西藏胡黄连在制备治疗肾脏疾病药物中的应用的制作方法

专利名称：西藏胡黄连在制备治疗肾脏疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及西藏胡黄连的新用途，特别涉及西藏胡黄连在制备治疗肾脏疾病药物中的应用。
背景技术：
慢性肾脏疾病、糖尿病肾病、急性缺血再灌注导致的肾脏损伤等是十分常见的肾脏疾病。在我国，糖尿病、肾脏疾病的人群日益增多，已成为最为常见的疾病。因此，加强上述疾病的防治是我国乃至全球性亟待解决的问题。但是，迄今为止，尚无有效的针对上述疾病的防治手段和药物。国内外的研究发现，上述疾病都具有的共同的病理生理特点，即都存在氧化反应增强，也就是氧化应激状态。研究证实氧化应激并非疾病的伴随现象，而是介导组织器官损害，参与病变发生发展的重要因素。
胡黄连是原产于印度的一种玄参科植物，其根茎可入药。作为中药材始见于《唐本草》，具有清热凉血、燥湿消疳作用，用于小儿惊痫、疳积、泻痢、骨蒸痨热、自汗、盗汗、吐血等症。在20世纪70年代以前，我国的胡黄连一直依赖进口主产于印度的胡黄连(Picrorhizakurrooa Royle ex Benth)。1965年在西藏东南部及云南西北部发现了与印度胡黄连同属植物，其生药形态、组织及性味等方面与前者非常相似，可以代替印度胡黄连用药，命名为西藏胡黄连(Picrorhiza scrophulariifora Pennell)。目前《中国药典》收载的胡黄连即西藏胡黄连。国内关于西藏胡黄连的研究报道以及专利文献均集中于其保肝作用、抗糖尿病活性等，未有对该中药在肾脏疾病方面的用途进行研究。

发明内容
本发明的目的在于提供西藏胡黄连提取物在制备治疗肾脏疾病药物中的应用，开辟了西藏胡黄连作为中药的一种新用途，也为肾脏疾病的治疗提供了一种新的途径。
本发明所述的西藏胡黄连的新应用，是将西藏胡黄连作为原料药用于制备治疗肾脏疾病的药物。所述的肾脏疾病包括慢性肾脏疾病、糖尿病肾病、急性缺血再灌注导致的肾脏损伤。主要采用西藏胡黄连的根茎，也可采用西藏胡黄连植物的其他有效部位。
优选的是采用西藏胡黄连的根茎的醇提取物。或者采用其他有机溶剂提取，具有类似的药效。
优选的生产方法是将西藏胡黄连的根茎风干后粉碎成颗粒状粉末，浸泡于50-95％乙醇或甲醇中，室温过夜提纯，过滤，蒸馏，经冷冻干燥制成西藏胡黄连提取物。
所述西藏胡黄提取物的密度范围为1.0005～1.0269g/ml。
本发明将西藏胡黄连用于制备治疗肾脏疾病药物时，药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型。具体是将西藏胡黄连提取物经过常规生产工艺，添加常规的口服剂型的辅料，制成片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、口服液等各种剂型。使用方法成人0.5～2g(以原料计)，2～3次/日，口服。儿童减半。
本发明所述的西藏胡黄连还可以与目前已知的其他治疗肾脏疾病的药，如黄芪等制成复方制剂，用于治疗肾脏疾病。
本发明通过各种动物模型及实验证明，西藏胡黄连对各种肾脏疾病均有确切的疗效。由于西藏胡黄连来源方便、广泛，提取物的制备方法简单，不需要贵重仪器设备和试剂，因此本发明提供了一种简便、价廉、高效的治疗肾脏疾病的药物。


