抗脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗的制作方法

专利名称：：抗脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗的制作方法抗脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗本发明涉及疫苗及其用途，特别是用于脑膜炎球菌疾病(meningococcaldisease)的疫苗。此说明书中对在先发表的文件的列举或讨论不应必然理解为承认该文件是现有技术的一部分或公知的一般知识。在此收入说明书中所列举的文件作为参考。微生物感染一直是对人类和动物健康的严重威胁，特别是在许多病原性微生物，特别是细菌，对于抗微生物剂诸如抗生素有抗性或者可变得有抗性的情况下更是如此。接种疫苗提供了抗击微生物感染的替代方法，但是常常难以鉴定适用于疫苗的免疫原，它们应当是安全的且对病原性微生物(特别是遗传多样的微生物)的多种不同分离林有效。虽然有可能开发用基本上完整无损(intact)的微生物作为免疫原的疫苗，诸如通常在决定毒力的基因中包含一处或多处突变的减毒活细菌，但是并非所有微生物都适用于此方法，而且并非总是希望将此方法用于不能总是保证安全性的具体微生物。还有，有些微生物表达能模拟宿主蛋白的分子，而这些分子是疫苗中不想要的。对开发进一步的疫苗重要的一类具体微生物是脑膜炎奈瑟氏球菌(A^wer/"we"/"g衍^s)，它引起脑膜炎球菌疾病，这是一种危及生命的感染，尽管引入了偶联的(conjugate)血清群C多糖疫苗，这种感染在欧洲、北美洲、发展中国家和其它地方仍然是儿童死亡的重要原因血清群。这是因为由血清群B抹(iVwB)引起的感染仍然流行，该菌抹表达a2-8连接的多聚唾液酸荚膜。关于脑膜炎奈瑟氏球菌的术语"血清群，，(serogroup)指在此细菌上表达的多糖荚膜。在英国引起疾病的常见血清群是B，而在非洲是A。脑膜炎球菌败血病一直维持高病死率；而且幸存者常常遗留重大心理和/或躯体残疾。在非特异性的前驱疾病后，脑膜炎球菌败血症可呈现为相应抗孩i生物疗法和所有辅助措施(follsupportivemeasures)难以治愈的爆发性疾病。因此，抗击脑膜炎球菌疾病的公众健康威胁的最好方法是预防性接种疫苗。脑膜炎球菌感染的非特异性早期临床征候和爆发性进程意味着治疗常常是无效的。因此，认为接种疫苗是减轻由此病原体引起的全球疾病负担的最有效策略(Feavers(2000)ABCofmeningococcaldiversity.Nature404，451-2)。用于预防脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y感染的现有疫苗基于位于细菌表面上的多糖荚膜(Andersonetal(1994)SafetyandimmunogenicityofmeningococcalAandCpolysaccharideconjugatevaccineinadults.InfectI誦un.62，3391-33955;Leachetal(1997)InductionofimmunologicmemoryinGambianchildrenbyvaccinationininfancywithagroupAplusgroupCmeningococcalpolysaccharide-proteinconjugatevaccine.JInfectDis.175，200-4;Liebermanetal(1996)Safety.andimmunogenicityofaserogroupsA/CNeisseriameningitidisoligosaccharide-proteinconjugatevaccineinyoungchildren.Arandomizedcontrolledtrial.J.AmericanMed.Assoc.275,1499-1503)。通向抗血清群B感染的疫苗的进展更为困难，因为它的荚膜，即a2-8连接的唾液酸的同聚物，在人体中是相对较差的免疫原。这是因为它共享在人细胞粘附分子N-CAM1上表达的表位(Finneetal(1983)Antigenicsimilaritiesbetweenbraincomponentsandbacteriacausingmeningitis.Implicationsforvaccinedevelopmentandpathogenesis.Lancet2,355-357)。事实上，产生抗血清群B荚膜的免疫应答可能实际上证明是有害的。鉴于此，仍然需要用于预防脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B感染的新疫苗。抗脑膜炎球菌疾病的保护作用的最可靠(validated)免疫学关联测定(correlate)是血清杀菌测定法(SBA)。