胡黄连苷i在制备治疗乙型肝炎药物中的应用及其制剂和制备方法

专利名称：胡黄连苷i在制备治疗乙型肝炎药物中的应用及其制剂和制备方法
技术领域：
本发明属于中药新药研发领域，具体而言，涉及胡黄连苷I在制备治疗乙型肝炎药物中的应用，并提供了胡黄连苷I的制备方法及其治疗乙型肝炎的药物制剂。
背景技术：
众所周知，中国是一个乙肝疾病大国。目前，全世界估计有600种以上用于治疗病毒性肝炎的药物，但至今尚无令人满意的治疗药物。世界卫生组织西太平洋地区永远荣誉主席韩相泰博士表示，现时最常用的治疗乙型肝炎药物是细胞干扰素(Cytokine Interferon)及核苷类似物(Nucleoside Analogues)。常用的细胞干扰素包括干扰素-α，干扰素必须每天注射，副作用较多，包括出现头痛及发烧等流感征状、肌肉痛、抑郁及腹泻等，用药与否也取决于肝功能，若肝功能已严重损坏，则不适合使用干扰素。另一种细胞干扰素Peg-intron也在开始使用。至于常用的核苷类似物，则包括拉米夫定(Lamivudine)及阿德福韦(Adefovir)。拉米夫定被用作治疗慢性乙型肝炎，属口服药物，副作用少，抑制病毒的效能高，但长期服用会出现耐药性，制造出变种的病毒。阿德福韦毒副作用少，此药亦用于抑制爱滋病毒的研究，但研究发现大剂量服用会影响肾功能，肾功能不良者不宜使用。使用细胞干扰素与核萁类似物的缺点之一，都在于长期使用会导致严重的副作用。部分调节免疫系统的药物例如胸腺肽(Thymosin)亦被发现有治疗功效，但目前未被广泛用作治疗乙型肝炎，因为详细的治疗功效不及其它药物清楚，价格亦相当昂贵。
到目前为止，没有一种药物对于抑制乙型肝炎有绝对效用。韩相泰博士认为，在未来治疗乙型肝炎的方法上，中草药可以担当一个重要的角色。世界卫生组织亦已将中药治疗乙型肝炎作为未来新导向，并希望以中西合璧作为未来的疗法。因此人们把目光逐渐集中到中草药治疗乙肝上来。
中医过去一直惯用中草药治疗乙型肝炎，应用中药治疗肝炎已经历了长期的实践，也积累了丰富的经验。中草药治疗乙型肝炎价钱便宜、疗效可靠而且副作用小，已越来越成为我国治疗乙肝的主要药物。乙型肝炎的中药治疗包括以下几种方法(1)清肝利湿促进黄疸消退；(2)活血化瘀改善肝脏微循环；(3)调理气血调动全身免疫机能；(4)健脾益肾改善肝炎的临床症状；(5)滋阴、补气，治疗各种并发症。但中草药在治疗乙型肝炎的有效性及安全性方面均欠缺科学数据。为此，迫切需要为众多的乙型肝炎疾病患者提供药理作用明确，药效高，毒副作用低的治疗乙型肝炎的药物。
中药胡黄连原出于《唐本草》谓其“大寒”，“主骨蒸劳热，补脾胆，明目”。《新修本草》曰“主骨蒸劳热，补肝胆，明目，……厚肠胃”。《开宝本草》谓其“味苦、平、无毒”。《雷火炝制药性解》中，其归经“入肝、胆、胃三经”。缪希雍《本草经疏》曰“胡黄连，善除湿热，……一切湿热，邪热，阴分伏热所生诸病，莫不消除。”《药品化义》曰“胡黄连，独入血分而清热。”《本草正义》言“湿火结聚，非此不能直达病所。”胡黄连善除湿热、消积聚，补肝胆，可清除慢性乙型肝炎的湿热病邪，保肝胆以助除疫毒，为彻底治疗本病提供了依据。
胡黄连是玄参科植物胡黄连Picrorhiza scrophulariifloraPennell干燥根茎，是多年生草本植物，生长于高寒地区的岩石上及土堆中，或者浅土层的向阳处，分布于四川西部，云南西北部、西藏南部。据文献记载，胡黄连中含有环烯醚萜苷类、葫芦素类、酚苷类，另外还含有少量的芳香酸和D-甘露醇，其中胡黄连苷I(Picroside I)是属于环烯醚萜苷类化合物。有关胡黄连苷I的制备方法及其在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用还未见报道。
本发明人采用传统中医理论和现代科学成果相结合，采用先进的提取分离纯化技术，从中药胡黄连药材中提取其治疗乙肝的有效成分胡黄连苷I，使其含量超过90％，并对胡黄连苷I及其相应的药物制剂进行了治疗乙型肝炎的药效学、药理毒理学研究，结果发现该单体药理作用清楚，具有抑制乙型肝炎病毒复制、保肝降酶、利胆退黄、免疫调节等效果，毒副作用极低，使用安全性高，可为广大乙肝患者提供一种高效低毒的中药新药。

