组织工程化周围神经移植物的制作方法

专利名称：组织工程化周围神经移植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种外科移植物，特别是用于修复周围神经缺损的神经移植物。
背景技术：
周围神经损伤及损伤后导致的神经缺损，是临床常见的致残性疾病。对于因各种意外事故引起的周围神经损伤的修复，一直是神经外科治疗的一个难题。我国每年新增的病例近100万例，其中，需要通过植入神经移植物来修复损伤神经的约45万例。目前，神经移植物的来源非常匮乏，急需研究和开发神经替代物。
国内外对神经移植物的研制一直停留在仿神经结构的导管上，目前所开发的人工产品均为将神经的两个断端连接起来的管状医用材料，即所谓的“人造神经管”或“人造神经移植物”。在中国专利“医用人造神经移植物及其制备方法”(专利号01108208.9)中揭示了一种由壳聚糖材料制成的生物导管，生物导管嵌有纤维支架，纤维支架材料为聚乙醇酸或聚乳酸；在中国专利申请“人工神经管”(申请号00810000.4)、“人造神经管”(申请号99807035.1)、“人工神经管”(申请号97199928.7)中都揭示了由生物体内分解吸收材料形成的管，其内腔中具有微细纤维化胶原体，其空隙中填充有昆布氨酸。
上述现有产品都是用可降解的生物材料制成的导管，能在植入体内后“桥接”缺损的神经，但是，上述产品仅仅是为再生神经轴突的生长提供了一条“桥梁”或“通道”，本身没有生物活性，不能提供神经生长所必要的内环境，也没有促进神经再生的作用。
现代医学已经证实，许旺细胞在人体神经生长过程中有极为重要的作用，它们附着并包围轴突形成髓鞘，促进轴突的延伸和成熟。因为上述现有产品没有提供神经再生所必需的许旺细胞或具有类似功能的活性细胞，在近断端长出新生轴突时，只能依赖机体本身的许旺细胞连带一齐长过来，这个过程就不仅很缓慢，而且机体本身的许旺细胞的迁移有一定限度，如果许旺细胞进不去，或者进得很少，神经的生长就大受影响，如果应用于临床，仅能修复短距离的神经缺损，一般不超过15毫米，临床上对如此短距离的神经缺损往往可以直接缝合，而不需要借助这些神经移植物。对更长距离的神经缺损，即使“桥接”上述导管，再生的神经轴突也不能到达远断端，不能恢复损伤神经的功能，因而修复效果十分不理想。
近年来，组织工程学的出现为组织损伤的修复带来了新希望。组织工程学是一门运用工程学与生命科学的原理和方法，研究正常及病变的哺乳动物组织形态和功能的相互关系，开发修复损伤组织形态和功能的生物替代物的科学，是生物技术领域的重要内容。具体来说是利用仿生学的原理，制备具有特定的三维结构和生物活性的复合体，营造出有正常生理功能的组织，可用于替代人体缺损组织的形态与功能。组织工程学的出现标志着医学将从现有的自体或异体组织和器官移植的模式，进入用人工制造的组织和器官移植修复缺损和重建功能的新阶段。
上述现有产品没有生物活性，都不是真正意义上的组织工程化周围神经移植物，这是导致现有产品在神经修复中效果不理想的根本原因。

发明内容
本发明的目的在于提供一种组织工程化周围神经移植物，用于修复周围神经损伤后出现的神经缺损。
本发明所述的组织工程化周围神经移植物，包括用于连接神经两断端的支架和具有促进神经再生功能的种子细胞，种子细胞附着于支架上，形成具有仿神经三维结构和生物活性的复合体。
所述的支架为去细胞异体神经，优选是采用化学萃取法制备的去细胞异体神经。
为进一步增强支架对种子细胞的粘附性，并促进神经再生和移植物的血管化过程，所述的去细胞异体神经中可加入能促进细胞粘附、神经再生和移植物血管化的物质。