SBA评估血清中抗体(经常是IgG2a亚类)介导补体在细菌细胞表面上沉积、组装膜攻击复合物、和裂解细菌的能力。在SBA中，将已知数目的细菌暴露于具有指定补体来源的血清的连续稀释液。测定存活细菌的数目，将SBA定义为介导50%杀伤的最高血清稀释度的倒数。SBA可预测抗血清群C感染的保护作用，它被广泛用作抗iVmB感染的免疫力的代名词(surrogate)。重要的是，在疫苗的临床前评估中，SBA是免疫力的现成标志物，它提供了临床试验的合适终点。A^B疫苗开发的大多数努力致力于确定有效的蛋白亚基。"反向疫苗学"(Reversevaccinology)中有一项重大投资，其在基因组序列中寻找有可能在表面表达为异源抗原的蛋白，并测试它们在动物中产生有意义的应答的能力。然而，此方法受到如下限制l)用于预测表面表达的抗原的计算机算法，2)未能表达许多潜在免疫原，和3)对鼠免疫应答的完全依赖性。成功的疫苗的关键在于，确定针对广泛多种疾病分离抹、而不是限于具体血清群或克隆组(clonalgroup)都能引发保护作用的抗原血清群。遗传筛选方法(我们称为对免疫原的遗传筛选(GeneticScreeningforImmunogens)或GSI)被用来分离在遗传多样的微生物菌林间保守的抗原，例如，用该方法在脑膜炎球菌菌抹中分离出了这样的抗原。其做法是，用下文详述的GSI鉴定微生物抗原诸如脑膜炎奈瑟氏球菌抗原；并通过评估由重组抗原引发的免疫应答的功能和评估抗原的保护效力予以验证(参见实施例和参见PCT/GB2004/005441(2005年7月7日作为WO2005/060995公开)，在此收入作为参考)。本质上，GSI法涉及鉴定微生物多肽的方法，该多肽与遭遇该微生物的动物中的免疫应答有关，该方法包括如下步骤(l)提供该微生物的多种不同突变体；(2)使所述多种微生物突变体与已产生抗该微生物或其一部分的免疫应答的动物的抗体接触，在所述接触的条件下，一旦所述抗体与所述微生物突变体结合，则杀死该微生物突变体；(3)选出步骤(2)中幸存的微生物突变体；(4)鉴定出任何幸存的微生物突变体中包含所述突变的基因；和(5)鉴定由该基因编码的多肽。应当领会，根据鉴定这些多肽所采用的方式，将这些多肽作为抗原性多肽是高度恰当的。正如实施例中更为详细所述的，通过GSI法鉴定的具体基因是脑膜炎奈瑟氏球菌的NBM0341(TspA)，画B0338，NMB1345,NMB0738，NBM0792(NadC家族)，NMB0279，丽B2050，NMB1335(CreA),NMB2035,丽B1351(Fmu和Fmv)，NMB1574(IIvC)，画B1298(rsuA),画B1856(LysR家族),画B0119,画B1705(rfak),NMB2065(HemK),NMB0339，NMB0401(putA)，NMB1467(PPX)，NMB2056,NMB0808，NMB0774(upp)，NMA0078,NMB0337(支链氨基酸转移酶)，NMB0191(ParA家族)，NMB1710(谷氨酸脱氢酶(gdhA)，NMB0062(r化A画l),NMB1583(HisB),NMB0377,NMB0264,NMB1333,NMB1036,NMB1176，NMB1359和NMB1138基因。脑膜炎奈瑟氏球菌的基因组序列可从例如TheInstituteofGenomeResearch(TIGR);www.tigr.org获得。尽管这些基因构成已经测序的基因组的一部分，就发明人所知，它们尚未分离，由它们编码的多肽尚未制得(且尚未分离)、而且没有迹象表明它们所编码的多肽可用作疫苗的成分。因此，本发明包括上文和实施例中所述的分离的基因、及变体和片段、及此类变体和片段的融合物，还包括上述基因编码的多肽、及其变体和片段、及此类片段和变体的融合物。下文更详细的描述了变体、片段和融合物。优选的是，上文给出的基因的变体、片段和融合物是编码多肽的那些，所述多肽能产生抗脑膜炎奈瑟氏球菌的中和抗体。类似的，优选的是，对于上文已给出了序列的那些多肽，它们的变体、片段和融合物是产生抗脑膜炎奈瑟氏球菌的中和抗体的那些。中和抗体可以在有免疫系统的任何动物中生成，例如大鼠、小鼠或兔。本发明还包括分离的多核苷酸，其编码实施例中给出了序列(优选分离的编码区)的那些多肽或编码变体、片段或融合物。本发明还包括包含此类多核苷酸的表达载体和包含此类多核苷酸和载体的宿主细胞(详见下文)。实施例中所述多肽是通过本发明方法鉴定得到的抗原。Sambrook&Russell(2001)MolecularCloning,alaboratorymanual,第三版,ColdSpringHarborlaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,在jt匕4t入作为参考。