发明内容
本发明的目的在于提供一种胡黄连苷I的医疗用途，具体而言，是在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供胡黄连苷I的制备方法及其治疗乙型肝炎的药物剂型。
本发明进一步提供了含有胡黄连苷I的用于治疗乙型肝炎的中药组合物。
胡黄连苷I(Picroside I)属于环烯醚萜苷类化合物。该化合物为白色无定型粉末，易溶于水和甲醇，熔点100-102℃。分子式为C24H28O11，结构式如下 本发明提供了具有工业价值的胡黄连苷I的制备方法。其分离纯化方法快速、简单、实用，生产成本较低，极有利于工业化生产。
本发明提供的胡黄连苷I提取、分离、纯化的方法如下(1)提取取西藏胡黄连(Picrorhiza scrophulariiflora Pennell)和印度胡黄连(Picrorhiza kurroa Royle ex Benth)的干燥根茎或其粉碎品，用水、乙醇、丙酮等溶剂或其二种、多种混合溶剂提取，提取液在70℃以下减压浓缩至干(或无有机溶剂)，加水至合适的体积，离心除沉淀，得上清液；(2)分离上清液通过常规处理好的吸附柱，分别用水及不同浓度的乙醇洗脱，收集含薄层检识有胡黄连苷I的洗脱液，70℃以下减压浓缩、真空干燥，粉碎，得胡黄连苷I粗品；(3)纯化将胡黄连苷I粗品用无水乙醇溶解，过滤，滤液拌入硅胶，水浴挥干溶剂，加载于硅胶柱顶端，用乙酸乙酯、丙酮或其二者的混合溶剂洗脱，收集流出液，减压干燥，粉碎得胡黄连苷I样品。
上述提取过程中所用的胡黄连药材可以是纯天然的药材，也可以是人工繁殖的药材。采用人工种植的胡黄连药材可以保证药材的来源稳定，质量可控，且可降低生产成本。
上述提取过程中所用的胡黄连药材可以粉碎成10～30目大小的粒度，可以有利于有效成分的提取。
上述提取过程中所用的溶剂可以是水、乙醇、丙酮，既可以单独使用，也可以以两种或两种以上的溶剂合并使用。采用的提取方法可以用回流、渗漉或者索氏提取器提取。
上述分离过程中所用的填充吸附柱的填料可以是非极性或弱极性的树脂，如苯乙烯型(包括甲基苯乙烯型、乙基苯乙烯型)、丙烯腈型树脂等，具体可采用D-101型、ZTC型、AB-8型等。
上述提取、分离、纯化过程中的最优条件可通过L9(34)正交表进行正交筛选实验，以胡黄连苷I的含量和转移率为指标，筛选出最佳实验条件。
按照上述方法制得的胡黄连苷I样品中胡黄连苷I含量在95％以上，转移率在55％以上。提取结果稳定，重复性好，可用于规模化生产。
本发明所述的胡黄连苷I在用于治疗乙型肝炎时疾病时，可以单独使用，也可以通过含有胡黄连苷I的药物组合物的形式使用。
本发明提供的药物组合物可按本领域内已知方法制备，并可通过口服、舌下、经皮、肌肉或皮下、皮肤粘膜、尿道、阴道或静脉等途径给药。
本发明提供了以胡黄连苷I为活性成分，用于治疗乙型肝炎的药物制剂和相应的药物剂型。该药物制剂是以上述胡黄连苷I为有效活性成分，并包括了药剂学上可接受的其他辅料组分，其中所述的胡黄连苷I含量超过90％，最好高于95％。本发明的药物制剂包括口服剂和非肠道给药制剂，其中口服剂包括胶囊剂、口服液、口嚼剂、丸剂、片剂、颗粒剂等，非肠道给药制剂包括注射液剂型及注射用冻干粉针剂型等。本发明的药物制剂还包括局部给药制剂，包括霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。本发明所述的剂型并不限于此。
在制备口服制剂时可选用的辅型剂可以是淀粉、糊精或环糊精、蔗糖、硬脂酸盐等常规充填剂。在制备冻干粉针剂可以通过无菌喷雾干燥、低温真空干燥、冷冻干燥等方法制备。各制剂的后期制备工艺及设备均属制药领域的常规技术，本发明对此不作限定，故在此不予详述。
本发明的创造性在于通过系列实验证明胡黄连苷I具有明显的治疗乙型肝炎的作用。为了证明胡黄连苷I对乙型肝炎有治疗作用，包括对急性、慢性乙型肝炎的治疗作用，发明人使用上所述方法制得的胡黄连苷I及相应的药物剂型，采用了不同的动物模型，通过口服和注射途径进行了大量的动物实验，实验结果表明(1)对四氯化碳、D-胺基半乳糖和对乙酰氨基酚造成急性肝损伤大鼠和小鼠的肝脏有明显的预防保护和治疗作用；(2)对免疫性肝炎和四氯化碳造成慢性肝损伤大鼠的肝脏有明显的预防保护和治疗作用；(3)能明显增加正常大鼠胆汁中的直接胆红素含量，即有明显的利胆作用；(4)可增加异硫氰酸-1-奈酯(ANIT)致黄疸性肝损伤小鼠血清中的直接胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)含量，即对异硫氰酸-1-奈酯致小鼠黄疸性肝损伤有明显的治疗作用；(5)能明显增加正常小鼠巨噬细胞吞噬指数，对非特异性免疫功能具有明显的增强作用；(6)可明显增加在正常小鼠免疫器官重量，促进溶血素的生成，具有增强体液免疫功能的作用；(7)对鸭乙型病毒性肝炎有明显的治疗作用；(8)能明显降低2.2.15细胞培养上清液中乙肝病毒表面抗原和e抗原的含量。
本发明的主要药效学实验方法及结果如下实验一 注射用胡黄连苷I对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的治疗作用通过检测小鼠血清ALT、AST的变化来观察注射用胡黄连苷I对D-氨基半乳糖(D-Galn)致小鼠急性肝损伤的保护作用。取昆明种小鼠按体重随机分为空白对照组、模型对照组、甘利欣组(50mg/kg)、注射用胡黄连甘-I小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(15mg/kg)三个剂量组，除空白对照组外，其余各组均腹腔注射1000mg/kg的D-氨基半乳糖造成小鼠急性肝损伤，各给药组于造模后1h，11h及21h按0.1mL/10g体积静脉注射给药，造模22h后，摘眼球取血测血清ALT、AST值，并计算肝脏系数。结果见下表。
表1注射用胡黄连苷I对D-氨基半乳糖致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响(x±s)


