专利名称：一种生物活性肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物活性肽及其制备方法和在抗肿瘤方面的应用，该生物活性肽是一种来自海洋的、具有抗肿瘤活性的五元大环环酯肽。
背景技术：
海洋环肽大多来自海绵、海鞘、海藻和海兔等，其新颖的结构和显著的生物活性引起了合成化学家和药物化学家的极大兴趣。然而，海洋环肽中多富含N-甲基氨基酸、含噻唑(啉)/噁唑(啉)杂坏的氨基酸及其它高度变异的氨基酸，这给合成化学家带来很大的麻烦。
Obyanamide是Moore小组(Williams，P.G.；Yoshida，W.Y.；Moore，R.E.；Paul，V.J.J.Nat.Prod.2002，65，29-31.)从海洋藻青菌Lyngbyaconfervoides中分离到的一个结构新颖的环酯肽。其对KB和LoVo细胞的IC50值分别为0.58和3.14mg/mL，最初推定该活性肽的结构如下图所示，立体绝对构型为(3S，10S，13S，23S，29S)。
然而，随着对该活性物质的深入研究，本发明人发现上述推定的结构并不正确，该生物活性肽正确的立体绝对构型为(3R，10S，13S，23S，29S)。因此合成具有正确结构的生物活性肽对了解和进行活性肽类药物的构效关系研究是非常重要的。另外由于天然产物的量过少，纯化、分离、鉴定都较为困难，大大限制了海洋活性肽的活性研究进展。其中化学合成就是一种替代方法，因此发展一种有效的制备活性肽的方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物活性肽及其有效的制备方法和应用，它能为抗肿瘤药物的研究提供足够的原料和有效合成路线。
一种生物活性肽，其特征是它的分子式为C30H41N5O6S，立体绝对构型为(3R，10S，13S，23S，29S)，结构式为 上述的生物活性肽的制备方法，其特征是首先制备三肽醇使N-苄氧羰基L-苯丙氨酸在碱性条件下进行氮甲基化得到甲基化产物N-(苄氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸，N-(苄氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸与叔丁醇反应，所得的N-(苄氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯用钯制剂催化氢解去除苄氧羰基保护基，随后与N-(苄氧羰基)-N-甲基缬氨酸用缩合剂缩合得到二肽片段N-(苄氧羰基)-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯，该二肽片段用钯制剂催化氢解去除苄氧羰基保护基，然后用缩合剂与(S)-2-苄氧基乳酸缩合得到三肽片段(2S，12S，18S)-O-(苄基)乳酰-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯，将该三肽片段用钯制剂催化氢解去除苄醚保护基得三肽醇(2S，12S，18S)-乳酰-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯；再制备二肽酸以叔丁氧羰基保护(R)-2-氨基丁酸的氨基，将所得(R)-2-(N-叔丁氧羰基)氨基丁酸进行阿恩特-艾司特重氮化和武尔夫重排得(R)-3-(N-叔丁氧羰基)氨基戊酸甲酯，随后去除叔丁氧羰基保护基并与2-[1-(叔丁氧羰基氨基)乙基]噻唑-4-甲酸缩合得相应的二肽酸甲酯，在碱液中水解该二肽酸甲酯得到二肽酸N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-(R)-3-氨基戊酸；然后将上述三肽醇与二肽酸在2，4，6-三氯苯甲酰氯及N，N-二甲基-4-甲氨基吡啶催化下进行酯化偶连反应，得到线型五肽N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-(R)-3-氨基戊酰-乳酰-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯；最后以三氟乙酸脱除线形五肽的叔丁氧羰基保护基和叔丁酯保护基，并环合得到本发明的化合物生物活性肽。
