专利名称：黄精凝集素ii蛋白在制备治疗或预防艾滋病的药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及以百合科植物囊丝黄精(Polygonatum cyrtonema Hua.)这种中草药为原料制备的黄精凝集素II蛋白的用途，特别涉及黄精凝集素II蛋白在制药中的用途。
背景技术：
凝集素(Lectin)是自然界中广泛存在的一类非酶、非免疫来源的、具有糖结合专一性并能使糖复合物沉淀的蛋白或糖蛋白。从第一个植物凝集素在蓖麻籽中发现到目前为止，人们已发现并分离了几百种凝集素。
百合科植物囊丝黄精(Polygonatum cyrtonema Hua.)是我国传统中草药，鲍锦库等在《生物化学杂志》(第12卷第6期，1996年12月)上发表的论文“黄精凝集素II分子的稳定性与生物学活性研究”公开了一种以植物黄精块茎为原料所制备的黄精凝集素II对淋巴细胞的促有丝分裂活性，以广州产PHA为对照，黄精凝集素II对人外周淋巴细胞的转化率高达97.6％，细胞分裂比达18.3％，是一种极强的促有丝分裂源。
自从1981年在美国发现艾滋病(获得性免疫缺陷综合症，AIDS)以来，世界各地发现艾滋病或带病毒者与日俱增。1983年人们确定了AIDS是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起以后，为医治这种给人类造成巨大危害的病症，全世界都在研究开发有效的抗HIV药剂。目前已开发出多种抗艾滋病毒药物，如蛋白酶抑制剂、核苷类似物等。治疗方法也由传统的单一药物治疗转变为多种药物组合方式，但至今仍然很难设计出一种长效抵御这一逆转录酶病毒的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供以植物黄精块茎为原料所制备的黄精凝集素II蛋白在制药中的新应用，以便开发出预防和治疗艾滋病的新药品。
本发明所述黄精凝集素II(PCL II)是从植物黄精中分离纯化出来的一种植物蛋白。从植物黄精中可分离纯化出的具有强凝集活性的蛋白有三种黄精凝集素I(PCL I)、黄精凝集素II(PCL II)、黄精凝集素III(PCLIII)，其中，黄精凝集素II(PCL II)含量最多。黄精凝集素II(PCL II)的制备方法有两种，一种方法的工艺步骤依次为“粗品制备、亲和柱分离纯化、CM-Sepharose离子交换快速柱纯化、分子筛纯化”，另一种方法的工艺步骤依次为“粗品制备、亲和柱分离纯化、分子筛纯化”。
本发明通过实验证明黄精凝集素II蛋白对人类免疫缺陷病毒(HIV)有很强的抑制作用。当受试细胞系为HT-4(小鼠神经细胞)时，黄精凝集素II蛋白对HIV-1的半数抑制浓度为EC50＝0.08ug/ml，对HIV-2的半数抑制浓度为EC50＝0.08ug/ml；当受试细胞系为CEM(T细胞淋巴瘤细胞)，黄精凝集素II蛋白对HIV-1和HIV-2的半数抑制浓度分别为EC50＝0.05ug/ml和EC50＝0.10ug/ml，比其它甘露糖结合凝集素的半数抑制浓度低10-100倍，即抑制HIV对正常细胞感染活性高出其它甘露糖结合凝集素10-100倍。而黄精凝集素II对HT-4和CEM的半数细胞毒性浓度分别为CC50＝73ug/ml和CC50＝74ug/ml，也比其它凝集素高出近10倍，显示出很高的抗HIV活性和很低的毒性。
因此，可将黄精凝集素II蛋白制备成治疗或预防人类免疫缺陷病毒(HIV)所致疾病的药品，用药方法可以通过口服、静脉内的注射等。
本发明具有以下有益效果1、本发明为黄精凝集素II蛋白发掘了新的医疗用途，为严重威胁人类生命的艾滋病的预防和治疗提供了新的药品。
2、黄精凝集素II蛋白药理作用强且毒性很低，预示着很好的药用前景。
3、制备黄精凝集素II蛋白的原料——植物黄精块茎来源广，制备黄精凝集素II蛋白的工艺简单，因而便于工业化生产，有利于降低制备成本。
图1是本发明所述黄精凝集素II蛋白的SDS-PAGE电泳图。
具体实施例方式
实施例1黄精凝集素II蛋白的制备本实施例中，黄精凝集素II蛋白的制备方法如下1、粗品制备将切成片状的黄精块茎以生理盐水溶液浸取(G/V＝1∶5)过夜，经高速组织捣碎机捣成糊状，生理盐水溶液浸取过夜，纱布过滤，离心(4℃，4500r/min，30min)，向上清中加入固体硫酸铵达30％饱和度，置4℃过夜，离心(4℃，4500r/min，30min)去沉淀，上清继续加硫酸铵至90％，离心收集沉淀，并将沉淀溶于蒸馏水，透析除盐，冷冻干燥得黄精凝集素粗品。
2、亲和柱分离纯化取粗品200mg溶于20ml生理盐水溶液，透析平衡，离心除去不溶物，取上清液进行亲和层析(柱2.6×40cm)。以甘露糖-Sepharose 4B为亲和吸附剂，用生理盐溶液平衡层析柱后，将上述凝集素粗品上柱，相同的生理盐溶液洗脱至流出液在280nm处吸收值小于0.02，换用0.2mol/L甘露糖溶液解吸附，洗脱及解吸附过程中皆分部收集，流速18ml/hr，3-4ml/管，收集管经280nm处测定紫外吸收后，将样品用生理盐水透析，以兔红细胞检查样品的凝集活性，合并活性部分并透析去盐，冷冻干燥得亲和层析样品。
