专利名称：从催吐萝芙木和酸橙中分离的抗糖尿病提取物及其使用方法
技术领域：
本发明属于药学领域。具体地，它涉及用于预防和治疗疾病的抗糖尿病药物领域。
背景技术：
胰岛素是由胰腺产生的激素，它使得葡萄糖可被人体内的细胞利用以获得能量。糖尿病主要是机体葡萄糖或碳水化合物代谢紊乱。在I型糖尿病中，胰腺几乎不产生胰岛素，或者它根本不产生胰岛素。治疗需要每天注射胰岛素，以使得糖尿病患者能够存活。在II型糖尿病中，胰腺产生胰岛素，但由于细胞抗性，胰岛素的数量不足够或者不够有效，或者既不足够也不有效。在这些形式的每一种中，存在各种异常，但这些异常可能属于的基本缺陷是(1)进入各种“外周”组织的葡萄糖减少；和(2)从肝释放到血流中的葡萄糖增加(增加的肝糖生成)。
据世界卫生组织(WHO)评估，每100个人中，有2至10个人将在其一生中形成该病症，且他们中有90％将为II型，迟发性非胰岛素依赖型糖尿病。Nathan(1993)New Eng.J.Med.3281676-1685。在II型糖尿病中，在肝、骨骼肌和脂肪组织中，由胰岛素刺激的葡萄糖摄取和利用受到损害。Zimmet(1982)Diabetologia 22399-411。通过限制热量和锻炼，能够改善这些缺陷。在该疾病的后期阶段，患者的唯一出路是终生的降血糖治疗。
目前对II型糖尿病的改进治疗包括给药磺胺类、双胍类(Turner和Clapham(1998)Prog.Drug.Res.5133-94)和噻唑烷二酮类。Kohlroser等人(2000)Am.J.Gast.96272-276。目前可用药物的缺点包括有害的副作用和许多相反的指示(例如不可能在妊娠中和哺乳期应用)，以及它们不能有效地阻止因长期II型糖尿病引起的组织并发症。因此，正在开发新的疗法，例如给药草药提取物。
例如美国专利公开20030206976公开了来自组合物的草药提取物，所述组合物包含Centaurii umbellatum、Gentianaceae(矢车菊植物)、Teraxacum officinale、Asteraceae(蒲公英根)、欧洲刺柏(Junipericommunis L)、Cupresaceae(杜松)、Urticae dioica L、Urticeae(荨麻植物)、Urticae dioica L、荨麻科(Urticaceae)(荨麻根)、菊苣(Cichorium intybusL.)、Cichoriaceae(菊苣根)、黑桑(Morus nigra L)、桑科(Moraceae)(桑叶)、欧蓍草(Achilleae millefolium L)、Asteraceae(西洋蓍草花)、欧洲越桔(Vaccinium myrtillus L)、杜鹃花科(Ericaceae)(越桔叶)、Phaseolusvulgaris L、Fabaceae(豆荚)、Valeriana officinalis L、Valerlanaceae(缬草根)。所述提取物被用于治疗II型糖尿病。
美国专利公开20030086985公开了用于从Argyrobium roseum中分离提取物的方法，Argyrobium roseum包含黄酮苷并具有降血糖活性。包含该提取物的组合物对治疗多种高血糖症有用，包括非胰岛素依赖型糖尿病。美国专利公开20020187201公开了使用从翡翠贻贝(Perna viridis)中分离的天然产物来控制糖尿病的方法。
但是，仍然需要发现具有长期作用的组合物和疗法。在此描述的本发明满足了这种需要，而且还提供了相关的优点。
发明公开本发明提供了一种方法，其用于从催吐萝芙木(Rauvolfia vomitoria)的叶部(叶和茎)和/或根以及酸橙(Citrus aurantium)的果实中提取药用活性部分。在一方面，所述方法要求通过过滤催吐萝芙木叶部和/或根以及酸橙果实的煮沸茶并浓缩上清液，从所述煮沸的茶中提取活性部分。在一个实施方案中，通过冻干上清液浓缩所述部分。
本发明还提供了一种方法通过向受试者给药治疗有效量的所述提取物或包含所述提取物的药物组合物，来治疗与受试者中异常升高的葡萄糖水平相关的疾病。这样的疾病包括但不限于II型糖尿病、异常的硬脂酰辅酶A去饱和酶活性、饮食过多、异常的脂质动员、受试者眼睛的异常脂肪酸谱(fatty acid profile)、溃疡和糖尿。
附图简述
图1比较了分别来自消瘦、肥胖和糖尿病C57BL小鼠的脂肪组织(A)、眼(B)、骨骼肌(C)、胰腺(D)、肝-甘油三酯部分(E)和肝-磷脂部分(F)中的总脂肪酸(总FA)和不同脂肪酸子类含量(饱和脂肪酸，SFA；MUFA和PUFA)。数据表示为平均数±SEM值。将来自肥胖和糖尿病小鼠与消瘦对照小鼠的数据的显著性差异表示为*＝P＜0.05；**＝P＜0.01；***＝P＜0.001。
图2比较了分别在消瘦、肥胖和糖尿病小鼠的脂肪组织(A)、眼(B)、骨骼肌(C)、胰腺(D)、肝-甘油三酯部分(E)和肝-磷脂部分(F)中评估的硬脂酰辅酶A去饱和酶活性(计算为油酸与硬脂酸的比率)。数据表示为平均数±SEM值。将肥胖和糖尿病小鼠与消瘦对照小鼠的数据的显著性差异表示为*＝P＜0.05；**＝P＜0.01；***＝P＜0.001。
图3比较了分别来自消瘦、肥胖和糖尿病小鼠的脂肪组织(A)、眼(B)、骨骼肌(C)、胰腺(D)、肝-甘油三酯部分(E)和肝-磷脂部分(F)中必需脂肪酸的含量(亚油酸，LA；α-亚麻酸，α-LE；花生四烯酸，AA；和二十二碳六烯酸，DHA)。数据表示为平均数±SEM值。将肥胖和糖尿病小鼠与消瘦对照小鼠的数据的显著性差异表示为*＝P＜0.05；**＝P＜0.01；***＝P＜0.001。
图4比较了分别在消瘦、肥胖和糖尿病小鼠的脂肪组织(A)、眼(B)、骨骼肌(C)、胰腺(D)、肝-甘油三酯部分(E)和肝-磷脂部分(F)中Δ6去饱和酶的活性(计算为α-亚麻酸、二高γ亚麻酸和花生四烯酸的总和与亚油酸含量的比率)。数据表示为平均数±SEM值。将肥胖和糖尿病小鼠与消瘦对照小鼠的数据的显著性差异表示为*＝P＜0.05；**＝P＜0.01；***＝P＜0.001。
图5显示在单次给药70倍人类日剂量后，萝芙木-橙提取物对11周大的消瘦C57BL/6J小鼠的体重的影响。
图6显示在单次给药70倍人类日剂量后，萝芙木-橙提取物对11周大的消瘦C57BL/6J小鼠的水(A)摄取和食物(B)摄取的影响。
图7显示在用每日给药7倍人每日剂量治疗6周后，萝芙木-橙提取物对11周大的糖尿病肥胖C57BL/KsBom-db/db小鼠的体重的影响。
图8显示在用每日给药7倍于最大的人类日剂量治疗6周后，萝芙木-橙提取物对11周大的糖尿病C57BL/KsBom-db/db小鼠的食物(A)和水(B)摄取的影响。
图9显示在6周的治疗时间后，在对照(n＝9)和经治疗(n＝10)饲养的糖尿病C57BL/KsBom-db小鼠的眼睛中，萝芙木-橙提取物治疗对(A)脂肪酸含量；(B)必需脂肪酸含量和(C)评估的硬脂酰辅酶A和Δ6去饱和酶活性的影响。数据表示为平均数±SEM值。将治疗小鼠与未治疗对照小鼠的数据的显著性差异表示为*＝P＜0.05；**＝P＜0.01。
图10显示人类病例研究的血糖水平进程，将其表达为治疗时间的函数。
实施本发明的方式在本公开的全文中，通过鉴别引用来参考各种公开、专利和公开的专利说明书。这些公开、专利和公开专利说明书的内容据此被引入本公开作为参考，以更充分地描述本发明涉及的领域状态。
