专利名称：一种肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属制药领域，涉及一种用于肿瘤治疗的主动靶向免疫脂质体载体，具体涉及一种肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统。
背景技术：
临床上常用于恶性肿瘤的治疗方案包括外科手术、放射治疗、药物化疗和基因(免疫)疗法等。其中药物化疗应用范围较广，不仅可以单独用于治疗，也可用于其它治疗方案的辅助治疗或巩固治疗。化疗药物的一般给药形式进入体内后，半衰期较短，分布广泛。为达到疗效，有时只能采用大剂量冲击的方式进行治疗，因此往往治疗药物在杀伤肿瘤的同时，对正常机体组织造成较大的损伤，带来较大的毒副作用。为了实现降低毒副作用、提高化疗药物疗效的目标，一个有效的方式就是通过药物剂型、药物修饰等的手段实现化疗药物的靶向传递，即最大限度地增加特定部位(如肿瘤)的药物浓度，减少化疗药物在正常组织器官中的分布。
肿瘤的靶向治疗是利用肿瘤组织的某些生理特征或肿瘤细胞所具有的区别于正常细胞的某些特异性结构分子作为靶点，使用特定的递药系统或能与靶分子特异结合的单抗、配体等靶向肿瘤的治疗方法。肿瘤坏死治疗(Tumor NecrosisTherapy，TNT)是靶向治疗的有效方法之一。相对于正常细胞，肿瘤细胞增殖迅速并伴有异常分化，过快的细胞增殖引起瘤组织内部的血供障碍，从而引发细胞变性坏死。肿瘤组织内的微血管也因为快速增长和瘤细胞某些分泌成分的作用，在结构和功能上呈现出某些缺陷如细胞膜成分缺失，通透性增强等。这种缺陷有利于瘤组织的血流和营养灌输，也为靶向分子的通透并与靶点结合提供了帮助。在肿瘤坏死部位，细胞坏死后暴露出DNA和组蛋白，形成TNT治疗的靶点(Sharifi J，et al.Hybridoma and Hybridomics.2001，20305-312；Gaffar SA，et al.Journal of Immunoassay.1991，121-14)。TNT治疗的原理是利用肿瘤组织微血管和细胞膜“易漏”(leaky)的特点，利用能与细胞核抗原成分特异性结合的靶向分子将放射性核素、药物或蛋白靶向至肿瘤坏死部位，杀伤与坏死细胞相邻的肿瘤细胞，从而扩大肿瘤细胞坏死的范围，造成对肿瘤的特异性杀伤。
美国专利US6017514和US6071491公开了相关抗原为细胞内DNA和组蛋白的肿瘤坏死靶向单抗的制备及其在坏死组织检测和肿瘤治疗的应用。人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单克隆单抗(chimeric Tumor Necrosis Therapy-3 monoclonalantibody，chTNT-3)是一种能特异性地结合肿瘤坏死区坏死细胞DNA的肿瘤坏死靶向单抗。chTNT-3是小鼠单抗可交区(Fv)基因与人单抗恒定区(Fc)基因的嵌合重组产物，人源部分占70％，鼠源部分占30％。由于采用人源化嵌合技术，chTNT-3大大降低了机体内人抗鼠抗体(Human anti-mouse antibody，HAMA)的产生。常规肿瘤细胞单抗只对特定肿瘤的细胞膜抗原有特异性亲和，对于不同种类的肿瘤，需要采用相对应的不同品种的单抗进行治疗。chTNT-3避开了这一局限，其对应的核抗原DNA、组蛋白等结构成分是细胞中的基本成分，由于血管和细胞膜的选择性通透作用，只有在坏死细胞或病变细胞中能与chTNT-3接触作用。由于许多肿瘤细胞在快速增殖期都会出现坏死，因此chTNT-3对一系列肿瘤，如肝癌、肺癌、脑癌、结肠癌等均有效，具有一定的广谱性(Spicer KM，etal.Journal of Nuclear Medicine.2000，41272P-272P)。
脂质体是一种由磷脂双分子层构成的具有水相内核的脂质微囊。亲水性药物可以被包封在脂质体的内水相中，亲脂性药物可以被包封在双分子层中，两亲性药物(弱酸或弱碱)可以通过远程载药法包载药物，如硫酸铵法包载阿霉素(HaranG，et al.Biochimica Et Biophysica Acta.1993，1151201-215)或pH梯度法包载长春新碱(Boman NL，et al.Cancer Research.1994，542830-2833)。通过在脂质体的表面修饰PEG等亲水性高分子克服了普通脂质体在体内循环系统滞留时间短迅速被清除的缺点，使脂质体能够通过增强的通透性和滞留性(Enhanced Permeabilityand Retention，EPR)效应在实体肿瘤部位蓄积；在长循环的基础上将特定的单抗或受体配基共价连接到脂质体表面制得空间稳定主动靶向脂质体，能识别相对应的抗原或受体，提高脂质体对肿瘤部位的选择性，进一步减少化疗药物对正常机体的损伤。
