专利名称：Ag85B,ESAT－6的嵌合疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域和新型疫苗开发领域，具体地说，本发明提供了一种新型的结核杆菌的蛋白质多肽疫苗，即将结核杆菌esat-6基因嵌合入ag85b基因内，表达Ag85B，ESAT-6的嵌合亚单位疫苗。
背景技术：
结核病仍对人类构成巨大的威胁。据WHO统计，每年约有800万～1000万新发病例，而每年死于结核病的患者高达300万人。结核病已成为全球头号传染病杀手。
我国结核病疫情较严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数居世界第二位。2000年我国第四次全国结核病流行病学抽样调查结果分析，受感染人数超过4亿。在未来的十年内可能有3000万人发生结核病。调查显示，我国结核病疫情仍相当严重，且部分地区有蔓延趋势。
卡介苗问世已80余年，全球大多数国家将其列入计划免疫接种项目。但它不能保护最常见的成人肺结核的发生。有资料表明BCG对成人的保护效果有印度南部的0％到英国的80％不等。尽管发表文献综合有效值为50％，但据估计其对结核病死亡的预防效果仅占5％，因此，研制新型结核疫苗迫在眉睫。
多种类型的新型疫苗已被广泛研究，包括重组BCG疫苗、营养缺陷型结核分枝杆菌疫苗、蛋白质多肽疫苗、DNA疫苗、以病毒为载体的结核亚单位疫苗等。然而经检索，目前与本发明相似的疫苗尚未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种比目前市售卡介苗性能更佳的疫苗。
本发明的另一个目的是提供上述疫苗的一种制备方法。
本发明的提供了一种嵌合亚单位疫苗，该疫苗中对应ESAT-6的多肽序列与对应Ag85B两个抗原表位的多肽序列相连，并且位于Ag85B两个T细胞抗原表位的多肽片段之间。
本发明的疫苗中，将ESAT-6的多肽片段插入到Ag85B第169～182位氨基酸位置，并且去除Ag85B第169～182位氨基酸，形成嵌合蛋白。
本发明还提供了一种重组质粒，该质粒中含有Ag85B蛋白T细胞抗原表位的编码序列和ESAT-6蛋白的编码序列，并且ESAT-6蛋白的编码序列插入Ag85B两个T细胞抗原表位的编码序列之间。
本发明的疫苗中，含有Ag85B蛋白T细胞抗原表位的编码序列和ESAT-6蛋白的编码序列，并且ESAT-6蛋白的编码序列插入到Ag85B第169～182位氨基酸的编码序列位置，同时去除Ag85B第169～182位氨基酸的编码序列。
对应ESAT-6的多肽序列与对应Ag85B两个抗原表位的多肽序列包括对应ESAT-6的多肽序列与对应Ag85B两个抗原表位的多肽序列及其被修饰后的多肽序列。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，基因编码序列包括Ag85B蛋白T细胞抗原表位的编码序列或者ESAT-6蛋白的编码序列及其简并序列。该简并序列是指，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与Ag85B蛋白T细胞抗原表位的编码序列或者ESAT-6蛋白的编码序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出相应的序列。本发明还包括对Ag85B蛋白T细胞抗原表位的编码序列或者ESAT-6蛋白的编码序列作常规修饰但不影响其表达产物功能的序列。
本发明根据Ag85B，ESAT-6的T细胞抗原表位，选择合适位点将esat-6基因嵌合入ag85b基因内，表达Ag85B，ESAT-6的嵌合亚单位疫苗。Ag85B基因登录号BX842578.1；蛋白登录号CAB10044.1；ESAT-6基因登录号BX248347.1；蛋白登录号CAD96091.1。
Ag85B，ESAT-6是结核杆菌重要的保护性抗原。其抗原表位已得到广泛研究，其中ESAT-6的T细胞抗原表位位于蛋白分子的N端及第51～60氨基酸之间；Ag85B的T细胞抗原表位位于蛋白分子C端的第241～260氨基酸之间和第261～280氨基酸(是根据蛋白登录号为CAB10044.1的蛋白序列，但不包括前面信号肽的40个氨基酸)之间。本发明依据Ag85B，ESAT-6的T细胞抗原表位，将ESAT-6插入到Ag85B第169～182氨基酸之间形成嵌合蛋白。即本发明用EAST-6替换了Ag85B的169-182氨基酸。