图1为5/6肾切除大鼠肌酐清除率与血清AOPP含量的相关分析图。
图2为5/6肾切除大鼠肌酐清除率与血清AGEs含量的相关分析图。
图3表示实时定量荧光PCR分析肾组织ICAM-1mRNA表达量。荧光定量操作系统所得数据结果Ct值(荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)按照2-ΔΔCt方法处理后进行分析比较。
图4表示实时定量荧光PCR分析肾组织MCP-1mRNA表达量。荧光定量操作系统所得数据结果Ct值(荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)按照2-ΔΔCt方法处理后进行分析比较。
具体实施例方式
实施例一西藏胡黄连提取物的制备本发明所述的西藏胡黄连提取物是通过以下方法制备的取西藏胡黄连(生药)的根茎，风干后机械粉碎成颗粒状粉末(颗粒大小适中，约20mm3左右)。350g原料浸泡于50-95％乙醇2000ml中，置于摇床上(150转/分)，室温过夜提纯，负压过滤，蒸馏至少两次，最后经冷冻干燥制成胡黄连提取物醇提取物，密闭干燥保存。1g醇提取物相当于3.5g生药。提取物的密度范围为1.0005～1.0269g/ml。浸泡提取过程中所采用的有机溶剂也可采用其他醇类，如甲醇等。
实施例一中制备得到的西藏胡黄连提取物用于以下实施例中的实验。
实施例二西藏胡黄连提取物延缓5/6肾切除大鼠慢性肾脏病的进展的实验(一)材料与方法一、实验动物分组雄性SD大鼠30只(南方医科大学实验动物中心提供)，体重231.56±23.75g，随机分为三组。胡黄连治疗组(n＝10)和手术对照组(n＝10)，行5/6肾切除手术，0.3％戊巴比妥钠35mg/kg腹腔注射麻醉，经背部切除左肾2/3，一周后切除右肾；假手术组(n＝10)，经背切口暴露肾脏，牵拉肾脏撕裂肾包膜后，放回原位，缝合切口。第二次术后一周开始，胡黄连治疗组给予胡黄连提取物灌胃(400mg/kg/d)，手术对照组和假手术组给与等体积生理盐水灌胃。至第九周处死所有大鼠。处死前一天禁食，自由饮水，放置代谢笼收集24小时尿液。0.3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，用50ml生理盐水从腹主动脉灌注肾脏，以去除循环中红细胞；摘取左肾，部分用生理盐水制作10％肾皮质匀浆，部分固定。
二、尿、血清学指标检测腹主动脉采血，3000r/min离心。考马斯兰亮法[1]测24小时尿蛋白含量。用自动生化分析仪测定血清白蛋白(ALB)、血尿素氮(Bun)、血肌酐(Scr)、尿肌酐，并计算肌酐清除率(Ccr)；DTNB法[2]测定血清硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx)活性；硫代巴比妥酸反应法[3]测定尿液丙二醛(MDA)；竞争ELISA法测血清晚期糖基化终产物(AGEs)[4]；晚期氧化蛋白产物(AOPP)测定参考文献的方法[5]，以氯胺T为标准曲线，测定酸性条件下340nm处吸光度值。
参考文献[1]Lott JA，Stephan VA，Pritchard KJEvaluation of the Coomassie Brilliant Blue G-250method for urinary protein[J].Clin Chem.1983，291946-1950[2]Flohe L，Gunzler WAAssays of glutathione peroxidase[J].Methods Enzymol.1984，105114-120 Obertop H，Malt RALost mass and excretion as stimuli to parabiotic compensatory renalhypertrophy[J].Am J Physiol.1977，232405-408[4]Hou FF，Boyce J，Chertow GM，Kay J，et al.Aminoguanidine inhibits advanced glycation endproducts formation on beta2-microglobulin[J].J Am Soc Nephrol.1998；9277-283[5]Yagi KA simle fluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma.Biochem Med15212-216，1973三、病理形态学观察部分肾组织经4％中性福尔马林缓冲液固定后，石蜡包埋切片，PAS、Masson染色行光镜检查，双盲法观察病理组织学改变。
肾小球硬化程度采用Reijis的半定量法(Raij L，Azar S，Keaue WMesangial immuneinjury，hypertention and progressive glomerular damage in Dahl rats[J].Kidney Int.198426137)，按肾小球的硬化面积分成0～4级。0级肾小球无硬化；1级肾小球硬化面积≤25％；2级26～50％；3级51％～75％；4级76％～全部肾小球硬化。肾小球硬化指数GI＝〔(1n1+2n2+3n3+4n4)/观察肾小球总数〕×100％，n1、n2、n3和n4分别代表分级为1、2、3和4的肾小球数。
间质病理损害程度的评定根据肾小管扩张、肾小管萎缩、肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管上皮细胞坏死、间质纤维化机肾间质炎症细胞浸润程度分0～3分0分正常或病变面积＜25％；1分病变面积25％～50％；2分病变面积50％～75％；3分病变面积＞75％。
四、统计学方法采用SPSS 10.0版统计软件包，正态分布计量资料用X±S表示。三组以上数据采用单因素方差分析比较。尿丙二醛(MDA)排泄率，血清晚期氧化蛋白产物(AOPP)、血清晚期糖基化终产物(AGEs)及血清硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx)含量与肌酐清除率的关系采用双变量相关分析。
(二)结果分析一、一般情况术后第九周胡黄连治疗组大鼠体重及残肾/体重与假手术组和手术对照组之间无显著性差异，结果见表1。
表1 各组大鼠体重及残肾重

注各组之间无显著性差异二、肾功能及尿蛋白变化西藏胡黄连提取物能明显减少5/6肾切除大鼠24小时尿蛋白含量(P＜0.01)，降低血清血尿素氮(Bun)，血肌酐(Scr)含量，升高肌酐清除率，但差异无显著性。与假手术组相比，手术对照组大鼠血尿素氮(Bun)和血肌酐(Scr)水平明显升高，肌酐清除率降低(P＜0.05)，24小时尿蛋白定量显著升高(P＜0.01)，结果见表2。
表2 各组大鼠肾功能的变化

注与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与治疗组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01三、肾脏病理改变西藏胡黄连提取物能明显减轻5/6肾切除大鼠肾小球硬化和肾小管间质损害程度，其半定量积分明显低于手术对照组大鼠(P＜0.05)。与假手术组相比，手术对照组大鼠肾小球硬化和肾小管间质损害程度显著加重(P＜0.01)。见表3。
表3 各组大鼠肾小球硬化指数和肾间质损害程度