生物素(Biotin)又称维生素H，分子量为244.31Da，等电点约3.5，其结构中含一个咪唑环和一个噻吩环。亲和素(Avidin，Av)是一种来源于鸡蛋清的糖蛋白，分子量为约66kDa，等电点约10，由四个完全相同的亚基组成，每个亚基可通过其色氨酸与生物素分子中的咪唑酮环结合。亲和素与生物素的亲和力非常高(Kd为10-15mol/L)，远高于抗原-抗体的亲和力(Kd为10-11mol/L)，两者结合快且不可逆，并可在较长时间内保持高度稳定性。链霉亲和素(Streptavidin，SAv)来源于细菌Streptomyces avidinii，分子量60kDa。SAv与Av一样由四个相同亚基组成，与生物素的亲和力也与Av类似，但SAv不含糖基侧链，是一种接近中性的蛋白(pH约5～6)，因此与带电分子和细胞膜糖受体的非特异性结合均很低(Fan CZ.Pharmaceutical Sciences.2002，Master23-29；吴湖炳，et al.国外医学·放射医学核医学分册.1998，22248-251)。由于生物素与(链霉)亲和素之间强烈的特异性结合作用，生物素-(链霉)亲和素系统(Biotin-avidinsystem，BAS)被广泛地应用于生物分析和肿瘤放射免疫显像。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体给药系统，以提高抗肿瘤药物治疗效果。
本发明需要解决的技术问题是，提供一种生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体给药系统，该系统包括生物素化肿瘤坏死靶向单抗和表面PEG末端共价连接链霉亲和素或亲和素的空间稳定脂质体。脂质体内水相中包载抗癌化疗药物。
本发明的目的通过下述技术方案实现采用生物素化肿瘤坏死靶向单抗chTNT/B和链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体，给药时首先给予chTNT/B预定位于肿瘤坏死部位，后给予链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体。
本发明所述的肿瘤坏死靶向单抗为人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单克隆单抗chTNT-1、chTNT-2和chTNT-3中的一种，优选为chTNT-3。
本发明所涉及的表面可连接链霉亲和素或亲和素的空间稳定脂质体，其组分和摩尔含量百分比是高相变温度磷脂酰胆碱48％～68％胆固醇 30％～50％甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 1％～15％吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺0.2％～5％所述的高相变温度磷脂酰胆碱为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)或氢化蛋磷脂酰胆碱(HEPC)。
所述的胆固醇(CHOL)级别为分析纯或分析纯以上。
所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺结构通式为mPEG-PE，其中mPEG为甲氧基聚乙二醇，PE为磷脂酰乙醇胺。其中mPEG分子量为1000～10000，更佳的分子量为2000～5000；PE是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、氢化蛋磷脂酰乙醇胺(HEPE)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)或蛋磷脂酰乙醇胺(EPE)其中的一种，优选DSPE或HSPE。
所述的吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺结构通式为PDP-PEG-PE，其中PDP为吡啶二硫丙酰基，PEG为聚乙二醇，PE为磷脂酰乙醇胺。涉及的PEG分子量为1000～10000，更佳的分子量为2000～5000；PE可以是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、氢化蛋磷脂酰乙醇胺(HEPE)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)或蛋磷脂酰乙醇胺(EPE)其中的一种，优选DSPE或HSPE。
甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量有关，通常吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量要大于或等于甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量。本发明优选甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为2000，吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为3350或2000。
本发明的主动靶向免疫脂质体的制备涉及表面含PDP活性基团的空间稳定脂质体的制备，其方法如下将高相变温度磷脂酰胆碱、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶于氯仿，旋转蒸干成膜后置真空干燥器中继续干燥超过2h。用缓冲液水化后，用高压均质机分别通过孔径为200nm和100nm核孔膜，得到小单室脂质体。
所用水化缓冲液为0.155mol/L硫酸铵溶液或50mmol/L钙黄绿素水溶液。所用水化温度为55℃～70℃。
本发明采用下述方法制备生物素化肿瘤坏死靶向单抗生物素氨基己糖酸-3-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-NHS-LC-biotin)与chTNT-3按2～30摩尔比反应，分离纯化后得到生物素取代度为2～15的生物化肿瘤坏死靶向单抗(chTNT-3/B)。
肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统中脂质体表面共价连接的蛋白可以是亲和素或链霉亲和素，优选为链霉亲和素。
表面共价连接链霉亲和素的空间稳定脂质体的制备方法如下链霉亲和素经琥珀酰亚胺马来酰亚胺苯基丁酸酯(SMPB)衍生化得马来酰亚胺苯基丁酰基链霉亲和素(MPB-SAv)；PDP脂质体经二硫苏糖醇(DTT)还原成表面带巯基的空间稳定脂质体后，与MPB-SAv反应过夜，经Sepharose CL-4B凝胶柱分离纯化收集脂质体组分，即得表面共价修饰链霉亲和素的空间稳定脂质体(SAv-SL)。其平均粒径为80nm～150nm。
本发明涉及的生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统给药时首先给予chTNT-3/B预定位于靶细胞或肿瘤坏死部位，间隔6～96h后给予SAv-SL，利用生物素和链霉亲和素之间的特异性结合作用将脂质体靶向至肿瘤组织。优选时间间隔为12h～48h。
本发明涉及的生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统的体外靶向性评价通过其与固定Raji细胞的结合量来验证。Raji细胞经化学处理(多聚甲醛，丙酮固定)后细胞膜的选择性通透特性被破坏，核抗原在细胞内固定下来，但细胞的基本结构仍然得到较完整的保留。试验结果表明，包载钙黄绿素的生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体均能够特异性地靶向固定Raji细胞内的核抗原，与固定Raji细胞的结合量均显著高于阴性对照组，与肿瘤靶向坏死靶向单抗-空间稳定脂质体相当。
包载化疗药物阿霉素的脂质体对恶性肿瘤的治疗作用与脂质体在血循环中的滞留时间和在肿瘤部位的蓄积量直接相关。对于非主动靶向的空间稳定脂质体而言，由于其半衰期较长，能够通过EPR效应在肿瘤部位蓄积；主动靶向脂质体由于脂质体表面修饰了单抗或链霉亲和素，血中滞留时间与非主动靶向的空间稳定脂质体相比有所缩短，但由于对肿瘤坏死部位的主动选择性增强，因此其在肿瘤部位蓄积量高于空间稳定脂质体，抗肿瘤活性亦高于后者。
本发明涉及的给药系统能将化疗药物携带至肿瘤坏死部位，化疗药物杀伤肿瘤坏死部位周围的肿瘤细胞，从而形成新的坏死区，周而复始，使肿瘤坏死区不断扩大，由此形成对整个肿瘤的杀伤作用。体内试验结果表明，生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统的药动学行为符合两室模型，能显著延长阿霉素生物半衰期，其在肿瘤组织中积蓄是一个渐进过程；以阿霉素为模型药物，生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统抗皮下移植瘤药效较好，抑瘤率61.9％，明显高于非主动靶向的空间稳定脂质体抑瘤率49.1％。
图1生物素化肿瘤坏死靶向单抗的免疫活性检测其中，chTNT-3人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单抗；MPB-chTNT-3马来酰亚胺苯基丁酰基chTNT-3；chTNT-3/B(sub 3)生物素化chTNT-3，生物素取代度为3；chTNT-3/B(sub 5)生物素化chTNT-3，生物素取代度为5；chTNT-3/B(sub 8)生物素化chTNT-3，生物素取代度为8；IgG非特异性人源IgG。
图2包载钙黄绿素的生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体与固定Raji细胞的结合量其中，SL[Calc]包载钙黄绿素的空间稳定脂质体；SAv-SL[Calc]包载钙黄绿素的链霉亲和素化空间稳定脂质体；chTNT-3/B+SAv-SL[Calc]包载钙黄绿素的肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体；Calc游离钙黄绿素。
图3生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体在大鼠体内的药代动力学曲线其中，SL[DXR]包载阿霉素的空间稳定脂质体；chTNT-3-SL[DXR]包载阿霉素的肿瘤坏死靶向单抗-空间稳定脂质体；chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]包载阿霉素的肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体；SAv-SL[DXR]包载阿霉素的链霉亲和素化空间稳定脂质体；DXR游离阿霉素。
图4静脉注射生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体后荷H460移植瘤BALB/c裸鼠肿瘤中阿霉素的浓度其中，SL[DXR]包载阿霉素的空间稳定脂质体；chTNT-3-SL[DXR]包载阿霉素的肿瘤坏死靶向单抗-空间稳定脂质体；chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]包载阿霉素的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体；DXR游离阿霉素。