本发明提供了一种生物活性肽有效的制备方法和应用，它能为抗肿瘤药物的研究提供足够的原料和有效的合成路线，制备中综合使用多种有效的缩合剂以及阿恩特-艾司特重氮化和武尔夫重排反应等，有效地缩短了合成路线，制备方法简便，条件易于控制，具有一定的通用性，可用于合成具有与本发明生物活性肽相似的结构的其它肽类化合物，为药物筛选和进一步的构效关系研究等提供结构不同的多种化合物。
附图1为立体构型为(3S，10S，13S，23S，29S)的Obyanamide与天然产物碳谱化学位移的差值图。
附图2为立体构型为(3R，10S，13S，23S，29S)的Obyanamide 1a与天然产物碳谱化学位移的差值图。
具体实施例方式
本发明的生物活性肽Obyanamide 1a的制备方法包括以下步骤1.三肽醇(2S，12S，18S)-乳酰-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯(HO-Lac-MeVal-MePhe-OtBu)的制备，其具体步骤如下所示 首先使苄氧羰基(Z)苯丙氨酸在碱性条件下进行氮甲基化。操作时将2.99g(10.0mmol)苄氧羰基苯丙氨酸(Z-Phe-OH)、5.0mL(80.0mmol)CH3I溶于30mL无水四氢呋喃(THF)并降温至0℃，剧烈搅拌下分批加入1.20g(30.0mmol)NaH(重量百分浓度为60％)，加毕使其自然升至室温，并继续搅拌24h。薄层层析(TLC)显示反应结束后，滴加少许冰水破坏过量的NaH，然后减压蒸去四氢呋喃。将残余物溶于200mL蒸馏水中，并用正己烷洗涤三次，每次用20mL。水层用盐酸调pH＝1后，以乙酸乙酯萃取5次，每次乙酸乙酯的体积为40mL。合并萃取液并用10％(重量百分比)的Na2S2O3水溶液洗三次，每次20mL，再用饱和食盐水20mL洗涤一次后，使乙酸乙酯有机层浓缩得N-(苄氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸(Z-MePhe-OH)2.87g，收率91.7％。
然后以叔丁醇将Z-MePhe-OH酯化。操作时将3.13g(10.0mmol)Z-MePhe-OH溶于60mL二氯甲烷，搅拌下加入叔丁醇28mL并降温至0℃。依次加入2.88g(15.0mmol)1-[3-二甲基氨基]丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[EDC·HCl，1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide hydrochloride]和0.61g(5.0mmol)N，N-二甲基-4-甲氨基吡啶(DMAP)。2h后使其自然升至室温并继续搅拌20h。将减压浓缩后的残余物溶于250mL乙酸乙酯，并用10％柠檬酸水溶液洗涤三次，每次25mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗涤三次，每次25mL，再用饱和食盐水洗涤三次，每次25mL。将乙酸乙酯有机层干燥浓缩进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯-石油醚(二者的体积比为1∶8)进行洗脱得N-(苄氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯(Z-MePhe-OtBu)3.14g，收率85.1％。
接着用钯制剂催化氢解去除苄氧羰基保护基，所得氢解产物与N-(苄氧羰基)-N-甲基缬氨酸缩合得到二肽片段。操作时将739mg(2.0mmol)Z-MePhe-OtBu溶于3mL乙酸乙酯并加入0.2mmol的钯-碳于常温常压下进行氢解，TLC显示2h反应完毕。用硅藻土助滤除去钯-碳，并用乙酸乙酯淋洗滤饼三次，每次5mL。滤液合并后浓缩，经真空干燥4h后将浓缩物溶于5mL二氯甲烷，然后与N-(苄氧羰基)-N-甲基缬氨酸(Z-MeVal-OH)缩合，即将531mg(2.0mmol)Z-MeVal-OH加入到上述二氯甲烷溶液中后降温至0℃，依次加入EDC·HCl 460mg(2.4mmol)、327mg(2.4mmol)1-羟基苯并三氮唑(HOAt)。在0℃下反应2h后使其自然升至室温并继续搅拌18h。减压浓缩去二氯甲烷，将残余物溶于100mL乙酸乙酯，并用10％柠檬酸水溶液洗涤三次，每次25mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗涤三次，每次25mL，再用饱和食盐水洗涤三次，每次25mL。将乙酸乙酯有机层干燥浓缩进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯-石油醚(二者的体积比为1∶8)进行洗脱得得二肽片段无色油状物N-(苄氧羰基)-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯(Z-MeVal-MePhe-OtBu)750mg，收率77.7％。
