专利名称：转导肽－人红细胞生成素融合蛋白及其药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有药用价值的融合蛋白，具体为转导肽-人红细胞生成素融合蛋白，编码该融合蛋白的核酸分子。本发明也涉及含有该融合蛋白的药物组合物。
背景技术：
1906年Carnot发现贫血动物血液中存在有调节造血的因子，1948年Bonsdloff等提出这种造血因子是促红细胞生成素(红细胞生成素，促红素，erythropoietin，EPO)。1957年Jacobson等证实EPO来自肾脏，从此EPO这一概念被人们普遍接受。1985年成功地克隆出人EPO基因后，开始基因工程大批量生产重组人EPO，并广泛用于临床。EPO治疗肾性贫血已为世人公认，随着EPO临床应用的研究深入，EPO治疗贫血的范围不断扩大，并取得较好的疗效。
EPO为一种分子量约30500道尔顿的糖蛋白。EPO主要由肾脏的氧感受器受缺氧刺激后产生，在肾皮质肾小管周围毛细血管内皮细胞或成纤维细胞中合成。肝脏、巨噬细胞及有核红细胞中也能合成EPO，但这些肾脏外的产生量不足总产生量的10％～15％。
成熟的重组人红细胞生成素(rhEPO)是由166个氨基酸残基组成的高度糖基化蛋白，糖基化的程度对其生物活性有很大的影响。重组人红细胞生成素唾液酸含量高低与其生物比活性具有显著的相关性，唾液酸含量低，则生物活性低。由于rhEPO的生物活性依赖于分子的糖基化，通过原核细胞生产的rhEPO在体内基本不具生物活性，只有真核细胞生产的糖基化rhEPO在体内具有天然hEPO的生物活性作用。由于真核细胞对目的基因的表达效率较低，近年国内外学者纷纷采用不同方法提高rhEPO在真核细胞内的表达量。
目前关于EPO治疗贫血的机制不清楚，可能的机制有1)EPO与红细胞干细胞上的受体结合并激活，使之发展成为成熟的红细胞。2)EPO能够快速启动原癌基因c-myc表达，发挥抗凋亡并维持细胞存活的作用。实验表明EPO不能直接促进染色体复制和有丝分裂，所以与其说EPO促进了红细胞前体的增殖和分化，不如说是EPO强大的抗凋亡作用，使红系祖细胞得以存活并最终向成熟红细胞分化。
国内外研究进展人类重组红细胞生成素(r-hEPO)是利用DNA重组技术人工合成的活性因子，它的生物活性、免疫学特性与自然EPO完全相同，到目前为止尚未发现血中存在这种活性因子的抗体，故使用安全。
r-hEPO治疗肾性贫血的效果令人满意，EPO的临床应用，使90％以上的肾性贫血患者得到了有效治疗，有学者称之为肾衰贫血治疗的一次革命。适用于已做透析和还未做透析的肾衰而贫血的病人，为了使r-hEPO充分发挥作用，应补充其他造血原料，如铁和叶酸等。EPO每次用量为40u/kg，每周3次。除血透病人静注较方便外，其他病人均应皮下注射。皮下注射EPO可减量30％而疗效相同。可能由于皮下注射其半衰期较长之故。由于EPO促进骨髓内的原始红细胞变为成熟红细胞需要一段时间，故判断EPO的真实疗效大都需要4周左右时间。感染和慢性炎症或体内铝过多均可影响EPO疗效。
EPO的主要副作用有血栓形成、高血压、偶会发生癫痫。肾衰病人在没有控制好血压时，不宜使用EPO。严格控制Hct或血红蛋白(Hb)上升速度和终点水平，可减少甚至避免EPO的副作用。终点水平一般足以维持良好的生活质量，但如不用维持量，EPO停药后不久，病人会再发生贫血。另外，EPO还可增加血小板计数，但一般不超过正常水平。EPO对白细胞影响不大。
随着基因工程药物的发展，国外推出了第二代EPO新产品，2003年在市场上初战告捷，将逐渐成为第一代EPO的换代产品，势必瓜分促红细胞生成素的现有市场份额。
存在的问题(1)EPO的给药途径和给药次数EPO的给药途径包括静脉和皮下注射。皮下注射方法可以减小EPO的剂量。不管是采用静脉给药还是皮下注射，EPO最佳的给药次数是每周2～3次。
EPO治疗的原则包括(1)有剂量依赖性；(2)最有效的给药途径可能为皮下注射，但对某些患者静脉注射同样有效，甚至更佳；(3)给药频率依赖于给药途径，静脉注射至少每2～3天1次，皮下给药可减少次数，如每周1次或隔周1次；(4)除发生高血压脑病外，不应中断治疗；(5)维持充足的铁贮备；(6)最常见的EPO抵抗原因为炎症或感染。其他原因包括铝过量、甲状旁腺功能亢进、化疗期间发生的骨髓瘤和甲状旁腺功能亢进合并骨髓纤维化。
(2)生产成本较高由于成熟的重组人红细胞生成素rhEPO的生物活性依赖于分子的糖基化，通过原核细胞生产的rhEPO在体内不具生物活性，通过真核细胞生产的糖基化rhEPO在体内具有天然hEPO的生物活性作用。因此目前生产的商品EPO均为大规模哺乳动物细胞培养生产，生产成本高。
