专利名称：复合型组织工程神经损伤修复材料及其制备方法
技术领域：
本发明旨在研制一种具有良好生物相容性和生物可降解性的中枢及外周神经损伤后的修复桥接物，涉及胶原、明胶及氨基聚糖等多种生物原材料以及其加工工艺和制作方法。本材料既可用于神经损伤修复的基础研究，也可用于临床人体脊髓、外周神经节段性损伤、缺损后的桥接修复。
背景技术：
细胞外基质(ECM)是细胞赖以生存和维持细胞功能及生物学特征的基础，是生命的基本载体为生物提供其用以维持结构的支架和生物学功能的场所。ECM所具有的细胞黏附、细胞间信号传递、迁移等功能是独特的、其他物质所不具备的，对生物体的功能具有深远的影响。ECM包括三大类胶原、蛋白聚糖、糖蛋白。其中胶原在人体分布最广，约占30％，而一型胶原则是各种胶原中含量最多的，它为生物细胞提供用于维持结构的支架。I型胶原由三个α链组成，构成直径为67nm的三螺旋结构的原纤维，是基模的主要组成部分，具有抗压和维持空间结构的功能，主要分布在骨角膜，肌腱等处；明胶是一种由胶原分子降解而制得的多肽混合物，共有18种氨基酸组成了明胶肽链，胶原广泛存在于动物的骨、肌腱及结缔组织中，可被生物酶降解。大量的实验表明用细胞外基质制成的神经组织工程材料不仅具有良好的生物相容性，同时也有利于神经再生纤维的迁延和生长。但由于既往复合的桥接载体材料内部结构均无一定规律(在孔径大小和方向上)，不利于脊髓或外周神经节段性损伤再生纤维定向生长，从而影响了治疗或实验的效果。制备具有纵轴向孔径的胶原桥接材料，目前世界上尚无类似报道，我们所研制材料具有同一条件下材料的内部孔隙大小均匀，孔隙平行——完全与轴向平行等优点。因此，在神经修复组织工程中，更具有适宜脊髓和外周神经顺轴向孔定向生长和迁移的特点，获得脊髓和外周神经的有效修复、再生。在临床和实验中，应用前景广阔，作用巨大。
发明内容
本发明的目的旨在通过对原材料的配方及其加工工艺的改进提供一种生物相容性力学性质更好的复合型组织工程神经损伤修复材料及其制备方法，该材料不仅内部具有排列规律的微管型孔隙结构，而且孔径大小及方向可以根据需要进行调控，有利于神经再生纤维的生长，可用于脊髓、周围神经损伤的修复；通过调整制备材料的各基本成分，使该材料具有更好的促进神经再生纤维生长的作用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案该材料用胶原及氨基聚糖混合制成，材料采用I型胶原蛋白(collagen I)、IV型胶原蛋白(collagenIV)、硫酸类肝素(heparan sulfate)、明胶(gelatin)。其配方比例为(230∶5∶1∶115)～(4600∶100∶1∶2300)上述配方在温度梯度条件下通过调整原料混合物的冷淋速度及温度梯度，达到制备内部具有轴向平行均匀排列的微管结构，且微管直径具有可调节性的特殊神经损伤、缺损修复材料；其制作方法按以下步骤进行1)按比率称取一定量的I型胶原蛋白按27.5mg/ml的浓度放入0.05M醋酸溶液中溶解24小时；2)在4℃恒温环境中，18000r/min搅拌90min，制成悬浊液；3)另按比率称取一定量的硫酸类肝素、IV型胶原蛋白加入0.05M醋酸溶液中溶解24小时；4)在4℃恒温，18000r/min搅拌90min制成悬浊液；5)混合两种悬浊液保持4℃恒温，18000r/min搅拌90min，制成胶原蛋白和硫酸类肝素的悬浊液，抽真空静置12小时。
6)将制备好的桥接材料悬浊液注入内径为3mm、外径为4.2mm、长3cm至20cm的硅胶管中密封两端，沿管轴方向缓慢放入深低温冷淋剂中，进入速度控制为10×10-5m·s-1至10×10-7m·s-1；