除非另有说明，本发明的实施使用有机化学、分析化学、生物化学和生理学的常规技术，这些在本领域的技术范围内。文献中充分解释了这些技术。
定义在用于本文时，某些术语可以具有下面定义的含义。
在用于本说明书和权利要求书时，除非文章另有清楚地说明，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。例如术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
在用于本文时，术语“包括”用于指所述组合物和方法包括所引用的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应意味着排除对所述组合具有任何基本重要性的其他要素。因此，基本上由本文所定义的要素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物，以及药学可接受的载体，例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由...组成”应意味着排除痕量元素以外的其他成分和用于给药本发明组合物的基本方法步骤。由每个这些过渡术语定义的实施方案在本发明的范围内。
所有用数字表示的指代物，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，它们以(+)或(-)0.1的增量变化。应理解的是，尽管没有经常明确地说明，但所有用数字表示的指代物均由术语“约”引导。还应理解的是，尽管没有经常明确地说明，但本文所述的试剂仅仅是示例性的，它们的等效形式在本领域中是公知的。
术语“分离的”是指与化合物、组合物或提取物通常与之天然伴随的组分、细胞和其他物质分离的。
“受试者”或“宿主”是脊椎动物，优选走兽或哺乳动物，更优选人类患者。哺乳动物包括但不限于鼠类、大鼠、猿、人类患者、农场动物、运动动物(sport animal)和宠物。
在用于本文时，“治疗”包括全身改善与病理学相关的症状和/或延迟症状的发作。“治疗”的临床和亚临床迹象将随着病理学、个体和治疗而变化。例如给药对糖尿病病症的治疗能够导致降低血糖水平和停止糖尿。在一方面，“治疗”还包括“治愈”。申请人说明在例如约30天至约180天时间(或可替代为约60天至约120天)内服用提取物的患者，通常不再需要重复治疗。他们保持无症状，不再需要连续治疗。
“组合物”用于指活性剂与另一种惰性(例如可检测的试剂或标记物)或活性的化合物或组合物如辅剂的组合。
“药物组合物”用于包括活性剂与惰性或活性载体的组合，从而使得组合物适合体外、体内或离体的诊断或治疗使用。
在用于本文时，术语“药学可接受的载体”包括任何标准的药用载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂，例如油/水或水/油乳剂，以及多种类型的润湿剂。所述组合物还可包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和防腐剂的例子，参见Martin REMINGTON′S PHARM.Sd.，15thEd.(Mack Publ.Co.，Easton(1975))。
“有效量”是足以实现有益或所需结果的量。例如治疗量是指该量能获得所需的治疗效应。该量可与预防有效的量相同或不同，后者指防止疾病或疾病症状发作所必需的量。可在一次或多次给药、施用或剂量中给予有效量。
“I型糖尿病”(过去称为I型、IDDM或幼年型糖尿病)的特征是由自身免疫过程引起的β细胞破坏，通常导致胰岛素的绝对缺乏。Report ofthe Expert Committee on the Diagnosis and Classification of DiabetesMellitus.Diabetes Care(1997)201183-97(下文中“Expert Report(1997)”)。National Diabetes Data Group.Diabetes in America.2d ed.Bethesda，Md.National Institutes of Health，National Institute of Diabetesand Digestive and Kidney Diseases，(1995)NIH Publication No.95-1468(下文中“NIH(1995)”)。该发作通常是急性的，在几天到几周的时间内形成。超过95％的I型糖尿病患者在25岁以前形成该疾病，在两种性别中发病率相等，在白种人群中的患病率增加。通常发现I型糖尿病、麸质性肠病(乳糜泻)或其他内分泌疾病的家族史。这些患者中大多数具有I型糖尿病的“免疫调节形式”，具有胰岛细胞抗体，且常患有其他自身免疫疾病，例如桥本甲状腺炎、艾迪生病、白斑或恶性贫血。少数患者，通常是那些非洲或亚洲血统的患者不具有抗体，但具有相似的临床表现；因而，也将他们包括在该类中，他们的疾病被称为I型糖尿病的“自发形式”。Expert Report(1997)和NIH(1995)。
“2型糖尿病”(过去称为NIDDM、II型或成年型发病)的特征是外周组织中的胰岛素抗性和β细胞的胰岛素分泌缺陷。Expert Report(1997)和NIH(1995)。这是最常见的糖尿病形式，与糖尿病的家族史、较老的年龄、肥胖和缺乏锻炼高度相关。它在妇女中更常见，尤其是具有妊娠糖尿病史的妇女、黑人妇女、西班牙妇女和土著美洲妇女。胰岛素抗性和高胰岛素血症最终导致损害葡萄糖耐受性。缺陷的β细胞被耗尽，进一步加剧葡萄糖不耐受和高血糖的循环。II型糖尿病的病因学是多因素的，可能基于遗传，但它也具有强烈的行为成分。
将多种已知病因学的糖尿病类型分成一类，形成名为“其他特殊类型”的类别。这个组包括具有β细胞功能基因遗传缺陷的人(这类糖尿病以前被称为MODY或青年成熟型糖尿病)或具有胰岛素作用缺陷的人；具有胰腺外分泌疾病的人，例如胰腺炎或囊性纤维化病；具有与其他内分泌病(例如肢端肥大症)相关的功能障碍的人；和具有由药物、化学品或感染引起的胰腺功能障碍的人。Expert Report(1997)和NIH(1995)。
本申请人已确定从催吐萝芙木的叶部(叶和茎)和/或根以及酸橙的果实中提取药用活性部分的方法。在一方面，所述方法要求通过过滤煮沸的茶并浓缩上清液，从催吐萝芙木的叶部和/或根以及酸橙果实的煮沸茶中提取活性部分。在一个实施方案中，通过冻干上清液浓缩所述部分。
催吐萝芙木广泛分布在热带西非的沿海和内陆部分。该物种是公知的药用植物，被非洲的不同人群用作调和物(concoction)的主要或次要部分，用于治疗多种疾病。Sofowora，Medicinal Plants and TraditionalMedicine in Africa，Wiley and Sons，Chichester(1 982)；Burkill，The UsefulPlants of Tropical West Africa，Vol.1(1985)。以前研究了催吐萝芙木的生物碱含量，尤其是那些具有降压和抗炎性质的生物碱。Chatterjee&Bandyopadhyay(1979)Ind.J.Chem.28B87-88；Amer&Court(1980)Phytochemistry 191833-1836；Kweifio-Okai(1991)J.EthnoPharmacology 33263-267。据报告，当结合饮食控制时，酸橙具有减少体重的作用。Preuss等人(2002)J.Med.33247-264。此外，酸橙已经显示出辐射防护性，因为它富含具有抗氧化活性的黄酮。Hosseinimehr等人(2003)J.Rad.Res.(Tokyo)44237-241。
