0.1μM、1μM和10μMAβ诱导PC12细胞的锥虫蓝摄取发生剂量依赖性(分别为33％、36％和97％；p＜0.001，ANOVA法)增加。30μM和50μM SP233抑制了Aβ诱发的细胞死亡(p＜0.001 ANOVA法)。图15显示，SP233的神经保护性作用是剂量依赖性的，且在所有这三个Aβ浓度存在下都得到保持，尽管在高的超生理病理性(supra-physiopathological)Aβ浓度存在下其功效下降。
对22R-羟基胆甾醇衍生物进行鉴定的一个原因是需要这样的生物活性(神经保护性)化合物，所述化合物不能被P450scc代谢为孕烯醇酮，然后代谢为组织特异性的最终类固醇产物。为评价类固醇生成细胞对这些化合物的代谢，我们研究了这些化合物在MA-10小鼠肿瘤间质细胞中形成类固醇的能力，所述细胞为一种得到充分表征的类固醇生成细胞模型，其中22R-羟基胆甾醇为良好的P450scc底物，并且能够产生大量的类固醇。Li等，Cholesterol binding at thecholesterol recognition/interaction acid consensus(CRAC)of theperipheral-type benzodiazepine receptor and inhibition of steroidogenesisby an HIV TAT-CRAC peptide(外周型苯并二氮杂受体的胆甾醇识别/相互作用氨基酸共有区(CRAC)中的胆甾醇结合和HIV TAT-CRAC肽对类固醇生成的抑制)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，1267-1272(2001)。图16显示，与SP222相反，SP233不能被代谢为最终类固醇产物。
22R-羟基胆甾醇衍生物与Aβ的直接相互作用在针对放射性标记的22R-羟基胆甾醇/Aβ复合物进行的置换研究中得到证实(图17)。将放射性标记的22R-羟基胆甾醇与Aβ一起在37℃共孵育24小时，证明存在高分子量的放射性标记条带(图17)，其可被Aβ的特异性抗体所识别(Yao等，2002，数据未显示)。22R-羟基胆甾醇对Aβ的放射性标记的特异性，通过用未标记的22R-羟基胆甾醇进行的竞争性研究来证明(图17)，该研究中100μM SP222被80％的结合Aβ的放射性标记SP222化合物所置换。在所测试的SP化合物中，SP237、SP238、SP226、SP227和SP233置换与Aβ结合的放射性标记22R-羟基胆甾醇分别达46％、44％、65％、38％和35％(图17)。
用与Aβ的计算对接模拟进一步证实这些数据。对接结果表明，Aβ1-42在19-36氨基酸区域形成一个口袋，22R-羟基胆甾醇可在那里发生结合，这与我们先前的数据一致。Yao等，J.Neurochem.，83，1110-1119(2002)。各种被测化合物的对接能按与Aβ结合所需的最小能量的次序排列为(-10.34kcal/mol)SP229＜SP232＜SP224＜SP237＜SP222＜SP233＜SP228＜SP223＜SP230＜SP234＜SP225＜SP238＜SP236＜SP226＜SP235＜SP231＜SP227(-8.35kcal/mol)。图18和图19比较了SP222与SP233的结合特性。这是每个化合物运行100次的对接分析。数据显示，SP233大约有23％的次数是以-7.0Kcal/mol至-7.5Kcal/mol的能量进行对接；而SP222大约有25％次数只以5.5-6.0kcal/mol进行对接。SP233具有更强(负数更大)的对接能的概率比SP222明显更大。SP233在几乎100％的次数中都以小于-6.0kcal/mol发生结合，而SP222的对等数量只约为-4.0kcal/mol。对结合能频率分布的分析显示是双峰式分布，提示在Aβ中存在两个结合位点。对于SP233，各峰可能出现在-7至-7.5以及-8至-8.5kcal/mol；而对于SP222，各峰似乎位于-5.5至-6.0以及-4.0至-4.5kcal/mol。
讨论使用这种测定法，即使当PC12细胞暴露于高达10μM的Aβ浓度时，一些被测化合物即SP233、SP235、SP236和SP238还是显示出神经保护活性。有趣的是，这些化合物比22R-羟基胆甾醇(SP222)参比分子更有效。
Aβ作用机制的一个晚期事件是线粒体呼吸链的直接或间接破坏，这导致ATP生成减少，仅此即可导致细胞死亡。能够拯救PC12细胞免于Aβ诱发的毒性的SP222、SP235和SP238化合物，并不能阻断Aβ诱发的ATP合成上的改变。尽管这种明显的矛盾之处仍有待解释，但有可能是MTT测定(线粒体黄递酶活性)和ATP合成并不反映呼吸链中的相同部分的状况。与此对比，SP233和SP236能阻断(尽管是部分阻断)Aβ诱发的ATP生成减少。SP233保存ATP贮备的能力可解释这种化合物的强大神经保护作用，其得到锥虫蓝摄取细胞生存力测定的进一步证实。应指出的是，发现SP233不仅在所用的所有测定中是最灵验的，而且是功效最强的，可提供针对浓度高达10μM的Aβ的体外神经保护作用。
用0.1μM、1.0μM和10μM Aβ1-42进行本文所报道的研究。这些浓度是超生理病理性的，因为AD患者和对照组患者的脑脊液中存在的Aβ1-42浓度在500-1000ng/L(0.1-0.2nM)的范围。即使Aβ1-42可能以高10倍的浓度存在于AD大脑内，则其估计病理生理浓度会在1-2nM的范围，而这比本申请人实验的浓度低100-10,000倍。考虑到这些因素后，显然SP233所提供的针对0.1μM Aβ的保护作用有75％是药理学上相关的。
与22R-羟基胆甾醇不同的是，其生物活性衍生物SP233不能诱导类固醇形成。
SP化合物的神经保护特性可能遵从结构/活性关系(SAR)。SP231和SP235是薯蓣皂苷元的立体异构体(图1)，但只有SP235能抵抗Aβ诱发的神经毒性。SP235的立体化学结构为C3R、C10R、C13S、C20S、C22S、C25S，这种基序(motif)也为SP233和SP236所共有(图1)。显示高神经保护活性并且在高浓度Aβ的存在下具有活性的SP化合物，在C3位上包含酯、优选脂肪酸或脂肪酸类结构。的确，在C3位上具有未取代羟基的SP235所提供的神经保护作用有限，只针对0.1μMAβ。与此对比，SP236是在SP235的C3位所成的琥珀酸酯，其能针对更高的Aβ浓度有活性，而SP233是在SP235的C3位所成的己酸酯，是功效最强的化合物。SP238尽管对维持ATP水平没有作用，但却能够保护PC12细胞免于Aβ诱发的毒性的这一发现，进一步支持这个假设，因为其在C3位没有任何侧链的衍生物(SP226)不提供神经保护作用。SP232上出现的苯甲酸取代在神经保护方面无效的这一发现，提示在该水平上存在脂族链比存在芳族结构更具相关性。尽管这些数据说明的是SAR并突出了在C3位存在脂肪酸链的重要性。
对SP222衍生物通过结合Aβ1-42并使其失活来提供神经保护作用的能力进行了研究。显示抗Aβ诱发的细胞死亡的神经保护特性的SP化合物，置换了与淀粉样肽结合的放射性标记22R-羟基胆甾醇。