图5静脉注射生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体后荷H460移植瘤BALB/c裸鼠的肿瘤生长曲线其中，DXR游离阿霉素；SL[DXR]包载阿霉素的空间稳定脂质体；IgG-SL[DXR]包载阿霉素的非特异性人源IgG修饰的空间稳定脂质体；chTNT-3-SL[DXR]包载阿霉素的肿瘤坏死靶向单抗-空间稳定脂质体；SAv-SL[DXR]包载阿霉素的链霉亲和素化空间稳定脂质体；chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]包载阿霉素的肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体。
具体实施例方式
实施例1 生物素化肿瘤坏死靶向单抗制备精密吸取10mg/mL Sulfo-NHS-LC-biotin DMSO溶液，加入10mg/mLchTNT-3溶液中，轻微搅拌，室温反应2h。以pH 7.4的HEPES缓冲液(含25mmol/LHEPES和140mmol/L NaCl)为洗脱液过Sephadex G-50凝胶柱(10mm×120mm)，流速1mL/min，AKTA中压层析系统280nm处检测衍生化单抗chTNT-3/B组分并收集。采用Amicon Ultra-4离心超滤管(超滤膜截留分子量50,000)对chTNT-3/B离心浓缩，BCA法定量其蛋白含量为5mg/mL；HABA/Avidin法测定chTNT-3/B中生物素取代度为2～15。
实施例2 表面含巯基的阿霉素空间稳定脂质体制备将脂质体膜材(HSPC∶CHOL∶mPEG-HSPE∶PDP-PEG-HSPE＝5∶4∶0.2∶0.05，摩尔比)溶于氯仿中，旋转蒸除有机溶剂制得均匀磷脂膜，减压干燥12h。加入一定体积155mmol/L硫酸铵缓冲液(pH 5.5)，使磷脂浓度为10mmol/L，65℃水浴振荡2h，用高压均质机或微型挤压器依次挤压通过0.2、0.1和0.08μm的核孔膜，各10次，即得带PDP活性基团的空间稳定脂质体(PDP-SL)。将上述PDP-SL以123mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)洗脱通过Sepherose CL-4B凝胶柱更换外水相，加入阿霉素水溶液使最终其浓度为1mg/mL，65℃水浴振荡20min。PDP-SL经二巯基苏糖醇还原后，以pH 6.7的HEPES-Mes缓冲液(含25mmol/LHEPES、25mmol/L Mes和140mmol/L NaCl)为洗脱液过Sephadex G-50凝胶柱(16mm×150mm)，收集得到表面带有游离巯基的空间稳定脂质体(HS-SL)。
实施例3 链霉亲和素化空间稳定脂质体制备精密吸25m mol/L SMPB DMF溶液，加入10mg/mL SAv溶液中，使两者摩尔比为20∶1，轻微搅拌，室温反应1h。以pH 6.7的HEPES-Mes缓冲液(含25mmol/L HEPES、25mmol/L Mes和140mmol/L NaCl)为洗脱液过Sephadex G-50凝胶柱(10mm×120mm)，流速1mL/min，AKTA中压层析系统280nm处检测衍生化链霉亲和素组分(MPB-SAv)并收集。采用Amicon Ultra-4离心超滤管(超滤膜截留分子量10,000)离心浓缩MPB-SAv，BCA法定量其蛋白浓度。精密吸取MPB-SAv，加入HS-SL脂质体中使其与HSPC的摩尔比为1∶1000，室温反应过夜。以pH 7.4的HEPES缓冲液(含25mmol/L HEPES和140mmol/LNaCl)为洗脱液过Sepharose CL-4B凝胶柱，除去游离的MPB-SAv，收集脂质体组分，即得链霉亲和素化空间稳定脂质体(SAv-SL)。
实施例4 生物素化肿瘤坏死靶向单抗的免疫活性检测离心收集处于对数生长期的Raji细胞，按常规方法提取核抗原。以ELISA酶标法考察MPB-chTNT-3，chTNT-3/B和chTNT-3-SL中单抗的免疫活性，以chTNT-3为阳性对照，非特异性人源IgG修饰的空间稳定脂质体(IgG-SL)和表面带PDP活性基团的空间稳定脂质体(PDP-SL)为阴性对照。
ELISA操作如下96孔板，每孔加入200μL 0.005％多聚赖氨酸，湿袋中4℃放置过夜；吸去多聚赖氨酸溶液，磷酸缓冲盐水溶液(PBS)洗1次后加200μL核抗原(2μg/mL)，2000rpm离心10min，吸去上清液，加100μL 0.05％戊二醛于4℃固定15min；吸去固定液，PBS洗3次，每孔加入200μL 5％BSA，于37℃封闭1h；0.1％Tween-PBS洗3次后，分别加入100μL倍比稀释的chTNT-3-SL及对照(chTNT-3、MPB-chTNT-3、chTNT-3/B、IgG-SL和PDP-SL)，37℃温育1h；0.1％Tween-PBS洗3次后，加50μL辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG(1∶2000)，37℃温育1h；0.1％Tween-PBS洗3次，加底物TMB 100μL，室温避光放置10min，加入50μL 2M H2SO4终止反应，于酶标仪450nm波长处(参比波长630nm)测定吸收值。