本发明提供了基本上由从催吐萝芙木和酸橙中获得的液体提取物组成的生物学活性组合物。在一方面，所述提取物是从煮沸的催吐萝芙木的叶和茎以及煮沸的酸橙果实中分离的。该提取物能够与载体如药学可接受的载体组合。作为替代的和/或另加的，可向所述组合物中添加降低血糖水平的有效量的试剂。
本发明还提供了一种方法通过向受试者给药治疗有效量的所述提取物或包含所述提取物的药物组合物，来治疗与受试者中异常升高的葡萄糖水平相关的疾病。在用于本文时，“治疗”意味着减清与异常高的葡萄糖水平相关的症状。这样的症状包括但不限于II型糖尿病、异常的硬脂酰辅酶A去饱和酶活性、饮食过多、异常的脂质动员、受试者眼睛的异常脂肪酸谱、溃疡和糖尿。本领域技术人员能够通过注意到患者血液或尿中葡萄糖的减少或症状的改善例如血压正常化、曲张静脉周围的球状肿块的消失等而注意到何时已实现所述方法的目标。
可使用任意给药模式递送所述提取物。可能将提取物添加到药学可接受的载体中，全身、口服、经皮或局部给药至受试者。可凭经验确定治疗量，它将根据被治疗的病理学、被治疗的受试者和治疗方法中所用的活性部分形式的毒性而改变。可通过口服、静脉内、腹膜内或经皮递送各种形式的活性提取物、部分、化合物或包括一种或多种活性提取物、部分、化合物的组合物。当递送至动物时，所述方法用于进一步确认所述提取物、部分、化合物或包括一种或多种活性提取物、部分、化合物的组合物对所治疗疾病的效能。合适的动物模型在本领域中是已知的。仅仅为了说明的目的，在下面实验1中描述了适当的动物模型。使用实验1中描述的动物模型，申请人注意到，当通过口服施用到6周大的远交繁殖(outbred)NMRI消瘦小鼠或6周至11周大的近交繁殖C57BL/6J消瘦小鼠时，发现对应于70倍人每日剂量的单次剂量是无毒的。治疗方案包括在6周内，通过向C57BL/KsBom-db(db/db)小鼠口服施用相当于7倍人每日剂量的每日剂量。在治疗期间，将实验动物和对照动物保持缺乏碳水化合物和脂肪的Altromin C1009饮食。提取物降低了经治疗的II型糖尿病小鼠模型的饮食过多并促进体重减轻。尽管体重减轻不是统计学显著性的，但是与对照组相比，经治疗的动物具有显著更高的血清甘油三酯含量，这显示在经受严格热量限制的动物中，所述治疗能诱导体内储存的脂质动员。此外，经治疗动物眼睛的脂肪酸谱显示总脂肪酸和所有主要的脂质子类的显著减少，评估硬脂酰辅酶A去饱和酶活性减少33％(与未治疗的对照相比，P＝0.039)。有趣的是，如果将经治疗动物保持在热量限制下，则在中断治疗另5周后，它们保持了在6周治疗结束时观察到的脂肪酸动员。这与在db/db小鼠中观察到的“脆弱”胰腺的保护是一致的。相反，在治疗后被喂以更丰富的标准Altromin 1314饮食的经治疗小鼠却损失了这些优点。
在整个疗程中，能够以一个剂量连续或间歇地实现体内给药。确定最有效的给药方式和剂量的方法对本领域技术人员是熟知的，它们将根据用于治疗的组合物、治疗的目的、被治疗的靶细胞和被治疗的受试者而变化。能够用由医生选定的剂量水平和模式进行单次或多次给药。下文能够找到用于给药试剂的合适剂量制剂和方法。
本发明的提取物、部分、化合物、组合物和药物制剂能够用于制造药物、食品和健康补充剂，并通过常规方法给药，例如作为药物组合物中的活性成分，用于治疗人和其他动物。
会理解的是，本发明的化合物和组合物的适当剂量可取决于疾病类型和严重性以及阶段，且会随患者而异。最佳剂量的确定通常将包括平衡治疗益处的水平与本发明治疗的任何危险或有害副作用。例如提取物、部分、化合物或包括一种或多种提取物、部分、化合物的组合物可通过口服、鼻内、胃肠外或通过吸入疗法给药。可以将它配制成任何合适的递送形式(means)，所述形式的例子包括但不限于片剂、锭剂、颗粒剂、胶囊、药丸、安瓿剂、栓剂或气雾剂形式。它们也可以采用糖浆剂、颗粒物、散剂或者活性成分在水性或非水稀释剂中的混悬剂、溶液剂和乳剂的形式。除了本发明的活性剂或提取物外，所述药物组合物还可包含其他药用活性化合物或多种本发明的化合物。
通过任选地与一种或多种助剂压制或模制，可以制备片剂。可以如下制备压制片将自由流动形式的活性成分如粉末或颗粒任选地与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基淀粉钠)、表面活性剂或分散剂混合，在合适的机器中压片。通过将润湿的粉末化合物与惰性液体稀释剂的混合物在合适的机器中制模，可制备模制片。所述片剂可以任选地被包衣或压痕，通过使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素来提供所需的释放曲线，可将片剂配制成提供其中所含活性成分的缓释或控释。可以任选地为片剂提供肠溶包衣，以在胃以外的肠的部分提供释放。
用于局部给药的本发明药物组合物可被配制成软膏剂、乳膏、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油。或者，制剂可以包括浸渗活性成分和任选地一种或多种赋形剂或稀释剂的贴片或敷料如绷带或膏药。适合在口中局部给药的制剂还包括锭剂，其包括在调味基质中的活性成分，调味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；软锭剂，其中包括在惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶中的活性成分；以及口腔洗剂，其包括在合适的液体载体中的活性成分。
适合阴道给药的制剂可作为阴道栓剂、止血栓、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂出现，除了活性成分外，所述制剂还包含例如本领域已知的合适载体。
适合鼻腔给药的制剂(其中载体为固体)包括粒度为例如在约20至约500微米范围内的粗粉，其给药为采用鼻吸的形式，即从举到靠近鼻子的粉末容器迅速吸入通过鼻腔通道。其中所述载体为液体的用于给药的合适制剂例如鼻腔喷雾、滴鼻剂或通过喷雾器气雾给药，所述制剂包括活性成分的含水溶液或油溶液剂。
适合胃肠外给药的制剂包括含水和非水等渗无菌注射液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，它们致使所述制剂与预计的接受者的血液等渗；和含水与非水灭菌混悬剂，它们可以包括助悬剂和增稠剂，以及脂质体或其他微粒系统，它们被设计成将化合物靶向至血液组分或一个或多个器官。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量的密封容器如安瓿和小瓶中，可以贮存在冷冻干燥(冻干)条件中，这仅需要在就要使用前加入无菌液体载体，例如注射用水。即用注射溶液和混悬剂可以从前述种类的无菌粉末、颗粒剂和片剂中制得。
优选的单元剂量制剂是那些包含本文上述的药物成分或其适当部分的每日剂量或单元、每日亚剂量的制剂。