所得二肽片段催化氢解去除苄氧羰基保护基，然后与(S)-2-苄氧基乳酸缩合得到三肽片段。操作时将965mg(2.0mmol)Z-MeVal-MePhe-OtBu溶于5mL乙酸乙酯并以10％(重量百分比，下同)钯-碳氢解反应2h。以硅藻土助滤去除钯碳，用乙酸乙酯淋洗滤饼3次，每次5mL。将所得滤液浓缩并真空干燥4h后，将浓缩物溶于5mL二氯甲烷，加入360mg(2.0mmol)(S)-2-苄氧基乳酸(BnO-Lac-OH)后降温至0℃。依次加入EDC·HCl 460mg(2.4mmol)、HOAt 327mg(2.4mmol)。在0℃下反应2h后使反应体系自然升至室温，继续搅拌12h。TLC显示反应结束后，将残余物溶于100mL乙酸乙酯并用10％柠檬酸水溶液洗涤三次，每次25mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗涤三次，每次25mL，再用饱和食盐水洗涤三次，每次25mL。将乙酸乙酯有机层干燥浓缩进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯-石油醚(二者的体积比为1∶5)得无色油状物(2S，12S，18S)-O-(苄基)乳酰-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯(BnO-Lac-MeVal-MePhe-OtBu)950mg，收率93.0％。
再次催化氢解去除苄醚保护基即得三肽醇。操作时将709mgBnO-Lac-MeVal-MePhe-OtBu溶于5mL乙酸乙酯，加入0.01mmol钯-碳于常温常压下进行氢解4h后反应完毕。以硅藻土助滤去除钯-碳并以乙酸乙酯淋洗滤饼3次，每次5mL，将所得滤液浓缩并真空干燥后得白色蜡状固体三肽醇(2S，12S，18S)-乳酰-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯572mg，收率98.0％。三肽醇的结构表征如下迁移值为Rf＝0.39(1乙酸乙酯∶石油醚)；比旋光度为[a]D20=]]>-103.8]]>(c＝1.0，CH3OH)；核磁共振氢谱数据为1H NMR(600MHz，CDCl3)d0.75(d，J＝6.8Hz，3H，H-14)，0.94(d，J＝6.8Hz，3H，H-15)，1.05(d，J＝6.4Hz，3H，H-19)，1.47(s，9H，C(CH3)3)，2.27-2.31(m，1H，H-13)，2.33(s，3H，N-CH3)，2.79(s，3H，N-CH3)，2.39-2.97(m，1H，H-3a)，3.39(dd，J＝4.6，15.1Hz，1H，H-3b)，3.63(br，1H，Lac OH)，4.27-4.31(m，1H，-18)，4.99(d，J＝10.5Hz，1H，H-12)，5.52(dd，J＝4.1，11.9Hz，1H，H-2)，7.16-7.33(m，5H，Ar H)；核磁共振碳谱数据为13C NMR(CDCl3)d17.8(C-14)，19.6(C-15)，20.9(C-19)，27.9(C(CH3)3)，29.0(C-13)，29.5(N-CH3)，31.4(N-CH3)，34.2(C-3)，57.8(C-2)59.0(C-12)，64.3(C-18)，82.0(C(CH3)3)，126.6(C-7)，128.8and 129.4(C-5，C-6，C-8and C-9)，137.1(C-4)，169.5，169.6and 175.3(C＝0×3)；质谱数据为ESI-MS(m/z)calcd.M＝420.3，[M-H]-＝419.3，found 421.0，420.0。