目前EPO的使用必需是静脉注射和皮下注射给药方式，长期采用注射途径给病人(除血透病人)带来痛苦和不便，本发明改用非创伤性给药方式如皮肤或粘膜穿透给药、易被病人接受、而且通过皮肤进入体内还可以提高安全性及延长药物的半衰期。为达到此目的，本发明利用能高效携带蛋白质分子穿透生物膜包括皮肤、粘膜、血脑屏障的小分子转导肽(Protein Transduction Domain，PTD)，将原核表达的重组EPO通过非创伤性给药方式进入体内，从而达到治疗贫血的目的。
转导肽是一种能高效穿过生物膜的蛋白转导结构域，它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，还可以穿过血脑屏障。1988年Green发现HIV的Tat蛋白能够高效地自由进出细胞。1994年Fawell将TAT的36Aa的区域化学交联到异源蛋白上后，交联蛋白也可转导入细胞内。Schwarze SR等人将TAT的PTD区域短肽与大分子半乳糖苷酶在原核细胞中融合表达后，将融合蛋白在小鼠体内注射，发现有活性的酶分子在体内的各组织中都有表达，尤为重要的是可以通过血脑屏障。除TAT肽外，来自果蝇触角足同源异型转录因子Antp的43-58位的多肽序列，来自疮疹单病毒DNA结合蛋白VP22的267-300序列均具有与TAT肽完全相似的转导功能和转导机制，它们被统称为PTD。
发明内容
本发明一个方面涉及转导肽-人源红细胞生成素融合蛋白。本发明中，用于转导所述人源红细胞生成素的转导肽可以选自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蝇同源异型转录因子ANTP和单纯疱疹病毒I型VP22转录因子的PTD序列或其功能性类似物或片段。优选的，所述转导肽具有SEQ ID NO2(YGRKKRRQRRR)所述的氨基酸序列或其功能性片段。实际上，只要能够转导本发明所述人源红细胞生成素的转导肽均适用于本发明。
本发明中，所述融合蛋白的人源红细胞生成素含有SEQ ID NO4(APPRLICDSRVLE RYLLEAKEAE NITTGCAEHC SLNENITVPD TKVNFYAWKRMEVGQQAVEV WQGLALLSEA VLRGQALLVN SSQPWEPLQL HVDKAVSGLRSLTTLLRALG AQKEAISPPD AASAAPLRTI TADTFRKLFR VYSNFLRGKLKLYTGEACRT GDR)的氨基酸序列或其功能性片段。优选的，人源红细胞生成素由SEQ ID NO4组成。
具体地，本发明的融合蛋白即转导肽-人源红细胞生成素具有SEQID NO6(YGRKKRRQRRR GGS APP RLICDSRVLE RYLLEAKEAE NITTGCAEHCSLNENITVPD TKVNFYAWKR MEVGQQAVEV WQGLALLSEA VLRGQALLVNSSQPWEPLQL HVDKAVSGLR SLTTLLRALG AQKEAISPPD AASAAPLRTITADTFRKLFR VYSNFLRGKL KLYTGEACRT GDR)所示的氨基酸序列。本发明还涉及编码所述转导肽-人源红细胞生成素融合蛋白的核酸分子。本发明的再一方面涉及含有上述编码本发明转导肽-人源红细胞生成素融合蛋白的核苷酸的核酸分子，所述核酸分子优选为SEQ ID NO5(TAC GGC CGC AAG AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC GGT GGTACCgcaccaccgc gtctgatttg tgatagccgt gtcctggagc gttacctgctggaggccaaggaggccgaga atatcacgac gggctgtgcg gaacactgcagcctgaatga gaatatcaccgtcccggaca ccaaagttaa tttctatgcctggaagcgca tggaggtcgg tcagcaggccgtggaagtct ggcagggcctggccctgctg agcgaagcgg tcctgcgtgg ccaggccctgctggtcaaca gcagccagcc gtgggagccg ctgcagctgc atgtggataaagccgtcagcggcctgcgca gcctgaccac cctgctgcgc gcgctgggtgcccagaagga agccatcagcccaccggatg cggccagcgc agcgccgctgcgcaccatca ccgcggacac cttccgcaaactgttccgtg tctacagcaatttcctgcgt ggtaagctga agctgtacac cggtgaggcctgccgtaccggtgaccgcta a)所示的核苷酸序列。