用计算对接模拟进一步表征SP-Aβ相互作用。研究揭示，在Aβ上可能存在两个针对生物活性SP化合物的结合位点。第一个结合位点似乎对22R-羟基胆甾醇(SP222)更具特异性，而第二个结合位点显示对诸如SP233和SP236等化合物有更高的亲和性。尽管SP226也显示能与该第二个结合位点结合，但该化合物的计算结合能比神经保护性SP分子所显示的能量低得多。其后的计算对接模拟研究表明，SP222和SP233的结合能遵循双峰式分布，该发现强有力地证实在Aβ上存在两个结合位点。对结合能的进一步计算表明，SP222对该第二个结合位点的亲和性小于SP233，提示酯链的存在可能是SP233能够与Aβ上这两个位点结合的原因。基于这些观察结果，为使淀粉样肽持续失活，可能需要对Aβ的第二个结合位点加以占据。
与Aβ的直接失活不相关的其它机制也有助于SP233的神经保护活性。尽管对螺甾烯醇在核受体上的结合知之甚少，但不能排除可能存在对类固醇受体家族的调节。已证实，Aβ抑制含GLUT3小泡的融合，导致线粒体稳态被破坏，从而导致神经元死亡。另一方面，从黄精(Polygonati rhizome)提取的螺甾烯醇衍生物提高了正常小鼠和链脲佐菌素诱发的糖尿病小鼠的葡萄糖吸收。这些结果综合在一起提示，细胞内葡萄糖转运的恢复可能是由螺甾烯醇SP233激活的保护机制。
实施例III材料与方法Aβ聚合和淀粉样蛋白衍生的可扩散配体(ADDL)形成的免疫印迹分析将浓度递增的Aβ(0.1μM、1μM和10μM)与或不与浓度递增的SP233(1μM、10μM和100μM)在PC12培养基中，于37℃、5％CO2下孵育24小时和72小时。孵育结束时，样品用4-20％Tris-甘氨酸凝胶电泳(Invitrogen)分离(在非变性条件下，125V，2小时)，再转移到硝酸纤维素膜(HybondTMECLTM，Amersham Pharmacia Biotech)上(130A，30分钟)。将硝酸纤维素与5％牛奶一起孵育，以封闭抗体的非特异性吸收。用能识别Aβ蛋白的30氨基酸肽的抗Aβ多克隆抗体(Zymed Laboratories，San Francisco，CA)处理印迹，以便对各种Aβ进行免疫检测。将膜在第一抗体中以1∶2,000稀释度在室温下孵育1小时。然后，将膜在第二抗体中以1∶1,000稀释度在室温下孵育1.5小时。用ECLTMWestern Blotting Analysis System(Amersham Biosciences)使印迹显现。用OptiQuant软件(Packard BioScience)进行图像光密度分析。这个方法使Aβ复合物、多聚体和ADDL得以分离、显现和鉴定。
结果在将浓度递增的Aβ与浓度递增的SP233一起孵育后进行电泳，以鉴定Aβ所形成的寡聚体和在该形成过程中由SP233诱发的干扰作用。图20A和图20F显示在24小时(图20A)和72小时(图20F)孵育时间后进行的免疫印迹分析。在我们的实验条件下，在0.1μM Aβ存在下任何时间都没有检测到单体，在0.1μM和1μM Aβ存在下24小时和72小时都没有检测到三聚体或四聚体(ADDL)。SP233在1μM和10μM浓度的Aβ存在下，以剂量依赖性方式减少单体的量，所述量是在24小时(图20B)和72小时(图20G)进行定量测定的。当SP233与10μM Aβ共孵育时，也在24小时(图20C、图20D)和72小时(图20H、图20I)的三聚ADDL和四聚ADDL上观察到这种剂量-效应关系。相反，SP233引起多聚体发生少量的剂量依赖性增加(图20E、图20J)，提示SP233能结合Aβ并通过与该肽形成稳定的大复合物抑制神经毒性ADDL的形成。
讨论三聚体和四聚体属于淀粉样蛋白衍生的可扩散配体(ADDL)，是大约13-108kD大小的非纤维状寡聚体(Klein，Neurochem.Int.，41，345-352(2002))，在低至5-10nM的浓度下都具有很强的神经毒性特征(Lambert等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，6448-6453(1998)；Dahlgren等，J.Biol.Chem.，277(35)，32046-32053(2002))。最近的报告将ADDL描述为具有Aβ的神经毒性特征。Klein，Neurochem.Int.，41，345-352(2002)。SP233在24小时或72小时孵育后以剂量依赖性方式减少三聚体和四聚体的形成，这说明了它的神经保护作用。此外，SP233降低了可供ADDL形成的单体的量。SP233对ADDL量的剂量依赖性减少伴随着高分子量多聚体聚集的剂量依赖性增加，这提示22R-羟基胆甾醇和SP233通过与Aβ结合并形成稳定的无毒多聚体而使Aβ失活。
实施例IV用22R-羟基胆甾醇使神经元前体细胞分化本实施例证明22R-羟基胆甾醇能抑制NT2细胞的增殖并诱导它们分化成“神经元样”和“星形胶质细胞样”细胞。在22R-羟基胆甾醇诱导的NT2细胞分化过程中，高分子量神经丝蛋白NF 200的表达增加，低分子量神经丝蛋白NF 70表达减少，GFRα2的蛋白质表达增加。22R-羟基胆甾醇的这些作用是立体特异性的，因为它的对映异构体22S-羟基胆甾醇或其他类甾醇并不能诱导NT2细胞分化。
细胞培养、细胞生存力(细胞毒性)、细胞增殖和流式细胞术人NT2前体(Ntera2/D1畸胎瘤)细胞得自Stratagene(La Jolla，CA，USA)，并按供应商的说明进行培养。22R-羟基胆甾醇对细胞生存力(细胞毒性的反度量)和细胞增殖的作用，用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测定法(Trevigen，Gaithersburg，MD，USA)、乳酸脱氢酶释放(LDH)测定法(Boehringer Mannheim；Indianapolis，IN，USA)和5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)ELISA(Boehringer Manneim；Indianapolis，IN，USA)，按现有文献的描述(Yao等，Brain Res.，889，181(2001))或遵循公司的方案进行测定。对于流式细胞术，使细胞在10cm平皿中生长24小时，并用各种浓度的22R-羟基胆甾醇处理0(对照)、3天、6天和12天。胰蛋白酶消化处理后，收集细胞，悬浮(1-2×106个细胞于0.1ml柠檬酸/DMSO溶液中)，用含碘化丙锭(50μg/ml)和RNA酶(10μg/ml)的溶液染色后，在装有Modifit软件程序的FACS Scan流式细胞仪(Becton Dickinson，Menlo Park，CA，USA)中进行流式细胞术分析(Vindelov等，Cytometry，3，332(1983))。