注*与假手术组相比，P＜0.01；▲与治疗组相比，P＜0.05四、氧化应激水平的改变与手术对照组相比，西藏胡黄连提取物能明显升高5/6肾切除大鼠血清硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx)活性(P＜0.05)，减少尿丙二醛(MDA)排泄率(P＜0.05)，明显降低血清晚期氧化蛋白产物(AOPP)、血清晚期糖基化终产物(AGEs)水平(P＜0.05)。与假手术组相比，手术对照组大鼠血清硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx)活性显著降低(P＜0.05)，减少尿丙二醛(MDA)排泄率和血清晚期氧化蛋白产物(AOPP)、血清晚期糖基化终产物(AGEs)含量显著升高(P＜0.01)，结果见表3。且肌酐清除率与血清晚期氧化蛋白产物(AOPP)(r＝-0.483，P＜0.05)和血清晚期糖基化终产物(AGEs)(r＝-0.686，P＜0.01)含量呈负相关。见图1与图2。
表4 各组大鼠尿MDA排泄率及血浆氧化应激指标的变化

注与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与治疗组相比，▲P＜0.05结论本发明表明西藏胡黄连提取物能明显减少5/6肾切除大鼠24小时尿蛋白含量，减轻5/6肾切除大鼠肾小球硬化和肾小管间质损害程度，说明西藏胡黄连具有保护肾脏，延缓慢性肾脏疾病进展的作用。其机制可能与抑制慢性肾脏病时氧化应激有关。
实验例三西藏胡黄连提取物对糖尿病大鼠的肾脏保护作用研究(一)材料和方法1、动物分组及标本留取清洁级雄性SD大鼠30只，体重120-140g(购自南方医科大学实验动物中心)，适应性喂养3天后在3％戊巴比妥麻醉下行单肾摘除术，背部切口摘除左肾。7天后随机取20只，禁食16小时后单次腹腔注射链脲佐菌素(用0.1mol/L，pH4.5的柠檬酸缓冲液新鲜配制)55mg/Kg，余8只腹腔注射等量柠檬酸缓冲液做为对照组，7天后测血糖＞16.7mmol/L为糖尿病。将成模大鼠按血糖及体重随机分为糖尿病组8只，西藏胡黄连提取物处理组(300mg/Kg/d)8只，治疗组每天上午予西藏胡黄连提取物灌胃，糖尿病组予等量双蒸水灌胃。大鼠自由进食及饮水，治疗8周后留取24小时尿及血浆，自腹主动脉用冰生理盐水灌注肾脏，切除右肾，部分制作肾皮质匀浆，部分中性甲醛固定24小时后脱水，浸蜡，包埋，部分固定于2.5％的戊二醛，树脂包埋用于电镜检查。
2、肾功能和生化指标的检测葡萄糖氧化酶法测血糖，全自动生化分析仪测定血肌酐(SCr)、血白蛋白(ALB)、胆固醇(CH)、甘油三酯(TG)、尿肌酐(UCr)，并计算肌酐清除率(CCr)尿肌酐×尿量/血肌酐/大鼠体重。血浆AOPP测定以氯胺T为标准曲线，测定酸性条件下340nm的吸光度值。DTNB法测定血清及肾匀浆硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx)活性；硫代巴比妥酸反应法测定血清、尿液及肾匀浆丙二醛(MDA)；考马斯亮蓝法检测24小时尿蛋白定量；比色法测尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)(上海太阳生物技术有限公司试剂盒)。
3、肾组织病理学分析肾组织石蜡切片2μm行PAS染色，经图像分析系统对PAS染色切片进行分析，每张切片按顺时针方向随机取30个完整肾小球，经分析系统计算每个肾小球PAS阳性染色面积与整个肾小球面积之比值，然后求30个肾小球此比值的均数，即为每张切片肾小球细胞外基质的相对含量。电镜下每组选取3只大鼠标本放大30万倍照相，应用图像分析系统测定基底膜厚度。
4、统计分析所有数据用均数±标准差表示，多组数的比较采用单因素方差分析，统计应用SPSS11.0软件分析。
(二)结果分析1、西藏胡黄连提取物对大鼠体重及活动状态的影响与对照组相比，糖尿病大鼠出现明显的多饮、多食、多尿症状，精神状态差，体重均明显减轻(p均＜0.01)，西藏胡黄连提取物治疗可明显改善大鼠的精神和活动，治疗组大鼠体重减轻较未治疗组少(p均＜0.05)。见表5。
表5西藏胡黄连提取物对各组大鼠体重、肾质量指数、血糖、肌酐、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、尿蛋白、尿NAG酶、肌酐清除率的影响


