专利名称：治疗仔猪断奶多系统衰竭综合症的自家高免血清制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗仔猪断奶多系统衰竭综合症的自家高免血清制备方法，制备得到的高免血清用于集约化养猪场中仔猪断奶多系统衰竭综合症(PMWS)的防治，以确保养猪场兽医公共卫生安全，降低猪场PMWS的发病率和死亡率。
背景技术：
仔猪断奶后多系统衰竭综合症(Post-Weaning multi systemic WastingSyndrome，PMWS)是由猪圆环病毒2型(Porcinecircovims 2，PCV2)等引起的仔猪断奶和成长阶段的一种新疾病，可导致断奶仔猪和肥育猪的极高死亡率。该病呈世界性分布，严重危害着养猪业的健康发展，越来越受到相关领域的广泛关注。另外，由于PCV2较广泛地存在于猪体内，所以在研究或应用经基因改造的猪器官移植到人体内时，有可能引起人类感染及引起人类新的传染病，为器官移植的安全性提出了新的要求，需要对PCV2作为一种潜在的人兽共患病病原进行危险性评估。该病被证明在我国普遍存在，已经对我国规模化养猪场造成巨大的经济损失。研究证明，如果没有PCV2存在就不可能引起PMWS，但PMWS是由一些因素激发PCV2而引起的。这些激发因素包括致病因子猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)等，以及非致病因子不良环境、高密度、不同年龄猪混合饲养等。按传染病防制的基本要求，PMWS病猪本应全部淘汰，但由于该病发病率高，加之临床上许多此类病例一时难以确诊，受经济条件等限制，许多厂家很难做到全部淘汰病猪，实际上存在着对PMWS病猪进行治疗的问题。就目前而言，该病尚无有效的特异性预防疫苗，加之其病原属于病毒，使用抗生素治疗是无效的。该病一旦在猪场流行，将缠绵不断，难以根除，是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。因此，研制PMWS有效防治制剂，成了我国集约化养猪业生产实际中急需解决的问题。
理论和实践均已证明，对于尚无有效疫苗和药物防治的疫病，采用高免血清进行群体治疗是可行的办法。就目前我国集约化养猪场现状而言，猪群发生的疫病大多数情况下已经不是由单一病原感染所致，多个病原体混合协同感染已经是普遍现象。现有技术制备的健康血清采自自然感染状态下的猪只，大多是在不明确病原的情况下收集的，涉及的病料病原单一，所获得的健康血清抗体效价不高，不能满足对集约化养猪场PMWS的防治需要。研究表明，利用自家PMWS病死猪脏器制备疫苗，对本场漏去势公猪按照一定的程序进行免疫，研制出高免血清，在严格隔离的条件下，对全场这类病猪进行治疗，可以收到良好的治疗效果。目前尚未见有与此项研究相关的公开技术报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足和实际需求，提供一种治疗仔猪断奶多系统衰竭综合症的自家高免血清制备方法，制得的高免血清可以在不扩散病原的前提下，对本场发生的PMWS猪进行治疗，降低发病率和死亡率，减少经济损失。
为达到上述目的，本发明对传统血清制备方法进行了更新，在经免疫学方法确诊仔猪断奶多系统衰竭综合症PMWS疫情的情况下，采用多重PCR(聚合酶链式反应)技术检测脏器中主要病原体PCV2(猪圆环病毒2型)和协同感染病原PPV(猪细小病毒)以及PRRSV(猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒)病毒含量，选择病毒含量相对高的脏器作原料制备自家脏器苗，再按照一定的免疫程序，用灭活脏器苗对自家漏去势公猪进行多点注射强化免疫，用琼扩试验检测免疫猪的血清抗体水平，取用抗体水平高者的血液分离血清，经生物学安全检验后即可得到用于治疗仔猪断奶多系统衰竭综合症的自家高免血清。
本发明方法具体包括如下步骤1、自家脏器灭活苗的制备选取经PCV2抗体检测为阳性且出现典型PMWS病变而剖杀的病猪脏器，按照常规方法对被检病猪脏器提取DNA后，利用多重PCR方法进行PCV2、PPV、PRRSV三种病毒检测，选取病毒相对含量较高者作为制备脏器苗的原料。其中，设计检测病毒基因的引物分别是PCV2引物5’-primer5’-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3’，3’-primer5’-ATCTCGAGTCATGCTGAGGGTGA-3’；PPV引物5’-primer5’-CAGGATCCGCAACCTCACCACC-3’，3’-primer5’-GCCTCGAGTGCATGTTAGATTTCCC-3’；PRRSV引物5’-primer5’-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3’，3’-primer5’-ATCTCGAGTCATGCTGAGGGTGA-3’用组织匀浆器对选取的脏器苗原料进行匀浆，然后用灭菌纱布过滤，过滤液中加1％甲醛用以灭活，再加与过滤液等量的油类佐剂搅拌乳化，制得自家脏器灭活苗4℃保存备用。
