专利名称：白蚁菌圃提取物的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于中药制药领域，涉及一种从中药白蚁菌圃中提取有效物质的方法。该有效物质具有抗炎活性，可用于制备治疗炎症性疾病的药物。
背景技术：
炎症是致病因子作用下机体采取的一种防御措施的病理过程。致病因子可以是病毒、细菌及其它微生物。许多疾病都可归为炎症性疾病，如肝炎、关节炎、支气管炎、肾炎、胸膜炎、胃肠炎和艾滋病等。如表现为局部则为疮疖、痈疽等。
白蚁是一种古老的昆虫，在地球上已生存2.5亿年。世界上已发现的白蚁有44属3000余种，分布在热带、亚热带及温带的大部分地区。我国北纬40°以南的大部分地区，特别是长江以南地区最为常见。白蚁主食木材及含纤维的物质，常在桥梁堤坝、树林和房舍中筑巢，对人类危害极大，已被列为世界五大害虫之一。但白蚁的药用价值在历代医书中均有记载，其主要功效是滋补强壮作用，临床用于老弱体虚，久病气血两亏等。
蚁巢在生物学上称为菌圃，是白蚁的分泌物，是一种纯生物物质，民间用于治疗肝炎、慢性支气管炎、胃炎、风湿性关节炎有效。临床上，白蚁菌圃的主要药效作用是提高机体免疫力、抗炎、镇痛及抗衰老作用。
本发明的发明人经多年的研究，从白蚁菌圃中提取和分离出了其中所含的多种抗炎活性物质，其中有效部位是五环三萜化合物木栓酮和熊果酸为主要活性成分，含有该有效部位的药物可用于治疗炎症性疾病。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药白蚁菌圃提取物的制备方法及其在抗炎药物中的用途。
本发明的目的可以通过以下技术路线来实施一种具有抗炎活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，该中药提取物是从中药白蚁菌圃中提取分离有效部位得到，其制备方法如下将粉碎后的白蚁菌圃用原料重量的8～12倍的甲醇或乙醇或重量比为水1～99％、乙醇1～99％的溶剂加热回流提取3次，每次2～3小时，合并提取液，室温下静置24小时后过滤，滤液于0.09～0.1Mpa条件下减压浓缩，浓缩液上大孔吸附树脂行柱层析，先用4～6倍树脂床体积的水冲洗，再用4～6倍树脂体积的乙醇梯度洗脱，收集20％以上乙醇浓度的洗脱液，回收乙醇，喷雾或冷冻干燥得到白蚁菌圃提取物干粉。
所述的白蚁菌圃，可以是黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus Shiraki)菌圃、黄翅大白蚁(Macrotermes barneyi Light)菌圃、土垅大白蚁(Macrotermes annandalei Slivestri)菌圃或台湾乳白蚁(Coptotermes formosanus Shiraki)菌圃。
所述树脂为非极性或弱极性的大孔吸附树脂，包括型号为HPD-100、HPD-300、HPD-450、D101、DM-130或AB-8。
所述的白蚁菌圃提取物干粉含总三萜类及其酸性成分等有效物质30～50％(重量)。
一种中药白蚁菌圃提取物的用途，其特征在于，该中药提取物是从白蚁菌圃中制得，用于制备预防和治疗炎症性疾病的药物。
以上制备的干粉，为棕黄色固体物质，易吸潮，含总三萜类及其酸性物30～50％。该干粉可以加入相关辅料制成各种不同的剂型，如注射剂、散剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊剂、软胶囊剂、缓释剂、粉针剂、膏剂、冲剂、气雾剂、膜剂、酊剂、各种外用制剂等供临床药用。
本发明可用以下方法控制质量1、取少许干粉，加入冰醋酸及醋酐各1mL，水浴微热使溶，沿溶液边缘滴加1滴浓H2S04，颜色应由浅黄色逐渐变成深绿色。