应该理解，除了上面具体提及的成分外，考虑到所述的制剂类型，本发明的制剂还可包括本领域常规的其他生物活性剂。仅为了说明的目的，这些额外的生物活性剂包括但不限于磺酰脲类，例如氯磺丙脲(商品名Meldijan等)、氨磺丁脲(大约40个商品名)、格列本脲(商品名Euglukon、Glibenklamid、Genericon等)和双胍类，其包括例如苯乙双胍(商品名Phenformin、DB-Comb等)以及二甲双胍(商品名Gluchopage等)。在又一实施方案中，可以在组合物和制剂中包括适合口服给药的另外的试剂如甜味剂、增稠剂和调味剂。
所述提取物、部分、化合物或包括一种或多种提取物、部分、化合物的组合物也可以作为兽药制剂的形式使用，这些制剂可以通过例如本领域的常规方法制得。
本发明还提供了一种方法通过比较潜在治疗的活性与本发明提取物的治疗活性，筛选治疗剂来治疗或改善与异常的血糖水平，例如异常高的血糖水平相关的症状，例如糖尿病患者所经历的症状。在一方面，所述患者患有II型糖尿病。所述测定还可用于筛选所述提取物与另一种活性剂或治疗的新的或可替代的制剂或组合。所述筛选需要(a)将潜在试剂给药到合适的动物模型中，和(b)向另一合适的动物给药有效量的提取物或包含所述提取物的药学可接受的组合物。比较步骤(a)动物和步骤(b)动物的治疗响应的生物标记。如果步骤(a)的任何试剂提供的治疗响应与步骤(b)的模型中提供的响应程度相同或类似，则它就是用于治疗或改善与动物体内异常的血糖相关的症状的治疗剂。合适的动物模型包括但不限于下面实验1中所述的动物模型或人类患者，例如糖尿病人类患者。
本发明还提供了所述提取物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
本发明还提供了一种试剂盒，用于治疗或改善与异常的血糖，例如异常高的血糖水平相关的症状。所述试剂盒包括治疗有效量的提取物和使用说明。所述试剂盒可用于治疗选自下列疾病的疾病II型糖尿病、异常硬脂酰辅酶A去饱和酶活性、饮食过多、异常脂质动员、受试者眼睛的异常脂肪酸谱、溃疡和糖尿。
下列实施例用于说明，而非限制本发明。
实施例实验1-新颖的动物模型脂质组成活细胞的主要部分，在那里它们提供物理屏障来隔室化细胞，并作为能量在肝和脂肪组织中的主要贮存形式。膜脂不仅形成细胞的惰性框架。而且，现在认识到膜脂及其生物活性衍生物在细胞功能，尤其是在细胞对来自激素、神经递质和生长因子的外部刺激的响应中具有基本作用。因此，膜脂组成的改变与特定的疾病病症如囊性纤维化(Freedman等人(2004)New Eng.J.Med.350560-569)、糖尿病和肥胖相关就不奇怪了。Vessby B.(2000)Brit.J.Nutr.83 Suppl.S91-96。
但是，关于变化程度和哪些组织或器官最佳地呈现修饰，文献中的报告相互矛盾。尽管在人体中，饱和脂肪酸(SFA)和较低分子量多不饱和脂肪酸(PUFA)含量的增加与改变的骨骼肌胰岛素响应相关，但Clore等人((2000)MetabolismClinical and Experimental 492332-238)发现，与从健康对照中采集的样品相比，在糖尿病患者的血清中，长链PUFA(例如花生四烯酸)和低级亚油酸的含量增加了。
为了在II型糖尿病模型小鼠中建立与脂质内环境稳定相关的一些参数状态，研究了小鼠中的糖尿病病理生理学涉及的组织的脂肪酸(FA)含量。研究遗传繁殖糖尿病(db/db)和肥胖(ob/ob)小鼠、以及相同年龄并用相同饮食喂养的消瘦小鼠的组织脂肪酸组成。研究其FA特征的组织包括脂肪组织、眼、肝、胰腺和骨骼肌。结果显示，尽管在肥胖小鼠的大多数不同组织中存在脂质积累，但是在糖尿病小鼠的脂肪组织、眼睛和肌肉中，脂质的沉积存在选择性，并显示在后两种组织中硬脂酰辅酶A去饱和酶活性增加。
实验1-步骤动物在由Danish Animal Care and Use license批准的指导原则下进行所述研究。实验动物是雄性遗传繁殖的C57BL/6Jbom-ob/ob(肥胖，n＝4)、C57BL/KsBom-db/db(糖尿病，n＝3)小鼠和消瘦的C57BL/6J纯系(n＝4)。当动物13周大时，从Bomholtgaard Breeding and Research Centre Ltd.，Ry，Denmark购得。将动物保持为每组3-4只小鼠/笼，保持Altromin 1320标准维持饮食，居住在保持为25℃、具有12h黑暗和12h光线循环的屋子中。
样品收集当动物23周大时，将它们禁食过夜。第二天，将动物称重，用醚麻醉，通过眼眶穿刺收集血样，然后将动物处死。使血样在室温下凝结(约1小时)，并在4℃高速(3000g)离心30min后，收集干净的血清样品。使用放射免疫分析法(“RIA”)试剂盒(Linco Research，Inc.Missouri，USA)确定血清胰岛素和胰高血糖素含量。从每只动物采集眼睛、肝(左前叶)、胰腺、腿骨骼肌和脂肪组织(睾丸周围)的样品，立即冷冻在液氮中，保存在-70℃。
FA分析用氯仿/甲醇萃取组织中的总脂质，甲基化并在具有火焰离子化检测器的Hewlett Packard 5890系列II色谱仪(Hewlett-Packard GmbH，Waldbronn，Germany)中，通过气相-液相色谱法分析，基本上如由Staarup和Hoy(2000)J.Nutr.1302802-2808所述。简言之，给所述仪器安装60m熔凝硅石毛细管柱(SP-2380)，进样器和检测器温度处于270℃。载气为氦。烘箱初始温度为70℃，保持0.5min，接着程序升温如下15℃min-1至160℃，1.5℃min-1至200℃，保持15min，及30℃min-1至225℃，保持5min。
定量不同组织中每种脂肪酸类型的数量(脂肪酸的重量百分比含量乘以μg总脂肪/mg组织)。计算每个样品的饱和脂肪酸(SAT)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和PUFA的总和，表示为μg脂肪/mg组织(或者对于脂肪组织，mg脂肪/mg组织)。对于单个脂肪酸的百分比，将参与脂肪酸生物合成的选定酶的活性评估为产物与前体的比率。所评估的脂肪酸涉及的代谢过程包括A9或硬脂酰辅酶A去饱和酶活性和Δ6去饱和酶，将前者评估为油酸[C18:1(n-9)]与硬脂酸(C18:0)的比率，将后者计算为γ-亚麻酸(LNA，[C18:3(n-6)]、二高γ亚麻酸(DGLA，[C20:3(n-6)]和花生四烯酸(AA，[C20:4(n-6)])的总和与亚油酸[C18:2(n-6)]的比率。
统计将数值表示为平均数±标准误差。使用ANOVA(非双侧t检验)在Microsoft Excel中测试数据的统计学差异。认为p＜0.05的数值是显著的。
结果体重、血清胰岛素和胰高血糖素水平在表1中显示小鼠的体重、血清胰岛素和胰高血糖素水平。正如预期的，当与消瘦小鼠相比时，ob/ob小鼠显示出体重显著增加。在糖尿病小鼠与其消瘦对照物的平均体重之间不存在显著性差异。ob/ob和db/db小鼠显示胰岛素和胰高血糖素水平增加，这对于品种(5)是典型的；比较标准禁食范围分别为胰岛素0.5-2ng/ml，胰高血糖素50-150pg/ml。
表1小鼠的体重、血清胰岛素和胰高血糖素(表示±SEM)
*P＜0.05。
a在从仅2只db/db小鼠中获得的血清上进行分析。