上述的能促进细胞粘附、神经再生和移植物血管化的物质可以为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，包括胶原、氨基聚糖、糖蛋白三大类；也可以是各种生长因子。
所述的种子细胞是成体干细胞经体外诱导而成的类许旺细胞。成体干细胞优选为骨髓间质干细胞，或者脂肪干细胞。
周围神经由神经细胞、许旺细胞、结缔组织、血管、淋巴管以及特殊支持细胞组成。神经细胞(神经元)又是由胞体部分和突起的胞突构成，胞突的末端反复分支后与神经元接触，轴突是其中的一个最长和最重要的胞突，可伸延至效应器。许旺细胞包绕轴突形成神经纤维。上万条纤维集中在一起形成神经束，一个或数个神经束由结缔组织联系在一起，就组成了周围神经。当周围神经断裂并出现缺损后，需要用移植物来“桥接”缺损的神经段，新生的神经轴突从近断端长入移植物，在许旺细胞的引导下向远断端生长。现代医学已经证实，许旺细胞在人体神经生长过程中具有极其重要的作用，它们附着并包围轴突形成髓鞘，促进轴突的延伸和成熟。发明人已成功地将成体干细胞在体外培养中通过药物诱导为具有许旺细胞形态和功能特征的细胞，命名为“类许旺细胞”，这些细胞应是人类周围神经损伤修复所设计的组织工程化神经所采用的种子细胞中最为合适的细胞之一，其在体内的增殖为神经轴突的再生铺平了道路。
现有的所谓“人造神经管”或“人造神经移植物”仅仅是为再生神经轴突的生长提供的“桥梁”或“通道”，而本发明所述的组织工程化周围神经移植物具有突破性的优点，即采用了在连接神经断端的支架上“种植”具有生物学活性的种子细胞，该种子细胞是由成体干细胞经体外诱导而成的具有许旺细胞(Schwann’s cells)形态和功能特征的“类许旺细胞”，细胞有贴附生长的特性，类许旺细胞可在支架表面粘附、迁移、增殖，形成具有特殊三维结构和活性细胞的人造神经组织。支架和种子细胞都是本发明所述的周围神经移植物必不可少的组成部分，由此构成了真正意义上的组织工程化周围神经移植物。
现有的利用生物降解材料制备的“人造神经管”或“人造神经移植物”，仍存在许多有待改进之处。这类由生物降解材料制备的支架毕竟是人工仿制品，与天然神经纤维的结构相比，其三维结构过于简单，而要加工成具有复杂结构的支架的技术成本很高。因此，本发明采用去细胞异体神经作为支架，能进一步克服现有生物降解材料导管的缺陷。
本发明的特点是将异体神经作去细胞处理而利用其天然的神经基底膜管结构作为支架。发明人已成功用化学药物破坏并洗脱人类周围神经中的细胞，得到“去细胞异体神经支架”。经处理后的支架只清除神经组织中的各种细胞而保留神经基底膜管及管之间的基质，神经的纤维骨架仍然完好。
本发明在应用时，将所述的组织工程化周围神经移植物植入人体的神经缺损部位，从神经断端长出的新生轴突开始长进支架内并在支架内延伸和成熟。在这个过程中，附着于支架上的种子细胞则按再生轴突的生长方向不断增殖、迁移，形成“类许旺细胞”的细胞带，等候着新生轴突的到来，在新生神经轴突生长的过程中，种子细胞相当于“迎接”新生轴突的“引路人”，提供了必要的营养作用和诱导作用。新生的周围神经轴突就有一个接一个的类许旺细胞去“迎接”它，并包围轴突，形成髓鞘，并使之达到功能上的成熟。同时，作为支架的去细胞异体神经逐渐被机体吸收，并最终被新生的神经纤维所取代。