免疫细胞化学和免疫印迹分析为对70kDa、145kDa和200kDa神经丝蛋白和GFRα受体进行实验，将NT2细胞在8孔腔式载玻片中培养，用25μM浓度的22R-羟基胆甾醇处理6天。将细胞用新制备的3.7％甲醛固定15分钟，并用封闭剂(Zymed Laboratories，San Francisco，CA，USA)封闭。用兔抗NF200、抗NF145和抗NF70(均为1∶200)和山羊抗GFRα1、抗GFRα2和抗GFRα3(均为1∶100)进行免疫染色；Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)。所有抗体以200μg/ml使用。在4℃孵育过夜后，用辣根过氧化物酶缀合的抗兔或抗小鼠IgG在室温下检测免疫反应性1小时，用AEC进行显现。
为了进行免疫印迹分析，将NT2细胞在6孔板中培养，用不同浓度22R-羟基胆甾醇处理6天。然后将细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，用加样缓冲液裂解。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将蛋白质在4-20％梯度丙烯酰胺-双丙烯酰胺凝胶上进行分离(125V，2小时)，然后电转移到硝酸纤维素膜上。膜用5％脱脂乳封闭后，通过将其与兔抗NF200、抗NF145和抗NF70(均为1∶4000)(Chemicon International，Temecula，CA，USA)和山羊抗GFRα1、抗GFRα2和抗GFRα3(均为1∶500)(200μg/ml；Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA，USA)孵育过夜，并用山羊抗兔或兔抗山羊IgG-辣根过氧化物酶作为第二抗体(1∶5000)(ZymedLaboratories，San Francisco，CA，USA)，进行免疫印迹分析。用ECL试剂(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)显现蛋白质条带。用OptiQuant图像分析软件(Packard BioScience，Meriden，CT，USA)对免疫反应性蛋白质条带进行图像光密度分析。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPPH)作为内标。
3H-22R-羟基胆甾醇摄取测定为了对22R-羟基胆甾醇摄取进行测定，将NT2细胞(2×105个细胞/孔)在24孔板中，在含1ml 10％胎牛血清的培养基中和在0.1μCi3H-22R-羟基胆甾醇存在下，孵育0天、1天、3和6天，孵育后，将细胞用PBS洗涤，在1ml 0.1N NaOH中裂解。通过液体闪烁光谱测定法测量放射性。用牛血清白蛋白为标准，通过Bradford的染料结合测定法(Bradford，Anal.Biochem.，72，242(1976))定量检测蛋白质水平。
胆甾醇-蛋白质结合印迹测定(CPBBA)将NT2细胞蛋白质(4μg)和3H-22R-羟基胆甾醇(0.1μCi)单独或在20μl体积的浓度递增的未标记22R-羟基胆甾醇存在下，于37℃孵育3小时。孵育后，样品用1.0％琼脂糖(I-B型)凝胶电泳分离，再转移到10x盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液中的硝酸纤维素膜(Schleicher& SchueII，Keene，NH，USA)上。将膜暴露于氚敏屏，用Cyclone StoragePhosphor System(Packard BioScience，Meridien，CT，USA)进行磷光成像分析。用OptiQuant软件(Packard)进行图像光密度分析。该方法使在非变性条件下掺入了放射标记的胆甾醇(Yao等，FASEB，16，677(2002))和22R-羟基胆甾醇(Yao等，J.Neurochem.，83，1110(2002))的22R-羟基胆甾醇-蛋白质复合物得以分离、显现和鉴定。低分子量未掺入的22R-羟基胆甾醇在电泳过程中分离除去。
统计用INSTAT 3.00软件包(GraphPad，San Diego，CA，USA)，通过单向方差分析(ANOVA)和非配对学生氏t检验进行统计分析。
结果相差显微照片显示，用25μM 22R-羟基胆甾醇处理NT2细胞3天、6天和12天，诱导了形态学变化(图1，上小图)。22R-羟基胆甾醇处理6天后显著出现细胞形态学变化(图21c)。流式细胞术分析进一步显示，22R-羟基胆甾醇影响到NT2细胞的增殖(图21，下小图)。这些数据清楚地证实，经过12天处理，G0/G1期细胞的百分数从35.32％增加到50.34％，G2/M期细胞的百分数从34.43％下降到15.90％。
22R-羟基胆甾醇对NT2细胞形态学(分化)的这些作用，通过将细胞在25μM浓度的22R-羟基胆甾醇对映异构体22S-羟基胆甾醇(图22a)、前体(胆甾醇)或代谢物孕酮和DHEA(图22b)存在下孵育6天，并不能重现。有趣的是，发现22R-羟基胆甾醇诱导NT2细胞分化的作用不仅是立体特异性的，而且限于这些NT2细胞，因为用PC12细胞、MDA-MB-231细胞或人神经胶质瘤细胞系U87没有发现这种作用(数据未显示)。
在体内CNS发育中，细胞积极地参与两个相对立的过程增殖和死亡(Ross，Trends Neurosci.，19，62(1996))。已将在NT2细胞中的早期程序性细胞死亡与RA对分化的诱导联系起来，早期程序性细胞死亡主要发生在未分化细胞中，它与初次检测出的神经元表型(NT2N)同时出现(Guillemain等，J.Neurosci.Res.，71，38(2003))。在本研究中，用LDH、MTI甲胞吐和BrdU测定来检测22R-羟基胆甾醇、22S-羟基胆甾醇、孕烯醇酮和孕酮对NT2细胞存活和增殖的作用。LDH(图22c，上小图)和MTT(图22c，中间小图)测定所获得的结果显示，所有这些类甾醇在高浓度(25-50μM)下都具有细胞毒性。在50μM浓度下，所有这四种类甾醇都显著抑制NT2细胞增殖，而在25μM浓度下，细胞增殖只被22R-羟基胆甾醇(p＜0.05)和22S-羟基胆甾醇(p＜0.01)显著抑制(图22c，下小图)。这些数据表明，在22R-羟基胆甾醇诱导的分化过程中也出现未分化NT2细胞的凋亡性细胞死亡。
考虑到神经丝蛋白表达的增加可在进行了3天RA诱导分化的NT2细胞中检测出(Pleasure等，J.Neurosci.Res.，35，585(1993))，通过免疫细胞化学分析(图23，上小图)和免疫印迹分析(图23，下小图)研究了用22R-羟基胆甾醇进行6天处理对NF2细胞中神经丝蛋白NF70、NF145和NF200表达的作用。结果显示，在浓度递增的22R-羟基胆甾醇存在下，细胞中的NF70蛋白表达逐步减少。免疫印迹测定显示，将22R-羟基胆甾醇的浓度从1μM增加到50μM，则NF70蛋白水平从对照水平的83％降低至18％，不过这一变化没有在免疫细胞化学数据中反映出来，因为细胞的NF70蛋白表达水平低。22R-羟基胆甾醇也影响到NF145表达，其在25μM浓度下使表达降低至对照水平的56％，不过除在5μM下有明显增加外，在更低浓度下处理时变化并不显著(图23e)。22R-羟基胆甾醇(5-25μM)处理导致NF200蛋白表达明显增加(p＜0.001)，这一增加在25μM浓度下比在5μM浓度下不太显著——前者为对照值的180％，后者为210％(图23t)。