注与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较△△△P＜0.001。
表2注射用胡黄连苷I对D-氨基半乳糖致急性肝损伤小鼠肝脏系数的影响(x±s)

注与空白对照组比较△P＜0.05。
上述实验结果表明注射用胡黄连苷I小、中、大三个剂量组与模型对照组相比，ALT、AST值均有显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
结论注射用胡黄连苷I对D-氨基半乳糖诱发的小鼠急性肝损伤有明显的治疗作用。
实验二 注射用胡黄连苷I对CCl4致大鼠慢性肝损伤的预防保护作用观察注射用胡黄连苷I对CCl4致大鼠慢性肝损伤的预防保护作用。取Wistar大鼠雌雄各半，根据体重随机分为空白对照组、模型对照组、甘利欣组(30mg/kg)、注射用胡黄连苷I小(3.5mg/kg)、中(7mg/kg)和大(10mg/kg)剂量组。各给药组均尾静脉注射给药，每日1次，连续给药4周。给药7天后，除空白对照组大鼠外，其余各大鼠均皮下注射25％CCl4花生油溶液2mL/kg，每周2次，共3周，造成慢性肝损伤模型。于末次给药后24小时腹主动脉取血，测定血清ALT、AST、TP、ALB、MDA、SOD、GSH含量及肝糖原、肝羟脯氨酸。结果见下表。
表3 注射用胡黄连苷I对CCl4致大鼠慢性肝损伤血清AST、ALT的影响(x±s)

注与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与空白对照组比较△△△P＜0.001。
表4 注射用胡黄连苷I对CCl4致大鼠慢性肝损TP、ALB的影响(x±s)


注与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与空白对照组比较△△P＜0.01。
表5 注射用胡黄连苷I对CCl4致大鼠慢性肝损伤的肝糖原和肝脏羟脯氨酸的影响(x±s)

