专利名称：一种细胞灭活疫苗和卵黄抗体注射液及其制备方法
技术领域：
本发明属于免疫预防技术领域，涉及一种细胞灭活疫苗，同时还涉及一种由所述细胞灭活疫苗制成的卵黄抗体注射液及其制备方法。
背景技术：
猪圆环病毒2型(PVC-2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症和肾病皮炎综合症的主要 病原，同时该病还会造成免疫抑制，容易造成其他疾病的继发或并发感染，具有高发生率、高流行性、高致病性、高死亡性等特点,给养猪业造成了巨大的经济损失。PVC-2的致病机制尚不清楚，其对猪免疫系统的破坏被认为是引起相关猪病的主要原因。由于免疫力下降，猪在应激和病原感染时容易遭受其他病原侵袭，其临床症状主要为进行性消瘦、贫血和黄疸。现在防治手段有抗病毒药、中药等，但效果不佳。鸡卵黄抗体IgY是鸡的一种免疫球蛋白IgY在功能上相当于哺乳动物IgG，但结构上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空间构象。鸡卵黄抗体具有很多优越性。
(I)由于鸟类与哺乳类动物种系发生学的差距，鸟类更适于生产抗哺乳动物抗原的特异性抗体。卵黄抗体不会激发补体系统，不与抗哺乳动物抗原的抗体发生反应，不与哺乳动物和细菌的Fe受体结合，这在免疫诊断中具有重要意义。(2)卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、加工、摄食及消化过程中保证其稳定性是非常关键的。多项试验表明，鸡IgY具有较好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热。卵黄抗体较易保存，4°C条件下存放5年或室温条件下存放6个月对抗体活性无明显影响。(3 )卵黄抗体量大，成本低，便于规模化生产。卵黄中抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血清抗体浓度的水平上。I只产蛋鸡(以平均每周产蛋5飞枚，平均每枚鸡蛋蛋黄大约15mL计算)所产蛋生产的抗体量相当于9(Tl00mL血清或18(T200mL血液中抗体的量，例如I只兔子I个月可提取IgG约200mg，而I个月I只蛋鸡可从蛋中提取IgY2000mg以上。此外，在实际生产中，动物的采血不仅对动物本身是极大的应激，而且费时、费工，大规模生产是不切实际的，而利用蛋鸡生产抗体要方便的多。总的来讲，卵黄抗体对动物没有毒副作用，用高免卵黄抗体治疗动物疾病不但避免了高免血清价格昂贵、产量低的缺点，而且可以避免高免血清在治疗过程中引起的副作用，是一种很有前途的新型免疫球蛋白制剂。因此，卵黄抗体在禽畜疾病诊断、治疗和预防的应用越来越多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞灭活疫苗，该疫苗同时包含猪圆环病毒抗原表位和鹅圆环病毒抗原表位。本发明的目的同时在于提供一种由所述细胞灭活疫苗作为抗原制得的卵黄抗体注射液，该注射液能够同时预防、治疗猪圆环病毒病和鹅圆环病毒病。本发明的目的还在于提供一种卵黄抗体注射液的制备方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是
一种细胞灭活疫苗，由以下方法制得首先从猪圆环病毒中选筛出高致病性毒株SD株，然后从毒株中挑选出多个具有抗原免疫活性的病毒表位，经过纯化、克隆等技术将猪圆环病毒抗原表位点插入到鹅圆环病毒标准病毒基因组中，然后进行大量病毒增殖，制得细胞灭活疫苗。一种采用所述细胞灭活疫苗作为抗原制得的卵黄抗体注射液，包括以下组分90%卵黄抗体、0. 2-0. 3%的甲醛和0. 01-0. 02%的硫柳汞及余量的水。一种卵黄抗体注射液的制备方法，如下采用细胞灭活疫苗对健康鸡群进行三次免疫制备高免蛋，经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取、配制，得到抗猪圆环病毒卵黄抗体注射液。所述的卵黄抗体注射液的制备方法，具体步骤为
I)用细胞灭活疫苗，每间隔7-10天对健康产蛋鸡群进行基础免疫、加强免疫和强化免疫三次免疫，第二次免疫后开始检测抗体效价，当猪圆环病毒抗体效价达I :64、鹅圆环病毒抗体效价达I :64以上时，收集闻免蛋；2)清理、消毒高免蛋，晾干，无菌术取卵黄，得到卵黄原液；3)向卵黄原液中加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液；4)将卵黄溶液放入60-65°C水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH为4. 9-5. 2的、温度为4-6°C的酸化水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，静置沉淀，取上清液，离心 20min, 15000rpm/min,留上清液；5)向步骤4)上清液中加入辛酸，辛酸加入量为溶液体积的0. 