为探索22R-羟基胆甾醇的作用机制，用免疫细胞化学(图24a，条带c，上小图)和免疫印迹分析(图24a，条带c，下小图)研究其对胶质细胞系衍生神经营养因子受体蛋白表达的作用。结果显示，25μM22R-羟基胆甾醇的存在对GFRα1的表达没有显著作用(图24a)。与此对比，22R-羟基胆甾醇(25μM)强烈影响GFRα2蛋白表达，经6天处理使该表达比对照水平提高45％(图24b，下小图)。用22R-羟基胆甾醇(25μM)处理也影响了NT2细胞中的GFRα3蛋白表达，其表达降低16％(图24c，下小图)。
为确定22R-羟基胆甾醇是否在NT2细胞分化过程中进入细胞，测量了细胞在培养1天、3天和6天后对其的摄取。基于3H-22R-羟基胆甾醇摄取的测定表明，NT2细胞培养1天后就将其摄取(图24d，上小图)。用CPBBA研究了NT2细胞总蛋白质与22R-羟基胆甾醇的直接相互作用。所产生的模式表明，在37℃下孵育3小时后，3H-22R-羟基胆甾醇对蛋白质的放射性标记的强度，在数量递增的蛋白质存在下是增加的，在浓度递增的未标记22R-羟基胆甾醇存在下是降低的(图24d，下小图)。
讨论虽然未分化的NT2细胞是来源于生殖细胞肿瘤的，并不完全代表用以研究神经元分化的可靠模型，但它们确实似乎代表了保持着一些干细胞特性且只能够终末分化成神经元的定向人神经元前体细胞系(Pleasure等，J.Neurosci.Res.，35，585(1993))。因此，***NT2细胞向NT2N细胞的转化为人神经元的研究提供了独特的模型系统(同上；Pleasure等，J.Neurosci.，12，1802(1992))。NT2细胞当暴露于RA时在体外大量分化，这个过程的特征是有几种形态学上不同的细胞类型出现和细胞表面表型发生变化(同上；Andrews，Dev.Biol.，103，285(1984))。
在分化细胞当中，神经元形成由扩展的轴突束网状结构相互连接在一起的聚簇，并表达神经丝蛋白质和其他神经元标记物(同上)。已证实NT2细胞在RA处理后向稳定的神经元表型(NT2N)的这一定向是不可逆的，这由在2个月培养时间内缺乏有丝分裂活性或表型反转可以确定出。在时程方面，已证实NT2细胞的岛(island)在用RA处理三天后显示出神经丝蛋白质表达增加，到10-14天时这些细胞的形态开始与神经元相似。在这个基础上，同时考虑到NT2细胞已被广泛用于研究RA诱导的祖细胞向神经元和星形胶质细胞的分化(Bani-Yaghoub等，Exp.Neurol.，156，16(1999)；Neuroreport，10，3843(1999)；Sandhu等，J.Neurosci.Res.，68，604(2002))，故使用这个模型来研究22R-羟基胆甾醇对细胞增殖和分化的作用。
这些结果证明，用25μM 22R-羟基胆甾醇处理NT2细胞会诱导它们分化成“神经元样”或“星形胶质细胞样”细胞。就细胞形态学而言，图21所提供的相差显微照片清楚显示，用25μM 22R-羟基胆甾醇处理NT2细胞3天、6天和12天诱导了形态学变化，这些变化是在处理6天后明显起来的。流式细胞术分析进一步证实，22R-羟基胆甾醇所诱导的这些形态学变化，与NT2细胞对增殖的作用同时发生。在用类甾醇处理12天后，处于细胞周期的G0/G1期的细胞的百分数增加，处于G2/M期的细胞的百分数下降(图21，下小图)。考虑到以下其他最新结果，这个发现是有意义的，这些其他最新结果表明，如同用22R-羟基胆甾醇处理NT2细胞一样，用六亚甲基双乙酰胺(HMBA；一组诱导各种转化细胞的分化的杂化极性化合物的原型化合物)处理NT2细胞也导致处于G1期和终末分化的细胞的增多(Baldassare等，Oncogene，21，1739(1999))。这一HMBA诱导的NT2细胞生长停滞和分化涉及到细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27表达增加，p27与细胞周期蛋白E/CDK2复合物的缔合增强和与细胞周期蛋白E/CDK2有关的激酶活性被抑制。22R-羟基胆甾醇和HBMA两者的这些作用表明，它们能通过影响参与协调细胞周期调节和神经元分化的分子机制来起作用。
更具体地说，这些结果表明，22R-羟基胆甾醇可充当参与调节细胞分裂的发育控制内源分子信号；也即它可参与决定细胞是否继续增殖或停止生长而进行分化和程序性死亡。下面的事实强调了这一观点22R-羟基胆甾醇诱导NT2细胞分化的作用是立体特异性的，在其前体(胆甾醇)或其代谢物孕酮和DHEA(图2b)没有观察到，用PC12细胞、MDA-MB-231细胞或人神经胶质瘤细胞系U87也没有发现。
在体内CNS发育过程中，细胞积极地参与两个相对立的过程增殖和死亡(Ross，Trends Neurosci.，19，62(1996))。已将在NT2细胞中的早期程序性细胞死亡(凋亡)与RA对分化的诱导联系起来，早期程序性细胞死亡主要发生在未分化细胞中，它与初次检测出的神经元表型(NT2N)同时出现，也即在用膜联蛋白V标记作为凋亡的标志进行RA处理的第三天和第四天可定量检测到显著的凋亡性细胞死亡(Guillemain等，J.Neurosci.Res.，71，38(2003))。在本项研究中，用LDH、MTT甲胞吐和BrdU测定来确定22R-羟基胆甾醇、22S-羟基胆甾醇、孕烯醇酮和孕酮对NT2细胞存活和增殖的作用(参见图22)。LDH和MTT测定所得的结果表明，所有这些类甾醇在高浓度(25-50μM)下都有细胞毒性。在50μM浓度下，所有这四种类甾醇都显著抑制NT2细胞增殖，而在25μM浓度下，细胞增殖只被22R-羟基胆甾醇和22S-羟基胆甾醇显著抑制。因此，在22R-羟基胆甾醇诱导的分化过程中也出现未分化NT2细胞的凋亡性细胞死亡。还要指出的是，如MTT测定所确定出，22R-羟基胆甾醇只在高浓度(＞10μM)下才影响未分化NT2细胞的生存力，对分化的NT2N神经元细胞没有作用。
至于22R-羟基胆甾醇处理对NT2细胞的神经丝蛋白表达的作用，用22R-羟基胆甾醇处理6天导致NF70、NF145和NF200表达发生变化(参见图23)。免疫印迹测定显示，将22R-羟基胆甾醇的浓度从1μM增加到50μM，则NF70蛋白水平从对照水平的83％下降至18％。22R-羟基胆甾醇也影响着NF145表达，在25μM浓度下使该表达降低至对照水平的56％，在5-25μM浓度范围内导致NF200蛋白表达高度显著增加。