基因的变体可通过例如在其它微生物中或在该微生物的其它抹中鉴定相关基因，及克隆、分离或合成该基因来制备。典型的是，基因的变体是与上文给出的基因具有至少70%序列同一性，更优选至少85%序列同一性，最优选至少95%序列同一性的那些。当然，可容忍替代、删除和插入。一种核酸序列和另一种之间的相似性程度可使用UniversityofWisconsinComputerGroup的GAP程序来测定。基因的变体还指在严格条件下与该基因发生杂交的那些。所谓"严格"是指，将基因固定在膜上，探针(在本例中是长度>200个核苷酸)在溶液中，使基因与探针杂交，固定的基因/杂交的探针在0.1xSSC中于65。C清洗10分钟。SSC指0.15M氯化钠/0.015M柠檬酸钠。可制备基因(或变异基因)的片段，例如是完整基因的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。优选的片段包括整个编码序列或部分编码序列。变体和片段可以与其它无关多核苷酸融合。多核香酸编码有免疫原性的多肽，所述多肽与遭遇所述微生物的动物的抗体反应，所迷微生物是鉴定出该基因的微生物。抗原可以是由上文所鉴定的基因编码的多肽，该多肽的序列可从该基因序列轻易推导。在其它实施方案中，抗原可以是所鉴定的多肽的片段，或者可以是所鉴定的多肽的变体，或者可以是所述多肽或片段或变体的融合物。因此，本发明的一个具体方面提供了包含选自SEQIDNo2,4，6，8，10,12，14,16，18,20,22，24,26,28,30,32,34，36,38,40，42,44,46，48,50，52，54,56,58,60,62,64,66，68中任一的氨基酸序列的多肽；或其片段或变体、或此类片段或变体的融合物。因此，本发明提供了下列分离的蛋白、或其片段或变体、或这些的融合物如下文所述的NMB0341,NMB1583,NMB1345,丽B0738，NMB0792,雨B0279,画B2050，NMB1335,画B2035,雨B1351,丽B1574,丽B1298,雨B1856，画B0119,画B1705,NMB2065，画B0339,画B0401,画B1467,NMB2056,NMB0808,NMB0774，画A0078,NMB0337，画B0191，NMB1710,画B0062，薩B1333，NMB0377，NMB0264,NMB1036,薩B1176，NMB1359和画B1138。可制备所鉴定的多肽的片段，例如是完整多肽的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90°/。。典型的，所述片段是至少10、15、20、30、40、50、IOO个或更多氨基酸，但少于500、400、300或200个氨基酸。可制备多肽的变体。"变体"包括保守或是非保守的插入、删除和替代，其中此类变化基本上不改变所述蛋白的正常功能。"保守替代"指诸如Gly，Ala;Val,lie,Leu;Asp,Glu;Asn,Gin;Ser,Thr;Lys,Arg;及Phe,Tyr组合。此类变体可使用众所周知的蛋白工程和定点诱变方法来制备。一类具体的变体是由上述变异基因编码的那些，例如来自相关微生物或该微生物其它抹的那些。典型的，所述变异多肽与使用本发明方法所鉴定的多肽具有至少70%序列同一性，更优选至少85%序列同一性，最优选至少95%序列同一性。两种多肽之间的百分比序列同一性可使用合适的计算机程序来测定，例如UniversityofWisconsinGeneticComputingGroup的GAP禾呈序,应当4页会百分比同一性是在将多肽序列进行最佳比对后计算得出的。或者可使用ClustalW程序(Thompsonetal,(1994)A^c/e/c爿czAi"22，4673-80)来进行比对。所用参数可以如下快速成对比对参数K-元组(tuple)(词(word))长(size);1,窗长(windowsize);5，缺口罚分(gappenalty);3，顶端对角线数(numberoftopdiagonals);5。评分方法(Scoringmethod):x百分比。多重比对参数缺口打开罚分(gapopenpenalty);10,缺口延伸罚分(gapextensionpenalty);0.05。评分矩阵(Scoringmatrix):BLOSUM。融合物可以是与任何合适多肽融合的融合物。典型的，所述多肽是能够增强对与之融合的多肽的免疫应答的那些。融合配偶可以是便于纯化的多肽，例如通过构成可在例如亲和层析柱中固定的部分(moiety)的结合位点而便于纯化的那些。因此，融合配偶可以包含寡组氨酸或结合钴或镍离子的其它氨基酸。它还可以是单克隆抗体的表位，诸如Myc表位。正如上文所讨论的，变异多肽或多肽片段、或这些的融合物典型的是产生抗脑膜炎奈瑟氏球菌的中和抗体的那些。由此，本发明还包括制备如上所述抗原的方法，及通过该方法获得的或可通过该方法获得的抗原。