另一方面，本发明的提供了上述嵌合亚单位疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤(1)分别扩增ag85b和esat-6基因；(2)用同样的酶双酶切ag85b和esat-6基因序列，并与载体相连，形成质粒；(3)将(2)获得的重组质粒转化、扩增并表达；(4)分离(3)获得的重组质粒，提取蛋白以获得权利要求1所述的疫苗。
本发明中，该方法中双酶切使用的酶是NruI和XhoI。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
本发明中，该方法中使用的载体可以是pET28a、pQE30或者pUC118等。
在连接ag85b和esat-6基因片段时，可以通过双酶切将基因片段直接连接，也可先将基因片片段与适当的载体连接形成质粒，通过双酶切质粒来达到连接ag85b和esat-6基因片段的目的。例如，将ag85b与载体连接形成重组质粒后，双酶切该重组质粒和esat-6基因片段，并连接酶切产物；或者先将esat-6基因片段与载体连接形成重组质粒后，双酶切该重组质粒和ag85b基因片段，并连接酶切产物。
本发明的Ag85B，ESAT-6的嵌合亚单位疫苗具有下列优势1.重组表达了结核分枝杆菌两个重要保护性抗原。
2.依据Ag85B，ESAT-6的T细胞抗原表位构建嵌合蛋白，可减少因两蛋白融合时结构改变造成的对抗原表位的影响。
本发明研究发现，这种新的嵌合蛋白疫苗与佐剂MPL-TDM共免疫小鼠后，IgG2a/IgG1的比例和IFN-γ的分泌都比Ag85B-ESAT-6融合蛋白(Ag85B-EAST-6融合蛋白的连接顺序是直接头尾相连后插入同一载体的)高，后者已被报道在结核杆菌感染后可以产生与BCG同等的保护效果。因此，Ag85B，ESAT-6嵌合亚单位疫苗有可能成为一种有效的新的蛋白多肽疫苗而用于结核分枝杆菌的预防。
图1为重组蛋白的纯化结果图。M蛋白分子量标准；1，2表达A-E(即Ag85B-ESAT-6融合蛋白，Ag85B-EAST-6融合蛋白的连接顺序是直接头尾相连后插入同一载体的)和AN-E-AC(Ag85B，ESAT-6嵌合亚单位疫苗)的BL21菌体；3，4纯化的A-E和AN-E-AC。
图2为A-E和AN-E-AC免疫小鼠抗体水平的检测结果图。可见，AN-E-AC免疫的小鼠比Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫的小鼠抗体水平显著增加。
图3为A-E和AN-E-AC免疫小鼠IgG2a/IgG1的比例的检测结果图。可见，AN-E-AC免疫的小鼠脾细胞比Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫的小鼠的IgG2a/IgG1的比例更高。
图4为A-E和AN-E-AC免疫小鼠脾细胞IFN-γ表达的检测结果图。其中，“sfu”是(斑点形成数)。可见，AN-E-AC免疫的小鼠脾细胞比Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫的小鼠IFN-γ的分泌量显著增加。
具体实施例方式
本发明中未特定标注的试剂和条件均采用本领域普通技术人员熟知的常规产品和方法。
实施例1 Ag85B，ESAT-6的嵌合亚单位疫苗的制备1.1结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA的制备结核分枝杆菌(H37Rv)在7H9Broth培养基中培养4周，80℃，2小时灭活。用细菌DNA(小量)抽提试剂盒抽提基因组DNA。因结核菌的壁厚，细菌的消化时间延长至3到5小时。
1.2结核分枝杆菌H37Rv菌株ag85b，esat-6基因的扩增根据ag85b，esat-6基因及载体多克隆位点设计引物。引物设计如下ag85b上游5’TAAGAATTCTTCTCCCGGCCGG-G 3’EcoRI下游5’TAAGCGGCCGCTCAGCCGGCGCCT 3’NotIesat6上游5’TAATCGCGATGACAGAG-CAGCAGTG 3’NruI下游5’TAACTCGAGGCGAACATCCCAGTGA3’XhoIPCR反应体系10×buffer 5μl，dNTPs 5μl，DNA模板1μl，引物各1μl，Taq酶0.25μl，水36.75μl。