由于神经丝是神经轴突和树突中主要的细胞骨架成分，由于它们的表达既是组织特异性的也是受发育调节的，且由于它们通常局限于神经元，这些发现给22R-羟基胆甾醇诱导NT2细胞的神经元分化的作用提供了有说服力的证明。这一观点此外还得到先前的研究的证实，这些研究证明RA诱导的NT2细胞向神经元的分化涉及神经丝蛋白的诱导。例如，Lee等，J.Neurosci.，6，514(1986)中证明，早在暴露于RA两天就可在一些不具神经元形态的NT2细胞中检测到神经丝蛋白NF195、NF170和NF70，神经丝阳性细胞的数量随暴露于RA后的时间推移而增多，且两周后许多表达神经丝的细胞显示神经元形态。同样，在Webb等，J.Neuroimmunol.，11，67(1986)的研究中，在RA处理开始后三周，NT2细胞显示“神经元样”形态并表达NF55和NF210。考虑到在许多神经变性性疾病(包括AD)中神经丝蛋白会在神经元中蓄积，这些发现是有意义的。
为试图阐明22R-羟基胆甾醇诱导的神经元分化背后的机制，用免疫细胞化学和免疫印迹分析研究了22R-羟基胆甾醇对NT2细胞中GFRα受体蛋白表达的作用(图24)。发现用25μM 22R-羟基胆甾醇处理6天使GFRα2蛋白表达比对照水平增加45％，使GFRα3蛋白表达减少约16％。已知GDNF家族成员和GDNF家族配体对于各套中央神经元和外周神经元的发育和维持是至关重要的，所述配体是通过其受体酪氨酸激酶激活胞内信号传导途径来起作用的(Airaksinen等，Nat.Rev.Neurosci.，3，383(2002))。
与这些发现还相关的是，GDNF家族成员(GDNF、neurturin、artemin和persephin)是神经发育的关键调节物，支持着中脑多巴胺能运动神经元和松果体运动神经元的存活(Sanchez等，Nature，382，70(1996)；Widenfalk等，J.Neurosci.，17，8506(1997))。GDNF家族配体能结合其特异性GFRα受体并激活Ret跨膜受体酪氨酸激酶(Airaksinen等，Mol.Cell.Neurosci.，13，313(1999)；Airaksinen(2002))。最近的研究证实，GDNF通过RET介导的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27kipl的上调来诱导NT2细胞的增殖抑制(Baldassarre等，Oncogene，21，1739(2002))，所述抑制剂在NT2细胞存活和分化中起到关键作用(Baldassarre等，Oncogene，18，6241(1999))。
总之，这些结果表明用22R-羟基胆甾醇进行处理会诱导GRFα2和GRFα3的表达发生变化的发现，可理解为表明NT2细胞暴露于22R-羟基胆甾醇不仅会影响到参与神经元发育的调节的机制，而且会影响到参与“星形胶质细胞样”细胞或许还有“少突胶质细胞样”细胞的形成的机制。关于这一点，Bani-Yaghoub等，Neuroreport，10，3843(1999)报告说，NT2细胞能分化成星形胶质细胞，并得出结论说，NT2细胞和胚胎干细胞一样能产生神经元谱系和星形胶质细胞谱系。同样，Sandhu等，J.Neurosci.Res.，68，604(2002)发现，由流式细胞术、对Ki67的免疫染色和BrdU的掺入所检测出，NT2细胞用RA处理4周能分化成功能性星形胶质细胞，在分化的同时伴随发生细胞增殖减少和细胞周期停滞。
实施例IV还表明，3H-22R-羟基胆甾醇在与NT2细胞培养一天后被细胞吸收，在37℃下孵育3小时后，3H-22R-羟基胆甾醇对蛋白质的放射标记的强度，在浓度递增的蛋白质存在下出现增加，在浓度递增的未标记22R-羟基胆甾醇存在下出现减少(图24)。这些结果表明，22R-羟基胆甾醇和细胞蛋白质之间的生理化学相互作用有助于其诱导NT2细胞分化的作用。
考虑到以前的结果，则本文给出的结果更显出其重要意义，所述以前的结果证实神经类甾醇(如孕烯醇酮和DHEA)通过保持和/或增强认知功能(Valee等，PNAS USA，94，14865(1997))和通过改善年老动物的记忆力(Roberts，The Biological Role of Dehydroepiandro-sterone，Kalima等(编著)，de Gruyter(1990)，第13-42页)在大脑内发挥生理作用。孕烯醇酮和DHEA通过外周内分泌器官发生不依赖于它们的供应的蓄积(Baulieu等，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.，37，395(1990)，似乎起着神经调质的作用(Paul等，FASEB J.，6，2311(1992))。神经胶质细胞能将胆甾醇转化成孕烯醇酮。
体外研究证实，少突胶质细胞(一种神经胶质瘤细胞系)和施旺细胞可表达参与胆甾醇向孕烯醇酮的转化的细胞色素P450胆甾醇侧链切割酶(Jung-Testas等，Endocrinol.，125，2083(1989)；Papadopoulos等，PNAS USA，89，5113(1992)；Akwa等，C.R.Acad.Sci.III(France)，316，410(1993))。22R-羟基胆甾醇是这一酶促切割反应过程中所形成的三种羟基化中间体之一，这一点也得到很好的描述(Dixon等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，49，161(1970)；Hall，Anal.N.Y.Acad.Sci.，458，203(1985))。还值得注意的是，发现AD患者大脑样本中的22R-羟基胆甾醇水平比同年龄对照组患者要低。22R-羟基胆甾醇水平在海马中显著降低，海马是大脑的边缘系统中的一个结构，对保持认知功能如学习和记忆至关重要，它在AD中受到影响(Yao等，J.Neurochem.，83，1110(2002))。虽然即使有本文给出的结果，22R-羟基胆甾醇诱导的NT2细胞向NT2N表型的分化背后的确切机制仍不清楚，但实施例4表明，22R-羟基胆甾醇是通过结合到或相互作用于一些未知蛋白质来激活这些蛋白质，增加GFRα2蛋白表达和激活GFRα-Ret途径，从而抑制细胞增殖和诱导分化的。
实施例V用螺甾烯醇诱导神经元分化A.材料与方法1.材料(20α)-25ξ-甲基-(22R，26)-氮杂环呋甾-5-烯-3ξ-醇(SP-224)购自Interbioscreen公司(Moscow，Russia)。细胞培养用品购自GIBCO公司(Grand Island，NY)，细胞培养塑料器具得自Corning公司(Corning，NY)。小鼠胚胎畸胎瘤P19细胞、PC12大鼠嗜铬细胞瘤细胞和NT2人成神经细胞瘤细胞购自ATCC(Manassas，VA)。为进行体内研究，从Charles-River购得体重300-325g雄性Long-Evans大鼠，关养在乔治敦大学(Georgetown University)的比较医学系(Department ofComparative Medicine)。能连续14天每小时递送5.0μl的微型渗透泵(2ML2)购自DURECT Corp.(Cupertino，CA)。