可以如本领域众所周知的，将本发明的多核苷酸克隆到表达载体等载体中。此类载体可见于宿主细胞，诸如细菌、酵母、哺乳动物和昆虫宿主细胞。本发明的抗原可在合适的宿主细胞中由多核苷酸容易地表达，并从中分离，供疫苗中使用。典型的表达系统包括商品化的pET表达载体系列和大肠杆菌宿主细胞，诸如BL21。表达的多肽可通过本领域知道的任何方法来纯化。方便的是，将抗原与如上所述结合亲和柱的融合配偶融合，并使用该亲和柱(例如镍或钴亲和柱)纯化该融合物。应当领会抗原或编码抗原的多核苷酸(诸如DNA分子)特别适于用于疫苗。在那种情况中，抗原从生成该抗原的宿主细胞中纯化(或者在通过肽合成来制备抗原的情况中，从该合成的任何污染物中纯化抗原)。典型的是，在抗原所含有的污染性物质少于5%，优选少于2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%之后，将抗原配制到疫苗中。抗原最好是基本上不含热原。因此，本发明还包括含有抗原的疫苗，及制备疫苗的方法，包括将抗原与磷酸緩冲盐水等合适载体组合。本发明的抗原可以单独施用，但优选将其与一种或多种可接受的载体一起配成药用配制剂。载体必须是"可接受的"，这是指，载体应与本发明的抗原相容、且对该载体的受体无害。典型的是，载体是无菌且不含热原的水或盐水。疫苗还可包含佐剂。优选对患者进行主动免疫接种(activeimmunisation^在此方法中，将一种或多种抗原制成含有合适佐剂和载体的免疫原性配制剂，并以已知方式施用于患者。合适的佐剂包括弗氏完全或不完全佐剂，胞壁酰二肽，EP109942、EP180564和EP231039的"Iscoms"，氢氧化铝、皂苷、DEAE-葡聚糖、中性油(诸如miglyol)、植物油(诸如花生油)、脂质体、Pluronic多元醇或Ribi佐剂系统(参见例如GB-A-2189141)。"Pluronic，，是注册商标。待免疫的患者是需要获得抗微生物感染的保护的患者。本发明还包括药用组合物，其包含本发明的多肽、或其变体或片段、或这些的融合物、或者本发明的多核芬酸、或其变体或片段、或这些的融合物及如上文所讨论的药学可接受的载体。前述本发明抗原(或编码此类抗原的多核苷酸)或其配制剂可通过任何常规方法来施用，包括口服和肠胃外(例如皮下或肌肉内)注射。治疗可以由单剂或持续一段时间的多剂组成。应当领会本发明的疫苗，根据其抗原成分(或多核苷酸)，可用于人用药物和兽用药物领i或。由微生物引起的疾病在许多动物如家畜中是已知的。本发明的疫苗，在含有适宜的抗原或编码抗原的多核苷酸时，可用于人，但也可用于例如牛、绵羊、猪、马、犬和猫，及用于家禽诸如鸡、火鸡、鸭和鵝。因此，本发明还包括给个体接种疫苗以抵抗微生物的方法，该方法包括给个体施用如上所述的抗原(或编码抗原的多核苷酸)或疫苗。本发明还包括如上所述的抗原(或编码抗原的多核苷酸)在制备给个体接种的疫苗中的用途。本发明的抗原可以用作疫苗中的唯一抗原，或者它可以与针对相同或不同疾病微生物的其它抗原联合使用。关于脑膜炎奈瑟氏球菌，所得到的对7VwB有反应性的抗原可以与抗A和/或C血清群的疫苗中所使用的成分联合。它还可以方便的与抵抗嗜血菌(/7aemo;/n7ws)和/或肺炎链球菌OS^eptococcwj7"ewwow'ae)而提供保护的抗原性成分联合。另外的抗原性成分可以是多肽，或者它们可以是其它抗原性成分，诸如多糖。多糖也可用于增强免疫应答(参见例如Makelaetal(2002)ExpertRev.Vaccines1，399-410)。在上文疫苗和疫苗接种方法中特别优选的是，抗原是由上文(和实施例中)所述任何基因编码的多肽或者上述变体或片段或融合物(或编码所述抗原的多核苷酸)，而且需要接种疫苗进行抵抗的疾病是脑膜炎奈瑟氏球菌感染(脑膜炎球菌疾病)。下面将通过如下非限制性实施例更为详细的描述本发明。实施例l:脑膜炎奈瑟氏球菌中对免疫原的遗传筛选(GSI)GSI在此实施例中的应用包括，在脑膜炎奈瑟氏球菌的插入突变体文库中，筛选对杀菌性抗体的杀伤作用较不敏感的菌抹。GSI详见PCT/GB2005/005441(2005年7月7日作为WO2005/060995公开)。在iVwB的已测序分离抹MC58的突变体文库中，通过用抗荚膜阴性相同抹(acapsuleminusofthesamestrain)的小鼠血清进行筛选，我们证明了GSI的有效性。总共40,000个突变体用经同源菌抹腹膜内免疫小鼠而产生的血清进行分析；此血清抗野生型菌抹的SBA是约2，000。在将文库暴露于1:560稀释的血清(它杀死所有野生型细菌)时检测存活的突变抹。为了确定存活突变抹中的转座子插入就是抵抗杀伤作用的能力的原因，将这些突变回交(backcross)到亲本林中，并证实了回交突变抹在SBA中比野生型对杀伤作用更有抵抗力。通过标志获救(markerrescue)分离转座子插入位点，以此检查受该转座子影响的基因的序列。