3、分子筛纯化取经处理的Sephacryl S-100装柱(1.6×100cm)，用生理盐水平衡。将上述亲和层析样品用生理盐溶液溶解并透析平衡后上柱，用相同溶液洗脱，分部收集，流速为2ml/min，3ml/tube，经280nm处测定紫外吸收和检测活性后，收集活性部分，透析除盐，冷冻干燥得到纯化的黄精凝集素II，经SDS-PAGE检测为单一蛋白组分，见图1。
实施例2黄精凝集素II蛋白的制备本实施例中，黄精凝集素II蛋白的制备方法如下1、粗品制备将切成片状并晾干的黄精块茎以生理盐水溶液浸取(G/V＝1∶5)过夜，经高速组织捣碎机捣成糊状，生理盐水溶液浸取过夜，纱布过滤，离心(4℃，4500r/min，30min)，向上清中加入固体硫酸铵达30％饱和度，置4℃过夜，同前法离心去沉淀，上清继续加硫酸铵至90％，离心收集沉淀，并将沉淀溶于蒸馏水，透析除盐，冷冻干燥得黄精凝集素粗品。
2、亲和柱分离纯化取粗品(200mg)溶于20ml生理盐水溶液，透析平衡，离心除去不溶物，取上清液进行亲和层析(柱2.6×40cm)。以猪甲状腺球蛋白-Sepharose 4B为亲和吸附剂，用生理盐溶液平衡层析柱后，将上述凝集素粗品上柱，相同的生理盐溶液洗脱至流出液在280nm处吸收值小于0.02，换用0.2mol/L HAC溶液解吸附，洗脱及解吸附过程中皆分部收集，流速18ml/hr，3-4ml/管，收集管经280nm处测定紫外吸收后，以兔红细胞检查收集管得凝集活性(先以5％的NaHCo3中和解吸附部分收集管)，合并活性部分并透析去盐，冷冻干燥得亲和层析样品。
3、CM-Sepharose离子交换快速柱纯化取经处理的CM-Sepharose离子交换快速柱装柱(2.6×28cm)，用pH4.0，0.02mol/L的NaAC-HAC缓冲液平衡，将亲和样品(100mg)溶于20ml相同缓冲液中，离心除去不溶物并上CM-Sepharose柱，用相同的缓冲液洗脱至流出液在280nm处吸收值小于0.02，改用0.6mol/L的NaCl进行连续离子梯度洗脱，分部收集(3ml/min，3-4ml/管)，收集管经280nm测定后，兔红细胞检查凝集活性(先以5％的NaHCo3中和解吸附部分收集管)，合并活性部分，透析除盐并冷冻干燥得离子交换层析样品。
4分子筛纯化取经处理的Sephadex G-100装柱(1.6×100cm)，用生理盐水平衡。将上述CM-Sepharose柱样品用生理盐溶液溶解并透析平衡后上柱，用相同溶液洗脱，分部收集，流速为12ml/hr，3ml/tube，经280nm处测定紫外吸收和检测活性后，收集活性部分，透析除盐，冷冻干燥得到纯化的黄精凝集素II，经SDS-PAGE检测为单一蛋白组分，见图1。
实施例3黄精凝集素II蛋白(PCLII)对人类免疫缺陷病毒(HIV)的抑制作用1实验材料和方法1.1 材料雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin，GNA)、铃兰凝集素(Scilla campanulataagglutinin，SCA)、兰科植物凝集素(Listera Ovta lectin，LOL)样品由鲁文大学植物保护研究所的Van Damme教授实验室提供；石蒜凝集素(Lycoris radiataAgglutinin，LRA)由四川大学生物材料中心提供；黄精凝集素II(PCL II)蛋白由实施例1或实施例2所述方法制备。
艾滋病病毒株HIV-1和HIV-2由日加医学研究所保存。
正常细胞株CEM(T细胞淋巴瘤细胞系)和TH-4(小鼠神经细胞系)为日加医学研究所传代培养。
1.2 方法黄精凝集素II抗艾滋病毒活性的测定采用Balzarini的实验方法(见Balzrini J，Naesens L，Herdewijn P，Rosenberg I，Holy A，Pauwels R，Baba M，Johns DG，De Clercq I，Marked in vivo anti-retrovirus activity of PMEA[9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine]，anew selective anti-HIV agent，Proc Natl Acad Sci USA，1989，86332-336；Balzarini J，Aaesens L，Slachmuylders J，Niphuis H，Rosenberg I，Holy A，Schellekens H，De Clercq E，[9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine](PMEA)effectively inhibits retrovirus replication invitro and simian immunodeficiency virus infection in Rhesus monkeys，AIDS，1991，521-28)分别测定PCL II的EC50(半抑制浓度)和CC50(对受试细胞的半数细胞毒性浓度)。