上述核苷酸序列可以插入表达载体中。优选的，本发明所述表达载体为原核或真核表达载体，其中优选为pGEX、pET、pBV220和pcDNA。
本发明通过将所述核酸分子导入原核表达载体pET28，pGEX-4T-1等中，通过原核细胞培养获得与转导肽融合表达的人源红细胞生成素。
方法易于操作、成本低、转导效率高。蛋白纯化在变性条件下进行，使以包涵体形式存在的融合蛋白的纯化过程大大简化。使变性蛋白的天然构象变成相对灵活的链状结构，摆脱空间构象的限制，具备更高的能量，使转导效率大大提高。当融合蛋白转入细胞后，重新折叠，恢复天然构象使EPO发挥其生物学活性，而与其共价连接的蛋白转导域不影响细胞的正常结构或功能。
本发明又一方面涉及含有本发明所述融合蛋白的药物组合物，用于失血性贫血、外科术后贫血、癌症相关性贫血、人类免疫缺陷病毒感染、骨髓增生异常综合征、早产儿贫血、肾性贫血、骨髓移植、自体血液收集、孕产妇贫血、血红蛋白病、再生障碍性贫血等治疗。
所述药物组合物可以含有非注射剂型常用的药学可接受的载体或赋形剂。优选的，本发明所述剂型为可穿越皮肤、粘膜、角膜、结膜、浆膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脉络膜、神经膜、血脑屏障等一切细胞膜及生物膜的剂型。特别是舌下含服、肺吸入、鼻喷剂、肛栓及皮肤吸收等多种方式用药。
借助于上述转导肽技术，可以经非注射途径将人源红细胞生成素输入机体，使临床用药更为安全、方便。
实施例实施例1 人胎肝脏总RNA的提取采用Promega公司的RNAgentsR Total RNA Isolation System从引产胎儿肝脏提取总RNA。
实施例2 hEPO基因的克隆参考Genebank中EPO cDNA序列设计引物引物15′-GGAATTCGCACCACCACGCCTAATC-3′(SEQ ID NO7)引物25′-GTCGACTCATCATCTGTCCCCTGTCCT-3′(SEQ ID NO8)以实施例1的RNA作为模板，参照试剂盒厂家推荐方案进行PCR扩增，获得全长的hEPO cDNA，5′和3′端分别携带EcoRI，Sal I位点。
反转录与PCR扩增用Perkin ElmerCetus公司生产的反转录PCR试剂盒。取提取的细胞总RNA 1-2ug，加人20ul反转录体系中，以oligo dT为引物，于42℃作用1h，合成cDNA第一链。99℃5min终止逆转录反应。将20ul逆转录产物加入到100ul的PCR反应体系中，其中含上下游引物。96℃变性10min后加入Taq DNA聚合酶，进行PCR循环，反应参数为94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环后72℃再延伸7min。
实施例3 重组hEPO表达质粒构建与鉴定实施例2中hEPO的RT-PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后，与经同样酶切回收的表达载体pBV220片段，按4∶1摩尔比连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性重组子pBV hEPO。送上海申工公司测序。
实施例4 pBV hEPO在大肠杆菌中的诱导表达将过夜培养的实施例3筛选的阳性单菌落接种于LB液体培养基中(含Amp 60mg/L)，于30℃培养至OD600＝0.45后，迅速升温至42℃，诱导5h左右，至OD600＞1.2。于4℃下6000g离心10min，收集菌体。SDS-PAGE电泳鉴定rhEPO的表达水平，并鉴定表达形式。
实施例5 rhEPO的复性与纯化将诱导表达后的菌体超声破解。12000g离心20min，弃上清。沉淀经洗涤、溶解、复性。以50ml/min流速上样，柱结合量约5mg蛋白/ml介质。上样毕，用水平衡反相柱至检测基线，使用10％-80％乙醇1mol/L盐酸胍进行线性梯度洗脱，检测并收集含EPO主峰，ELISA测定结果表明，60％乙醇1mol/L盐酸胍可洗出EPO。含EPO收集液用10倍体积的10mmolTris·HCl(pH7.5)2％蔗糖缓冲液透析两次，每次5-6h，其透析过的EPO峰收集液用于DEAE型离子交换柱分离。