我们发现了其中两种受影响的基因TspA和NMB0338。TspA是引发强CD4+T细胞应答的表面抗原，可被患者血清识别(Kiziletal(1999)InfectImmun.67，3533-41)。NMB0338基因的功能在此之前是未知的，其编码据预测含有两个跨膜结构域且位于细胞表面的多肽。由NMB0338编码的氨基酸序列是FGMFALFGRLLSLRGENGRLRAEVKKNARLTGKELTAPPAQNAPESTKQP除了公共健康的要求以外，将MwB用于GSI有数项实用优势a)这种细菌可进行遗传跟踪(tractable);b)通过效应物免疫机制对该细菌造成的杀伤可直接测定；c)可获得三种具有不同血清群和克隆谱系的分离林的基因组序列(分别是血清群A的IV-A、血清群B5的ET-5和血清群C的ET-37);和d)有详细表征的临床资源可供此项工作所用。GSI有两项潜在限制。第一，杀菌性抗体的靶物可能是必不可少的。但这不太可能，因为WwB中杀菌性抗体的所有已知靶物都不是必不可少的，而且当前许可的细菌疫苗无一靶向必不可少的基因产物。第二，血清中含有抗多种抗原的抗体，失去单一一种抗原可能不影响突变抹的存活。我们早就证明，甚至在用抗同源菌林的血清进行筛选的过程中，使用适宜稀释度的血清仍然鉴定到相关抗原。GSI的主要优点在于1)高通量步骤不涉及过分要求技术的或昂贵的流程(诸如蛋白表达/纯化和免疫接种)；和2)试验中可使用人样品，而非仅仅依赖于动物数据。GSI可迅速查明表面蛋白中引发杀菌活性的那些蛋白，从而可以更详细分析相对较少的候选物。1.使用GSI鉴定杀菌性抗体的靶物使用抗异源菌林的鼠血清、并且使用人血清来鉴定交叉反应性抗原。所述血清得自i)用异源菌抹经全身性途径免疫的小鼠所迷菌林的选择和/或构建使得避免具有相同免疫型(immunotype)和亚血清群(sub-serotype)的分离才朱；ii)感染了脑膜炎奈瑟氏球菌已知分离抹的患者的急性期和恢复期血清(由NorthwickPark的DrR.Wall提供)；iii)接受NmB分离林H44/76的指定外膜泡(outermembranevesicle,OMV)疫苗的志愿者的免疫前和免疫后样品(由MeningococcalReferenceLaboratory提供)。这些血清来源都具有具体的优点和缺点。_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>动物的血清，对MC58突变林文库进行筛选。我们证明，用減毒活iVmB免疫接种引发了抗血清群A和C菌抹的交叉反应性杀菌性抗体应答。通过被破坏的基因的标志获救，鉴定了在有人血清时存活增强的突变林中不存在的抗原。b)鉴定了赋予针对异源血清杀伤作用的抵抗力的突变，并且确定了该基因产物是否也是已测序的血清群A和C菌抹(分别是Z2491和FAM18)的杀伤靶物。在基因组数据库查找这些基因的同系物。当存在同系物时，从MC58突变^^朱扩增转座子插入，并将其转化导入血清群A和C菌抹。比较每个血清群的突变抹和野生型菌抹的相对存活。因此，GSI可快速给出关于杀菌活性的靶物在脑膜炎奈瑟氏球菌任何血清群、免疫型和亚血清群的不同菌抹中是否保守、且是否可达到(accessible)的信息。c)使用恢复期病人或接受异源OMV疫苗(衍生自H44/76)的人的血清，测试能抵抗小鼠血清而存活增强的突变林。这解决靶物是否能够在人体中引发杀菌性抗体的重要问题。在其它疫苗方法中，此信息只能在按照GMP要求生产疫苗候选物之后，在临床试验的晚期耗费很多财力以后获得。优点在于，GSI是使用现有的简单技术进行的高通量分析。在人体中引发杀菌性抗体、且介导杀伤多个菌株的抗原可得到迅速鉴定，因为GSI在使用细菌菌抹和血清方面是灵活的。以与使用鼠血清选择的突变林相同的方式分析使用人血清选择的突变林。2.评估重组GSI抗原的抗体应答使用商品化载体，在大肠杆菌中表达蛋白和疫苗，所迷蛋白作为杀菌性抗体的耙物、并被恢复期患者的血清识别。通过PCR从MC58扩增相应的可读框，并连接到载体诸如pCRTopoCT或pBAD/His中，以容许蛋白分别在T7或阿拉伯糖诱导型启动子的控制下表达。从细胞总蛋白中纯化出上述重组蛋白，该过程是在镍或钴柱上通过与所述蛋白C末端融合的His标签进行的。成年新西兰白兔皮下注射25叱纯化蛋白及弗氏不完全佐剂，共两次免疫接种，其间间隔四周。在免疫接种前，通过全细胞ELISA,检查动物血清中已有的抗iVm抗体。用初始血清滴度<1:2的动物进行免疫接种实验。第二次免疫接种的两周后获取免疫接种后血清。为了确认特异性抗体已经产生，通过i)针对纯化的蛋白的Western分析和ii)使用野生型和相应突变抹(通过GSI产生)的细胞进行的ELISA,测试免疫前和免疫后血清。针对MC58(同源菌抹)，及已测序的血清群A和C菌4朱，用兔免疫血清进行SBA。试验至少进行两次，每次一式三份。