dP＜0.05.cP＜0.01，vs NS group；eP＜0.05，fP＜0.01 vs DN group2、西藏胡黄连提取物对大鼠肾脏病理改变的影响糖尿病大鼠的肾脏均明显增大，糖尿病组和西藏胡黄连提取物治疗组肾脏质量指数均明显高于对照组(p均＜0.01)，但西藏胡黄连提取物治疗可明显降低糖尿病大鼠的肾质量指数(p均＜0.01)。肾脏病理检查则可见糖尿病大鼠的肾小球体积较对照组明显增大，系膜基质明显增加。西藏胡黄连提取物治疗可减轻肾小球体积的增大，减少系膜基质沉积。电镜检查可见糖尿病大鼠肾小球基底膜明显增厚，而西藏胡黄连提取物治疗可明显减轻基底膜的增厚。
3、西藏胡黄连提取物对大鼠肾脏功能的影响8周时糖尿病大鼠的24小时尿蛋白定量较对照组明显升高，尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)亦明显升高(p均＜0.01)，西藏胡黄连提取物治疗可明显降低糖尿病大鼠的尿蛋白及尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)(p＜0.05)。糖尿病大鼠的肌酐清除率较对照组明显升高(p均＜0.05)，西藏胡黄连提取物治疗8周对糖尿病大鼠的肌酐清除率无显著影响。血肌酐各组之间无显著差异。见表4。
4、西藏胡黄连提取物对大鼠血糖及血脂的影响西藏胡黄连提取物治疗可明显降低糖尿病大鼠的血糖，150mg/Kg剂量组下降18.88％，300mg/Kg剂量组下降26.67％，但未使之恢复正常。8周时糖尿病大鼠的血总胆固醇、甘油三酯均较对照组明显升高，血浆白蛋白明显下降(p均＜0.05)，西藏胡黄连提取物300mg/Kg治疗可明显降低糖尿病大鼠的总胆固醇，升高血浆白蛋白(p均＜0.05)，但对血甘油三酯未见显著影响。见表4。
5、西藏胡黄连提取物对糖尿病大鼠体内氧化产物及抗氧化酶含量的影响8周时糖尿病大鼠的血抗氧化酶指标GPx较对照组明显下降(p均＜0.01)，血MDA、AOPP则较对照组明显升高(p均＜0.01)，尿MDA排泄率均明显升高(p均＜0.01)，肾匀浆MDA、GPx均明显高于对照组。西藏胡黄连提取物治疗可明显降低糖尿病大鼠的血清AOPP、MDA水平，升高GPx水平，降低尿MDA排泄率，降低肾脏升高的MDA水平，改善GPx在肾脏的异常升高(p均＜0.05)。见表6。
表6西藏胡黄连提取物对血浆AOPP、MDA、GPx活性水平，肾匀浆MDA、GPx活性水平，尿MDA水平的影响。