注与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较△△△P＜0.001。
表6 注射用胡黄连苷I对CCl4致大鼠慢性肝损伤血清中MDA、SOD、GSH含量的影响(x±s)


注与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与空白对照组比较△P＜0.05，△△△P＜0.001。
上述实验结果表明注射用胡黄连苷I能明显降低血清ALT、AST、MDA及肝羟脯氨酸，升高SOD、GSH、TP、ALB及肝糖原值，具有显著性差异(P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001)。
结论注射用胡黄连苷I对CCl4致大鼠慢性肝损伤有明显的预防保护作用。
实验三 胡黄连苷I对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的治疗作用观察胡黄连苷I口服给药对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的治疗作用。取Wistar大鼠采用四氯化碳(CCl4)造成慢性肝损伤后，随机分为模型对照组、联苯双酯组(150mg/kg)、胡黄连苷I小(15mg/kg)、中(30mg/kg)、大(60mg/kg)剂量组，并设立空白对照组平行操作。各组连续灌胃给药，连续给药4周。空白对照组和模型对照组给予等体积生理盐水。于末次给药后24小时，各组动物麻醉后进行腹主动脉取血，分离血清，测血清ALT、AST、TP、ALB值，并取肝脏做病理组织检查，测定肝脏羟脯氨酸及肝糖元含量。结果见下表。
表7胡黄连苷I对慢性肝损伤大鼠血清ALT、AST、A/G的影响(x±s)


注与空白对照组比较，△△△P＜0.001；与模型对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001。
表8胡黄连苷I对慢性肝损伤大鼠肝糖元、羟脯氨酸含量及肝系数的影响(x±s)

注与空白对照组比较，△△P＜0.01△△△P＜0.001；与模型对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001。
上述实验结果表明胡黄连苷I小、中、大剂量组与模型对照组比较，ALT、肝羟脯氨酸明显降低(P＜0.05)，肝糖元明显升高(P＜0.05)；胡黄连苷I中、大剂量组与模型对照组比较AST、肝系数明显降低，A/G比例明显升高(P＜0.05)。病理检查结果提示各给药组与模型对照组比较无明显差别。
结论胡黄连苷I对四氯化碳所致大鼠慢性肝损伤有明显的治疗作用。
实验四 注射用胡黄连苷I对正常小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响观察注射用胡黄连苷I对正常小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响。将ICR小鼠随机分空白对照组、环磷酰胺组(50mg/kg)、左旋咪唑组(30mg/kg)、注射用胡黄连苷I小剂量组(5mg/kg)、中剂量组(10mg/kg)、大剂量组(15mg/kg)，共6组，环磷酰胺组每日按0.02mL/10g腹腔注射给药，左旋咪唑组按0.2mL/10g灌胃给药，注射用胡黄连苷I各剂量组均按0.1mL/10g体积尾静脉注射相应药物，空白对照组尾静脉注射等体积生理盐水，每日一次，连续7天。末次给药后24h，进行碳廓清实验，计算吞噬指数。同时取小鼠肝和脾脏进行称重，计算脏器系数。结果见下表表9注射用胡黄连苷I对正常小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响(x±s)


注与空白对照组比较△P＜0.05 △△P＜0.01表10 注射用胡黄连苷I对实验动物脏器系数的影响(x±s)

注与空白对照组比较△△△P＜0.001上述实验结果表明注射用胡黄连苷I中、大剂量组与空白对照组比较，吞噬指数均有所上升，经统计学处理差异均具有显著性(P＜0.05)，脏器系数则无明显变化(P＞0.05)。
结论注射用胡黄连苷I对非特异性免疫功能具有明显的增强作用。
实验五 注射用胡黄连苷I对正常小鼠体液免疫功能的影响通过观察注射用胡黄连苷I对正常小鼠溶血素生成的影响，来检测其对体液免疫功能的影响。将ICR种小鼠按体重随机分为6组，即空白对照组，左旋咪唑(30mg/kg)组，环磷酰胺组(20mg/kg)组，注射用胡黄连苷I小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(15mg/kg)剂量组，其中除左旋咪唑组按0.2mL/10g灌胃给药外，各组均按0.1mL/10g尾静脉注射相应药物，连续8天。给药第二天，各组小鼠腹腔注射CRBC悬液0.2mL，连续7天，于末次免疫后1h，取血进行溶血素OD值测定，取胸腺、脾脏称重、计算脏器系数。结果见下表。
表11 注射用胡黄连苷I对正常小鼠免疫器官的影响(x±s)