实施例5 生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统的体外靶向性评价收集对数生长期的Raji细胞，离心浓缩(4℃，1000r·min-1，5min)，PBS洗1次，2％多聚甲醛固定5～10min，PBS洗3次，-20℃丙酮处理3～10min，离心(4℃，1000r·min-1，10min)，PBS洗1次，细胞计数，保存于含1％BSA、0.02％叠氮钠的PBS中。
采用50mmol/L钙黄绿素溶液水化脂质体，MiniExtruder微型挤出器控制粒径(80、100和200nm)，制备含有钙黄绿素的空间稳定脂质体(SL[Calc])、空间稳定免疫脂质体(chTNT-3-SL[Calc]、IgG-SL[Calc])和链霉亲和素化空间稳定脂质体(SAv-SL[Calc])，其中磷脂浓度均为10mmol/L。
生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统与固定Raji细胞结合试验操作步骤如下(1)96孔白底荧光板，每孔加200μL 1％BSA，37℃封闭1h；(2)吸去封闭液，加100μL固定Raji细胞(3×106/mL)；(3)加入200μL 60μg/mL chTNT-3/B，室温作用1h后离心(4℃，2000r·min-1，10min)，吸去上清液，用含1％BSA的PBS洗2次，每次300μL，再次离心(4℃，2000r·min-1，10min)后吸去上清液，加入200μL SAv-SL[Calc]，室温作用1h；
(4)离心(4℃，2000r·min-1，10min)，吸去上清液，用含1％BSA的PBS洗2次，每次300μL，再次离心(4℃，2000r·min-1，10min)后吸去上清液。
(5)每孔加270μL PBS、30μL 2.5％Triton X-100，混匀，LS-55荧光分光光度计测定荧光吸收值F(激发波长490nm，发射波长520nm)。
实施例6 生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统在大鼠体内的药动学研究取15只SD大鼠，体重190～210g，随机分成5组，乙醚麻醉后，按阿霉素5mg/kg体重的给药剂量股静脉注射游离阿霉素和各阿霉素脂质体制剂空间稳定脂质体(SL[DXR])、肿瘤坏死靶向单抗-空间稳定脂质体(chTNT-3-SL[DXR])、肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体(chTNT-3/B+SAv-SL[DXR])、链霉亲和素化空间稳定脂质体(SAv-SL[DXR])，其中肿瘤坏死靶向单抗预定位空间稳定脂质体组在给药前24h预先尾静脉注射chTNT-3/B。分别于给药后10min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h和72h尾静脉取血0.5mL，置于柠檬酸钠抗凝的塑料离心管中，3000r·min-1离心10min，取0.2mL血浆，置-20℃保存。样品于测定前室温解冻，HPLC法测定血样中阿霉素浓度。
实施例7 生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统在荷瘤裸鼠体内的组织分布研究挑选同一批次H460移植瘤体积为0.7～0.8cm3的裸小鼠48只，随机分成4组，每组12只，分别按阿霉素5mg/kg体重的给药剂量尾静脉注射SL[DXR]、chTNT-3-SL[DXR]、SAv-SL[DXR](24h前预先静注5mg/kg体重chTNT-3/B)、DXR。于给药后4h、24h和48h眼眶取血，处死裸小鼠后，取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，生理盐水洗净，用滤纸吸干，称重。HPLC法测定样品中阿霉素浓度。
实施例8 生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统在荷瘤裸鼠体内的药效学研究88只雌性Balc/c-nu/nu裸小鼠接种H460肿瘤，1周后从中挑选出瘤体积相近的42只(平均瘤体积为0.083cm3)，随机分成7组，每组6只。按阿霉素5mg/kg体重，于第1天、第8天给药两次，每次分别给予生理盐水、DXR、SL[DXR]、IgG-SL[DXR]、chTNT-3-SL[DXR]、SAv-SL[DXR]和chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]。
表1是给药后定期测量瘤径计算体积抑瘤率。
表1
*P＜0.05，**P＜0.01vs预定位组(chTNT-3/B+SAv-SL[DXR])
权利要求
1.一种肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于通过下述方法制备采用生物素化肿瘤坏死靶向单抗chTNT/B和链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体，给药时首先给予chTNT/B预定位于肿瘤坏死部位，后给予链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体。
2.根据权利要求1所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于所述的脂质体内水相中包载抗癌化疗药物。