2、气相色谱法(GC)采用气相色谱仪，FID检测器，GC色谱条件为Hp5-MS色谱柱(5％phenyl methyl siloxane，30m×0.25mm×0.25μm)；柱温从140℃以20℃·min-1升温到280℃后保持22min，进样量1μL，分流比10∶1，进样口温度280℃，氦气流速为1～5mL·min-1，检测器温度300℃，保留时间为27.1min应有吸收峰。
3、高效液相色谱法(HPLC)取本品少量，用甲醇溶解配制成约0.01mg/mL的流液进行高效液相色谱检测，保留时间为28.5min应有吸收峰。
检测波长为210nm，用Waters C18柱(250mm×4.6mm，10μm)，流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液(85∶15)。
具体实施例方式
下面将结合具体实例及实验，对本发明作进一步说明。
实施例1粉碎后的白蚁菌圃1000g加入8L水，煮沸2小时，过滤，连续3次；合并滤液，浓缩至小体积后加入乙醇，使含醇量达到60％，常温下放置24小时，离心去沉淀。滤液于0.09～0.1Mpa条件下减压浓缩，浓缩液经HPD-100型大孔吸附树脂行柱层析，用5倍树脂床体积的水冲洗，再用5倍树脂床体积的乙醇梯度洗脱，当流出液含醇量达到20％时收集洗脱液至李伯曼反应为阴性时停止收集。收集液浓缩、真空干燥，得到3.2g棕色提取物(为总三萜类成分)。
实施例2粉碎后的白蚁菌圃1000g加入8L 95％乙醇于水浴回流3次，每次2小时，合并提取液，常温下放置24小时，离心去沉淀。滤液回收乙醇至稠膏状，上HPD-100型大孔吸附树脂，先用5倍树脂体积的水冲洗，再用5倍树脂床体积的乙醇梯度洗脱，当流出液含醇量达到20％时，收集洗脱液至李伯曼反应为阴性时停止收集。收集液浓缩，真空干燥，得到9.1g棕色提取物(为总三萜类成分)。
实施例3
粉碎后的白蚁菌圃1000g，加8L甲醇于水浴回流3次，每次2小时，合并提取液，常温下放置24小时，离心去沉淀，滤液回收甲醇至稠膏状，上HPD-100型大孔吸附树脂，先用5倍树脂体积的水冲洗，再用5倍树脂床体积的乙醇梯度洗脱，当流出液含醇量达到20％时，收集洗脱液至李伯曼反应为阴性时停止收集。收集液浓缩，真空干燥，得到9.5g棕色提取物(为总三萜类成分)。
实验1白蚁菌圃提取物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响昆明种小鼠112只，雌雄各半，按体重随机分为8组阴性对照组(生理盐水20ml/kg)、阳性对照组(地塞米松5mg/kg)、A组分组(45，22.5mg/kg)、B组分组(40，20mg/kg)、C组分组(23，11.5mg/kg)。分别ig给药，连续14d。末次给药后1h，用乙醚轻度麻醉。在小鼠右耳两侧共涂二甲苯0.02ml/只为致炎耳，左耳不作任何处理为非致炎耳。4h后将动物处死，剪下两耳，用直径8mm的打孔器分别凿出相同部位相同大小的耳廓，用电子天平称重。以致炎耳廓重减去非致炎耳廓重的差值作为肿胀值。抑制率＝(对照组耳肿胀度-用药组耳肿胀度)/对照组耳肿胀度×100％。结果见表1。
表1白蚁菌圃提取物对二甲苯致耳廓肿胀的影响
与阴性对照组比较*为P＜0.05；**为P＜0.01实验2白蚁菌圃提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响昆明种小鼠160只，雌雄各半，体重随机分为8组，每组20只。每天一次灌胃给药，连续7天，末次给药1h后，各组尾静脉注射0.5％伊文思兰0.1mg/10g体重，并立即腹腔注射0.6％的冰醋酸0.1ml/10g。20min后颈椎脱臼处死。腹腔注射5mL生理盐水，轻柔，再剪开一小口，用吸管吸出洗液，如有出血则弃去不用。再以3000rpm离心12-15min，取上清液于722分光光度计在590nm波长处测吸光度(A)值。