2、高免血清的制备利用上述制得的自家脏器灭活苗，对本场3月龄大小的漏去势健康公猪进行多点注射强化免疫，2～3次免疫后，用琼扩检测免疫猪血清中抗PCV2的抗体。将经琼扩检测抗体效价在1∶32以上的免疫猪剖杀放血，分离血清，加入青、链霉素各2000μg/1000ml，经无菌检测及生物学安全检测后，得到高免血清按每10ml分装入容器中，4℃保存。
本发明选择具有典型PMWS病变、经PCR测定PCV2、PPV、PRRSV病毒含量高的脏器作为原料，制备的自家脏器苗病原含量高，可大大提高免疫效果。利用本场无商品价值的漏去势健康公猪强化免疫，可提高高免血清质量。本发明针对的病原是已知的，在确诊疫情的前提下，以自家脏器苗免疫自家公猪制备高免血清治疗自家病猪，整个研制过程都处于可监控状态，可避免因用外源血清而导致引进新病原的可能性。
本发明制备的自家高免血清，可以在不扩散病原的前提下，对本场发生的PMWS猪进行治疗，使养猪场PMWS疫情得到稳定控制，大大降低发病率和死亡率，减少经济损失，同时可以节省大量的治疗药物开支，具有显著的经济效益，适合于我国集约化养猪场的生产实际。
具体实施例方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1某地一个集约化万头养猪场连续几年流行疑似仔猪断奶多系统衰竭综合症(PMWS)，发病率达30％-50％，致使该场仔猪生长受阻，死亡逐年增加，损失惨重。本发明选择该场为项目实施基地，首先对一个猪场PMWS疑似病例进行PCV2抗体检测将PK-15细胞培养的PCV2毒株，经密度梯度离心纯化后作为包被抗原；按10ug/孔的含量包被96孔ELISA板，37℃，2h，PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤；采取有PMWS疑似症状的病猪血清作为待检样品；将待检血清按倍比稀释，分别加入ELISA包被板中以进行抗原抗体反应，37℃，2h，PBS洗涤；加入工作浓度(说明书规定)的HRP标记的羊抗猪IgG为二抗进行同样反应，37℃，2h，PBS洗涤；加入底物联苯二胺(OPD)，37℃，20min进行显色；在酶标阅读仪上读取每孔数值。以OD值样品孔/阴性对照孔比值大于2者判为阳性，只有PCV2检测结果阳性的病例才能进行下一步剖检诊断。
对PCV2抗体检测阳性猪进行剖杀，然后按照常规病理剖检程序进行病理学观察，大多数患猪呈现多器官广泛性病理损伤，可见淋巴结炎，并以腹股沟浅淋巴结和肠系膜淋巴结为甚。腹股沟浅淋巴结肿大、多灶性间质性肺炎、扁桃体炎、肝硬变以及胃溃疡、肠炎等。肾脏皮质和髓质有散在大小不一的白色坏死点，肾肿大。在肝、肺、胰、肾上腺、唾液腺及淋巴组织可出现肉芽肿。只有对出现上述典型PMWS病变且PCV2检测阳性者进行综合诊断，才能确诊为PMWS猪。
本发明的自家高免血清的制备方法步骤如下1、自家脏器灭活苗的制备选取经PCV2抗体检测为阳性且出现典型PMWS病变而剖杀的病猪脏器，按照常规方法对被检病猪脏器提取DNA后，利用多重PCR方法进行PCV2、PPV、PRRSV三种病毒检测。其中，设计检测病毒基因的引物分别是PCV2引物5’-primer5’-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3’，3’-primer5’-ATCTCGAGTCATGCTGAGGGTGA-3’；
PPV引物5’-primer5’-CAGGATCCGCAACCTCACCACC-3’，3’-primer5’-GCCTCGAGTGCATGTTAGATTTCCC-3’；PRRSV引物5’-primer5’-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3’，3’-primer5’-ATCTCGAGTCATGCTGAGGGTGA-3’PCR反应体系为50μL，组成为10×PCR buffer 5μL，dNTPs(2.5mM)4μL，3对引物各1μL，模板DNA(eDNA)10μL，rTaq酶0.5μL(5U/μL)，加灭菌超纯水至50μL，混合均匀，加入30μL灭菌石蜡油。将混合物95℃变性10min后，按94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察扩增片段大小。以出现三条特异条带的样品为阳性。选取病毒含量相对较高者，无菌取出后作为制备脏器苗的材料。
用组织匀浆器对选取的病毒含量高的脏器进行匀浆，然后用灭菌纱布过滤，过滤液中加1％甲醛作用以灭活，再加与过滤液等量的柏油等油类佐剂用电动搅拌器进行乳化，制得自家脏器灭活苗4℃保存备用。