dP＜0.05，cP＜0.01，vs NS group；eP＜0.05，fP＜0.01 vs DN group结论本发明首次证实了西藏胡黄连提取物可显著降低糖尿病大鼠尿蛋白和尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)含量，升高血浆白蛋白，减轻糖尿病大鼠肾小球基底膜增厚和系膜基质增生，并降低糖尿病大鼠的血糖、总胆固醇，表明西藏胡黄连对糖尿病肾损害具有防治作用。
实验例四西藏胡黄连提取物对急性缺血再灌注肾损伤的保护作用(一)材料和方法一、动物分组及给药方法选取健康雄性SD大鼠，体重200～250g左右(南方医科大学附属南方医院实验动物中心提供)随机分为以下各组(n＝8)1.假手术组；2.手术对照组(单纯缺血60min再灌注72h)手术前三天给大鼠灌胃2ml生理盐水，连续3天，术前2h灌胃一次；3.胡黄连提取物不同剂量预防+治疗组(40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg)手术前3天给大鼠灌胃胡黄连提取物，连续3天，术前2h灌胃一次，术后每天灌胃一次；4.胡黄连提取物预防组手术前3天给大鼠灌胃胡黄连提取物(160mg/kg)，连续3天，术前2h灌胃一次，术后不给药；5.胡黄连提取物治疗I组(早期给药组)手术前不给药，术后6h、30h各灌胃一次胡黄连提取物(160mg/kg)；6.胡黄连提取物治疗II组(晚期给药组)手术前不给药，术后于30h、54h各灌胃一次胡黄连提取物(160mg/kg)。
二、缺血再灌注肾损伤大鼠动物模型的制备急性缺血再灌注肾损伤动物模型制备手术前将大鼠禁食12小时，按动作要领抓取大鼠，3％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射，充分麻醉后固定于鼠板上，在无菌条件下取腹部正中切口切开皮肤，钝性分离腹肌，切口约4-5cm。进入腹腔后，先暴露右肾，钝性分离肾周脂肪及筋膜，游离出右肾动静脉，用缝合线双层结扎动静脉，切除右肾。然后暴露左肾，钝性分离肾周脂肪及筋膜，小心分离左肾动静脉及其分支，用无创动脉夹夹闭左肾动脉60min后打开动脉夹，观察肾脏由苍白变为鲜红，表明再灌注成功。缝合伤口后在正常条件下喂养72h，自由进食水，在规定时间留取标本。假手术组暴露双肾并分离肾周组织，不切除右肾及夹闭左肾动脉，其余处理同手术组。
三、标本的收集和处理在规定时间留取标本前24h将大鼠放入代谢笼，留取标本前12h禁食，先留取24h尿液，计算尿量，分装后-70℃冻存。在规定时间将大鼠充分麻醉后固定于鼠板上，腹主动脉取血，组织灌注后取左肾，收集血标本30min内4℃ 3000rpm离心10min，留取血清，分装后-70℃冻存。取左肾组织腹面半个肾组织，下极楔型切除约0.3cm3，切成0.5-1mm3大小，立即放入2.5％戊二醛磷酸盐缓冲液中固定，剩余部分置于10％中性甲醛固定液中固定。称取肾组织50mg，加入预冷的0.1M中性磷酸盐缓冲液3ml，电动匀浆器研磨制备组织匀浆，镜检未见完整细胞.离心(2000rpm×10min，4℃)组织匀浆，取上清液-80℃保存备用。另外半个肾组织立即将放入液氮冻存。
四、肾组织PAS染色观察肾组织形态学改变肾组织用10％中性甲醛固定液固定18小时以上后，经梯度乙醇脱水75％乙醇5min×3次→85％乙醇10min→85％乙醇+伊红10min→95％乙醇10min×2次→无水乙醇10min×2次，二甲苯透明3min×2次，浸腊(软蜡60℃、30min→硬蜡60℃、60min)，包埋蜡块，切2υm切片，75℃烤片45min。组织切片经二甲苯、梯度乙醇脱蜡至入水。2％高碘酸15min→水洗→Schiff液50min→水洗→苏木素复染15min→0.5％盐酸-乙醇→水洗分化→流水反蓝→梯度乙醇脱水→二甲苯透明后封片。光学显微镜下观察照相。并在显微镜下根据Paller氏法评定肾小管损伤分数10×20倍光镜下组织切片随机选取左上、左下、右上、右下及正中10个视野，每个视野观察10个肾小管，按照以下标准计分肾小管上皮细胞胞浆空泡样变性计1分，小管上皮细胞扁平计1分，刷状缘脱落计1分，上皮细胞坏死计2分，各种管型计2分，间质水肿计1分。
五、肾组织电镜下观察肾组织形态学改变肾组织(0.5-1mm3大小)在2.5％戊二醛中前固定12小时以上，0.1MPB磷酸盐缓冲液漂洗(PH 7.4)15min×5次，1％锇酸(0.24M PH 7.4)后固定1.5小时，固定后用缓冲液洗15min×3次；30％、50％、70％、90％丙酮逐级脱水每次15min，100％丙酮脱水3次，每次15分钟，包埋剂∶丙酮＝1∶1浸透1小时，包埋剂(spur)∶丙酮＝1∶2浸透2小时，纯树脂浸透3小时后包埋，60℃聚合24小时后，修块，AO型切片机切成60mm切片，选取呈银灰或黄色的超薄切片，醋酸双氧铀染色30分钟，枸橼酸铅染色10-15分钟，H-600电子显微镜观察。
六、生化法检测血肌酐、尿肌酐留取血、尿标本送南方医院检验科，用东芝全自动生化分析仪直接检测，并结合尿量计算内生肌酐清除率(Ccr)。Ccr＝尿肌酐/血肌酐×24尿量/1440(ml/min)七、肾组织匀浆和血浆TBARS检测采用硫代巴比妥酸反应法，以四乙氧基丙烷为标准，标准应用液的浓度为10nmol/ml。
结果计算MDA浓度＝f/F×10(nmol/ml)f由样本液测得的光密度F由标准液测得的光密度八、肾组织匀浆和血浆GSHPx检测改良DNTB比色法。
分光光度计于423nm波长处测定各管吸光度A，单位定义以每毫升血清于37℃每分钟使GSH浓度下降1μmol为一个酶活力单位。结果计算血清GSHPx活力(U/ml)＝(A非酶管-A测定管)A非酶管×100/3九、免疫组织化学检测肾组织ICAM-1、MCP-1和单核巨噬细胞计数取石蜡组织切5μm切片，经二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水化。室温下用3％过氧化氢孵育10min以灭活内原酶，用双蒸水洗2min×3次。将切片浸入枸橼酸缓冲液中，加热至96～100℃持续20min，室温下冷却。用PBS洗5min×3次。滴加1∶50正常山羊血清封闭液，室温下孵育20min。滴加1∶150稀释的兔抗鼠ICAM-1、MCP-1抗体，滴加1∶50稀释的兔抗鼠ED-1抗体，以非免疫兔IgG做阴性对照，切片置于湿盒内，放入4℃冰箱过夜。用PBS洗5min×3次，滴加羊抗兔-Evision二抗，37℃孵育30min。用双蒸水洗5min×3次，DAB显色5～10min，显微镜下观察，用双蒸水冲洗终止呈色反应。苏木素复染1min，0.5％盐酸-乙醇分化，温水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片。显微镜下观察照相。肾组织ICAM-1、MCP-1免疫组化结果半定量积分评价根据染色范围进行分析评定着色范围参照Hugo标准，阴性为0分，着色范围≤25％为1分，＞25％≤50％为2分，＞50％≤75％为3分，＞75％为4分。单核巨噬细胞计数采用目镜网格测位尺，即在光镜400倍下(网格测位尺面积25×25um2/网格)随机选取10个视野，计数所有阳性细胞数并取其平均值作为分析指标。
十、实时定量荧光PCR测定肾组织ICAM-1、MCP-1mRNA表达十一、统计学处理各组数据以均数±标准差表示，多个样本均数的比较用One-Way ANOVA，多重比较采用LSD检验，P＜0.05为具有统计学意义。所有统计由SPSS统计软件11.5完成。
(二)结果分析一、急性缺血再灌注肾损伤大鼠动物模型的建立SD大鼠切除右肾无创动脉夹夹闭左肾动脉60min再灌注72h后，血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)显著升高，尿肌酐(Ccr)降低，肌酐清除率下降，尿渗量降低，尿NAG酶升高。肉眼观察左肾肿大明显，重量增加，皮质缺血；镜下观察肾皮髓质交界处肾小管变性坏死明显，证明造模成功。
二、西藏胡黄连提取物对缺血再灌注后肾组织形态变化的影响1.光镜下缺血再灌注72h后，西藏胡黄连提取物各给药组与手术对照组均可见皮髓交界处肾小管上皮细胞刷状缘脱落、上皮细胞变性、坏死、脱落，小管腔内管型形成，间质水肿等病理改变，但各给药组肾组织病理改变轻于手术对照组。各预防+治疗组小管间质评分均低于手术对照组(P均为0.000)(表7)，随给药剂量的增加，肾组织病理改变逐渐减轻，小管间质评分下降，各剂量预防+治疗组之间小管间质评分有显著性差异(各剂量组之间P均为0.000)。预防组、治疗1组、治疗II组肾小管损伤分数均低于手术对照组(P＝0.000 P＝0.000 P＝0.019)，预防组、治疗I组、治疗II组肾小管损伤分数高于预防+治疗160mg/kg组(P＝0.02 P＝0.003 P＝0.000)，预防组、治疗I组小管间质评分数低于治疗II组(P＝0.000 P＝0.000)，预防组、治疗I组之间无显著性差异(P＝0.479)。
2.电镜下西藏胡黄连提取物各给药组与手术对照组均可见肾小管上皮细胞微绒毛肿胀、脱落，线粒体肿胀，嵴空泡变性、甚至消失，胡黄连提取物给药组的病变较手术对照组减轻。
表7 各组大鼠肾小管间质评分