7)将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷好的铝盘中，于-30℃、100mtorr条件中冻干48h；8)真空状态下升温至0℃保持24h，再继续升温至22℃保持45~90min，解除真空，升至常温；9)将材料用20％戊二醛浸泡24小时固化，对双蒸水反复透析，再经紫外线照射交联16小时；10)将材料无菌密封包装并置于2000伦琴CO60环境中照射消毒24小时。
本发明所研制的新型脊髓、周围神经修复桥接材料具有①材料的外表面均为全封闭结构。②材料的微管孔径大小可控制在20μm～300μm；③微管的走行方向为轴向且平行、均匀。在生物组织材料复合中，大孔径的材料对细胞的附壁爬行或灌注如嗅鞘细胞、雪旺细胞等起支架载体作用；而小孔径的材料则适宜于复合各种神经生长因子、药物等，用于脊髓和外周神经缺损处的桥接。所研制的材料表面无孔裂，使得在植入脊髓或外周神经缺损处能防止增生结缔组织纤维长入缺损段，避免阻碍神经再生轴突的定向生长。
本发明提出的复合型组织工程神经损伤修复材料具有以下特点1.采用了生物相容性更好的原料，更接近生物的体内环境，更加有利于神经的再生。其中IV型胶原蛋白(collagen IV)是神经基膜的构成组分，硫酸类肝素(heparan sulfate)有利于神经的再生，明胶(gelatin)则是神经营养因子最理想的载体。
2.探明了I型胶原蛋白(collagen I)、IV型胶原蛋白(collagen IV)、硫酸类肝素(heparan sulfate)、明胶(gelatin)等生物材料的最佳混合比例及对材料在生物学性质及力学性质等方面的影响；3.探明了温度、速度与新型神经组织工程修复材料内部结构间关系；4.探明了各种成分不同比例混合对材料内部结构的影响。
5.探明了组分之间胶联、固化的最佳条件增加了材料的抗拉强度和刚度，更好的改善了材料的力学性质。
6.通过控制材料的成分构成比率，有效的降低了材料在体内的分解速度。
7.研制了①多级可调式速度调控仪，使材料加工过程中冷淋速度在10×10-5～1.5×10-7m/s之间可随意进行多级可变式调控；②冷淋温控仪，使冷淋温度在0℃～-180℃之间任意调控。
本发明的复合型组织工程神经损伤修复材料是一种新型脊髓、周围神经修复桥接材料，既可直接植入脊髓、周围神经缺损处；也可作为神经组织工程各种子细胞移植的载体，可复合、携带各种促进神经再生的药物，用于人体脊髓、外周神经节段性损伤、缺损后的桥接；同样可用于脊髓、外周神经节段损伤修复的基础研究。
图1是400倍扫描电镜下轴向切面观察的图片，其材料内部为走向平行、孔径均一、排列规律的纵向微孔；图2是70倍电镜下轴向切面观察的图片，显示材料内部为纵向微孔结构。
图3是45°斜切面在300倍电镜下的图片，显示材料内部为立体纵向管状结构；图4是横切面400倍电镜下图片，显示材料内部微孔内径较为均一。
具体实施实例以下结合制作工艺及实施实例对本发明做进一步详细说明。
依照本发明的技术方案，该复合型组织工程神经损伤修复材料用胶原及氨基聚糖混合制成，材料采用I型胶原蛋白(collagen I)、IV型胶原蛋白(collagen IV)、硫酸类肝素(heparan sulfate)、明胶(gelatin)。其配方比例为(230∶5∶1∶115)～(4600∶100∶1∶2300)上述材料在一定的低温温度梯度环境中，温度梯度递减速率是决定材料内部微孔结构孔径大小、微孔取向的关键因素，改变注有胶原—氨基聚糖混合物硅胶管进入冷淋剂的速度可以达到对所需制备的材料在内部结构上孔径大小和孔隙方向及均匀程度均具有可调控性，从而得到复合型脊髓、周围神经组织工程损伤修复材料。