注与空白对照组比较△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
表12 注射用胡黄连苷I对正常小鼠溶血素含量的影响(x±s)


注与空白对照组比较△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001上述实验结果表明与空白对照组比较注射用胡黄连苷I中、大剂量组溶血素OD值均明显升高，经统计学处理差异均有显著性(P＜0.05、P＜0.001)。与空白对照组比较注射用胡黄连苷I大剂量组脾脏系数明显升高，经统计学处理差异有非常显著性(P＜0.01)。
结论注射用胡黄连苷I有增强正常小鼠体液免疫功能的作用。
实验六 注射用胡黄连苷I对正常大鼠的利胆作用通过观察注射用胡黄连苷I对胆汁分泌量及胆汁中直接胆红素含量的影响，研究注射用胡黄连苷I的利胆作用。方法取Wistar雄性大鼠50只，体重220～240g，根据体重随机分为空白对照组、阳性药苯丙醇胶丸组(250mg/kg)、注射用胡黄连苷I小(3.5mg/kg)、中(7mg/kg)和大(10mg/kg)剂量组，共5组。大鼠麻醉后打开腹腔，作胆总管插管引流胆汁，收集药前0h～0.5h胆汁，然后分别从舌下静脉给药1mL/100g，收集给药后0h～0.5h，0.5h～1.0h，1.0h～1.5h，1.5h～2.0h，2.0h～2.5h，2.5h～3.0h的胆汁流量并测定直接胆红素含量。结果见下表。
表13 注射用胡黄连苷I对大鼠胆汁流量的影响(x±s)


注与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与自身给药前比较△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
表14注射用胡黄连苷I对大鼠胆汁直接胆红素的影响(x±s)



注与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与自身给药前比较△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
上述实验结果表明注射用胡黄连苷I各剂量组与空白对照组相比，各时间段胆汁流量均有不同程度升高，且可明显增加胆汁中的直接胆红素含量(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001)。
结论注射用胡黄连苷I有明显的利胆作用。
实验七 注射用胡黄连苷I对异硫氰酸-1-奈酯致小鼠黄疸性肝损伤的治疗作用通过检测小鼠血清总胆红素(TBIL)、结合胆红素(DBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的变化来观察注射用胡黄连苷I对黄疸性肝损伤的治疗作用。昆明种小鼠按体重随机分为空白对照组、模型对照组、阳性茵栀黄(200mg/kg)、注射用胡黄连苷I小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(15mg/kg)剂量组共6组，每组12只。除空白对照组外，其余各组均按0.1mL/10g灌服ANIT(100mg/kg)花生油溶液造成小鼠急性黄疸模型，造模后6h、24h、47h给药三次。末次给药后1小时(即造模后48小时)，各组动物摘眼球取血，离心血清测TBIL、DBIL、ALT、AST。取肝脏，称重计算脏器系数。结果见下表。
表15注射用胡黄连苷I对ANIT致小鼠黄疸性肝损伤血清TBIL和DBIL的影响(x±s)

注与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较△△△P＜0.001。
表16 注射用胡黄连苷I对ANIT致小鼠黄疸性肝损伤血清ALT和AST的影响(x±s)


注与模型对照组比较*P＜0.05；与空白对照组比较△△△P＜0.001。
上述实验结果表明注射用胡黄连苷I中、大剂量组与模型对照组比较，血清TBIL、ALT值均明显降低，经统计学处理具有显著性差异(P＜0.05)。其余各指标与模型对照组比较，无明显差异(P＞0.05)。
结论注射用胡黄连苷I对小鼠黄疸性肝损伤有明显的治疗作用。
实验八 注射用胡黄连苷I对鸭乙型病毒性肝炎的影响观察注射用胡黄连苷I对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的影响。实验设6组，正常对照组、模型组、阳性药组(拉米夫定20mg/kg)、注射用胡黄连苷I小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)剂量组，除正常对照组外，其余各组均采用麻鸭乙肝模型，给药采用静脉途径，分别检测给药前(T0)、给药后第5天(T5)、第10天(T10)和停药后第3天(P3)鸭血清中DHBV-DNA和前s表面抗原(DHBpresAg)的含量。实验重复三批。结果见下表。
表17 注射用胡黄连苷I(HD-I)对鸭血清DHBV-DNA含量的影响