遗传肥胖小鼠和糖尿病小鼠组织在单不饱和脂肪酸如何积累中的不同在图1的A、B、C、D、E和F中分别表示不同小鼠的脂肪组织、眼、骨骼肌、胰腺、肝-甘油三酯(肝-TAG部分)和肝-磷脂(肝-PL部分)中主要脂肪酸类别的相对量。通常，与在消瘦小鼠和糖尿病小鼠组织中相比，在肥胖小鼠的组织中的总脂肪酸尤其是SFA和MUFA增加。因此，除了眼睛外，与消瘦小鼠中的数值相比，在肥胖小鼠组织中观察到SFA和MUFA积累显著增加。有趣的是，当与消瘦小鼠组织中的FA含量相比时，遗传糖尿病小鼠仅在脂肪组织、骨骼肌和眼中显示FA积累(尤其是MUFA)的显著增加(图1B)。
在ob/ob和db/db小鼠组织中评估的硬脂酰辅酶A去饱和酶活性的不同增加与上面观察的MUFA积累一致，在肥胖小鼠的大多数组织中，计算的硬脂酰辅酶A去饱和酶活性有增加(图2的A、B、C、D、E和F)。对于糖尿病小鼠，Δ9不饱和度的显著增加仅与眼和骨骼肌相关，它们还具有显著的MUFA积累(参见上述)。
遗传肥胖小鼠和糖尿病小鼠在多不饱和脂肪酸如何在组织中积累和何种多不饱和脂肪酸在组织中积累的不同当与消瘦小鼠中的水平相比时，ob/ob小鼠胰腺、肝-TAG部分和骨骼肌的PUFA部分显著增加(参见图1和3)。在db/db小鼠中，PUFA的显著增加在骨骼肌中也显而易见。尽管长链和短链形式的PUFA都在肥胖小鼠组织中积累，但PUFA部分在糖尿病小鼠肌肉中的增加主要来自短链LA和α-亚麻酸的积累(图3)。虽然与消瘦小鼠相比，在db/db小鼠中前体n-6 LA的积累与较长链n-6产物花生四烯酸(AA)的显著减少不一致，但在db/db小鼠的骨骼肌和其他组织中，长链n-3 DHA显著减少。这里唯一的例外是db/db胰腺，与从消瘦对照动物的胰腺中观察到的相比，其中包含显著更高数量的DHA(参见图3)。
评估Δ6去饱和酶活性在db/db小鼠的眼和骨骼肌中降低除了胰腺和肝PL部分外，评估Δ6去饱和酶活性在db/db小鼠的组织中减少(图4的A、B、C、D、E和F)。不能用评估Δ4不饱和度(计算为DHA[C22:6(n-3)]对二十二碳六烯酸DPA[C20:5(n-3)]的比率)来确证Δ6不饱和度的减少，因为糖尿病小鼠的几个组织缺乏可检测的DPA水平。但是，在糖尿病小鼠中，Δ6不饱和度的减少确实与DHA水平的显著减少是一致的。在肥胖小鼠中，还预测胰腺和肝-TAG部分的评估Δ6活性减少，而预期脂肪组织和肝-PL部分的评估Δ6活性增加(图4的D和E)。
结果讨论肝和脂肪组织构成哺乳动物中贮存、处理和分布热量燃料(caloricfuel)的主要组织。在正常条件下，这些组织与体内对某些激素和辅因子有高度响应的其他组织之间存在动态的相互影响，从而即使在间歇的禁食期，也能确保哺乳动物组织保持富含高能的燃料的稳定流动。II型糖尿病或NIDDM来自机体能量代谢的机能障碍。NIDDM的代谢紊乱特征与脂质动员和肥胖日益密切相关。Vessby(2000)New Eng.J.Med.350560-569；McGarry(1992)Science 258766-770。肥胖的特征是组织脂质的蓄积增加。
该实验显示，当与其消瘦对照物相比时，在具有严重NIDDM形式的遗传糖尿病db/db小鼠和具有较温和的II型糖尿病形式的遗传肥胖ob/ob小鼠中，组织脂质分布明显不同。尽管除了眼睛外，ob/ob小鼠在所检查的全部组织中都积累了SFA和MUFA，但MUFA在db/db小鼠中的积累限于脂肪组织、眼和骨骼肌。因此，严重糖尿病小鼠的肝显得缺少脂质积累。相反，过度产生的MUFA沉积在其他非脂肪组织上，例如眼和肌肉(参见表2)。尽管已经报告了糖尿病视网膜病及其通常相关的视网膜脂质沉积(Curtis&Scholfield(2004)Diabetes-Metab.Res.2028-43)，但是在文献中还没有报告眼组织脂质积累与ob/ob(表示温和的NIDDM状态)和db/db小鼠(表示严重的NIDDM状态)之间的这种区别。
在哺乳动物细胞内，通过酶复合体FA合成酶(FAS)合成饱和脂肪酸如棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)，该酶使用由限速酶乙酰辅酶A羧化酶产生的构成嵌段。由于硬脂酸和少数棕榈酸是不溶于水的(Kim&Ntambi(1999)Biochem.Biophys.Res.Comm.2661-4)，所以哺乳动物体内从头FA生物合成的终产物通常被硬脂酰辅酶A去饱和酶分别转化为其MUFA形式、油酸(C18:1)和棕榈油酸(C16:1)。Enoch等人(1976)J.Biol.Chem.2515059-5103。但是，在大多数发达国家常见的高脂肪饮食中，一些被消耗的过量脂肪没有被代谢，而是仅仅贮存在组织中。事实上，现存脂质通过脱酰作用/再酰化作用进行从头FA合成和重建，其发生速率与大鼠肝细胞中的速率相似。Schmid等人(1995)Arch.Biochem.Biophys.319168-176。在本研究中，在肥胖小鼠的组织中(除了眼)，评估硬脂酰辅酶A去饱和酶活性增强。在糖尿病小鼠中，硬脂酰辅酶A去饱和酶活性的增加仅仅与眼和肌肉相关(即MUFA积累增加的两个组织)。在肥胖和II型糖尿病的发展中，酶对FA积累的主要作用已经被如下发现所确证，即两个小鼠SCD基因中一个基因的损失会导致减少身体肥胖和抵抗饮食诱导的体重增加。Ntambi等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9911482-11486。此外，由于参与胰岛素信号的细胞因子升高，SCD1-/-动物的胰岛素敏感性增加。Rahman等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10011110-11115。事实上，已经显示抗II型糖尿病药物噻唑烷二酮类通过压制SCD1基因表达，通过PPAPγ受体发挥它们的一部分抗糖尿病效应。Kurebayashi等人(1997)Diabetes 462115-2118。
与NIDDM相关的一个长期并发症是伤口愈合不良。Colville-Nash&Willoughby(1997)Mol.Med.Today 314-23。必需脂肪酸(EFAs)是几种类二十烷酸和二十二烷酸的重要前体，类二十烷酸和二十二烷酸分别具有促炎和抗炎效应。因此，检查了两种NIDDM模型小鼠中EFA的变化。与消瘦小鼠相比，PUFA部分在ob/ob小鼠的胰腺、肝-TAG和骨骼肌中增加，但在肝-PL部分中减少。从db/db小鼠的骨骼肌中也观察到了PUFA部分的增加。与ob/ob小鼠中PUFA的增加模式相反，较短链PUFA-LA和α-亚麻酸仅仅引起db/db小鼠肌肉中PUFA的增加。与在消瘦对照中发现的数量相比，在成人中，肥胖和糖尿病患者的胰岛素抗性与骨骼组织(Borkman等人(1993)New Engl.J.Med.328238-244；Storlien等人(1996)Lipids 31S261-S265)和红细胞(Min等人(2004)Diabetologia4775-81)中相对低比例的长链PUFA相关。