2.二肽酸甲酯N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-(R)-3-氨基戊酸甲酯[Boc-Ala(Thz)-(R)-Apa-OMe]的制备，其反应步骤如下所示 将451mg(1.5mmol)N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰乙酯[Boc-Ala(Thz)-OEt]溶于4mL THF、1mL MeOH和2mL H2O的混合液中并降温至0℃。向上述溶液中加入一水合氢氧化锂126mg(3.0mmol)，并于20min后撤去冰浴。TLC显示原料消失后，将溶液减压浓缩并以40mL饱和食盐水稀释。所得水溶液用盐酸调pH＝2~3后，以乙酸乙酯萃取5次，每次20mL。将萃取液合并浓缩真空干燥后得2-[1-(叔丁氧羰基氨基)乙基]噻唑-4-甲酸(也可以命名为N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酸，Boc-Ala(Thz)-OH)备用。
然后以(R)-2-氨基丁酸为原料，以叔丁氧羰基保护氨基，接着进行阿恩特-艾司特(Arndt-Eistert)重氮化和武尔夫(Wolff)重排，得(R)-3-氨基戊酸甲酯，去除苄氧羰基保护基，并与Boc-Ala(Thz)-OH缩合得相应的二肽酸甲酯。操作中将347mg(1.5mmol)(R)-3-(N-叔丁氧羰基)氨基戊酸甲酯[Boc-(R)-Apa-OMe]溶于1.5mL二氯甲烷，降温至0℃后，向其中缓缓滴入三氟乙酸(TFA)1.5mL。15min后撤去冰浴使其自然升至室温。1.5h后TLC显示原料消失。低温下减压浓缩，将所得残余物溶于2mL二氯甲烷后再次浓缩。如此操作3次并将之在高真空下干燥4h，然后溶于5mL二氯甲烷。加入2-[1-(叔丁氧羰基氨基)乙基]噻唑-4-甲酸(Boc-Ala(Thz)-OH)后将溶液降温至0℃。依次加入288mg(1.5mmol)EDC·HCl、204mg(1.5mmol)HOAt、524mL(3.0mmol)二异丙基乙基胺(DIPEA)。反应液保持0℃，2h后撤去冰浴使之自然升至室温并继续搅拌6h。TLC显示反应结束后，以80mL乙酸乙酯稀释反应液并用10％柠檬酸水溶液洗涤三次，每次25mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗涤三次，每次25mL，再用饱和食盐水洗涤三次，每次25mL。将乙酸乙酯有机层干燥浓缩进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯-石油醚(二者的体积比为1∶5)得无色油状物二肽酸甲酯N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-R-3-氨基戊酸甲酯[Boc-Ala(Thz)-(R)-Apa-OMe]566mg，收率98.1％。二肽酸甲酯的结构表征如下迁移值为Rf＝0.30(EtOAc-petroleum ether＝1∶1)；比旋光度为[a]29D＝-24.5(c0.28，MeOH)；核磁共振氢谱数据为1H NMR(600MHz，CDCl3)d 0.98(t，J＝7.3Hz，3H，H-5)，1.47(s，9H，tBu)，1.62(d，J＝6.6Hz，3H，H-11)，1.67-1.73(m，2H，H-4)，2.64(dd，J＝16.1，5.9Hz，1H，H-2a)，2.67(dd，J＝15.8，5.5Hz，1H，H-2b)，3.70(s，3H，CO2CH3)，4.32-4.38(m，1H，H-3)，5.08(br，1H，H-10)，5.14(br，1H，NH)，7.64(d，J＝8.8Hz，1H，NH)，8.00(s，1H，H-8)；核磁共振碳谱数据为13C NMR(CDCl3)d10.7(C-5)，21.6(C-11)，27.3(C-4)，28.3((CH3)3COC＝O)，38.4(C-2)，47.5(C-3)，48.7(C-10)，51.7(CO2CH3)，80.3((CH3)3COC＝O)，123.0(C-8)，149.9(C-7)，155.0，160.6，171.9 and 174.0(4quat.C)；高分辨质谱数据为HRESIMScalcd for C17H27N3O5SNa[M+Na]+408.1569，found 408.1586。