注*成对t检验给药组不同时间(T5、T10、P3)鸭血清DHBV-DNA平均光密度值与未给药前(T0)平均光密度值比较。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
△组间t检验给药组不同时间(T0、T5、T10、P3)鸭血清DHBV-DNA平均光密度值与模型组(T0、T5、T10、P3)平均光密度值比较。△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001表19 注射用胡黄连苷I(HD-I)对鸭血清DHBpresAg水平的影响


注*成对t检验给药不同时间(T5、T10、P3)鸭血清DHBpresAg OD值与未给药前(T0)OD值比较。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
△组间t检验给药组不同时间(T0、T5、T10、P3)鸭血清DHBpresAg OD值与模型组(T0、T5、T10、P3)OD值比较。△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
上述实验结果表明对鸭血清中DHBV-DNA含量测定结果为三批实验中注射用胡黄连苷I小、中、大剂量组给药后第5天、第10天和停药后第3天的鸭血清DHBV-DNA平均光密度值与给药前比较有显著性下降(P＜0.001或者P＜0.01)；注射用胡黄连苷I小、中、大剂量组给药后第5天、第10天和停药后第3天的血清DHBV-DNA水平分别与相应的模型组给药后第5天、第10天和停药后第3天相比均有显著性下降(P＜0.001或者P＜0.01或者P＜0.05)，并具有一定的剂量效应关系。对鸭血清中DHBpresAg含量测定结果为三批实验中注射用胡黄连苷I小、中、大剂量组给药后第5天、第10天和停药后第3天的鸭血清DHBpresAg OD值与给药前比较有显著性下降(P＜0.001或者P＜0.01或者P＜0.05)；注射用胡黄连苷I小、中、大剂量组给药后第5天、第10天和停药后第3天的血清DHBpresAg水平分别与相应的模型组给药后第5天、第10天和停药后第3天相比均有显著性下降(P＜0.001或者P＜0.01或者P＜0.05)。
结论注射用胡黄连苷I体内对鸭乙肝病毒具有较明显的抑制作用。
实验九 注射用胡黄连苷I对乙肝病毒抑制作用的体外研究体外观察注射用胡黄连苷I对乙肝病毒(HBV)是否具有抑制作用。用MTT法检测注射用胡黄连苷I对2.2.15细胞的毒性；用ELISA方法检测不同浓度注射用胡黄连苷I作用于2.2.15细胞不同时间后细胞培养上清中HBV相关抗原—表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的含量，计算药物对细胞的半数毒性浓度(TC50)和对抗原的半数抑制浓度(IC50)，以TC50和IC50的比值(即治疗指数)来评价药物的有效性和安全性，TI＞2为安全有效。同时设置正常对照组，空白对照组，及阳性药拉米夫定(3TC)组平行操作。结果见下表。
表20 注射用胡黄连苷I对HbsAg和HBsAg的治疗指数