3.根据权利要求1所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于所述的chTNT/B，chTNT与生物素以共价方式连接，chTNT/B中生物素取代度为2～15，其中chTNT选自人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单抗chTNT-1、chTNT-2或chTNT-3中的一种。
4.根据权利要求1所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体含有高相变温度磷脂酰胆碱、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、链霉亲和素或亲和素-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和抗肿瘤药物。
5.根据权利要求4所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体，其组分和摩尔含量百分比是高相变温度磷脂酰胆碱48％～68％胆固醇 30％～50％甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 1％～15％链霉亲和素或亲和素-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺0.2％～5％其中高相变温度磷脂酰胆碱选自氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱或氢化蛋磷脂酰胆碱；甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的通式为mPEG-PE，其中mPEG为单甲氧基聚乙二醇，PE为磷脂酰乙醇胺；链霉亲和素或亲和素-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的通式为SAv(Av)-PEG-PE，其中SAv为链霉亲和素，Av为亲和素，PEG为聚乙二醇，SAv或Av通过共价方式与PEG链末端连接，PE为磷脂酰乙醇胺。
6.根据权利要求5所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体的mPEG-PE中mPEG的分子量为1000～10000。
7.根据权利要求5所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体的mPEG-PE中mPEG的分子量为2000～5000。
8.根据权利要求5所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体的SAv(Av)-PEG-PE中的SAv或Av与PEG链末端通过马来酰亚胺与游离巯基加成的方式共价连接。
9.根据权利要求5所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体的SAv(Av)-PEG-PE中PEG的分子量为1000～10000。
10.根据权利要求5所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体的SAv(Av)-PEG-PE中PEG的分子量为2000～5000。
11.根据权利要求5所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体的mPEG-PE和SAv(Av)-PEG-PE中PE选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
12.根据权利要求2所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于所述的脂质体内水相中包载的抗癌化疗药物是阿霉素。
13.根据权利要求1所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体平均粒径为80nm～150nm。
14.权利要求1或2的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统在制备抗肿瘤药物中的用途。
15.根据权利要求1所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的先、后给药时间间隔为6h～96h。
16.根据权利要求1所述的肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统，其特征在于，所述的先、后给药时间间隔为12h～48h。
全文摘要
本发明公开了生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位脂质体给药系统及其在肿瘤治疗中的应用。本发明的脂质体给药系统包括生物素化肿瘤坏死靶向单抗和PEG末端共价连接链霉亲和素或亲和素的空间稳定脂质体，通过一定时间间隔给药。该脂质体给药系统在体外能特异性地靶向肿瘤细胞核抗原。通过生物素化肿瘤坏死靶向单抗预定位策略，包载阿霉素的链霉亲和素或亲和素化空间稳定脂质体在肿瘤组织中能较好地靶向蓄积，抗肿瘤效果良好。
文档编号A61K39/395GK1883454SQ20061002722
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月1日 优先权日2006年6月1日
发明者陆伟跃, 潘弘, 姚明, 钟高仁, 周光兴 申请人:复旦大学