反应条件94℃1min，66℃1min，72℃3min；共30个循环，然后72℃延伸10min。产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.3载体pET28a、ag85b的酶切、连接及转化载体pET28a、ag85b的PCR产物使用EcoRI和NotI双酶切，37℃，4小时。用胶回收试剂盒纯化酶切产物。T4DNA连接酶连接，16℃，过夜。制备E.coliDH5α感受态细胞取DH5α单菌落于3mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜，次日按1∶100转接于30mlLB培养液中，37℃振荡培养2小时，0℃冷却放置10min，5kr/min 4℃离心5min收集菌体，重悬于10ml0.1mol/LCaCl2中。冰浴20min，5kr/min 4℃离心5min收集菌体。加预冷0.1mlmol/LCaCl2冰浴放置1小时以上备用。将10ml连接产物加入200mlE.coliDH5α感受态细胞中，冰浴30min，37℃热休克5min，立即冰浴2min，加入LB培养液800ml，37℃振荡培养1小时，然后涂布于含50μg/ml Kana的LB平板上37℃培养过夜。挑选单菌落分别接种于3ml含50μg/ml Kana的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，离心收菌，抽提质粒DNA。用EcoRI和NotI双酶切鉴定。选取正确的重组子(简称PA)进行下一步实验。
1.4重组子(PA)、esat6的酶切、连接及转化重组子(PA)、esat6的PCR产物使用NruI和XhoI(TaKaRa Biotechnology Co.，NruID1168A，XhoID1094A)双酶切。然后连接，转化(同上)。选取正确的重组子进行下一步实验。重组质粒pET28a-ag85b(esat-6)测序，结果表明所插入序列和Gene Bank中相应基因序列一致。
1.5重组质粒pET28a-ag85B(esat-6)的转化，表达及纯化重组质粒pET28a-ag85b(esat-6)转化入E.coliBL21中(方法同上)。挑选单菌落分别接种于3ml含50μg/ml Kana的LB培养液中，振荡培养过夜，按1∶100接种目的表达菌株至1LLB培养基中，220rpm，37℃培养至对数期，加入1.0mM IPTG，37℃培养4hr。收菌，SDS-PAGE电泳验证表达成功。超声破菌(超声1S，中止1S，200V，50个循环)，收取上清及沉淀，SDS-PAGE电泳显示目的蛋白主要在包涵体中。包涵体重悬于含有8M尿素，10mMTris-HCl(pH7.4)的缓冲液中，室温溶解4hr，12,000g4℃离心40分钟收集上清。将收集所得上清流过缓冲液A(8M urea，0.1M sodium phosphate buffer，0.01M Tris-HCl，pH 8.0)预先处理好的His-Bind-Ni2+-NTA柱，缓冲液A洗柱后，用缓冲液B(8M urea，0.1M sodiumphosphate buffer，0.01M Tris-HCl，pH 6.3)，缓冲液C(8M urea，0.1M sodium phosphate buffer，0.01M Tris-HCl，pH 4.5)洗脱，收集纯化蛋白，超滤，测蛋白浓度。(图1)实施例2 疫苗免疫小鼠并免疫指标的测定用Ag85B，ESAT-6的嵌合亚单位疫苗(简称AN-E-AC)与佐剂MPL-TDM共免疫C57BL/c小鼠，同时分别用Ag85B-ESAT-6的融合亚单位疫苗(简称A-E)和Tris-MPL(即单磷酸内酯A)-TDM(即海藻糖丙吡胺霉菌酸酯)作为对照。每两周免疫一次，共免疫三次。免疫后取血用ELISA法检测血清抗体表达水平。无菌分离脾脏，应用ELISPOT技术检测脾细胞受到相应蛋白刺激后IFN-γ的表达。它们分别反映了疫苗免疫后体液免疫和细胞免疫的水平。结果表明Ag85B，ESAT-6的嵌合亚单位疫苗和Ag85B-ESAT-6的融合亚单位疫苗组相比，所诱导的血清抗体水平(图2)，IgG2a/IgG1的比例(图3)和脾细胞IFN-γ表达(图4)都有显著的增高。这说明AN-E-AC可以诱导较A-E高的体液和细胞免疫水平。