8-1. 0%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，离心10min,20000rpm/min,留取上清液,静置；6)用0.45 的滤膜对步骤5)所得上清液过滤，得到卵黄抗体溶液，再经MCW300KD的滤膜过滤，得到较精制的卵黄抗体溶液；7)将步骤6)精制的卵黄抗体溶液经除菌滤膜再次过滤，留取滤液，加入甲醛、硫柳汞，甲醛为卵黄抗体溶液的0. 2-0. 3%，硫柳汞为卵黄抗体溶液的0. 01-0. 02%，即得卵黄抗体注射液。步骤I)中基础免疫接种I. 5ml，加强免疫和强化免疫接种量加倍。步骤I)中当猪圆环病毒抗体效价达I :128、鹅圆环病毒抗体效价达I :128以上时，收集高免蛋。步骤4)中酸化水溶液是盐酸配制的酸化水，预冷时间为l_2h。本发明采用了最新的冷热酸化处理卵黄液技术，消毒和酸化处理同步进行，减少了生产步骤，也相对减少抗体的损失。该产品采用基因整合技术、克隆等选先进技术制成的疫苗增加其免疫原性和抗体治疗范围，将猪的圆环病毒基因插入到鹅圆环病毒基因组中，增强对鹅圆环病毒的免疫原性和对鹅机体的免疫系统的刺激，使其产生抗体要比单一使用猪圆环病毒疫苗产生的卵黄抗体效价高，临床应用效果好，同时产生鹅的圆环抗体对猪圆环疾病具有辅助治疗效果。细胞灭活疫苗是由临床上发病率高的猪场采集样品，分离，纯化，整合到鹅病毒基因组中，增殖细胞培养，灭活制成的疫苗。本发明抗猪圆环病毒病高免卵黄抗体注射液制剂可以治疗猪圆环病毒病，见效快、疗效显著，同时小剂量也可以防治本病的发生，降低发病的机率，提高经济效益。同时，这种卵黄抗体也可以针对鹅的圆环病毒病进行治疗。还可以提高工作效率，减少饲养成本，提高经济效益。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细的阐述。实施例I :本实施例猪圆环病毒细胞灭活疫苗制备从山东地区发生严重的猪圆环病猪场采集 病料，病料经匀浆、反复冻融3次后，高速离心，取上清后经0. 22 y m滤膜过滤后，接种敏感单层的PK-15细胞。将PK-15细胞连续传代6代后，取部分细胞经冻融后提取PCV-2病毒的DNA，用针对PCV-2病毒ORFl基因特异性PCR引物对目的基因扩增。扩增产物克隆入PMD-18T载体进行测序，鉴定，命名为SD毒株。在该毒株中筛选出多个具有抗原免疫活性的病毒表位，经过特异引物PCR、产物电泳、测序、克隆、纯化、检测每个表位的蛋白免疫活性等技术，最终选择5个抗原表位点，经拼接技术将各个抗原位点连接，将猪圆环病毒的所筛选的抗原表位点插入到鹅圆环病毒标准毒株基因组中，然后病毒在敏感性细胞PK-15单层上传代，经过45代传代，获得免疫原性的SD45株，扩大增殖，用IPMA法测定病毒的效价，该病毒在PK-15细胞中传代表现稳定细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在103 9TCID5(l/1.0ml，收集细胞，经过甲醛灭活加弗氏佐剂充分混匀制得细胞灭活疫苗。由上述猪圆环病毒细胞灭活疫苗制成的抗猪圆环病毒卵黄抗体注射液，由以下方法制得I)用猪圆环病毒细胞灭活疫苗免疫健康鸡群，第一次免疫接种I. 5mL，每次免疫间隔7天时间，以后免疫加I倍量；第二次免疫后开始检测抗体效价，当猪圆环病毒抗体效价达I : 128、鹅圆环病毒抗体效价达I :128时，收集高免蛋；2)清理、消毒高免蛋，晾干，无菌术取卵黄，得到卵黄原液；3)向卵黄原液中加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液；4)将卵黄溶液放入60°C水浴锅内加热30min，然后加入pH为4. 8盐酸水，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，静置沉淀，取上清液，离心20min，15000rpm/min,留上清液；5)向步骤4)上清液中加入辛酸，加入量为上清液体积的0. 8%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，离心IOmin, 20000rpm/min,留取上清液,静置；6)用0.45 pm的滤膜对步骤5)所得上清液过滤，得到卵黄抗体溶液，再经MCW300KD的滤膜过滤，得到较精制的卵黄抗体溶液；7)将步骤6)精制的卵黄抗体溶液经除菌滤膜再次过滤，留取滤液，加入浓度为甲醛、硫柳汞，甲醛的加入量为卵黄抗体溶液体积的0. 2%，硫柳汞为卵黄抗体溶液体积的0. 01%，得到抗猪圆环病毒病高免卵黄抗体注射液。为了检测卵黄抗体注射液在常温下的放置时抗体效价变化，以此来确定本产品的保质期，做了以下试验将本品保存在37°C培养箱中，保存24个月，分别I周、2周、I月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂扩散(AGP)法，测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化，结果见表I。表I.常温放置注射液不同时间段效价的变化