3.生物活性肽Obyanamide 1a的制备，具体步骤如下所示 将88mg(0.23mmol)二肽酸甲酯Boc-Ala(Thz)-(R)-Apa-OMe脱去甲酯并真空干燥后得到二肽酸，然后溶于2mL无水四氢呋喃。搅拌下依次注入156mLDIPEA和105mL 2，4，6-三氯苯甲酰氯。反应5hTLC显示原料消失后，在氩气保护下将THF减压蒸除，将残余物迅速溶于2mL无水甲苯，依次加入84mg(0.20mmol)三肽醇HO-Lac-MeVal-MePhe-OtBu、110mg DMAP，反应4h后TLC显示反应结束。以20mL乙酸乙酯稀释反应液并用10％柠檬酸水溶液洗涤三次，每次2mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗涤三次，每次2mL，再用饱和食盐水洗涤三次，每次2mL。将含有乙酸乙酯的有机层干燥浓缩进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯-石油醚(二者的体积比为1∶5)得白色泡状固体线型五肽N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-R-3-氨基戊酰-乳酰-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯[Boc-Ala(Thz)-(R)-Apa-Lac-MeVal-MePhe-OtBu]146mg，收率94.2％。线型五肽的结构表征如下迁移值为Rf＝0.11(EtOAc-petroleum ether＝3∶2)；比旋光度为[a]27D＝-96.6(c 0.15，MeOH)，核磁共振氢谱数据为为1H NMR(CDCl3，one main rotamer)d 0.77(d，J＝6.5Hz，3H，H-14)，0.91(d，J＝6.2Hz，3H，H-15)，0.95(t，J＝7.4Hz，3H，H-24)，1.15(d，J＝6.6Hz，3H，H-19)，1.46(s，9H，tBu)，1.47(s，9H，Boc)，1.49(d like，overlaped，3H，H-30)，1.56-1.65(m，2H，H-23)，2.23-2.28(m，1H，H-13)，2.44(s，3H，N-CH3)，2.64-2.76(dd and dd like，overlaped，2H，H-21a and H-21b)，2.79(s，3H，N-CH3)，2.90-2.95(m，1H，H-3a)，3.38(dd，J＝15.0，4.4Hz，1H，H-3b)，4.33-4.38(m，1H，H-22)，4.95(d，.J＝10.6Hz，1H，H-12)，5.05-5.11(m，overlaped，2H，H-29 and H-18)，5.53(dd，J＝12.0，4.0Hz，1H，H-2)，7.17-7.28(m，5H，Ar H)，7.82(d，J＝8.8Hz，1H，22-NH)，8.00(s，1H，H-27)；核磁共振碳谱数据为为13C NMR(CDCl3，one main rotamer)d 10.7(C-24)，16.1(C-19)，17.8(C-15)，19.7(C-14)，21.5(C-30)，26.8(C-13)，27.2(C-23)，28.0((CH3)3C)，28.3((CH3)3COC＝O)，29.2(N-CH3)，31.4(N-CH3)，34.3(C-3)，38.3(C-21)，47.6(C-22)，48.7(C-29)，57.6(C-12)，58.3(C-2)，67.0(C-18)，80.3((CH3)3COC＝O)，81.9((CH3)3COC＝O)，122.9(C-27)，126.6(C-7)，128.4 and 128.8(C-5，C-6，C-8 and C-9)，137.2(C-4)，150.1(C-26)，154.9，160.6，169.6，170.0，170.8(quat.C)；高分辨质谱数据为HRESIMScalcd for C39H59N5O9SNa[M+Na]+796.3931，found 796.3962。