用10mmol Tris·HCl(pH7.5)缓冲液平衡DEAE型离子交换柱，取透析处理的收集液上样，流速为20ml/min，柱结合蛋白量为20mg/ml。上样完毕，用上述缓冲液平衡色谱柱至基线，随后在缓冲液中加NaCl，进行截状梯度洗脱，NaCl浓度分别为50、75和125mmol/L。ELISA检测结果表明75mmol/L洗脱峰中含EPO。取DEAE离子交换柱收集含EPO峰液体进行Sephacryl S-200色谱。每次上样体积为80ml，流速2ml/min，使用流动相为20mmol/L柠檬酸钠100mmol/L NaCl缓冲液，rhEPO保留时间约为45min。该色谱柱收集到的rhEPO样品比活性约为1.5×108U/g蛋白，经三步纯化后产品的SDS PAGE结果呈现一条带，终产品SDS PAGE扫描结果纯度达到98％以上。
纯度测定对终产品进行SDS PAGE电泳。
实施例6 生物活性测定EPO酵母表达产物的生物活性测定(in vitro)取8-10周雌性Balb/c小鼠，尾静脉注射FVA(Friend Virus of Anemia)病毒。14d后，观察小鼠腹部肿大后，眼球放血，杀小鼠，取脾脏研磨细胞，于Hank′s液中，过200目筛，洗2次，1200Xg离心10min后，用淋巴细胞分离液分离细胞，2000Xg 30min，取界面上白色细胞，按2.5×105接种，加入IMDM培养基(含30％胎牛血清，10mmol/L硫代甘油，1％BSA，1％谷氨酰胺，1％双抗，3.02g/L碳酸氢钠)，同时加入待测EPO样品，于37℃CO2，培养箱中培养。48h后，观察，收集细胞，用15mg/ml联苯胺染色，涂片，计数，根据染为蓝色的细胞计数便可知是否有活性。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所<120>转导肽-人红细胞生成素融合蛋白及其药物组合物<160>8<210>1<211>33<212>DNA<213>编码PTD的核苷酸序列<400>1TACGGCCGCA AGAAACGCCG CCAGCGCCGC CGC 33<210>2<211>11<212>氨基酸序列<213>PTD的氨基酸序列<400>2YGRKKRRQRR R 11<210>3<211>501<212>DNA<213>编码人源红细胞生成素的核苷酸序列<400>3gcaccaccgc gtctgatttg tgatagccgt gtcctggagc gttacctgct ggaggccaaggaggccgaga atatcacgac gggctgtgcg gaacactgca gcctgaatga gaatatcaccgtcccggaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagcgca tggaggtcgg tcagcaggccgtggaagtct ggcagggcct ggccctgctg agcgaagcgg tcctgcgtgg ccaggccctgctggtcaaca gcagccagcc gtgggagccg ctgcagctgc atgtggataa agccgtcagcggcctgcgca gcctgaccac cctgctgcgc gcgctgggtg cccagaagga agccatcagcccaccggatg cggccagcgc agcgccgctg cgcaccatca ccgcggacac cttccgcaaactgttccgtg tctacagcaa tttcctgcgt ggtaagctga agctgtacac cggtgaggcctgccgtaccg gtgaccgcta a 501<210>4<211>166<212>氨基酸序列<213>人源红细胞生成素的氨基酸序列<400>4APPRLICDSR VLERYLLEAK EAENITTGCA EHCSLNENIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQAVEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVNSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLG ALGAQKEAISPPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR 166