因为周围神经生长一定需要许旺细胞的“保驾护航”。现有的神经移植物产品仅提供支架而不提供许旺细胞或具有类似功能的活性细胞，在近断端长出新生轴突时，只能依赖机体本身的许旺细胞连带一齐长过来，这个过程就不仅很缓慢，而且机体本身的许旺细胞的迁移有一定限度，如果许旺细胞进不去，或者进得很少，神经的生长就大受影响，如果应用于临床，仅能修复短距离的神经缺损，一般不超过15毫米，临床上对如此短距离的神经缺损往往可以直接缝合，而不需要借助这些神经移植物。对更长距离如3厘米以上的神经缺损，即使“桥接”上述导管，再生的神经轴突也不能到达远断端，难以恢复损伤神经的功能，因而修复效果十分不理想。而本发明采用种子细胞与支架相结合的结构，不仅为再生的神经纤维通过神经缺损区提供了仿生化的通道，而且其内在的种子细胞对神经再生有促进作用，因此可用于修复更长距离的神经缺损，神经修复效果显著提高，临床应用范围更广。


图1为本发明的结构示意图。
图2为图1的A-A剖面局部放大示意图。
图3为本发明的应用示意图。
具体实施例方式
本发明所述的组织工程化周围神经移植物，如图1和图2所示，包括用于连接神经两断端的支架1和具有促进神经再生功能的种子细胞2，种子细胞2附着于支架1上，形成具有仿神经三维结构和生物活性的复合体。支架1为去细胞异体神经。如图2所示，去细胞异体神经由许多神经基底膜管11组成，神经基底膜管11内的细胞已去除，剩下空腔，种子细胞2主要附着于神经基底膜管11的内壁上，也可附着于神经基底膜管11外。如图3所示，当修复神经缺损时，将本发明所述的组织工程化周围神经移植物植入近断端3与远断端4之间。
在实际产品中，去细胞异体神经所含有的神经基底膜管极小，图1至图3均为微观示意图，其比例不代表实际产品的比例。
所述的种子细胞是由成体干细胞经体外诱导而成的类许旺细胞。成体干细胞包括有多种干细胞，如骨髓间质干细胞、脂肪干细胞等，以下实施例以经体外诱导的骨髓间质干细胞和脂肪干细胞分别作为种子细胞加以说明实施例一从捐献者的肢体上切取完整的神经，用化学药物(如三硝基甲苯和脱氧胆酸钠等)破坏神经组织中的细胞并将其细胞成分萃取出来，得到去细胞异体神经，灭菌后作为支架1。在患者体内(如髂骨、胫骨)抽取骨髓，分离出骨髓间质干细胞，在体外进行细胞培养，加入诱导剂(如全反式视黄酸、巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子等)使其分化为类许旺细胞，然后将上述细胞作为种子细胞2注射到灭菌后的去细胞异体神经支架1上，即得到了本发明所述的由骨髓间质干细胞经体外诱导而成的类许旺细胞与去细胞异体神经构造的组织工程化周围神经移植物。临床使用时，将本发明所述的组织工程化周围神经移植物植入到要修复的周围神经缺损处。如图3所示，周围神经断裂后，新生轴突从神经的近断端3长出来，类许旺细胞靠近和包围轴突，向轴突提供营养，并引导轴突向神经的远端生长，同神经纤维的远断端4相连接。在这个过程中，类许旺细胞发挥许旺细胞的功能，而作为支架的去细胞异体神经则被机体吸收，最终被再生的神经纤维取代。
为进一步增强支架对种子细胞的粘附性，并促进神经再生和移植物的血管化过程，本实施例中，去细胞异体神经可加入能促进细胞粘附、神经再生和移植物血管化的物质。该物质可以为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，包括胶原、氨基聚糖、糖蛋白三大类；也可以是各种生长因子。
在本实施例中，当患者的指神经缺损2厘米时，可取相应长度的异体指神经进行去细胞处理作为支架；当患者的正中神经缺损4厘米时，可取相应长度的异体正中神经进行去细胞处理作为支架；当患者的坐骨神经缺损6厘米时，可取相应长度的异体坐骨神经进行去细胞处理作为支架。