然后以三氟乙酸脱除保护基叔丁氧羰基和叔丁酯保护基并环合得到本发明的化合物生物活性肽。具体操作时，将65.0mg(0.084mmol)线型五肽溶于0.5mL二氯甲烷并降温至0℃，向其中缓缓加入0.5mL TFA。20min后撤去冰浴并在室温下继续搅拌4h。TLC显示反应结束后，低温下将反应液减压浓缩至干。将残余物溶于1mL二氯甲烷后再次浓缩。如此操作3次，并将浓缩物在高真空下干燥4h后溶于170mL无水THF(浓缩物的浓度为5×10-4mol/L)并降温至0℃。依次加入96mg O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-O)-N，N，N’，N’-四甲基脲六磷酸酯[HATU，2-(azobenzotriazolyl-1-oxy)-N，N，N’，N’-tetramethyluronium hexafluoroborate]和117mL DIPEA。4h后撤去冰浴使之自然恢复至室温并继续搅拌3d。减压浓缩去四氢呋哺，并将残余物溶于20mL乙酸乙酯，反应液用10％柠檬酸水溶液洗涤三次，每次2mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗涤三次，每次2mL，再用饱和食盐水洗涤三次，每次2mL。将含有乙酸乙酯有机层干燥浓缩进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(二者的体积比开始为150∶1然后梯度递增到60∶1)洗脱后，再以SephadexLH-20纯化，(流动相为氯仿-甲醇，二者的体积之比为1∶1)纯化得白色固体即为本发明的化合物生物活性肽，亦称为Obyanamide 1a 29.3mg，收率58.1％。该生物活性肽Obyanamide 1a的结构表征如下迁移值为Rf＝0.45(CHCl3-MeOH＝20∶1)；比旋光度为[a]27D＝+22.2(c 0.07，MeOH)；核磁共振氢谱数据为1H NMR(CDCl3)d 0.50(d，J＝6.4Hz，3H，H-25)，0.86(d，J＝6.9Hz，3H，H-26)，1.07(t，J＝7.3Hz，3H，H-5)，1.24(d，J＝6.8Hz，3H，H-30)，1.43(d，J＝6.9Hz，3H，H-11)，1.61-1.69(m，2H，H-4)，2.28-2.34(m，1H，H-24)，2.41(dd，J＝11.9，2.8Hz，1H，H-2a)，2.79(dd，J＝11.9，5.0Hz，1H，H-2b)，2.90(dd，J＝13.7，6.4Hz，1H，H-14a)，3.13(s，3H，H-27)，3.14(s，3H，H-21)，3.28(dd，J＝13.7，8.2Hz，1H，H-14b)，4.40-4.46(m，1H，H-3)，5.04-5.07(m，overlaped，1H，H-10)，5.07(d，J＝10.1Hz，1H，H-23)，5.20(q，J＝6.8Hz，1H，H-29)，5.45(t like，J＝8.2，6.9Hz，1H，H-13)，7.08(t，J＝7.3Hz，1H，H-18)，7.17(d，J＝7.8Hz，1H，H-16 and H-20)，7.19-7.22(dd like，2H，H-17 and H-19)，7.94(d，J＝6.0Hz，1H，10-NH)，8.02(s，1H，H-8)，9.14(d，J＝10.1Hz，1H，3-NH)；核磁共振碳谱数据为13C NMR(CDCl3)d 11.2(C-5)，15.8(C-30)，18.5(C-25 and C-26)，24.1(C-11)，25.9(C-4)，27.4(C-24)，29.0(C-21)，29.8(C-27)，37.0(C-14)，38.8(C-2)，47.3(C-3)，48.0(C-10)，57.8(C-23)，60.7(C-13)，67.5(C-29)，123.1(C-8)，127.0(C-18)，128.7(C-16 and C-20)，129.1(C-17 and C-19)，136.3(C-15)，148.6(C-7)，160.4(C-6)，168.0(C-12)，169.5(C-9)，169.9(C-22)，170.3(C-1)，172.9(C-28)；高分辨质谱数据为HRESIMS calcd for C30H42N5O6S[M+H]+600.2856，found 600.2875。
本发明中所述的催化氢解的钯制剂为钯-碳或氢氧化钯。所述的与N-(苄氧羰基)-N-甲基缬氨酸缩合用的缩合剂为N，N-二环己基亚胺、1-[3-二甲氨基]-丙基-3-乙基碳二酰亚胺盐酸盐或7-氮杂苯并唑-1-基-氧(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐。所述的在碱液中水解得到二肽酸的碱液为氢氧化钠或氢氧化锂水溶液，二肽片段与碱的摩尔比范围为1∶1~1∶2。所述的三肽醇与二肽酸进行酯化偶连反应时摩尔比为1∶1.2~1∶5.0。