将SBA〉8视为显著。所得结果提供了蛋白候选物是否能作为重组蛋白引发杀菌性抗体的证据。3.确定GSI抗原的保护功效测试所有候选物保护动物抵抗活细菌攻击的能力，因为这能在单个试-睑中评估任一方面的免疫力(细胞免疫力或体液免疫力)。我们建立了抗活细菌感染的主动免疫和保护模型。在此模型中，成年小鼠在第0天和第21天免疫，在第28天腹膜内接受活细菌攻击，为葡聚糖铁(作为补充性铁来源)中的106或107CFUMC58。该模型类似于评估Tbps免疫的保护功效的模型(Danve.etal(1993)Vaccine11,1214-1220)。未免疫动物在感染后4小时内发生菌血症，到24小时时显示出全身性疾病的征候。我们早就能够证明减毒7Vm菌抹和蛋白抗原二者抗脑膜炎球菌活菌攻击的保护功效；PorA是引发杀菌性抗体的外膜蛋白，但其抗原性变动很大，因此不是首选的疫苗候选物(Bartetal(1999)/"/ec"mmzm.67，3832-3846)。六周龄BALB/c小鼠(每组35只动物)在第0和21天皮下接受25吗重组蛋白及弗氏不完全佐剂，然后在第28天腹膜内接受106(15只动物)或107(15只动物)CFUMC58攻击。使用两种攻击剂量来检验疫苗在高和低攻击剂量的功效；在第28天从每组中剩余的五只动物及从第一次免疫接种前的五只动物获取血清，并保存于-70。C供进一步的免疫学试验。对照组的动物接受i)单独的佐剂；ii)重组的再折叠PorA;或减毒活菌抹。为了降低对照组中动物的总数，一次测试多个有五个候选物的组(组的数目=5个候选物+3个对照)。通过MannWhitneyU检验比较各组动物的存活情况。在每组15只小鼠/剂时，这些实验显示出25%的组间存活差异。对于针对攻击显示出显著保护作用的疫苗，进行重复实验以确认该发现。另外，为了确定使用候选物进行的疫苗接种还引发抵抗菌血症的保护作用，在第二次实验过程中测定菌血症的水平；在感染后22小时在经免疫和未免疫动物中采集血样(此时菌血症水平最高)。使用双尾(two-tailed)Student-T检验分析结果，以确定在接种疫苗的动物中菌血症是否显著减轻。所使用的其它材料和方法脑膜炎奈瑟氏球菌的诱变为了对脑膜炎奈瑟氏球菌的研究，通过体外诱变构建突变抹。用Tn5衍生物对脑膜炎奈瑟氏球菌的基因组DNA进行诱变，所述Tn5衍生物含有编码卡那霉素抗性的标志物和在大肠杆菌中有功能的复制起点。这些元件通过Tn5的复合(composite)末端联合在一起。用Tn5的高活性变体进行转座反应，并用T4DNA聚合酶和连接酶在有ATP和多种核香酸的条件下修复DNA。用该修复的DNA将脑膜炎奈瑟氏球菌转化成卡那霉素抗性菌。Southern分析证实，每个突变抹只包含所述转座子的单一插入。血;青杀菌观'J定'法(Serumbactericidalassay,SBA)将细菌在固体培养基(含Levanthals补充物的脑心浸液培养基(brainheartinfUsionmedia))上培养过夜，然后在实验当天的上午在固体培养基上再次划线，培养4小时。此后，将细菌收集到磷酸盐緩冲盐水中并计数。SBA在lml体积、含有补体来源(幼兔或人)、以及约105个菌落形成单位的条件下进行。在温育结束时收集细菌，并涂布到固体培养基上以回收幸存的细菌。分离转座子插入位点通过标准方法从感兴趣的突变抹回收基因组DNA,并用尸vwll、￡coAV和Dral消化3小时，然后通过酚抽提来純化。接着将DNA以IOO微升体积在有T4DNA连接酶的情况下于16。C自我连接过夜，沉淀，然后用于通过电穿孔将大肠杆菌转化成卡那霉素抗性菌。实施例2:其它筛选及其结果GSI已经用于筛选大约40,000个MC58插入突变4朱的文库。该文库是使用含有pACYC184复制起点的转座子、通过体外Tn5诱变构建的。选择MC58是因为它是脑膜炎奈瑟氏球菌的血清群B分离抹，而且此菌抹的完整基因组序列已知。总是以野生型菌林作为对照来平行筛选该文库，而且显示了从该文库和野生型回收的菌落数。使用鼠血清进行的选择最初，使用经YH102减毒抹免疫的动物的血清分析文库。成年小鼠(Balb/C)三次腹膜内接受108个菌落形成单位，并在最后一次免疫接种的10天后收集血清。此筛选鉴定得到对血清杀伤的抗性增强的几个突变林。如下述对此进行确认分离各个突变抹，在初始遗传背景中重建所述突变，并再次测试各个突变抹对补体介导的裂解作用的易感性，并与野生型进行比较。转座子插入位于如下基因中NMB0341(TspA)DNA序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>NBM0341蛋白序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>IGDRDAAAETVQKLLEEAEGDVLKRAQALAQELGINMB0338DNA序列TAANMB0338蛋白序列LSLRGENGRLRAEVKKNARLTGKELTAPPAQNAPESTKQP对多肽的分析指出，预测有两个跨膜结构域，残基54-70和88-107。