△与假手术组相比P＜0.01；▲与缺血再灌注组相比P＜0.01；●与缺血再灌注组相比P＜0.05；One-Way ANOVA F值＝161.391，P＝0.000三、西藏胡黄连提取物对缺血再灌注后肾功能变化的影响与假手术组相比，缺血再灌注引起Scr升高，Ccr下降。各预防+治疗组Ccr高于手术对照组(P＝0.000 P＝0.000 P＝0.013)(表8)，并且随给药剂量的增加，Ccr逐渐升高，预防+治疗160mg/kg组与预防+治疗40mg/kg组之间有显著性差异(P＝0.013)，预防+治疗160mg/kg组与预防+治疗80mg/kg组之间无显著性差异(P＝0.054)；预防组、治疗I组、治疗II组Ccr高于手术对照组(P＝0.000 P＝0.000 P＝0.003)；预防组、治疗I组、治疗II组与预防+治疗160mg/kg组之间Ccr无显著显著性差异(P＝0.948 P＝0.732 P＝0.094)。
表8 各组大鼠Ccr变化


△与假手术组相比P＜0.01；▲与缺血再灌注组相比P＜0.01；●与缺血再灌注组相比P＜0.05；One-Way ANOVA F值＝13.952，P＝0.000四、西藏胡黄连提取物对缺血再灌注后氧化应激指标的影响1、西藏胡黄连提取物对肾组织和血浆TBARS的影响与假手术组相比，缺血再灌注引起肾组织和血浆TBARS升高，给予胡黄连提取物后，各预防+治疗组肾组织匀浆TBARS含量低于手术对照组(P均为0.000)(表9)，随着胡黄连提取物剂量的增加，肾组织匀浆TBARS含量逐渐降低，各剂量预防+治疗组之间肾组织匀浆TBARS含量有显著性差异(各剂量组之间P均为0.000)；预防组、治疗I组肾组织匀浆TBARS低于手术对照组(P＝0.008 P＝0.033)，治疗II组肾组织匀浆TBARS与手术对照组无显著性差异(P＝0.190)，预防组、治疗I组、治疗II组肾组织匀浆TBARS高于预防+治疗160mg/kg组(P均为0.000)，预防组、治疗I组、治疗II组三组之间无显著性差异(P＝0.563 P＝0.184 P＝0.433)。给予胡黄连提取物后，各预防+治疗组血浆TBARS含量低于手术对照组(P均为0.000)，随着胡黄连提取物剂量的增加，血浆TBARS含量逐渐降低，预防+治疗160mg/kg组与预防+治疗40mg/kg组之间有显著性差异(P＝0.000)，预防+治疗160mg/kg组与预防+治疗80mg/kg组之间无显著性差异(P＝0.404)；预防组、治疗I组、治疗II组血浆TBARS低于手术对照组(P均为0.000)，预防组、治疗I组、治疗II组血浆TBARS高于预防+治疗160mg/kg组(P均为0.000)，预防组、治疗I组血浆TBARS低于治疗II组(P＝0.000 P＝0.000)，预防组、治疗I组之间无显著性差异(P＝0.855)。
表9 各组大鼠血浆和肾组织TBARS水平


△与假手术组相比P＜0.01；▲与缺血再灌注组相比P＜0.01；●与缺血再灌注组相比P＜0.05。One-Way ANOVA，P＝0.0002、西藏胡黄连提取物对肾组织和血浆GSHPx的影响与假手术组相比，缺血再灌注引起肾组织和血浆GSHPx降低，给予胡黄连提取物后，各预防+治疗组肾组织匀浆GSHPx含量高于手术对照组(P均为0.000)(表10)，随着胡黄连提取物剂量的增加，肾组织匀浆GSHPx含量逐渐升高，预防+治疗160mg/kg组肾组织匀浆GSHPx含量高于预防+治疗80mg/kg组和预防+治疗40mg/kg组(P＝0.049P＝0.000)，预防+治疗80mg/kg组与预防+治疗40mg/kg组之间无显著差异(P＝0.083)；预防组、治疗I组肾组织匀浆GSHPx高于手术对照组(P均为0.000)，治疗II组肾组织匀浆GSHPx与手术对照组无显著性差异(P＝0.284)，预防组、治疗I组、治疗II组肾组织匀浆GSHPx低于预防+治疗160mg/kg组(P＝0.005 P＝0.000 P＝0.000)，预防组、治疗I组肾组织匀浆GSHPx高于治疗II组(P＝0.01 P＝0.008)，预防组、治疗I组之间无显著性差异(P＝0.929)。给予胡黄连提取物后，各预防+治疗组血浆GSHPx含量高于手术对照组(P均为0.000)(表10)，随着胡黄连提取物剂量的增加，血浆GSHPx含量逐渐降低升高，各剂量预防+治疗组之间血浆GSHPx含量无显著性差异(P＝0.424 P＝0.206 P＝0.667)；预防组、治疗I组、治疗II组血浆GSHPx低于手术对照组(P均为0.000)，预防组、治疗I组、治疗II组血浆GSHPx与预防+治疗160mg/kg组无显著性差异(P＝0.403 P＝0.114 P＝0.082)，预防组、治疗I组血浆GSHPx高于治疗II组(P＝0.013 P＝0.002)，预防组、治疗I组之间无显著性差异(P＝0.448)。
表10 各组血浆和肾组织匀浆GSHPx活性