实施例二从捐献者的肢体上切取完整的神经，用化学药物(如三硝基甲苯和脱氧胆酸钠等)破坏神经组织中的细胞并将其细胞成分萃取出来，得到去细胞异体神经，灭菌后作为支架1。在患者体内脂肪较丰富处(如腹壁)抽取脂肪组织，分离出脂肪干细胞，在体外进行细胞培养，加入诱导剂(如碱性成纤维细胞生长因子、神经生长因子等)使其分化为类许旺细胞，然后将上述细胞作为种子细胞2注射到灭菌后的去细胞异体神经支架1上，即得到了本发明所述的由脂肪干细胞经体外诱导而成的类许旺细胞与去细胞异体神经构造的组织工程化周围神经移植物。临床使用时，将本发明所述的组织工程化周围神经移植物植入到要修复的周围神经缺损处。如图3所示，周围神经断裂后，新生轴突从神经的近断端3长出来，类许旺细胞靠近和包围轴突，向轴突提供营养，并引导轴突向神经的远端生长，同神经纤维的远断端4相连接。在这个过程中，类许旺细胞发挥许旺细胞的功能，而作为支架的去细胞异体神经则被机体吸收，最终被再生的神经纤维取代。
为进一步增强支架对种子细胞的粘附性，并促进神经再生和移植物的血管化过程，本实施例中，去细胞异体神经可加入能促进细胞粘附、神经再生和移植物血管化的物质。该物质可以为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，包括胶原、氨基聚糖、糖蛋白三大类；也可以是各种生长因子。
在本实施例中，当患者的指神经缺损2厘米时，可取相应长度的异体指神经进行去细胞处理作为支架；当患者的正中神经缺损4厘米时，可取相应长度的异体正中神经进行去细胞处理作为支架；当患者的坐骨神经缺损6厘米时，可取相应长度的异体坐骨神经进行去细胞处理作为支架。
上列详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
权利要求
1.组织工程化周围神经移植物，其特征在于包括用于连接神经两断端的支架(1)和具有促进神经再生功能的种子细胞(2)，种子细胞(2)附着于支架(1)上，形成具有仿神经三维结构和生物活性的复合体。
2.根据权利要求1所述的组织工程化周围神经移植物，其特征在于所述的支架(1)为去细胞异体神经。
3.根据权利要求2所述的组织工程化周围神经移植物，其特征在于所述的支架(1)是采用化学萃取法制备的去细胞异体神经。
4.根据权利要求2或3所述的组织工程化周围神经移植物，其特征在于所述的去细胞异体神经含有能促进细胞粘附、神经再生和移植物血管化的物质。
5.根据权利要求4所述的组织工程化周围神经移植物，其特征在于所述的能促进细胞粘附、神经再生和移植物血管化的物质为细胞外基质或者生长因子。
6.根据权利要求1所述的组织工程化周围神经移植物，其特征在于所述的种子细胞(2)是成体干细胞经体外诱导而成的类许旺细胞。
7.根据权利要求6所述的组织工程化周围神经移植物，其特征在于所述的成体干细胞是骨髓间质干细胞。
8.根据权利要求6所述的组织工程化周围神经移植物，其特征在于所述的成体干细胞是脂肪干细胞。
全文摘要
本发明公开了一种组织工程化周围神经移植物，以提供适用范围更广和质量更好的修复神经缺损的外科移植物。本发明所述的组织工程化周围神经移植物，包括用于连接神经两断端的支架和具有促进神经再生功能的种子细胞，种子细胞附着于支架上，形成具有仿神经三维结构和生物活性的复合体。所述的支架为去细胞异体神经，所述的种子细胞是由成体干细胞经体外诱导而成的类许旺细胞。本发明是真正意义上的组织工程化周围神经移植物，不仅为再生的神经纤维通过神经缺损区提供了仿生化的通道，而且其内在的种子细胞对神经再生有促进作用，因此可用于修复更长距离的神经缺损，神经修复效果显著提高，临床应用范围更广。
文档编号C12N11/02GK1580254SQ20041002722
公开日2005年2月16日 申请日期2004年5月18日 优先权日2004年5月18日
发明者朱家恺, 刘小林, 朱庆棠, 劳镇国, 许扬滨 申请人:中山大学附属第一医院