兔抗GAP43抗体、豚鼠抗双皮层蛋白(DCX)抗体、小鼠抗βIII微管蛋白抗体和兔抗胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗体购自Chemicon公司(Chemicon International，Temecula，CA)，小鼠抗CNPase抗体、兔抗GFAP抗体和小鼠抗MAP2抗体购自Abcam公司(Cambridge，MA)，兔抗突触小泡蛋白抗体购自Zymed Laboratories(San Francisco，CA)，小鼠抗溴脱氧尿苷(BrdU)抗体购自Neomarkers公司(Lab Vision Corp.，Fremont，CA)。
德克萨斯红缀合抗体、罗丹明缀合抗体、罗丹明(TRITC)缀合抗体和FITC缀合抗体购自Jackson Immunoresearch Laboratories(WestGrove，PA)。DAPI和溴化乙锭核复染染料得自Molecular Probes公司(Eugene，OR)。
2.细胞培养和处理将小鼠胚胎畸胎瘤P19细胞在直径13mm玻璃盖玻片上的α极限必需培养基中，于37℃、95％CO2下进行培养，所述培养基中含有核糖核苷、脱氧核糖核苷、小牛血清(7.5％)和胎牛血清(2.5％)。将PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤神经元)在直径13mm玻璃盖玻片上的RPMI1640培养基中，于37℃和5％CO2下进行培养，所述培养基中不含谷氨酰胺但补充了10％胎牛血清和5％马血清。当细胞达到70％铺满时，将培养基更换为含有90μM SP-224的新鲜培养基。接着将P19细胞和P12细胞孵育2天后，洗出SP224并更换为标准培养基。在将细胞固定进行免疫细胞化学分析之前，连续5天每2天或连续30天每2天更换培养基。将NT2细胞进行5天处理和10天洗出。
3.体内研究按自然的日-夜循环关养体重300-325g的雄性Long-Evans大鼠(3-4月龄)，随意进食饮水。大鼠进行外科手术前先用麻醉药equithesin(3ml/kg，腹膜内注射)麻醉，然后放在立体定位仪上。用电极显微操作器，将微型渗透泵的出口按坐标D＝3.4mm、L＝1.4mm和AP＝0.92mm尾部至前囟置入左脑室。将渗透泵的罐体埋植在大鼠背部中肩胛区的皮下。大鼠外科手术后放在加热毯上进行康复。在整个手术过程中，监控体温并稳定保持在37℃。将在聚丙二醇/甘油/蒸馏水(50/25/25)中增溶的375μM SP-224通过脑室内注射(i.c.v.)途径以5μl/小时灌注2周。在大脑灌注结束后3周，通过心脏内灌注将大鼠处死，先是用洗涤溶液(NaCl 8g/L、葡萄糖4g/L、蔗糖8g/L、氯化钙0.23g/L、无水二甲胂酸钠0.25g/L，溶于去离子水中)灌注，然后是用固定二甲胂酸盐缓冲液(蔗糖40g/L、低聚甲醛40g/L、无水二甲胂酸钠10.72g/L，溶于去离子水中)灌注。将大脑在固定二甲胂酸盐缓冲液中再保存一周，然后石蜡包埋。为了研究神经干细胞增殖，大鼠每日注射100mg/kg BrdU溶液。第一次注射在手术后一天进行，最后一次注射在安乐死前一天进行。
4.免疫细胞化学和免疫组织化学将P19细胞用甲醇在-20℃下固定15分钟，然后用含0.1％Triton100X的1X PBS pH＝7.4在室温下透化处理30分钟。将细胞与抗GAP43(1/1000)、DCX(1/3000)、βIII微管蛋白(1/500)、突触小泡蛋白(1/200)、MAP2(1/500)、ChAT(1/2000)、GFAP(1/1000)或CNPase(1/250)的抗体在4℃下孵育24小时。阳性免疫染色由在室温下孵育2小时的德克萨斯红缀合抗体、罗丹明缀合抗体、罗丹明(TRITC)缀合抗体或FITC缀合抗体(1/200)显示。细胞核用DAPI或溴化乙锭复染。
大脑切除后立即石蜡块包埋，切成20μm厚的切片。用不同的第一抗体处理这些大脑切片；将抗BrdU(1/100)和抗DCX(1/3000)在4℃下孵育24小时，用FITC缀合的或罗丹明缀合的第二抗体(1/200)显示信号。
B.结果1.在人未分化神经元NT2细胞中、小鼠胚胎畸胎瘤P19细胞中和小鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中诱导神经突样出芽使用了上文提及的细胞系，因为它们已被广泛用作神经元分化的模型(Houldsworth等，2002；Chou等，2003；Das等，2004)。为诱导出芽。将细胞接种在6孔板中，用90μM SP-224处理2天(P19)或5天(PC12和NT2)，然后用新鲜培养基洗涤，再培养多5天(P19)或10天(PC12和NT2)。在我们的实验条件下，这三种细胞类型都显示明显的出芽现象(图25B、D、F)，其中P19细胞观察到最为壮观的效果(图25D)。有趣的是，出芽是在洗出期间开始的，而在处理期间没有观察到细胞形状改变。同时，我们观察到经过处理的细胞出现生长停滞。对照细胞用无SP-224培养基处理2天，然后在与SP-224处理细胞相同的条件下进行洗出。对照细胞即使在达到铺满后还保持生长，不显示任何种类的出芽现象(图25A、图25C、图25E)。
2.分化P19细胞中神经元标记和非神经元标记的鉴定如下评价SP-224诱导P19细胞神经元分化的能力。将P19细胞进行2天处理，然后是5天的洗出期间(图26)。在28天后还对神经元标记表达进行研究(图27)，以核实在第5天所观察到的该表达是暂时的还是持久的。在对照上没有观察到神经元标记，例外的是突触小泡蛋白，但其染色非常弱(图26C)。SP-224暴露诱导了所研究的不同神经元标记——βIII微管蛋白(图26A)、突触小泡蛋白(图26B)、MAP2(图26C)和ChAT(图26D)的强烈表达。游走成神经细胞标记DCX在暴露于SP-224的P19细胞中也得到强烈表达(图26E)。图26A甚至显示了轴突样结构上的βIII微管蛋白免疫染色，其长度明显超过100μm标尺。在进行了28天洗出后，神经元分化更为重要。如βIII微管蛋白染色(图27A)所示，轴突和树突的网状结构发生了极大的扩充。突触小泡蛋白标记的重要性(图27B)证实，新形成的神经元建立了突触联系。
研究了神经胶质标记GFAP和CNPase(它们反映SP-224使P19细胞分化成星形胶质细胞和少突神经胶质细胞的能力)的表达，以评价分化过程的最终特异性。使用这个方案——用90μM SP-224培养2天，然后在无SP-224培养基中培养5天，发现SP-224也诱导P19分化成少突神经胶质细胞(图28B)，然而没有检测出阳性GFAP信号(图28D)。GFAP和CNPase这两个标记在作为对照的P19细胞中没有表达。
3.神经干细胞增殖的体内表征和早期神经元标记DCX的鉴定进行本实验是为了验证在体外所获得的结果，评价SP-224诱导大鼠大脑室下带(SVZ)中存在的神经干细胞的神经元分化的能力。SP-224以375μM溶液通过脑室内途径给予2周，相当于每只大鼠SP-224总量为530nM。为模拟体外方案的洗出期间，大鼠在切除大脑前再饲养多3周。免疫组织化学检测揭示了重要的BrdU，证实SP-224能够诱导SVZ中的神经干细胞的自我更新(图29C-G)。此外，在离SVZ的较远处(白色箭头)检测到一些BrdU阳性细胞，提示某些细胞可能已进入了迁移过程。SP-224输注还诱导了早期神经元标记DCX在SVZ细胞中的表达，证实如同在体外情况一样，SP-224能够促使存在于该区域的神经干细胞发生神经元分化(图29D-H)。