2、高免血清的制备挑取本场外观健康活泼，3月龄大小的漏去势小公猪，利用上述制得的自家脏器灭活苗沿小公猪脊柱两侧各选5点进行肌肉注射，每点1ml，进行强化免疫，免疫程序为首免后3周进行2免，2免后3周进行3免，3免后用琼扩检测免疫猪血清中抗PCV2的抗体。
将经琼扩检测抗体效价在1∶32以上的免疫猪剖杀放血，分离血清，加入青、链霉素各2000μg/1000ml，得到高免血清。取10ml高免血清装入容器中，在37℃下培养，以进行无菌检测；同时按每头份10ml肌肉注射3头1月龄小猪，观察其健康状况，以进行生物学安全检测。检测合格，则将得到的高免血清按每10ml分装入容器中，4℃保存。
本发明制备得到的自家高免血清的应用经流行病学、临床诊状、病理剖检、血清学试验等确诊为PMWS猪群中的病弱仔猪(约2月龄)，在严格隔离的条件下，先用抗生素、磺胺等连续治疗3天，未见有好转，然后每猪每次肌注10ml本发明制备的自家高免血清，每天一次，连续3天。之后，考虑到PMWS有继发细菌感染的情况，辅之以庆大霉素、青、链霉素、补液盐及健胃药等治疗3天。试验共进行两次，第一次共338头病猪，其中39头有明显全身出血斑点，死亡37头，其余出血点不明显者全部康复，治愈率达89％。第二次247头病猪，有明显全身出血斑点者61头，死亡46头，其余全部康复，治愈率达81％。本发明的自家高免血清对治疗早期或慢性PMWS病猪则效果极好，同时，辅之以抗菌类药物及一些对症治疗措施，可收到更为理想的治疗效果。
自应用本发明所研制的自家高免血清后，该养猪场PMWS疫情得到稳定控制。目前，猪死亡率由3年前的30％左右下降到现在的1％左右。利用的是本场无商业价值的漏去势公猪作为制备高免血清的试验猪，不但没有增加成本，反而节省了大量的治疗药物的开支，本场会计部门成本核算表明，这种新的高免血清已带来了明显的经济效益。
权利要求
1.一种治疗仔猪断奶多系统衰竭综合症的自家高免血清制备方法，其特征在于包括如下步骤1)自家脏器灭活苗的制备选取经PCV2抗体检测为阳性且出现典型仔猪断奶多系统衰竭综合症病变而剖杀的病猪脏器，对被检病猪脏器提取DNA后，利用多重PCR方法进行PCV2、PPV、PRRSV三种病毒检测，选取病毒相对含量较高者作为制备脏器苗的原料；其中，设计检测病毒基因的引物分别是PCV2引物5’-primer5’-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3’，3’-primer5’-ATCTCGAGTCATGCTGAGGGTGA-3’；PPV引物5’-primer5’-CAGGATCCGCAACCTCACCACC-3’，3’-primer5’-GCCTCGAGTGCATGTTAGATTTCCC-3’；PRRSV引物5’-primer5’-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3’，3’-primer5’-ATCTCGAGTCATGCTGAGGGTGA-3’；用组织匀浆器对选取的脏器苗原料进行匀浆，然后用灭菌纱布过滤，过滤液中加1％甲醛用以灭活，再加与过滤液等量的油类佐剂搅拌乳化，制得自家脏器灭活苗，4℃保存备用；2)高免血清的制备利用上述制得的自家脏器灭活苗，对本场3月龄大小的漏去势健康公猪进行多点注射强化免疫，2～3次免疫后，用琼扩检测免疫猪血清中抗PCV2的抗体，将经琼扩检测抗体效价在132以上的免疫猪剖杀放血，分离血清，加入青霉素、链霉素各2000μg/1000ml，经无菌检测及生物学安全检测后，得到高免血清按每10ml/每支分装入容器中，4℃保存。
2.根据权利要求1的治疗仔猪断奶多系统衰竭综合症的自家高免血清制备方法，其特征在于所述多点注射强化免疫按照首免后3周进行2免，2免后3周进行3免的免疫程序，沿免疫猪脊柱两侧各选5点进行肌肉注射。
全文摘要
本发明涉及一种治疗仔猪断奶多系统衰竭综合症的自家高免血清制备方法，在经免疫学方法确诊仔猪断奶多系统衰竭综合症PMWS疫情的情况下，采用多重PCR技术检测脏器中主要病原体PCV2和协同感染病原PPV以及PRRSV病毒含量，选择病毒含量相对高的脏器作原料制备自家脏器苗，再按照一定的免疫程序，用灭活脏器苗对自家漏去势公猪进行多点注射强化免疫，用琼扩试验检测免疫猪的血清抗体水平，取用抗体水平高者的血液分离血清，经生物学安全检验后即可作为治疗用的高免血清。本发明以自家脏器苗免疫自家公猪制备的高免血清，可以在不扩散病原的前提下，对本场发生的PMWS猪进行治疗，以最大程度地降低发病率和死亡率，减少经济损失。
文档编号A61P31/12GK1970082SQ20061011663
公开日2007年5月30日 申请日期2006年9月28日 优先权日2006年9月28日
发明者朱建国, 华修国, 张艳玲 申请人:上海交通大学