实施例1(按照I型胶原蛋白∶IV胶原蛋白∶硫酸类肝素∶明胶的比例为2300∶50∶1∶1150)按照本发明的技术方案，以胶原蛋白、明胶和硫酸类肝素为例，其制作方法按以下步骤进行1.按比率称取一定量的I型胶原蛋白按27.5mg/ml的浓度放入0.05M醋酸溶液中溶解24小时；2.在4℃恒温环境中，18000r/min搅拌90min，制成悬浊液；3.另按比率称取一定量的硫酸类肝素、IV型胶原蛋白加入0.05M醋酸溶液中溶解24小时；4.在4℃恒温，18000r/min搅拌90min制成悬浊液；5.混合两种悬浊液保持4℃恒温，18000r/min搅拌90min，制成胶原蛋白和硫酸类肝素的悬浊液，抽真空静置12h。
6.将制备好的桥接材料悬浊液注入内径为3mm、外径为4.2mm、长3cm至20cm的硅胶管中密封两端，沿管轴方向缓慢放入深低温冷淋剂中，进入速度控制为10×10-5m·s-1、5×10-5m·s-1至10×10-7m·s-1；7.将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷好的铝盘中，于-30℃、100mtorr条件中冻干48h；8.真空状态下升温至0℃保持24h，再继续升温至22℃保持45~90min，解除真空，升至常温；9.将材料用20％戊二醛浸泡24小时固化，对双蒸水反复透析，再经紫外线照射交联16小时；10.将材料无菌密封包装并置于2000伦琴CO60环境中照射消毒24小时。
温度和冷淋速率是制备本材料的的两个关键因素。为了获得均匀稳定的冷淋速度，通过多次实验摸索，申请人研制了多级可变式调速仪，使冷淋速率和温度均可在所需范围内调控。
本发明所研制出的桥接材料具有以下特点①材料的外表面为全封闭结构，无裂孔可有效的阻止疤痕组织长入；②材料的微孔直径可人为简单调控，既有利于神经再生纤维的长入，又有利于神经因子和种子细胞的植入；③内部微管尺寸均匀，排列规律，有利于神经再生纤维的定向生长；④动物实验证明该材料生物相容性好且降解速度适中有利于神经再生；⑤该材料经特殊工艺处理后，力学性质好，抗拉及抗变形能力好。
以下实例2～8各原材料的混合比相同。
实施例2采用胶原(I型)、硫酸类肝素和明胶作为原材料，其重量分别为1150mg、0.5mg、575mg，实施过程同实例1；实施例3采用胶原(I型、IV型)和明胶作为原材料，其重量分别为1150mg、25mg、575mg，实施过程同实例1；实施例3采用胶原(I型)和硫酸类肝素作为原材料，其重量分别为1150mg、0.5mg，实施过程同实例1；实施例4采用胶原(IV型)和硫酸类肝素作为原材料，其重量分别为25mg、0.5mg、，实施过程同实例1；实施例5采用胶原(I型)和明胶作为原材料，其重量分别为1150mg、575mg，实施过程同实例1；实施例6采用胶原(IV型)和明胶作为原材料，其重量分别为25mg、575mg，实施过程同实例1；实施例7采用胶原(I型、IV型)和硫酸类肝素作为原材料，其重量分别为1150mg、25mg、0.5mg，实施过程同实例1；实施例8采用胶原(IV型)、明胶和硫酸类肝素作为原材料，其重量分别为25mg、575mg、0.5mg，实施过程同实例1。