表2白蚁菌圃提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
与阴性对照组比较*为P＜0.05；**为P＜0.01实验3白蚁菌圃提取物对大鼠棉球植入所致肉芽肿的影响取180-220克，SD大鼠112只，雌雄各半。手术前一天将大鼠按体重性别随机分为八组并分别给相应的药物。第二次给药后乙醚麻醉，在大鼠两侧腋窝下剪开约1cm的小口，将两个灭菌棉球(每个棉球重50±1mg。高压灭菌，各加入氨苄青霉素每个1mg/0.5ml。50℃烘箱烤干)分别值入皮下，缝合创口。并在创口局部涂以少量抗生素。第8次给药后颈椎脱臼处死，取出棉球，剥离附着的结缔组织，在60℃烤箱烘12小时后称重，减去原来棉球重量，即为肉芽肿净重，取两侧肉芽肿质量的均值。
表3白蚁菌圃提取物对大鼠棉球植入所致肉芽肿的影响
与阴性对照组比较*为P＜0.05；**为P＜0.01***为P＜0.001实验4白蚁菌圃提取物对大鼠佐剂性关节炎的影响雄性Wistar大鼠60只，体重180-220克，按体重随机分为6组B组(40，20mg/kg)、C组(23，11.5mg/kg)、空白对照组(生理盐水20ml/kg)、阳性对照组(地塞米松5mg/kg)。在大鼠右足踝关节下0.5mm处划线作标记，用排水法测原始体积。按上述相应药物灌胃给药。给药1h后，在大鼠右足趾皮下注射0.1ml佛氏完全佐剂，连续给药25天，并于致炎后18h、3d、8d、14d、18d、25d分别测致炎足的体积。同时观察其左足、耳、鼻、尾部的变化，并按标准记分，作为继发性病变的指标之一。
表4对大鼠佐剂性关节炎足肿胀的影响
与阴性对照组比较*为P＜0.05；**为P＜0.01实验5白蚁菌圃提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀炎症组织及血清中PGE2含量的影响。
取2.1.3中致炎后4h的小鼠，拔眼球取血并脱臼处死。自踝关节下剪下致炎足，称重，划破足跖部皮肤投入有5ml生理盐水的试管中，浸泡并不停地振摇。2h后弃足，将浸泡液和血于3000rpm离心15min。各取上清液0.15ml，加入0.5mol/L的KOH甲醇2ml。于50℃下温育。20mim后每管加入2.5ml甲醇。于紫外分光光度计下测PGE2含量。
表5对角叉菜胶致小鼠足肿胀模型中PGE2的影响
**P＜0.01，与阴性对照组比较(模型组)*P＜0.05，与阴性对照组比较；▲▲P＜0.01，与空白组比较实验6白蚁菌圃提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响昆明种小鼠80只，按性别体重随机分为5组，每组16只，B组(40mg/kg)、C组(23mg/kg)、空白对照组(生理盐水20ml/kg)、阳性对照组(地塞米松5mg/kg)、正常组(生理盐水20ml/kg)。各组连续给药10天。在末次给药前，除正常组外，每鼠右足踝关节处划线作标记，于毛细管放大装置中测足的原始体积。给药1h后，于每只小鼠右足皮下注射1％角叉菜胶0.05ml。测致炎后30min 1h 2h 4h体积。计算出各组肿胀度。
表6白蚁菌圃提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响
与阴性对照组比较*为P＜0.05；**为P＜0.01实验7白蚁菌圃提取物对角叉菜胶致胸膜炎大鼠胸腔渗出液中自三烯LTB4含量的影响雄性SD大鼠50只，按体重随机分为5组，给药同2.1.3。于末次给药12h后，每只大鼠胸腔注射2％角叉菜胶致炎。致炎10h后，股动脉取血留用，并脱臼处死。在横膈周边部打开胸腔，吸出渗出液，于4℃下4000rpm离心15min。取上清液留用。按照大鼠白三烯LTB4试剂盒说明书用酶标法测白三烯的含量。
表7对胸膜炎大鼠渗出液中白三烯含量的影响