<210>5<211>557<212>DNA<213>编码PTD-人源红细胞生成素融合蛋白的核苷酸序列<400>5tacggccgca agaaacgccg ccagcgccgc cgcggtggta ccgcaccacc gcgtctgatttgtgatagcc gtgtcctgga gcgttacctg ctggaggcca aggaggccga gaatatcacgacgggctgtg cggaacactg cagcctgaat gagaatatca ccgtcccgga caccaaagttaatttctatg cctggaagcg catggaggtc ggtcagcagg ccgtggaagt ctggcagggcctggccctgc tgagcgaagc ggtcctgcgt ggccaggccc tgctggtcaa cagcagccagccgtgggagc cgctgcagct gcatgtggat aaagccgtca gcggcctgcg cagcctgaccaccctgctgc gcgcgctggg tgcccagaag gaagccatca gcccaccgga tgcggccagcgcagcgccgc tgcgcaccat caccgcggac accttccgca aactgttccg tgtctacagcaatttcctgc gtggtaagct gaagctgtac accggtgagg cctgccgtac cggtgaccgctaa 543<210>6<211>180<212>氨基酸序列<213>转导肽-人源红细胞生成素的氨基酸序列<400>6YGRKKRRQRR RGGSAPPRLI CDSRVLERYL LEAKEAENIT TGCAEHCSLN ENITVPDTKVNFYAWKRMEV GQQAVEVWQG LALLSEAVLR GQALLVNSSQ PWEPLQLHVD KAVSGLRSLTTLLGALGAQK EAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLY TGEACRTGDR 180<210>7<211>25<212>DNA<213>引物<400>7GGAATTCGCA CCACCACGCC TAATC 25<210>8<211>27<212>DNA<213>引物<400>8GTCGACTCAT CATCTGTCCC CTGTCCT2权利要求
1.一种融合蛋白，其含有转导肽和人源红细胞生成素。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述转导肽选自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蝇同源异型转录因子ANTP和单纯疱疹病毒I型VP22转录因子的PTD序列或其功能性类似物或片段。
3.权利要求2的融合蛋白，其中所述转导肽具有SEQ ID NO2的序列或其功能性片段。
4.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述人源红细胞生成素具有SEQ ID NO4的序列。
5.权利要求1的融合蛋白，其具有SEQ ID NO6的序列。
6.核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项的融合蛋白。
7.权利要求6的核酸分子，其具有SEQ ID NO5的序列。
8.包含权利要求7的核酸分子的表达载体。
9.药物组合物，其含有权利要求1-5中任一项的融合蛋白。
10.权利要求9的药物组合物，其剂型为可穿越皮肤、粘膜、角膜、结膜、浆膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脉络膜、神经膜、血脑屏障等一切细胞膜及生物膜的剂型。
11.权利要求9的药物组合物，其适合于舌下含服、肺吸入、鼻喷剂、肛栓及皮肤吸收用药。
12.权利要求1-5中任一项的融合蛋白在制备药物中的应用，所述药物用于治疗失血性贫血、外科术后贫血、癌症相关性贫血、人类免疫缺陷病毒感染、骨髓增生异常综合征、早产儿贫血、肾性贫血、骨髓移植、自体血液收集、孕产妇贫血、血红蛋白病、再生障碍性贫血。
全文摘要
本发明涉及一种转导肽－人红细胞生成素融合蛋白以及含有编码所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本发明还涉及含有上述核酸分子的表达载体。本发明还涉及所述融合蛋白在制备药物中的应用，所述药物用于失血性贫血、外科术后贫血、癌症相关性贫血、人类免疫缺陷病毒感染、骨髓增生异常综合征、早产儿贫血、肾性贫血、骨髓移植、自体血液收集、孕产妇贫血、血红蛋白病、再生障碍性贫血等治疗。
文档编号A61P7/06GK101074268SQ20061008245
公开日2007年11月21日 申请日期2006年5月19日 优先权日2006年5月19日
发明者李前, 孙曼霁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所