本发明所研制的新型复合型神经组织工程修复材料具有具有可简易调控的内径大小在20μm～300μm之间的各种尺寸的孔径和平行、均匀的单一取向的纵轴向微孔。该材料还可方便的制成不同的外型，如圆柱型，椭圆柱型等。在生物组织工程材料的应用中，较大孔径的对细胞附壁爬行或灌注如嗅鞘细胞、雪旺细胞等起支架、载体作用；而较小孔径的则适宜于复合各种神经生长因子、药物等，作为其缓释的载体，用于脊髓或外周神经组织缺损处的桥接。本发明所研制的材料表面结构接近于正常的神经且无孔裂，使得植入脊髓或外周神经组织缺损处，能防止增生结缔组织长入缺损段，影响神经再生纤维的定向生长。广泛用于人体周围神经或脊髓节段性损伤的临床治疗和动物外周神经或脊髓节段性损伤的实验研究中。
权利要求
1.一种复合型组织工程神经损伤修复材料，其特征在于，它包括I型胶原蛋白、硫酸类肝素、IV型胶原蛋白和明胶；其配方的重量百分比为I型胶原蛋白65.53％～65.71％；硫酸类肝素0.01％～0.28％；IV型胶原蛋白1.42％～1.43％；明胶32.77％～32.85％。
2.实现权利要求1所述的复合型组织工程神经损伤修复材料的制备方法，在温度梯度条件下通过调整原料混合物的冷淋速度及温度梯度，达到制备内部具有轴向平行均匀排列的微管结构，且微管直径具有可调节性的特殊神经损伤、缺损修复材料；其特征在于，按以下步骤进行1)原材料配方的重量百分比I型胶原蛋白65.53％硫酸类肝素0.28％IV型胶原蛋白1.42％明胶32.77％2)按上述比率称取I型胶原蛋白，按27.5mg/ml的浓度放入0.05M醋酸溶液中溶解24h；3)在4℃恒温环境中，18000r/min搅拌90min，制成悬浊液；4)另按上述比率称取硫酸类肝素、IV型胶原蛋白加入0.05M醋酸溶液中溶解24小时；5)在4℃恒温，18000r/min搅拌90min制成悬浊液；6)混合两种悬浊液保持4℃恒温，18000r/min搅拌90min，制成胶原蛋白和硫酸类肝素的悬浊液，抽真空静置12h；7)将制备好的桥接材料悬浊液注入内径为3mm、外径为4.2mm、长3cm至20cm的硅胶管中密封两端，沿管轴方向缓慢放入深低温冷淋剂中，进入速度控制为10×10-5m·s-1、5×10-5m·s-1至10×10-7m·s-1；8)将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷好的铝盘中，于-30℃、100mtorr条件中冻干48h；9)真空状态下升温至0℃保持24h，再继续升温至22℃保持45min～90min，解除真空，升至常温；10)将材料用20％戊二醛浸泡24h固化，对双蒸水透析，再经紫外线照射交联16h；11)将材料无菌密封包装并置于2000伦琴CO60环境中照射消毒24h。
全文摘要
本发明公开了一种复合型组织工程神经损伤修复材料，它包括I型胶原蛋白、硫酸类肝素、IV型胶原蛋白和明胶；该材料具有可简易调控的内径，大小在7.95μm～178.47μm之间的各种尺寸的孔径和平行、均匀的单一取向的纵轴向微孔。可方便的制成不同的外型，如圆柱型，长方型等。在生物组织工程材料的应用中，其较大孔径的对细胞附壁爬行或灌注如嗅鞘细胞、雪旺细胞等起支架、载体作用；而较小孔径的则适宜于复合各种神经生长因子、药物等，作为其缓释的载体，用于脊髓或外周神经组织缺损处的桥接。本发明所研制的材料表面结构接近于正常的神经且无孔裂，使得植入脊髓或外周神经组织缺损处，能防止增生结缔组织长入缺损段，影响神经再生纤维的定向生长。
文档编号A61L31/04GK1546182SQ20031011899
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月15日 优先权日2003年12月15日
发明者罗卓荆, 梁伟, 王树森 申请人:中国人民解放军第四军医大学