检测血清抗体血清抗体的检测用免疫酶标技术(ELISA)。酶标板分别用Ag85B-ESAT-6(5μg/well)，or Ag85B(ESAT-6)(5μg/well)包被4℃过夜。次日用含1％BSA的200μl/well PBS37℃封闭30min，含0.05％Tween 20的PBS洗三次，每次五分钟。加入按2倍梯度从1/1000开始稀释的血清37℃2h，同上洗三次。加辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，IgG1和IgG2a，分别按1/10000，1/1000和1/1000用PBS稀释，37℃1h，同上洗三次。用含1mg/mlOPD(邻苯二胺)和0.03％过氧化氢的0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 5.0显色，加入50μl/well of 1N H2SO4终止反应。分光度492nm读板。
检测脾细胞IFN-γ脾细胞IFN-γ的检测用ELISPOT技术。无菌分离小鼠脾细胞，悬浮在含10％的胎牛血清RPMI-1640培养基中，计数后按5×/105cells/well铺板。每孔加100μl of70％乙醇室温10min润湿PVDF膜，后加入50μl of稀释的包被抗体4℃过夜。用5倍的洗涤缓冲液洗涤，加200μl封闭缓冲液，37℃封闭1h。5×105cells/well铺板，at 37℃，5％CO2，100％湿度培养24小时。洗掉细胞后每孔加入100μl合适稀释度的生物素标记的抗体37℃1h。洗涤三次，加100μl/well合适稀释度的辣根过氧化物酶标记的链球菌亲和素，37℃1h。洗涤三次，加10μl的AEC(3-氨基-9-乙基吡咯)底物缓冲液，室温15-30min。显点后，用无菌水洗涤终止反应。
结果显示，本发明的嵌合蛋白疫苗与佐剂MPL-TDM共免疫小鼠后，小鼠抗体水平、小鼠脾细胞IgG2a/IgG1的比例和IFN-γ的分泌都比Ag85B-Esat-6融合蛋白显著增加。
权利要求
1.一种含有Ag85B和ESAT-6多肽序列的嵌合亚单位疫苗，其特征在于，该疫苗中将ESAT-6的多肽片段插入到Ag85B第169～182位氨基酸位置，并且去除Ag85B第169～182位氨基酸，形成嵌合蛋白。
2.一种重组质粒，其特征在于，该质粒中含有Ag85B蛋白T细胞抗原表位的编码序列和ESAT-6蛋白的编码序列，并且ESAT-6蛋白的编码序列插入到Ag85B第169～182位氨基酸的编码序列位置，同时去除Ag85B第169～182位氨基酸的编码序列。
3.如权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)分别扩增ag85b和esat-6基因；(2)用同样的酶双酶切ag85b和esat-6基因序列，并与载体相连，形成质粒；(3)将(2)获得的重组质粒转化、扩增并表达；(4)分离(3)获得的重组质粒，提取蛋白以获得权利要求1所述的疫苗。
4.一种如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，该方法中双酶切使用的酶是NruI和XhoI。
5.一种如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，该方法中使用的载体是pET28a、pQE30或者pUC118。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域和结核疫苗领域。近十几年来由于结核耐药株增多和结核分枝杆菌与HIV的共感染，导致结核病发病率增高，成为继HIV之后人类的第二大杀手。目前全球广泛使用的唯一的结核病疫苗是BCG。本发明提供了一种新型Ag85B，ESAT－6嵌合蛋白疫苗。这种新的嵌合蛋白疫苗与佐剂MPL－TDM共免疫小鼠后，IgG2a/IgG1的比例和IFN－γ的分泌都比Ag85B－ESAT－6融合蛋白高，后者已被报道在结核杆菌感染后可以产生与BCG同等的保护效果。因此，Ag85B，ESAT－6嵌合亚单位疫苗有可能成为一种有效的新的蛋白多肽疫苗而用于结核分枝杆菌的预防。
文档编号A61P31/06GK1923278SQ20061011605
公开日2007年3月7日 申请日期2006年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者王洪海, 徐颖, 王宝林, 王庆忠, 陈嘉臻, 祝秉东, 王九玲, 郄亚卿 申请人:复旦大学