在哺乳动物细胞中，从LA和α-亚麻酸生物合成长链必需PUFA是在一系列延长和去饱和步骤中由Δ6和Δ5不饱和酶驱动的。在缺乏胰岛素时(在未治疗的I型糖尿病的情况下)，两种酶的活性都被下调。Brenner(2003)Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids 68151-162。通过给药胰岛素纠正病症。Mercuri等人(1967)Lipids 2284-285；Suresh&Das(2003)Nutrition 19213-228。尽管已经充分研究了I型糖尿病中酶的活性，但仅有极少的数据涉及它们在II型糖尿病中的水平和活性。在本研究中，基于n-6 PUFA产物与底物比率的酶活性评估提示，尽管Δ6去饱和酶活性可能在肥胖小鼠的一些组织中增加，但所述酶的活性可能在大多数db/db小鼠的组织中减少(参见图3)。对db/db倾向的唯一例外是胰腺，其中与消瘦对照相比，评估Δ6活性增加，与在消瘦小鼠中观察到的水平相比，评估Δ6去饱和酶活性(图3D)和计算为DHA与DPA比率的Δ4不饱和度都没有显著差异。尽管评估Δ6去饱和酶活性在db/db小鼠其他组织中的显著减少与DHA水平的显著减少是一致的(图4)，但在与消瘦小鼠中的水平相比时，AA含量没有减少。而且，在本文分析的大多数组织中，甘油三酯和磷脂部分之间缺少区别，这使得难以确定LA或α-亚麻酸的增加是否仅仅来自甘油三酯的增加，后者利于短链PUFA的积累。在ob/ob肝中，仅仅在甘油三酯部分出现所积累的脂质。
不过，在II型糖尿病中，EFA组织含量的变化能够对II型糖尿病的预后具有一些长期影响。一方面，在严重NIDDM中缺乏的长链PUFADHA是二十二碳三烯和resolvin的一个主要前体，二十二碳三烯和resolvin对于分辨急性和慢性炎症(Hong等人(2003)J.Biol.Chem.27814677-14687)、以及对于涉及不适当活化的自身免疫响应的疾病是有益的。Calder(1997)Ann.Nutr.Metab.41203-204。另一方面，显示通过15-脂氧化酶-1，13-S-羟环十八碳二烯酸的作用，从LA获得的脂质基分子是凋亡剂。Shureiqi等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA1009968-9973；Nixon等人(2004)Prostaglandins Leukot.Essent.FattyAcids 707-15。总结起来，DHA的减少以及LA的增加可能有助于增强与眼相关的一些糖尿病长期并发症和骨骼肌伤口愈合不良。最近，Brenner与合作者(Brenner等人(2003)Lipids 38733-742；Montanaro等人(2003)Lipids 38827-832)公布的研究显示，在两种其他II型糖尿病模型动物的肝微粒体中，Δ6和Δ5去饱和酶活性增加。
在本文研究的遗传糖尿病ob/ob小鼠中，只有肝-PL部分中Δ6去饱和酶活性的评估值与II型糖尿病模型动物大鼠中的真实酶活性测量一致。
FA代谢是细胞特异性的，本研究中考虑的硬脂酰辅酶A去饱和酶和Δ6去饱和酶活性都是估计值。因此，在从3组C57BL小鼠采集的组织中，确定和比较参与脂质动态平衡的酶表达和活性的真实水平是有益的。在基于相同的C57BL-基因型并以相同饮食喂养的消瘦、肥胖和糖尿病小鼠的组织中，脂质含量和组成存在明显区别。因此，除了眼外，在遗传肥胖小鼠的所有组织中都存在SFA和MUFA的积累。在具有更严重NIDDM形式的db/db小鼠中，其与几种II型糖尿病的长期并发症相关，肝缺少脂质积累，MUFA子类的脂肪酸积累限于眼、脂肪组织和骨骼肌。NIDDM的轻微形式和严重形式都与PUFA在骨骼肌中的积累相关，但短链PUFA是严重NIDDM中的增加的主要原因。II型糖尿病组织脂质中的这些反常(distortion)可以定义该疾病的病理生理学。
实验2-提取物的制备和给药动物研究材料和方法萝芙木-橙浸剂的植物材料和制备在尼日利亚北部伊多州的Auchi和Ihievbe(位于赤道的北纬70和东经60 20′)，收集催吐萝芙木嫩茎上附着的叶子和酸橙的新鲜果实。在大铝罐中，将洗过的干燥叶部合并(总重400g)与四份完整的酸橙果实(总湿重2kg)以交替的层排列。然后用8升自来水覆盖植物材料，煮沸，以低热慢煮1h。将所得金色液体冷却到室温，通过粗滤器过滤。用3升水漂洗用过的(spent)植物材料，按前述煮沸，将所得的茶也过滤，与最早收集的第一批汇合，在-20℃冷冻。总收率典型地为7.5升。将汇合的植物提取物冻干，收率典型地为从1升中得到12g干提取物。
动物模型和居住条件在治疗实验中所用的实验动物是雄性近交繁殖的糖尿病C57BL/KsBom-db小鼠。该小鼠的特征是肥胖、饮食过多、短暂的高胰岛素血症、胰腺β细胞随年龄退化和高血糖症。由于在这些小鼠中观察到的胰岛素抗性，认为它们是II型非胰岛素依赖型糖尿病的模型。已经确定db基因可编码在下丘脑表达的莱普亭受体的一种不同的小鼠形式。Lee等人(1996)Nature 379632-635。莱普亭是由脂肪细胞分泌的激素，它对许多身体系统，包括生殖和代谢具有多种效应。Chehab等人(1996)Nature Genetics 12318-320。莱普亭的总体缺乏或机体对该蛋白的效应的抵抗能导致发展严重的肥胖。Ahima等人(1996)Nature 382250-252。当实验动物5周大时购买它们，用标准Altromin小鼠/大鼠饮食喂养，直至它们11周大，此时开始治疗。在治疗过程中，通过用缺乏碳水化合物和脂肪的Altromin C1009饮食喂养，使实验和对照动物均受到热量限制。
对于毒性实验，在消瘦的6周和11周大的C57BL/6J近交繁殖小鼠、以及消瘦的6周大的远交繁殖NMRI小鼠上测试萝芙木-橙浸剂。在毒性实验的过程中，用Altromin 1320标准小鼠/大鼠维持饮食喂养动物。
所有动物均购自Bomholtgaard Breeding and Research Centre Ltd.，Ry，Denmark；以每组4只/笼居住，处于受控的环境条件下(温度25±1℃，相对湿度55±5％，12h黑暗和12h光线循环，换气为10次/h)。使动物能自由接近水和上面规定的饲料。居住和护理依照国家指导原则，Danish National Animal Ethics Committee批准了本研究。依照由Danish Animal Experimental Inspectorate批准的指导原则开展本研究和所有程序。
毒性实验推荐的最大人用剂量为3杯普通饮用杯/天。在平均体积为750ml/70kg体重的基础上，给每kg小鼠给药来自770ml的干提取物，相当于70倍人每日剂量。70倍测量使小鼠体内的代谢速率比人体内快10倍，产生超剂量的额外因子为7。使用小鼠管饲法，在一次剂量中通过口服给药浓缩的提取物。在给药后，连续2小时观察动物，使它能随意到达水和食物，每2天监测体重增加或损失，以及每笼的食物和水摄取。每周还使用Boerhinger Mannheim(Reflolux S)棒监测对照和实验组的未禁食血糖含量。
治疗方案在6周内，使用小鼠管饲法，以0.5ml的总体积，每天给糖尿病小鼠口服应用相当于10倍最大人用每日剂量的植物提取物。在药物或水给药后1小时，每天观察所有动物的总行为变化，使其自由接近水和食物，每2天监测体重、食物和水摄取。每周还测量未禁食的血糖含量。