本发明的生物活性肽Obyanamide 1a的结构如下式所示 为了进一步确定本发明所合成的生物活性肽的立体绝对构型为(3R，10S，13S，23S，29S)，本发明人也合成了立体绝对构型为(3S，10S，13S，23S，29S)的Obyanamide环肽，两者的制备方法相同，只在合成二肽酸的过程中后者采用(S)-2-氨基丁酸为原料，而本发明的生物活性肽Obyanamide 1a采用(R)-2-氨基丁酸为原料。合成的Obyanamide环肽的结构表征如下迁移值为Rf＝0.46(CHCl3∶MeOH＝20∶1)；比旋光度为[a]D28＝-96.3(c＝0.06，MeOH)；核磁共振氢谱数据为1H NMR(600MHz，CDCl3)d0.59(d，J＝6.6Hz，3H，H-25)，0.88(d，J＝6.6Hz，3H，H-26)，1.02(t，J＝7.3Hz，3H，H-5)，1.46(d，J＝6.6Hz，3H，H-11)，1.50(d，J＝6.6Hz，3H，H-30)，1.69-1.77(m，1H，H-4a)，1.94-2.01(m，1H，H-4b)，2.26-2.31(m，1H，H-24)，2.74(dd，J＝4.4，16.5Hz，1H，H-2a)，2.80-2.84(m，2H，H-2b and H-14a，overl aped)，3.08(s，3H，H-21)，3.21(s，3H，H-27)，3.44(dd，J＝8.8，13.6Hz，1H，H-14b)，4.10-4.15(m，1H，H-3)，5.02(d，J＝10.6Hz，1H，H-23)，5.16(dd，J＝5.8，8.8Hz，1H，H-13)，5.31-5.35(m，1H，H-10)，5.42(q，J＝7.0Hz，1H，H-29)，7.15-7.25(m，5H，Ar H)，7.96(s，1H，H-8)，8.00(d，J＝7.7Hz，1H，10-NH)，8.82(d，J＝9.1Hz，1H，3-NH)；核磁共振碳谱数据为13C NMR(150MHz，CDCl3)d11.4(C-5)，16.2(C-30)，18.7(C-26)，18.9(C-25)，23.3(C-11)，27.57(C-24)，27.61(C-4)，29.0(C-21)，30.1(C-27)，36.4(C-14)，37.7(C-2)，46.6(C-10)，47.8(C-3)，57.2(C-23)，60.9(C-13)，67.4(C-29)，122.3(C-8)，127.0(C-18)，128.7(C-17 and C-19)，129.4(C-16 and C-20)，136.3(C-15)，150.4(C-7)，160.4(C-6)，167.2(C-12)，168.9(C-9)，170.0(C-1)，170.4(C-22)，171.9(C-28)；高分辨质谱数据为HRESIMS calcd.[M+Na]+622.2675.found622.2665。
将合成的Obyanamide环肽的谱图数据和本发明的生物活性肽Obyanamide1a与天然产物的碳谱比较，如附图所示，其中图1为(3S，10S，13S，23S，29S)Obyanamide环肽与天然产物碳谱化学位移的差值，图2为(3R，10S，13S，23S，29S)Obyanamide 1a与天然产物碳谱化学位移的差值，标准值为天然产物的化学位移值。由附图1可以看出Obyanamide与天然产物碳谱化学位移值的相差无较大，由附图2可以看出Obyanamide 1a与天然产物碳谱化学位移值的相差无几，由此可见天然产物的真实立体绝对构型应为(3R，10S，13S，23S，29S)，即为本发明的生物活性肽Obyanamide 1a。
生物活性肽Obyanamide 1a抗肿瘤生物活性体外筛选试验筛选方法采用四氮唑盐(MTT)还原法和磺酰罗丹明B(SRB)蛋白染色法，所用的肿瘤细胞株包括LOVO(大肠癌细胞株)、KB(鳞癌细胞株)和HL-60(白血病细胞株)，作用时间均为72h。本发明的生物活性肽Obyanamide 1a对上述各肿瘤细胞株的抑制率如下表所示。各表中均给出本发明的生物活性肽的浓度与各肿瘤细胞株生长抑制率之间的关系。
对LOVO肿瘤细胞生长的抑制率
对KB肿瘤细胞生长的抑制率
对HL-60*肿瘤细胞生长的抑制率
本发明的生物活性肽Obyanamide 1a对各肿瘤细胞株的的抑制率IC50值分别为6.8mM(LOVO)，6.7mM(KB)，19.0mM(HL-60*)，均具有较强的抗肿瘤活性。
权利要求