因此，1-53和108-终点(C末端)区域的片段作为免疫原可能是特别有用的。NMB1345DNA序列NMB1345蛋白序列TAISLK则QLKLNGKTLQNEPEPDFDEGGMVSEPQQ使用疫苗接种者血清进行的选择我们从Manchester的MeningococcalReferenceLaboratory得到血清。所述血清来自志愿者OMV免疫接种的临床试验。由疫苗接种者CI血清选出的突变抹(筛选一次)分离得到如下序列NMB0338(见上文)<image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>NMB0738DNA序列CTGTCAGACCGCTAANMB0738蛋白序列<image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>VTVAIGCTGGQHRSVYIVEKLARRLKGRYELLIRHRQAQNLSDRNMB0792NadC家族(转运蛋白)DNA序列<image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>TTGGTTGCTCTGTGGGCTTATGCTGTACTGATGTAANMB0792蛋白序列NMB0279DNA序列GAACTGGTCGGCGATGAAGAACTGGAAACGGGCTTTACGTTTTAANMB0279蛋白序列YLRRVSRRYAEIAPLYALLVELVGDEELETGFTFNMB2050DNA序列TTGTCGGAATCTTTGGAATACGCGGCAGAAGATGAAGCAGTCTGANMB2050蛋白序列NMB1335CreA蛋白DNA序列GAAAATCTCGACAAACGCTGANMB1335蛋白序列E肌DKRNMB2035DNA序列ATCCACGGCAGGGAACTTTTCGCCTTAGGCTGANMB2035蛋白序列NMB1351Fmu和Fmv蛋白DNA序列NMB1351蛋白序列NMB1574IlvCDNA序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>NMB1574蛋白序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>NMB1298rsuADNA序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>NMB1298蛋白序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>NMB1856LysR家族(转录调控物)DNA序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>NMB1856蛋白序列NMB0119DNA序列TTATCGGACTTTAAAACAACACGCGGATTCAAATAANMB0119蛋白序列NMB1705rfaKDNA序列NMB1705蛋白序列NMB2065Hemk蛋白DNA序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>NMB2065蛋白序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>由疫苗接种者17D血清选出的突变抹(仅筛选一次)NMB0339DNA序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>ACGTTTACCCCGAATAAAATCGAAGTTTAANMB0339蛋白序列NCHFKSQVFFWHCPACNKWQTFTPNKIEV使用患者血清进行的选择我们有急性期和恢复期血清的收集物可供我们用于筛选。这来自感染了脑膜炎奈瑟氏球菌不同血清群的个体。筛选用急性期(A)或恢复期(C)血清进行。急性感染和收集血清之间的时段为2周至3个月。