评价治疗的“治愈效应”和治疗后饮食的影响在萝芙木-橙治疗的常规应用中，建议患者坚持健康饮食(低糖和低脂肪)并将酒精消耗保持到最小。在严格按照上述治疗方案治疗的2组db/db小鼠中达到了治疗的“治愈效应”。所述2组中每组也由10只实验和10只对照小鼠组成。在6周的治疗期后，在5周的时间内，一组保持较差的Altromin C1009饮食，而第二组喂以较丰富的标准Altromin1314饮食，不进行进一步的治疗。
样品收集和分析在实验指定的时期结束时，用醚麻醉小鼠，通过眼眶穿刺收集血样。然后将动物处死，分割出器官。使血样在室温下凝结(约1小时)，在4℃高速离心30min后，收集干净的血清样品。在BoehringerMannheim/Hitachi分析系统上确定血液血清样品中血清葡萄糖、甘油三酯和胆固醇的含量。还使用Rat Insulin and Glucagon RIA试剂盒(LincoResearch，Inc.)确定血清胰岛素和胰高血糖素的含量。
确定动物的肾、肝、胰腺和脾重量，将这些组织的样本、以及眼睛冷冻在液氮中，在-70℃保存。
如前面实验1中所述，然后确定治疗和对照动物的眼睛的脂肪酸谱。
统计分析将数值表示为平均数±SD(有时为标准误差)。使用ANOVA(非成对t检验)，在Microsoft Excel中检验实验和对照组数据的统计学差异。认为P＜0.05的数值是显著的。
实验2-结果毒性实验在给药单个70倍人用剂量/g小鼠体重后，在最初一小时，观察到动物非常安静。在摄取药物后的第二小时，观察到所有的实验动物变得更加警觉。在第二天，所有的实验小鼠与对照组的小鼠一样活跃。但是，在给药植物提取物4周后，与经毒性实验的6周大C57BL/6J和NMRI小鼠相比，对照组的最终体重或器官重量、血清甘油三酯和胆固醇含量没有显著性差异。尽管在4周观察期结束时，经治疗的C57BL/6J小鼠具有显著更高的血清葡萄糖含量，但实验和对照组的血清葡萄糖数值均处于标准范围内(表2)。这个结果确证萝芙木-橙提取物对至少2个品种的年轻小鼠是无毒的。
表2毒性实验结果在单次给药70倍人每日剂量后，6周大的C57 6J和NMRI小鼠的体重、血清甘油三酯、胆固醇、和葡萄糖含量。突出了显示对照和实验小鼠之间存在显著性差异的参数。*＝P＜0.5。
与对照动物相比，在经毒性实验的11周大C57BL/6J小鼠中，治疗组的体重增加存在显著性差异(图6)。在刚刚给药提取物后，差异更显著。这在如下事实中得到了反映，即在观察期间，与对照组相比，治疗组吃得较少且喝得较少(图7A和7B)。由于在4周观察期结束时，与其同窝出生的对照小鼠相比，经毒性实验的较老C57BL/6J小鼠显示出统计学显著性更小的平均肝重量和更高(虽然处于标准水平)的血清葡萄糖含量(参见表4)，可以推断尽管植物提取物对较老的小鼠无毒，但它可能影响较老年小鼠肝中的一些代谢过程。
表3毒性实验结果在单次给药70倍人每日剂量后，11周大的C57 6J小鼠的身体和器官重量、血清甘油三酯、胆固醇、和葡萄糖含量。突出显示了对照和实验小鼠之间存在显著性差异的参数。*＝P＜0.5。
经治疗糖尿病小鼠的体重损失在治疗实验中，在转移至较差的饮食后，治疗和对照db/db小鼠都损失了一些体重。但是，治疗组的体重损失显著高于在对照组中观察到的体重损失(参见图8)。这可能已经出现了，因为与其同窝出生的对照小鼠相比，经治疗小鼠喝得较少且吃得较少(参见图9A和9B)。
经治疗小鼠显示血糖量正常和脂肪代谢的信号在6周的治疗期结束时，与对照小鼠的数值相比，治疗组显示血清葡萄糖水平更接近正常范围。有趣的是，治疗组还显示显著更高的血清甘油三酯数值，尽管两个组都仍然具有非常高的血清胰岛素和胰高血糖素水平(参见表3)。与未治疗的对照相比，血清甘油三酯的增加与经治疗小鼠眼睛中总脂肪酸含量减少36％是一致的(参见图10A)。具体地，总脂肪酸含量的减少反映在总饱和脂肪酸、MUFA和PUFA分别减少25％、45％和31％。经治疗小鼠眼睛中PUFA含量的减少似乎主要是由于亚油酸含量减少了62％。与其未治疗的同窝出生对照小鼠相比，在经治疗的小鼠中，随着脂肪酸含量的这些显著减少，评估硬脂酰辅酶A去饱和酶活性减少33％，评估Δ6去饱和酶活性增加72％。在MicrosoftExcel中列出治疗和未治疗对照小鼠眼睛样品的每种脂肪酸数量(表示为每mg组织中总脂肪酸的％)，如附录I所示。
治疗后饮食对“治愈”的影响在5周的治疗后观察期结束时，当与喂以相同饮食的经治疗小鼠的数值相比时，保持差Altromin C1009饮食的对照小鼠具有更低的平均体重、血清葡萄糖、甘油三酯和胰岛素数值。有趣的是，在经治疗小鼠中平均胰腺重量显著更高(参见表4)，这意味着与低热量饮食的组合治疗可能已经减慢了胰腺β细胞的退化，所述退化是C57BL/KsBom-db小鼠的特征。相反，在治疗后喂以更丰富的标准Altromin 1314饮食的小鼠体重迅速增加，从而在5周观察期结束时，在这组经治疗小鼠与对照小鼠之间，血清葡萄糖和甘油三酯数值没有差异。
实验2-讨论在近交繁殖和远交繁殖消瘦小鼠中研究了萝芙木-橙植物药的潜在毒性效应。除了在给药药物的第一天内活动减慢，在单次给药70倍人每日剂量时，在6周大的消瘦远交繁殖NMRI小鼠或近交繁殖C57BL/6J小鼠中，在总反应和所监测的参数中没有显著性差异。催吐萝芙木具有强烈的镇静效应，被常规用于使精神病患者平静下来(Sofowora(1982)Medicinal Plants and Traditional Medicine in Africa，Wiley&Sons，Winchester，pp 75-76)。因此，单次高剂量诱导的睡意可能来自由催吐萝芙木部分贡献的这些镇静化合物。但是，给11周大的C57BL/6J小鼠应用相同的剂量会产生更高的血清葡萄糖和更小的肝重量。血清葡萄糖仍然在正常范围内，在实验组观察到的更小肝重量暗示，尽管高剂量的提取物对较老的小鼠无毒，但它可能影响一些代谢过程，这些过程可能在更年轻的小鼠中不存在或不重要。
在6周治疗期结束时，经治疗的db/db小鼠显示出中等的体重损失并且血糖正常化。与治疗前的状态相比，在每周的葡萄糖耐受实验中，对照和实验小鼠都显示出了改善。这暗示着葡萄糖清除的改善可能是由Altromin C1009饮食引起的热量限制的结果。该饮食的热量和营养学信息可在网址为altromin.de/cgi-bin/diets2.cgi？ansichtsid＝C10009&ansicht＝normal&diaetart＝diaetart＝sonder的网页中获得。比较可在网址altromin.de/cgi-bin/diets2.cgi？ansichtsid＝1320&ansicht＝normal&diaetart＝standard中获得的标准Altromin 1320饮食。然而，经治疗小鼠的最终血清未禁食葡萄糖显著更低。因此，除了仅仅由热量限制获得的结果以外，治疗必然已经改进了经治疗小鼠的胰岛素敏感性。