1.一种生物活性肽，其特征是它的分子式为C30H41N5O6S，立体绝对构型为(3R，10S，13S，23S，29S)，结构式为
2.权利要求1所述的生物活性肽的制备方法，其特征是首先制备三肽醇使N-苄氧羰基L-苯丙氨酸在碱性条件下进行氮甲基化得到甲基化产物N-(苄氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸，N-(苄氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸与叔丁醇反应，所得的N-(苄氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯用钯制剂催化氢解去除苄氧羰基保护基，随后与N-(苄氧羰基)-N-甲基缬氨酸用缩合剂缩合得到二肽片段N-(苄氧羰基)-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯，该二肽片段用钯制剂催化氢解去除苄氧羰基保护基，然后用缩合剂与(S)-2-苄氧基乳酸缩合得到三肽片段(2S，12S，18S)-O-(苄基)乳酰-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯，将该三肽片段用钯制剂催化氢解去除苄醚保护基得三肽醇(2S，12S，18S)-乳酰-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯；再制备二肽酸以叔丁氧羰基保护(R)-2-氨基丁酸的氨基，将所得(R)-2-(N-叔丁氧羰基)氨基丁酸进行阿恩特-艾司特重氮化和武尔夫重排得(R)-3-(N-叔丁氧羰基)氨基戊酸甲酯，随后去除叔丁氧羰基保护基并与2-[1-(叔丁氧羰基氨基)乙基]噻唑-4-甲酸缩合得相应的二肽酸甲酯，在碱液中水解该二肽酸甲酯得到二肽酸N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-(R)-3-氨基戊酸；然后将上述三肽醇与二肽酸在2，4，6-三氯苯甲酰氯及N，N-二甲基-4-甲氨基吡啶催化下进行酯化偶连反应，得到线型五肽N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-(R)-3-氨基戊酰-乳酰-N-甲基缬氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯；最后以三氟乙酸脱除线形五肽的叔丁氧羰基保护基和叔丁酯保护基，并环合得到本发明的化合物生物活性肽。
3.如权利要求2所述生物活性肽的制备方法，其特征是所述的钯制剂为钯-碳或氢氧化钯。
4.如权利要求2所述的生物活性肽的制备方法，其特征是所述的与N-(苄氧羰基)-N-甲基缬氨酸缩合用的缩合剂为N，N-二环己基亚胺、1-[3-二甲氨基]-丙基-3-乙基碳二酰亚胺盐酸盐或7-氮杂苯并唑-1-基-氧(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐。
5.如权利要求2所述生物活性肽的制备方法，其特征是所述的在碱液中水解得到二肽酸的碱液为氢氧化钠或氢氧化锂的水溶液，二肽片段与碱的摩尔比范围为1∶1～1∶2。
6.如权利要求2所述生物活性肽的制备方法，其特征是所述的三肽醇与二肽酸进行酯化偶连反应时的摩尔比为1∶1.2～1∶5.0。
7.权利要求1所述的生物活性肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
一种生物活性肽及其制备方法和应用，制备时先制备三肽醇，再制备二肽酸，然后将三肽醇与二肽酸在2，4，6－三氯苯甲酰氯及N，N－二甲基－4－甲氨基吡啶催化下进行酯化偶连反应，得到线型五肽N－叔丁氧羰基－2－噻唑丙氨酰－(R)－3－氨基戊酰－乳酰－N－甲基缬氨酰－N－甲基苯丙氨酸叔丁酯；最后以三氟乙酸脱除线形五肽的叔丁氧羰基保护基和叔丁酯保护基，并环合得到本发明的化合物生物活性肽。本发明能为抗肿瘤药物的研究提供足够的原料和有效的合成路线，制备方法简便，条件易于控制，具有一定的通用性，为药物筛选和进一步的构效关系研究等提供结构不同的多种化合物。
文档编号A61K38/07GK1919865SQ20061006844
公开日2007年2月28日 申请日期2006年8月29日 优先权日2006年8月29日
发明者李英霞, 张伟, 李春霞, 王鹏 申请人:中国海洋大学