NMB0401putADNA序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>NMB1467PPXDNA序列GCCGTCTGANMB1467蛋白序列DALEYESV(2WQKINMPFKVEAVNMB2056HemKGCACGCCGTGCAAAACAATTCTCCAAACGTTAANMB2056蛋白序列ARRAKQFSKRNMB0808DNA序列CTCGAACGCGACATTTGGATAGACTAANMB0808蛋白序列LERD工WIDNMB0774uppDNA序列GGCGACAAGATTTTCGGCACGCGCTAANMB0774蛋白序列AALDSHLNENGYIIPGLGDAGDKIFGTRNMA0078推定的整合膜蛋白DNA序列NMA0078蛋白序列ADPSYTKAQIGWQTQRDLTQMMEDSWRWVSNNPNGYDDNMB0337支链氨基酸氨基转移酶DNA序列GCGGAAGACAAATACGGCTGGCTGGTTGAAGTGTGCTGANMB0337蛋白序列KSQERGYAIRKAITDIQYGLAEDKYGWLVEVCNMB0191ParA家族蛋白DNA序列NMB0191蛋白序列KAYLALADELAARVSGKNMB1710谷氨酸脱氬酶(gdhA)DNA序列GCGCAAGGCTTCTAANMB1710蛋白序列VNYVNGANIAGFVKVADAMLAGGFNMB0062葡萄糖-l-磷酸胸苷酰基转移酶(rfbA-l)DNA序列TATTTGCTGCGCCTGTTGAAAAAATAANMB0062蛋白序列NMB1583咪唑甘油-磷酸脱水酶(hisB)DNA序列GGCACGCTGACCGCATAANMB1583蛋白序列GTLTA下列的另外的抗原使用基本上如上所述的方法鉴定得到:NMB1333核酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>NMB0264氨基酸序列WAHQSGGFLNEHVEWQHDNMB1036核酸序列CGCTTTACCGACATCCGCATGATGGCGTAANMB1036氨基酸序列LTPGQRCASTSNRNFEGRQGNGGRTHLVSPAMAAAAAVTGRFTDIRMMAGACCGCCGCCAACTGGACAGGCTGAAAAAAGGAGACTGGTAANMB1176氨基酸序列D,LDRLKKGDWNMB1359核酸序列NMB1359氨基酸序列ACGSPAMTEQTKNLFVQQHKLPENLFFSDAFTPSASNMB1138核酸序列GACCGCCGCCAACTGGACAGGCTGAAAAAAGGAGACTGGTAANMB1138氨基酸序列DRRQLDRLKKGDW序列表序列编号(SEQIDNo)序列1NMB0341DNA2NMB034I蛋白3NMB1583DNA4廳B1583蛋白5應B1345DNA6NMB1345蛋白7NMB0738DNA8NMB0738蛋白9應B0792DNA10NMB0792蛋白11菌B0279DNA12NMB0279蛋白13NMB2050DNA14NMB2050蛋白15.固B1335DNA16NMB1335蛋白17NMB2035DNA18NMB2035蛋白19NMB1351DNA20NMB1351蛋白21NMB1574DNA22NMB1574蛋白23NMB1298DNA24NMB1298蛋白25NMB1856DNA26NMB1856蛋白27NMB0119DNA28NMB0119蛋白29NMB1705DNA30NMB1705蛋白31NMB2065DNA32NMB2065蛋白33NMB0339DNA34NMB0339蛋白35NMB0401DNA36NMB0401蛋白37NMB1467DNA38NMB1467蛋白39NMB2056DNA40NMB2056蛋白41NMB0808DNA42NMB0808蛋白43NMB0774DNA44NMB0774蛋白45NMA0078DNA46NMA0078蛋白47NMB0337DNA48NMB0337蛋白49NMB0191DNA50NMB0191蛋白51NMB1710DNA52NMB1710蛋白53雨B0062DNA54丽B0062蛋白55麵B1333DNA56NMB1333蛋白57丽B0377DNA58NMB0377蛋白59丽B0264DNA60NMB0264蛋白61NMB1036DNA62NMB1036蛋白63NMB1176DNA64NMB1176蛋白65NMB1359DNA66NMB1359蛋白67NMB1138DNA68NMB1138蛋白权利要求1.包含选自SEQIDNo2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68中任一的氨基酸序列的多肽；或其片段或变体、或此类片段或变体的融合物。全文摘要描述了可用于疫苗的多种多肽、或其变体或片段、或这些的融合物。所述多肽可以是包含选自SEQIDNo(2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68)中任一的氨基酸序列的多肽；或其片段或变体、或此类片段或变体的融合物，而且可用于抗脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗。文档编号A61P31/04GK101115502SQ200580047962公开日2008年1月30日申请日期2005年12月23日优先权日2004年12月23日发明者克利斯托夫·M·唐,李延文申请人:帝国改革有限公司