由于小鼠没有被喂以脂质补充剂，所以将治疗db/db小鼠中血清甘油三酯的显著增加解释为由于内部贮存的脂肪酸代谢的增加。这个假设受到治疗小鼠眼睛内脂肪酸沉积显著减少的支持(参见图10A)。已经报道酸橙包含有助于体重损失和增加产热的β拮抗剂。Preuss等人(2002)J.Med.33247-264。β拮抗剂在过氧化物酶体增殖剂激活的受试者(PPAR)上发挥作用，以减少肥胖动物体内的血浆脂质和胰岛素血症。Grimaldi(2003)Biochem.Soc.Trans.311130-1132。PPAR是饮食脂肪和血清脂蛋白的分子审查员，它对于控制许多分子过程和代谢过程很重要，这些过程包括发展、增殖、分化和脂质动态平衡。该数据以及前面实验1产生和报告的数据确实支持如下假设，即萝芙木-橙治疗能反转糖尿病脂质动态平衡中的这种趋势。脂肪酸从内部沉积物中的释放由甘油三酯脂酶介导。然后通过由蛋白激酶运行的cAMP刺激的磷酸化激活甘油三酯脂酶。然后通过血流，将所释放的脂肪酸运输到组织中，通过线粒体中的β-氧化并借助于肉碱而被处理。尽管还没有确定植物提取物中活性化合物的结构，但成功的治疗对热量限制的依赖将暗示，这种cAMP增加的状况对基于萝芙木-橙的植物药的抗糖尿病效应是可能的设定。所提出的设定还符合对β拮抗剂影响体重损失和产热提出的设定。Preuss等人(2002)J.Med.33247-264，该数据显示在治疗后，硬脂酰辅酶A去饱和酶活性显著减少。
来自实验1的结果显示，II型糖尿病的几个组织显示缺乏长链多不饱和脂肪酸、二十二碳六烯酸。在用植物提取物治疗遗传糖尿病小鼠后，本研究所报告的Δ6去饱和酶活性的评估增加可能导致产生长链多不饱和脂肪酸，它对组织炎症的正确响应和分辨很重要。如果相同的过程发生在人体内，则它能够解释治疗与治愈的关系，如在曾经用过该药物的尼日利亚糖尿病患者中报告的那样。但是，眼中脂肪酸含量的减少对所有脂肪酸类别都是显著性的。这意味着尽管亚油酸含量减少，同时Δ6去饱和酶活性的评估增加，但不存在长链PUFA的积累。事实上，在经治疗的动物体内，存在显著但较小的花生四烯酸减少。由于眼睛脂质没有被分离成甘油三酯和磷脂部分，所以难以确定亚油酸的减少是否主要来自甘油三酸库(triacylglyceric acid pool)。事实上，花生四烯酸部分缺少增加将支持如下假设，即亚油酸库随着所积累的MUFA而被动员。因此，考虑到实验动物被喂以非常差的饮食，如果该治疗与PUFA饮食补充组合，结果可能看起来不同。
当在治疗后将动物在热量限制下再保持5周的时间时，仍然存在脂质动员的证据，如通过增加的血清三甘油酯含量作出的判断。有趣的是，这与该小鼠品种典型的“脆弱”db/db胰腺保护是一致的。
表4在6周的治疗和C1009 Altromin饮食后，萝芙木-橙提取物对近交繁殖糖尿病C57BL/Ks-db小鼠的身体和器官重量、血清甘油三酯、胆固醇、葡萄糖、胰岛素和胰高血糖素的影响。将胰岛素和胰高血糖素的数值分别表示为ng ml-1胰岛素±SEM和pg ml-1胰高血糖素±SEM。突出了显示对照和实验小鼠之间存在显著性差异的参数。*＝P＜0.5。
表5在治疗后5周，给C57BL/Ks-db小鼠保持差C1009和更丰富的标准1314饮食，不进行其他药物给药，饮食对所述治疗的“治愈效应”的影响。将胰岛素和胰高血糖素的数值分别表示为ng ml-1胰岛素±SEM和pg ml-1胰高血糖素±SEM。突出了显示对照和实验小鼠之间存在显著性差异的参数。*＝P＜0.5。
实验3人类研究在开始萝芙木-橙治疗时，“A”为72岁老年男性。在约9年前，即他在约63岁时视力混浊，然后被诊断为II型糖尿病。他接受3片格列吡嗪的每日剂量，以及用于高血压的药物。他的体重为91kg，登记的HbAlc 8.9(参考值4.2-6.3)、C-肽1.89nmol/1(参考值0.15-1.10)，未禁食的血糖为13.7％。
该患者不满意他采用的抗糖尿病药物，因为他感觉到昏睡和经常的虚弱以及疲劳。A还难以保持体重。在开始治疗前3天他停用格列吡嗪，在4个月内每天服用750ml(即普通的饮用杯)萝芙木-橙浸剂。他吃得很健康，避免富含脂肪的食物、糖和酒精。他每天监测血糖和血压。附图10显示在治疗过程中A的血糖水平进程。
在服用药物的最初2周结束时，他将锻炼水平从每天和狗在公园散步2次增加到在公园里散步2次并慢跑3km。他报告了健康的感觉、更好的视力和静脉中几个结节的消失。他开始减少体重，在治疗结束时体重78kg。在进入萝芙木-橙治疗2个月后，他的医生允许他脱离高血压药物。他享受了美好的2002冬天至2003夏天，即在服用和停用药物后一年。他连续锻炼并保持健康的饮食，并且禁止饮酒，除了偶尔的一杯或两杯酒。但是，存在轻微的缺点，因为他在2003年9月的最初2周登记了一些高血糖症。他抱怨是由于暑假期间许多的社交活动。在2003年11月，他采用了两周的萝芙木-橙提取物治疗。然后稳定在体重75kg，在需要时每天服用一片格列吡嗪，在75岁仍然每天带着狗进行每日3km的慢跑和散步。
上述结果显示，如果结合锻炼和限制热量，所述药物具有“治愈”的抗糖尿病效应。但是，如果患者不继续实践健康的生活方式，仍存在II型糖尿病复发的可能。
尽管为了清楚的理解，通过说明和示例详述了上述发明，但本领域技术人员会明白，可实践某些变化和修饰。因此，本说明书和实施例不应理解为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书描绘。
附件权利要求
1.一种生物学活性组合物，其基本上由从催吐萝芙木(Rauvolfiavomitoria)和酸橙(Citrus aurantium)中获得的提取物组成。
2.权利要求1所述的提取物，其中所述提取物从催吐萝芙木的叶部和/或根以及酸橙的果实中分离。
3.一种组合物，其包括权利要求1所述的提取物和载体。
4.权利要求3所述的组合物，除了所述提取物外，还包括有效量的试剂，所述试剂降低组织脂肪酸含量并降低血糖水平。
5.一种用于分离权利要求1所述的提取物的方法，所述方法包括过滤从煮沸的催吐萝芙木叶部和酸橙果实中获得的液体提取物。
6.一种用于治疗或改善受试者中异常升高的组织脂肪酸含量和血糖水平的症状的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1所述的组合物。
7.权利要求6所述的方法，其还包括减少所述受试者的每日热量摄取。
8.权利要求6所述的方法，其中所述受试者中异常升高的血糖的症状选自II型糖尿病、异常的硬脂酰辅酶A去饱和酶活性、饮食过多、异常的脂质动员、受试者眼睛的异常脂肪酸谱、溃疡和糖尿。
9.权利要求8所述的方法，其中所述受试者为动物。
10.权利要求9所述的方法，其中所述动物选自宠物、农场动物或人类患者。
11.一种用于治疗或改善与受试者中异常升高的血糖水平有关的病症的症状的试剂盒，其包括治疗有效量的权利要求1所述的提取物和使用说明。
12.权利要求11所述的试剂盒，其中所述病症选自受试者中的血糖，选自II型糖尿病、异常的硬脂酰辅酶A去饱和酶活性、饮食过多、异常的脂质动员、受试者眼睛的异常脂肪酸谱、溃疡和糖尿。
全文摘要
本发明提供了用于从催吐萝芙木的叶部(叶和茎)和/或根以及酸橙的果实中提取药用活性部分的方法。在一方面，所述方法要求通过过滤催吐萝芙木叶部和/或根以及酸橙果实的煮沸茶并浓缩上清液，从所述煮沸的茶中提取活性部分。在一个实施方案中，通过冻干上清液浓缩所述部分。通过向受试者给药治疗有效量的所述提取物或包含所述提取物的药物组合物，所述部分用于治疗与受试者中异常升高的葡萄糖水平相关的疾病。所述疾病包括但不限于II型糖尿病、异常的硬脂酰辅酶A去饱和酶活性、饮食过多、异常的脂质动员、受试者眼睛的异常脂肪酸谱、溃疡和糖尿。
文档编号A61P7/00GK101094683SQ200580045476
公开日2007年12月26日 申请日期2005年10月26日 优先权日2004年10月29日
发明者J·坎贝尔－托夫特 申请人:J·坎贝尔－托夫特