注判定标准为TI＞2为有效；1≤TI≤2为有毒有效；TI＜1为毒性作用。
上述实验结果说明三批实验注射用胡黄连苷I对HBsAg和HBeAg治疗指数的平均值分别为2.97和4.83；阳性药拉米夫定对HBsAg的治疗指数是4.83，对HBeAg没有抑制作用。
结论注射用胡黄连苷I体外对HBV具有明显的抑制作用。
药效学实验结果表明胡黄连苷I不但具有较好的保肝降酶、利胆退黄和免疫调节作用，而且还具有显著的抗乙肝病毒作用。
为了研究胡黄连苷I对机体可能存在的毒性作用，评价利用该单体制备成的中药药物的用药安全性，本发明人进行了一般毒性实验和特殊毒性实验。
一、一般毒性实验1.急性毒性研究实验结果表明胡黄连苷I的注射剂型静脉注射给药对小鼠的LD50值为1040mg/kg，静脉注射给药对大鼠的LD50值为171.4mg/kg，腹腔注射给药对大鼠的LD50为552mg/kg药物对动物的重要组织和脏器无明显急性毒性损伤。
2.长期毒性研究(1)胡黄连苷I注射剂型腹腔注射给药对大鼠的长期毒性研究共设4组，分别为溶剂对照组(等体积生理盐水)，胡黄连苷I注射剂型的小40mg/(kg·d)、中150mg/(kg·d)和大300mg/(kg·d)三个剂量组，分别相当于药效学有效剂量的5倍、21倍、42倍。以动物给药前后的一般表现、体重、摄食量、血液学及血清生化指标、尿常规、骨髓分类、脏器重量、脏器系数为检测指标，并辅以动物各组织脏器的病理学检查，综合评价药物的毒性情况。结果显示，胡黄连苷I注射剂型大剂量组动物体重增长缓慢，其余各项指标均正常。中、小剂量组动物的各项检测指标亦未见明显异常。病理组织学检查结果显示，三个剂量组动物各组织脏器未见异常。可认为中剂量以下为安全剂量。
(2)胡黄连苷I注射剂型静脉滴注给药对Beagle的长期毒性研究共设4组，分别为溶剂对照组(等体积生理盐水)，胡黄连苷I注射剂型小20mg/(kg·d)、中77.46mg/(kg·d)和大150mg/(kg·d)三个剂量组。分别相当于药效学有效剂量的10、40和70倍。观测指标同上。结果显示，大、中、小剂量组动物各项检测指标亦未见异常。病理检测结果提示，三个剂量组动物各重要组织脏器无明显异常。
综合上述两个长期毒性研究结果，我们认为注射用胡黄连苷I毒性较低，安全范围广，远远超过药效学有效剂量的范围。
二、特殊毒性实验1.胡黄连苷I的致突变作用研究通过“鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验”、“中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)染色体畸变实验”和“小鼠骨髓嗜多染细胞微核形成实验”分别研究了胡黄连苷I在体外和体内潜在的致突变性。结果表明，胡黄连苷I无论在体外还是体内，均无明显的直接或间接致突变作用。
2.胡黄连苷I的致畸作用研究通过胡黄连苷I的致畸敏感期生殖毒性试验观察胡黄连苷I在大鼠致畸敏感期连续给药，是否可致畸胎发生。结果表明胡黄连苷I各剂量均无明显的致畸作用。
综上所述，胡黄连苷I毒副作用较小，药理作用明确，它不但具有较好的保肝降酶、利胆退黄和免疫调节作用，而且还具有显著的抗乙肝病毒作用，这是本发明的创造性所在之一，是国内同类产品所不具备的特点。此外作为注射剂，该药物起效迅速，对急性肝炎有良好的治疗效果。作为口服剂，其主要优点是较西药如拉米夫定、阿西洛韦等毒性较小，宜长期服用。上述实验证明胡黄连苷I为一种治疗乙型肝炎包括急慢性乙型肝炎疾病的有效化合物，含有胡黄连苷I的药物组合物是一味治疗乙型肝炎疾病的良好药物。
目前胡黄连可以采用人工种植的方法进行繁殖，保证了药材的来源稳定，质量可控，且大量种植与开发可降低生产成本。鉴于我国为乙肝大国，胡黄连苷I开发成治疗乙型肝炎的药物必将有较广阔的市场应用前景。
具体实施例用以下的实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于下列实施例包含的内容。
实施例1胡黄连苷I的制备方法取胡黄连药材3000g(药材中胡黄连苷I含量3.19％)，粉碎成过10目筛的药粉。用12倍药材重量体积(v/w)的70％乙醇回流，所得渗漉液在60℃浓缩成相对密度为1.18～1.20的浓缩液，所得浓缩液加入水稀释，离心，所得上清液以1.2L/Kg.h的速度通过D-101大孔吸附树脂柱(树脂径∶高＝1∶10，树脂用量为药材重量的2.5倍)，待药液完全流入树脂后，依次用20倍药材重量体积(v/w)的水、32倍药材重量体积(v/w)15％乙醇洗脱杂质，然后用20倍药材重量体积(v/w)25％乙醇洗脱胡黄连苷I，收集洗脱液，60℃减压浓缩，真空干燥，粉碎，再用无水乙醇将药粉溶解，滤过，滤液拌入硅胶，60℃水浴挥干溶剂，加载于硅胶柱顶端(硅胶径∶高＝1∶10，硅胶用量为1倍药材重量)，用10倍药材重量体积(V/W)乙酸乙酯洗脱，收集流出液，60℃减压干燥，粉碎得胡黄连苷I样品56.85g，胡黄连苷I含量95.24％，胡黄连苷I重量54.14g，胡黄连苷I转移率56.57％。(注“L/Kg.h”表示每公斤药材一小时流出液的体积数，下同。)实施例2胡黄连苷I的制备方法取胡黄连药材84kg(药材中胡黄连苷I含量3.19％)，粉碎成过10目筛的药粉。用8倍药材重量体积(v/w)的70％乙醇速度渗漉，所得渗漉液在60℃浓缩成相对密度为1.18～1.20的浓缩液，所得浓缩液加水稀释，离心，所得上清液通过ZTC型树脂柱，待药液完全流入树脂后，依次用18倍药材重量体积(v/w)的水、25倍药材重量体积(v/w)15％乙醇洗脱杂质，然后用25倍药材重量体积(v/w)25％乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃减压浓缩，真空干燥，粉碎，再用1倍药材重量体积(v/w)无水乙醇将药粉溶解，滤过，滤液拌入硅胶，60℃水浴挥干溶剂，加载于硅胶柱顶端，用10倍药材重量体积(V/W)丙酮洗脱，收集流出液，60℃减压干燥，粉碎得胡黄连苷I样品1.55kg，胡黄连苷I含量95.30％，胡黄连苷I重量1.48kg，胡黄连苷I转移率55.12％。