C.讨论神经干细胞疗法据认为能用来置换受损的神经元，以治疗几种神经变性性疾病和病症，如帕金森病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、创伤性脑损伤、中风和外周神经损伤(T.L.Limke等，Stem CellRes.，12，615(2003)；D.J.Watson等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，62，368(2003)；S.Chiba等，J.Neurol.Sci.，219，107(2004)；V.Silani等，Lancet，364，200(2004)；Y.Tai等，Curr.Opin.Pharmacol.，4，98(2004)；M.Tohill等，Biotechol.Appl.Biochem.，40，17(2004))。最有希望的两个策略是体外分化的干细胞的移植及内源干细胞的增殖和分化的诱导(O.Lindvall等，Nature Medicine，10，，S42(2004))。但是，可利用的神经前体细胞的数量少，可能会限制成体大脑的修复能力，因此移植和原位分化这两种策略的联合应用，看来是最有可能成功的治疗方法。许多小分子如视黄酸或环巴胺已被用作体外诱导NSC的神经元分化的工具，但它们由于毒性原因在体内使用非常困难。地塞米松、氟西汀或格尔德霉素具有潜在危险的副作用(S.Ding等，Nature Biotech.，22，833(2004))。根据本发明，获得了天然产生的呋甾烯醇(20α)-25ξ-甲基-(22R，26)-氮杂环呋甾-5-烯-3ξ-醇(SP-224)，并用来在体外和体内诱导大鼠大脑的神经发生。
SP-224处理P19、NT2和PC12细胞2-5天后接着进行5-10天的洗出，诱导细胞出现神经突样结构形成，这显示了这些干细胞可能的分化的第一个证据。有趣的是，SP-224只有在处理方案中包括有洗出期才发挥作用。的确，当2天后没有除去“治疗压力”时，我们没有观察到任何神经突过程，这提示了一种“打了就跑”的作用机制。在分化的P19中这一结构改变伴随着特异性神经元标记βIII-微管蛋白和MAP2的出现。βIII-微管蛋白免疫染色显现结果表明，在进行5天洗出后所形成的轴突，其达到的长度大约有500μM。
重要的是，SP-224还诱导突触小泡蛋白的表达，证实新形成的神经元能够建立突触。对于新形成的神经元向预先存在的网状结构的整合来说不可缺少的突触形成，如在一个月的生长后所示，在5天洗出期结束后仍保持发展，这提示SP-224的作用并不是短暂的。此外，分化的P19细胞显示出胆碱能表型，因为它们显示了强烈的ChAT信号。SP-224能够促使P19细胞发生胆碱能表型的事实是很有意义，因为这一事实把这种化合物提为用以在将人神经干细胞重新移植到AD患者海马中之前对该神经干细胞进行预处理的理想物质。
神经元分化为双皮层蛋白的表达所证实，双皮层蛋白这种标记已被证明在游走的未成熟神经元中特异性表达(F.Francis等，J.Neuron.，23，247(1999))。这些结果提示，SP-224不仅能够诱导神经干细胞的体外神经元分化和促进突触及沟通网络的形成，而且还能触发分化的神经元向发挥其正常功能的区域迁移。SP-224没有触发P19细胞向星形胶质细胞的分化，且少突神经胶质细胞特异性标记CNPase的表达极低，提示神经元分化途径受到SP-224的体外特异性激活。
哺乳动物成体大脑的两个主要胚区是室下带(SVZ)和海马齿状回(B.J.Chiasson等，J.Neurosci.，19，4462(1999)；Alvarez-Buylla等，BrainRes.Bull.，57，571(2002))。在大鼠大脑的左脑室中连续灌注SP-224两周，引发SVZ的细胞极大地增加BrdU。这些数据证实，SP-224能够诱导SVZ中存在的NSC的增殖。此外，BrdU免疫染色与神经元分化的早期标记DCX共定位，因此在体内证实了在体外所观察到的SP-224分化特性。还检测出BrdU染色接近于SVZ，但在纹状体当中，这提示存在一些游走细胞。应指出的是，所显示的SP-224的作用对大脑组织没有任何明显的毒性作用。
总之，SP-224似乎是有希望用于干细胞疗法的小分子。式(I)、式(II)或式(III)的其他化合物据认为也会显示类似的生物活性，因为这些化合物被选择来模拟22R-羟基胆甾醇的蛋白质结合亲和性。
已描述了本发明的多个实施方案。然而要认识到，在不偏离本发明精神和范围的前提下，可以作出各种修改。因此，其它实施方案落入所附权利要求书的范围内；由于在不偏离本发明范围的前提下，可以对上述组合物、制剂、联合疗法和方法作出各种变化，故我们的意思是，以上说明书中所包括的所有公开内容都应当视为说明性的，而不是限制性的。本文列举的所有专利文献和参考文献都通过引用结合到本文中。
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Greeson，JanetPapadopoulos，Vassilios<120>神经保护性螺甾烯醇药用组合物<130>1941.023WO1<150>US10/389,189<151>2003-03-14<150>US10/663,619<151>2003-09-16<150>US60/364,140<151>2002-03-15<150>US60/319,846<151>2003-01-09<150>US60/618,696<151>2004-10-14<150>US11/031,538<151>2005-01-07<160>1<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1
<211>42<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40
权利要求
1.一种诱导哺乳动物神经元前体细胞分化成神经元细胞的方法，所述方法包括使所述神经元前体细胞与有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐接触 其中每个R1、R2、R4、R7、R11、R12、R15和R16独立地为氢、(C1-C8)烷基、羟基、氨基、羧基、氧代基、磺酸或任选嵌入以下基团的(C1-C8)烷基-NH-、-N((C1-C8)烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR′-或-NR′-C(O)-，其中R′为H或(C1-C8)烷基；R3为羟基、(C1-C6)烷基CO2-、HO2C(CH2)2CO2-、甲苯-4-磺酰氧基或苯甲酰氧基；每个R6、R8、R9、R10、R13和R14独立地为氢、(C1-C8)烷基、羟基(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基或羟基；R17为-CH(CH3)CH(OH)(CH2)2CH(CH3)2或-CH(CH3)CH(OC(＝O)CH3)(CH2)2CH(CH3)CH2N(C(＝O)CH3)2。