△与假手术组相比P＜0.01；▲与缺血再灌注组相比P＜0.01；●与缺血再灌注组相比P＜0.05。One-Way ANOVA，P＝0.000五、西藏胡黄连提取物对缺血再灌注后炎症反应参数1.西藏胡黄连提取物对肾组织ICAM-1蛋白表达的影响假手术组肾脏组织ICAM-1未见明显表达，手术对照组肾脏ICAM-1表达明显，主要位于皮髓交界处的肾小管及间质，近曲及远曲小管均见阳性染色，肾小球表达不明显；胡黄连提取物给药组肾脏ICAM-1阳性染色明显弱于手术对照组。半定量结果显示，胡黄连提取物160mg/kg、80mg/kg预防+治疗组ICAM-1组化评分低于手术对照组(P＝0.000P＝0.000)，40mg/kg预防+治疗组ICAM-1组化评分与手术对照组无显著性差异(P＝0.188)，随着胡黄连提取物剂量的增加，ICAM-1组化评分逐渐降低，各剂量组之间有显著性差异(各剂量组之间P＝0.000)(表11)。预防组、治疗I组ICAM-1组化评分低于手术对照组(P＝0.000P＝0.000)，治疗II组ICAM-1组化评分与手术对照组无显著性差异(P＝0.147)，预防组、治疗I组、治疗II组ICAM-1组化评分高于160mg/kg预防+治疗组(P均为0.000)，预防组、治疗I组ICAM-1组化评分低于治疗II组I(P＝0.000 P＝0.000)，预防组、治疗I组之间无显著性差异(P＝0.249)。
表11 肾组织ICAM-1组化评分


△与假手术组相比P＜0.01；▲与缺血再灌注组相比P＜0.01；●与缺血再灌注组相比P＜0.05。One-Way ANOVA，F值＝279.988，P＝0.0002西藏胡黄连提取物对肾组织MCP-1蛋白表达的影响假手术组肾脏组织MCP-1未见明显表达，手术对照组肾脏MCP-1表达明显，主要位于皮髓交界处的肾小管及间质，近曲及远曲小管均见阳性染色，肾小球表达不明显；胡黄连提取物给药组肾脏MCP-1阳性染色明显弱于手术对照组。半定量结果显示，胡黄连提取物各预防+治疗组MCP-1组化评分低于手术对照组(P均为0.000，见表11)，随着胡黄连提取物剂量的增加，MCP-1组化评分逐渐降低，各剂量组之间有显著性差异(各剂量组之间P＝0.000)。预防组、治疗I组MCP-1组化评分低于手术对照组(P＝0.000)，治疗II组MCP-1组化评分与手术对照组无显著性差异(P＝0.298)，预防组、治疗I组、治疗II组MCP-1组化评分高于160mCkg预防+治疗组(P均为0.000)，预防组、治疗I组MCP-1组化评分低于治疗II组I(P＝0.000 P＝0.000)，预防组MCP-1组化评分低于治疗I组(P＝0.000)。
表11 各组大鼠肾组织MCP-1免疫组化评分

△与假手术组相比P＜0.01；▲与缺血再灌注组相比P＜0.01；●与缺血再灌注组相比P＜0.05。One-Way ANOVA F值＝233.881，P＝0.000
3西藏胡黄连提取物对肾组织ICAM-1mRNA表达的影响FQ-RT-PCR结果显示，假手术组大鼠肾组织ICAM-1mRNA表达量很低，手术对照组肾组织ICAM-1mRNA表达明显上调，各胡黄连提取物预防+治疗组ICAM-1mRNA低于手术对照组(P均为0.000，见图3、图4)，随着胡黄连提取物剂量的增加，肾组织ICAM-1mRNA表达量逐渐降低，各剂量组之间有显著性差异(各剂量组之间P＝0.000)。预防组、治疗I组、治疗II组ICAM-1mRNA表达量低于手术对照组(P均为0.000)，预防组、治疗I组、治疗II组ICAM-1mRNA表达量高于160mg/kg预防+治疗组(P均为0.000)，预防组ICAM-1mRNA表达量低于治疗I组、治疗II组(P＝0.000 P＝0.000)，治疗I组、治疗II组之间无显著性差异(P＝0.273，见表12)。
表12 各组大鼠肾组织ICAM-1mRNA的变化