所用细胞株为CEM(T细胞淋巴瘤细胞系)和TH-4(小鼠神经细胞系)；艾滋病病毒为HIV-1和HIV-2病毒株，对照样品为雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin，GNA)，石蒜凝集素(Lycoris radiata Agglutinin，LRA)，铃兰凝集素(Scilla campanulata agglutinin，SCA)，兰科植物凝集素(Listera Ovta lectin，LOL)。
CEM和TH-4细胞悬浮于新鲜培养基(4×105cells/ml)，用100倍CCID50/ml(cellculture infective dose 50)的HIV-I和HIV-II进行感染(1个CCID50为50％培养细胞被感染时所需的病毒剂量)。然后，100ul感染的细胞悬液移入微量血清稀释板与100ul经系列倍比稀释的黄精凝集素II及其它样品混合后于37℃培养。4天后检测被感染细胞培养液中合胞囊的形成。抗病毒活性用EC50(effective concentration 50)表示，即半抑制由HIV介导的合胞囊形成时所需的黄精凝集素II浓度；细胞毒性用CC50(cytotoxicconcentration 50)表示，即50％培养细胞发生病变所需的黄精凝集素II浓度。
2结果与讨论表4黄精凝集素II蛋白细胞毒性和抗HIV活性
黄精凝集素II对HIV-1和HIV-2抗性结果见表4，由表4可知，黄精凝集素II蛋白对HIV有很强的抑制作用。当受试细胞系为HT-4(小鼠神经细胞)时，黄精凝集素II对HIV-1的半数抑制浓度为EC50＝0.08ug/ml，对HIV-2的半数抑制浓度为EC50＝0.08ug/ml；当受试细胞系为CEM(T细胞淋巴瘤细胞)，黄精凝集素II对HIV-1和HIV-2的半数抑制浓度分别为EC50＝0.05ug/ml和EC50＝0.10ug/ml，比其它甘露糖结合凝集素的半数抑制浓度低10-100倍，即抑制HIV对正常细胞感染活性高出其它甘露糖结合凝集素10-100倍。而黄精凝集素II对HT-4和CEM的半数细胞毒性浓度分别为CC50＝73ug/ml和CC50＝74ug/ml。也比其它凝集素高出近10倍，显示出很高的抗HIV活性和很低的毒性。SCA是近年来研究得较为清楚的单子叶甘露糖结合凝集素，其空间结构也已阐明，特别是其抗艾滋病毒活性已引起许多学者的关注[Pierre Rizkallah，“Bluebells & Daffodils may be used in AIDS drugs”，BritishResearchers Report New Findings，2002]。本实验结果显示黄精凝集素II的抗HIV-1和HIV-2活性分别比SCA高出60倍和100倍。黄精凝集素II的活性明显高出其它单子叶甘露糖结合凝集素的原因可能是黄精凝集素II除可以结合甘露糖外，还可以结合唾液酸，是一种唾液酸和甘露糖结合凝集素。研究表明，HIV的gp120糖链除含甘露糖外，还含有唾液酸化的糖基，推测黄精凝集素II除和gp120的甘露糖基结合外，还结合gp120的唾液酸基团，从而更有效的封闭和阻断gp120与宿主细胞表面CD4的识别和结合，显示出更强的抑制HIV感染的作用，也表明黄精凝集素II是一种高效的HIV感染抑制糖结合蛋白。
权利要求
1.黄精凝集素II蛋白在制备治疗或预防艾滋病的药中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所治疗或预防的艾滋病为人类免疫缺陷病毒HIV-1、HIV-2所引起。
全文摘要
黄精凝集素II(PCL II)是从植物黄精中分离纯化出来的一种植物蛋白，本发明通过实验证明，黄精凝集素II蛋白对人类免疫缺陷病毒(HIV)有很强的抑制作用，抑制HIV对正常细胞感染活性高出其它甘露糖结合凝集素10－100倍。本发明为黄精凝集素II蛋白发掘了新的医疗用途，为严重威胁人类生命的艾滋病的预防和治疗提供了新的药品。
文档编号A61P31/18GK1840174SQ20061000557
公开日2006年10月4日 申请日期2004年4月20日 优先权日2004年4月20日
发明者鲍锦库, 吴传芳, 安洁, 邓洁, 何晓佳, 洪志霞, 吕鸿周, 刘超, 陈放 申请人:四川大学