2.权利要求1的方法，其中R1、R2、R4、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14和R15为H。
3.权利要求2的方法，其中R16为H或乙酰氧基。
4.权利要求1的方法，其中所述化合物选自22R-羟基胆甾醇或醋酸26-二乙酰氨基-(22ξ)-乙酰氧基-(16ξ)-乙酰氧基-胆甾-5-烯-基酯。
5.一种诱导哺乳动物神经元前体细胞分化成神经元细胞的方法，所述方法包括将所述神经元前体细胞用有效量的式(II)化合物或其药学上可接受的盐进行处理 其中每个R1、R2、R4、R7、R11、R12和R15独立地为氢、(C1-C4)烷基、羟基、氨基、羧基、氧代基、磺酸或任选嵌入以下基团的(C1-C6)烷基-NH-、-N((C1-C4)烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR′-或-NR′-C(O)-，其中R′为H或(C1-C8)烷基；R3为羟基、(C1-C6)烷基CO2-、HO2C(CH2)2CO2-、甲苯-4-磺酰氧基或苯甲酰氧基；每个R6、R8、R9、R10、R13和R14独立地为氢、(C1-C4)烷基、羟基(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基或羟基；R19为OH或(C1-C2)烷氧基；R20为被甲基酰胺甲基在3位取代的丁基。
6.权利要求5的方法，其中R1、R2、R3、R4、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14和R15为H。
7.权利要求5的方法，其中R10和R13为CH3。
8.权利要求7的方法，其中R19为甲氧基。
9.权利要求5的方法，其中R3为乙酰氧基或OH。
10.权利要求5的方法，其中所述化合物选自醋酸(20ξ)-26-乙酰氨基-(22ξ)-羟基呋甾-5-烯-3ξ-基酯、醋酸(20ξ)-26-乙酰氨基-(22ξ)-甲氧基呋甾-5-烯-3α-基酯和醋酸(20ξ)-26-乙酰氨基-(22ξ)-乙氧基呋甾-5-烯-3ξ-基酯。
11.一种诱导哺乳动物神经元前体细胞分化成神经元细胞的方法，所述方法包括使所述神经元细胞与有效量的式(III)化合物或其药学上可接受的盐接触 其中每个R1、R2、R4、R7、R11、R12和R15独立地为氢、(C1-C8)烷基、羟基、氨基、羧基、氧代基、磺酸或任选嵌入以下基团的(C1-C8)烷基-NH-、-N((C1-C8)烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR′-或-NR′-C(O)-，其中R′为H或(C1-C8)烷基；R3为羟基、(C1-C6)烷基CO2-、HO2C(CH2)2CO2-、甲苯-4-磺酰氧基或苯甲酰氧基；每个R6、R8、R9、R10、R13和R14独立地为氢、(C1-C8)烷基、羟基(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基或羟基；X为O、N(H)、N(Ac)、N(甲苯-4-磺酰氧基)。
12.权利要求11的方法，其中R3为OH或(C1-C6)CO2-。
13.权利要求11或12的方法，其中X为O。
14.权利要求11或12的方法，其中X为NH。
1 5.权利要求12的方法，其中R10和R13为CH3。
16.权利要求11的方法，其中R1、R2或R12为OH。
17.权利要求12、13或15的方法，其中R1、R2、R4、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14和R15为H。
18.权利要求17的方法，其中所述化合物选自(20α)-25ξ-甲基-(22R，26)-氮杂环呋甾-5-烯-3ξ-醇、(20ξ)-25ξ-甲基-N-乙酰基-(22R，26)-氮杂环呋甾-5-烯-3ξ-醇、(22R，25ξ)-(20α)-螺甾-5-烯-(2α，3ξ)-二醇、对甲苯磺酸(20α)-25ξ-甲基-N-对甲苯磺酰基-(22R，26)-氮杂环呋甾-5-烯-3ξ-基酯、(22R，25ξ)-(20α)-(14α，20α)-螺甾-5-烯-(3β，12β)-二醇、(22R，25S)-(20ξ)-螺甾-5-烯-3ξ-醇、苯甲酸(22R，25ξ)-(20α)-螺甾-5-烯-3β-基酯、己酸(22S，25S)-(20S)-螺甾-5-烯-3β-基酯、(22R，25ξ)-(20α)-螺甾-5-烯-(1ξ，3ξ)-二醇、(22R，25S)-(20α)-螺甾-5-烯-3β-醇、琥珀酸(22R，25S)-(20α)-螺甾-5-烯-3β-基酯和丙酸(20α)-25S-甲基-N-乙酰基-(22S，26)-氮杂环呋甾-5-烯-3β-基酯。
19.权利要求18的方法，其中所述化合物为己酸(22S，25S)-(20S)-螺甾-5-烯-3β-基酯。
20.权利要求1、5或11的方法，其中所述哺乳动物神经元前体细胞为人细胞。
21.权利要求1、5或11的方法，其中所述哺乳动物神经元前体细胞为NT2细胞。
22.权利要求20的方法，其中所述神经元细胞显示NT2N表型。
23.权利要求22的方法，其中所述神经元细胞为神经元。
24.权利要求1、5或11的方法，其中所述接触在体外进行。
25.权利要求1、5或11的方法，其中所述接触在体内进行。
26.权利要求25的方法，其中所述接触通过序贯或同时给予所述前体细胞和所述化合物来实施。
27.权利要求1、5或11的方法，其中所述量能有效增加GFRα2蛋白表达。
28.权利要求1、5或11的方法，其中所述神经元前体细胞为干细胞。
29.权利要求27的方法，其中所述干细胞为神经元干细胞。
30.权利要求27的方法，其中所述干细胞为胚胎干细胞。
31.权利要求27的方法，其中所述干细胞为多潜能成体祖细胞(MAPC)。
32.权利要求27的方法，其中所述干细胞为骨髓基质细胞。
33.一种组合物，所述组合物包含治疗有效量的神经元前体细胞以及分化诱导量的式I、式II或式III化合物。
34.权利要求33的组合物，其中所述神经元前体细胞为干细胞。
全文摘要
本发明涉及治疗、预防或减少患者发生与神经变性性障碍如神经毒性或神经病理有关，特别是与β－淀粉样蛋白诱发的神经毒性和早老性痴呆有关的障碍或疾病或者相关症状的危险的方法、药盒、联合疗法和组合物。本发明还提供通过给予所述患者治疗有效量的本发明化合物来诱导干细胞分化成神经元细胞的方法。
文档编号A61K31/56GK101076250SQ200580042630
公开日2007年11月21日 申请日期2005年10月14日 优先权日2004年10月14日
发明者姚知行, 劳伦特·莱卡奴, G·特佩尔, J·格里森, V·帕帕多普洛斯 申请人:乔治敦大学, 萨马里坦药品公司