*与假手术组比较P＜0.01；#与手术对照组比较P＜0.01。
4、西藏胡黄连提取物对肾组织MCP-1mRNA表达的影响FQ-RT-PCR结果显示，假手术组大鼠肾组织MCP-1mRNA表达量很低，手术对照组肾组织MCP-1mRNA表达明显上调，各胡黄连提取物预防+治疗组MCP-1mRNA低于手术对照组(P均为0.000，见图3、图4)，随着胡黄连提取物剂量的增加，肾组织MCP-1mRNA表达量逐渐降低，各剂量组之间有显著性差异(各剂量组之间P＝0.000)。预防组、治疗I组、治疗II组MCP-1mRNA表达量较手术对照组降低(P均为0.000)，预防组、治疗I组、治疗II组MCP-1mRNA表达量高于160mg/kg预防+治疗组(P＝0.035 P＝0.000 P＝0.000)，预防组、治疗I组MCP-1mRNA表达量低于治疗II组(P＝0.000)，预防组MCP-1mRNA表达量低于治疗I组(P＝0.000，见表13)。
表13 各组MCP-1mRNA的变化

*与假手术组比较P＜0.01；#与手术对照组比较P＜0.015、西藏胡黄连提取物对肾组织巨噬细胞浸润程度的影响免疫组化结果显示，假手术组几乎未见巨噬细胞浸润，缺血再灌注后各组肾组织均可见明显巨噬细胞浸润，给予胡黄连提取物后，各预防+治疗组巨噬细胞数目少于手术对照组(P均为0.000，见表14)。随着胡黄连提取物剂量的增加，肾组织中巨噬细胞数目逐渐减少，各剂量组之间有显著性差异(各剂量组之间P＝0.000)。预防组、治疗I组巨噬细胞数目少于手术对照组(P＝0.000 P＝0.000)，治疗II组巨噬细胞数目与手术对照组无显著性差异(P＝0.180)，预防组、治疗I组、治疗II组巨噬细胞数目多于预防+治疗160mg/kg组(P均为0.000)，治疗II组巨噬细胞数目多于预防组、治疗I组(P＝0.000 P＝0.000)，预防组、治疗I组之间无显著性差异(P＝0.086)。
表14 肾组织巨噬细胞计数


△与假手术组相比P＜0.01；▲与缺血再灌注组相比P＜0.01；●与缺血再灌注组相比P＜0.05。One-Way ANOVA，F值＝144.255，P＝0.000结论胡黄连提取物呈剂量依赖关系保护缺血再灌注肾损伤，且预防性或早期给予胡黄连提取物的保护作用较后期给药明显，其作用机制与抗氧化和抑制炎症反应作用有关。
实施例三以西藏胡黄连配制的口服剂型本发明所述的西藏胡黄连可以配制成片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、口服液等口服剂型。
(一)制成片剂将西藏胡黄连经醇提后的提取物，加入适量润滑剂制成软材，用10目筛制粒，干燥，干粒加入硬脂酸镁，混匀，压片机压片成片剂，薄膜包衣，分装，即得包衣片剂。
(二)制成胶囊剂将西藏胡黄连经醇提后的提取物，喷雾干燥制成粉末，过100-120目左右筛，与辅料混合均匀，装胶囊，分装，即得胶囊剂。
(三)制成颗粒剂将西藏胡黄连经醇提后的提取物，加入赋形剂，制粒，干燥，过8-10目筛，分装，制成颗粒剂。
(四)制成散剂将西藏胡黄连粉碎，加入适量赋形剂后混匀，分装，制成散剂。
(五)制成口服液将西藏胡黄连经醇提后的提取物，加水溶解，加入矫味剂，加水调节容量，制成口服液。
(六)使用方法成人0.5～2g(以原料计)，2～3次/日，口服。儿童减半。
权利要求
1.西藏胡黄连在制备治疗肾脏疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肾脏疾病包括慢性肾脏疾病、糖尿病肾病、急性缺血再灌注导致的肾脏损伤。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于采用西藏胡黄连的根茎的醇提取物。
4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于采用将西藏胡黄连的根茎风干后粉碎成颗粒状粉末，浸泡于50-95％乙醇或甲醇中，室温过夜提纯，过滤，蒸馏，经冷冻干燥制成的西藏胡黄连提取物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述西藏胡黄连提取物的密度范围为1.0005～1.0269g/ml。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的口服剂型包括片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、散剂。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于采用西藏胡黄连与其他治疗肾脏疾病的药制成复方制剂。
全文摘要
本发明涉及西藏胡黄连的新用途，具体是西藏胡黄连在制备治疗肾脏疾病药物中的应用。本发明所述的肾脏疾病包括慢性肾脏疾病、糖尿病肾病、急性缺血再灌注导致的肾脏损伤。采用西藏胡黄连的根茎的醇提取物。药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型。本发明通过各种动物模型及实验证明，西藏胡黄连对各种肾脏疾病均有确切的疗效。由于西藏胡黄连来源方便、广泛，提取物的制备方法简单，不需要贵重仪器设备和试剂，因此本发明提供了一种简便、价廉、高效的治疗肾脏疾病的药物。
文档编号A61P13/00GK1943671SQ20061003718
公开日2007年4月11日 申请日期2006年8月24日 优先权日2006年8月24日
发明者刘尚喜, 侯凡凡, 梁敏 申请人:南方医科大学