注射用胡黄连苷I制备工艺处方胡黄连苷I60.0g，制成1000支。
制法取胡黄连苷I60.0g，加入注射用水约2800mL，65℃水浴使溶解，加入总配制量2.0‰活性炭(6.0g)，搅拌半小时，过滤，于滤器上加水至3000mL，继以0.45μm、0.22μm微孔滤膜分级过滤，滤液以每瓶3mL定量分装于10mL西林瓶中，冷冻干燥，回充高纯度氮气，加塞，轧盖，包装，即得。
胡黄连苷I片剂制备工艺处方共制成1000片，各组分及含量如下黄连苷I 30g淀粉 180g微晶纤维素 60g乳糖 30g硬脂酸镁 1.5g制法取胡黄连苷I样品，其中胡黄连苷I含量超过90％，将其粉碎过80目筛，与淀粉、微晶纤维素、乳糖等混合均匀，用8％淀粉浆制软材，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片，质检，包装，即得。
权利要求
1.胡黄连苷I的医疗用途，其特征是在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征是胡黄连苷I在制备治疗急、慢性乙型肝炎药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的药物，其特征是含有黄连苷I的用于治疗乙型肝炎的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征是该组合物可以通过口服、舌下、经皮、肌肉、皮下、皮肤粘膜、尿道、阴道、静脉等途径给药。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于该组合物可以以口服剂、注射剂及局部给药制剂形式存在，其中口服剂包括胶囊剂、口服液、口嚼剂、丸剂、片剂、颗粒剂等，注射剂包括注射液剂型及注射用冻干粉针剂型等，局部给药制剂包括包括霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。
6.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述的胡黄连苷I含量超过90％。
7.根据权利要求1～6所述的胡黄连苷I，其特征在于可以通过下述方法得到(1)提取取西藏胡黄连(Picrorhiza scrophulariiflora Pennell)和印度胡黄连(Picrorhiza kurroa Royle ex Benth)的干燥根茎或其粉碎品，用水、乙醇、丙酮等溶剂或其二种、多种混合溶剂提取，提取液在70℃以下减压浓缩至干，加水至合适的体积，离心除沉淀，得上清液；(2)分离将所得的上清液通过常规处理好的吸附柱，分别用水及不同浓度的乙醇洗脱，收集含薄层检识有胡黄连苷I的洗脱液，70℃以下减压浓缩、真空干燥、粉碎，得胡黄连苷I粗品；(3)纯化将胡黄连苷I粗品用无水乙醇溶解，过滤，滤液拌入硅胶，水浴挥干溶剂，加载于硅胶柱顶端，用乙酸乙酯、丙酮或其二者的混合溶剂洗脱，收集流出液，减压干燥，粉碎得胡黄连苷I样品。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于提取方法可以用回流、渗漉或者索氏提取器提取方法。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于分离过程中所用的填充吸附柱的填料可以是非极性或弱极性的树脂，如苯乙烯型(包括甲基苯乙烯型、乙基苯乙烯型)、丙烯腈型树脂等。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于分离过程中所用的树脂为D-101型、ZTC型、AB-8型。
全文摘要
本发明属于中药新药研究开发领域，具体而言，涉及胡黄连苷I在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。胡黄连苷I毒副作用较小，药理作用明确，不但具有较好的保肝降酶、利胆退黄和免疫调节作用，而且还具有显著的抗乙肝病毒作用，对乙型肝炎包括急、慢性乙型肝炎均有较好的治疗效果。本发明还提供了胡黄连苷I的制备方法及治疗乙型肝炎的药物剂型。本发明提供的胡黄连苷I的制备方法成本低廉、操作简便、极有利于工业化大生产。
文档编号A61P1/16GK1788732SQ20041009864
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月15日 优先权日2004年12月15日
发明者周亚伟 申请人:周亚伟