**P＜0.01，与阴性对照组比较(模型组)；*P＜0.05，与阴性对照组比较；▲▲P＜0.01，与空白组比较实验7白蚁菌圃提取物对胸膜炎大鼠血清中皮质醇含量的影响用3.1.2中取出的血液疑固后离心(3000rpm)15min。分离出血清，按照大鼠血浆皮质醇试剂盒说明书，酶标仪在540nm处测出吸光度，作标准曲线，测出皮质醇的含量表8对胸膜炎大鼠血浆皮质醇含量的影响
**P＜0.01，与阴性对照组比较(模型组)；*P＜0.05，与阴性对照组比较；▲▲P＜0.01，与空白组比较
权利要求
1.一种具有抗炎活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，该中药提取物是从中药白蚁菌圃中提取分离有效部位得到。其制备方法如下将粉碎后的白蚁菌圃用原料重量的8～12倍的甲醇或乙醇或重量比为水1～99％、乙醇1～99％的溶剂加热回流提取3次，每次2～3小时，合并提取液，室温下静置24小时后过滤，滤液于0.09～0.1Mpa条件下减压浓缩，浓缩液上大孔树脂柱层析，先用4～6倍树脂床体积的水冲洗，再用4～6倍树脂体积的乙醇梯度洗脱，收集20％以上乙醇浓度的洗脱液，回收乙醇，喷雾或冷冻干燥得到白蚁菌圃提取物干粉。
2.根据权利要求1所述的白蚁菌圃提取物的制备方法，其特征在于，所述的白蚁菌圃可以是黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus Shiraki)菌圃、黄翅大白蚁(Macrotermesbarneyi Light)菌圃、土垅大白蚁(Macrotermes annandalei Slivestri)菌圃或台湾乳白蚁(Coptotermes formosanus Shiraki)黄胸散白蚁(Reticulitermes flaviceps Oshima)菌圃。
3.根据权利要求1所述的白蚁菌圃提取物的制备方法，其特征在于，所述的树脂为非极性或弱极性的大孔吸附树脂，包括型号为HPD-100、HPD-300、HPD-450、D101、DM-130或AB-8。
4.根据权利要求1所述的白蚁菌圃提取物的制备方法，其特征在于，所述的白蚁菌圃提取物干粉含30～50％(重量)的总三萜类及其酸性成分等有效物质。
5.一种白蚁菌圃提取物的用途，其特征在于，该提取物可用于制备抗炎药物。
6.根据权利要求5所述的白蚁菌圃提取物，其特征在于，该提取物可用于制备预防和治疗肝炎的药物。
7.根据权利要求5所述的白蚁菌圃提取物，其特征在于，该提取物可用于制备治疗关节炎的药物。
8.根据权利要求5所述的白蚁菌圃提取物，其特征在于，该提取物可用于制备治疗肾炎的药物。
9.根据权利要求5所述的白蚁菌圃提取物，其特征在于，该提取物可用于制备治疗支气管炎的药物。
10.根据权利要求5所述的白蚁菌圃提取物，其特征在于，该提取物可用于制备预防和治疗艾滋病的药物。
全文摘要
本发明涉及一种以白蚁菌圃为原料制备含有多种生物活性成分的白蚁菌圃提取物的制备方法及用途。具体步骤是将已粉碎的白蚁菌圃用8～12倍重量比的醇或含水醇溶剂加热回流得到提取液，将提取液过滤浓缩后通过大孔吸附树脂，以水和梯度乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，回收乙醇，浓缩制得的白蚁菌圃提取物。该提取物是由含总三萜类及其酸性成分占30～50％的有效物质所构成。本发明制备的提取物可用于制备治疗炎症性疾病的药物。所说的炎症可以是肝炎、关节炎、支气管炎、肾炎、胃肠炎以及艾滋病等。
文档编号A61P29/00GK101069698SQ20061007974
公开日2007年11月14日 申请日期2006年5月12日 优先权日2006年5月12日
发明者薛德钧, 李红勇, 王金平, 徐彭, 曹娟, 张敏, 张会明, 谢康 申请人:江西中医学院