权利要求
1.一种细胞灭活疫苗，其特征在于，由以下方法制得首先从猪圆环病毒中选筛出高致病性毒株SD株，然后从毒株中经PCR、电泳手段从0RF1/2阅读框中挑选出多个具有抗原免疫活性的病毒表位，经过纯化、克隆将猪圆环病毒抗原表位点插入到鹅圆环病毒标准毒株基因组中，然后进行大量病毒增殖，制得细胞灭活疫苗。
2.根据权利要求I所述的细胞灭活疫苗，其特征在于，所述的高致病毒株SD株从山东区采集样品分离而得SD株，依据抗原免疫原性筛选出PCV2型ORFl五个免疫性高的位点进行拼接，增加免疫原性的特异性和免疫强度；将这个特异基因段插入到鹅圆环病毒基因中，使其产生猪圆环病毒的特异性和效价。
3.一种采用权利要求I所述细胞灭活疫苗作为抗原制得的卵黄抗体注射液，其特征在于，包括以下重量百分数的各组分90%卵黄抗体、0. 2-0. 3%的甲醛和0. 01-0. 02%的硫柳汞及余量的水。
4.一种如权利要求3所述的卵黄抗体注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤采用细胞灭活疫苗对健康鸡群进行三次免疫制备高免蛋，经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取、配制，得到抗猪圆环病毒卵黄抗体注射液。
5.根据权利要求4所述的卵黄抗体注射液的制备方法，其特征在于，具体步骤为 1)用细胞灭活疫苗，每间隔7天对健康产蛋鸡群进行基础免疫、加强免疫和强化免疫三次免疫，第二次免疫后开始检测抗体效价，当猪圆环病毒抗体效价达I :128、鹅圆环病毒抗体效价达I :128以上时，收集高免蛋； 2)清理、消毒高免蛋，晾干，无菌术取卵黄，得到卵黄原液； 3)向卵黄原液中加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液； 4)将卵黄溶液放入60-65°C水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH为4.8-5. 2的、温度为4-6°C的盐酸酸化水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，静置沉淀，取上清液，离心 20min, 15000rpm/min,留上清液； 5)向步骤4)上清液中加入辛酸，辛酸加入量为溶液体积的0.8-1. 0%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，离心10min,20000rpm/min,留取上清液,静置； 6)用0.45mm的滤膜对步骤5)所得上清液过滤，得到卵黄抗体溶液，再经MCW300KD的滤膜过滤，得到较精制的卵黄抗体溶液； 7)将步骤6)精制的卵黄抗体溶液经除菌滤膜再次过滤，留取滤液，加入甲醛、硫柳汞，甲醛为卵黄抗体溶液的0. 2-0. 3%，硫柳汞为卵黄抗体溶液的0. 01-0. 02%，即得卵黄抗体注射液。
6.根据权利要求5所述的卵黄抗体注射液的制备方法，其特征在于，步骤I)中基础免疫接种I. 5ml，加强免疫和强化免疫接种量加倍。
7.根据权利要求5所述的卵黄抗体注射液的制备方法，其特征在于，步骤I)中当猪圆环病毒抗体效价达I :128、鹅圆环病毒抗体效价达I :128以上时，收集高免蛋。
8.根据权利要求5所述的卵黄抗体注射液的制备方法，其特征在于，步骤4)中酸化水溶液是盐酸配制的酸化水，预冷时间为l_4h。
全文摘要
本发明涉及一种细胞灭活疫苗和卵黄抗体注射液及其制备方法，该疫苗同时包含猪圆环病毒抗原表位和鹅圆环病毒抗原表位，由以下方法制得首先从猪圆环病毒中选筛出高致病性毒株，然后从毒株中挑选出多个具有抗原免疫活性的病毒表位，经过纯化、克隆等技术将猪圆环病毒抗原表位点插入到鹅圆环病毒基因组中，然后进行大量病毒增殖，即得细胞灭活疫苗。本发明同时公开了一种由所述细胞灭活疫苗作为抗原制得的卵黄抗体注射液，该注射液可以治疗猪圆环病毒病，见效快、疗效显著，同时小剂量也可以防治本病的发生，降低发病的机率，提高经济效益。同时，这种卵黄抗体也可以针对鹅的圆环病毒病进行治疗。这种制剂不仅减少对机体的刺激，还可以提高工作效率，减少饲养成本。
文档编号A61K39/12GK102716476SQ20121018075
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者吴红云, 徐进, 郭俊清 申请人:郑州后羿制药有限公司