专利名称：洋金花甾内酯类成分及制备与它在抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域。具体涉及洋金花甾内酯类成份withametelin F、withametelin B和withametelin G及其制备方法，以及在制备治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病，据世界卫生组织调查表明，全球肿瘤患者比例约占6.89‰，而每年新增肿瘤患者为1.78‰，生存数近4000万人。国家卫生部统计资料表明，目前中国恶性肿瘤患病率达到1.15～1.27‰，因恶性肿瘤死亡居全部死因的第二位。恶性肿瘤的治疗虽然取得很大进展，但目前还缺乏理想的治疗药物，无法满足临床需要，恶性肿瘤仍被人们视为难治疾病，仍在不断寻找安全有效的抗肿瘤药物。
洋金花为传统中药，系茄科植物白曼陀罗Datura metel L.或毛曼陀罗Datura innoxia Mill.的干燥花。中医药认为其味辛，性温，有毒。入肺、心、脾经。功能定喘、祛风、麻醉止痛。主治哮喘、惊痫、风湿痹痛、脚气、疮疡疼痛化学工业出版社《中华人民共和国药典》一部2005年版。
现代研究表明洋金花含有丰富的甾内酯类成分(Withanolides)，至今已有数十种Withanolides类化合物被发现，包括withametelin B、withametelin G、withametelin F，Mohini Gupta，Anil B.Ray Journal of Natural Products54，2，599(1991)；M.A.Farboodniay Jahromi，Mohini Gupta，Anil B.RayJ.Chem.Research(S)，1993，234-235。本发明人通过抗肿瘤活性追踪筛选，首次证实withametelin B、withametelin G、withametelin F具有较强的抗肿瘤活性，并研究了它们的制备方法，这三种化合物可单独或相互组合作为有效成分或组分用于制备抗肿瘤药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究具有抗肿瘤活性的洋金花甾内酯类成分withametelin F、withametelin B和withametelin G的制备方法，提供其在制备抗肿瘤药物中的应用。
洋金花含有生物碱、黄酮、甾体类化学成分，通过本发明人的筛选研究，发现了甾内酯类成分withametelin F、withametelin B和withametelin G具有抗肿瘤活性。
本发明提供了洋金花甾内酯类成分withametelin F、withametelin B和withametelin G的制备方法该方法包括下列步骤1.提取称取洋金花生药，加入30-50倍量溶剂溶剂选自含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯，而且包括并不限于以上种类，可以使用一种溶剂，也可以使用2种或2种以上溶剂混合物，采用冷浸、超声波、渗漉或加热回流方法提取1-5次，合并提取液，除去溶剂，得到洋金花提取物。
2.分离取上述洋金花提取物，加入4倍量水稀释，用石油醚萃取此溶液3次，然后以乙酸乙酯萃取水溶液5次，合并乙酸乙酯层，以0.5％的盐酸水溶液洗涤乙酸乙酯层3次，以水洗涤乙酸乙酯层至中性，将乙酸乙酯层蒸干得到总甾部位。
3.纯化洋金花总甾部位通过硅胶柱层析，从石油醚∶丙酮(或乙酸乙酯)100∶0到0∶100进行梯度洗脱。
如以石油醚-丙酮10∶1到0∶1梯度洗脱，分别以withametelin B、withametelin G和withametelin F对照品进行薄层层析检测，合并分别含有withametelin B、withametelin G和withametelin F的相同流份，其中，在石油醚-丙酮9∶1洗脱下来的流份再经硅胶柱层析，二氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脱，以30∶1洗脱下来的流份在乙酸乙酯中析出结晶Withametelin F；石油醚-丙酮6∶1洗脱下来的流份析出结晶Withametelin B；石油醚-丙酮4∶1洗脱下来的流份再经硅胶柱层析，二氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脱，以4∶1洗脱下来的流份在乙酸乙酯中析出结晶Withametelin G。
为提高纯度，可进一步以有机溶剂进行重结晶，有机溶剂选自乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、石油醚，而且包括并不限于以上种类，可以使用一种有机溶剂，也可以使用2种或2种以上有机溶剂混合物，滤去母液即得。
上述成分通过UV，IR，MS，NMR，2D-NMR等方法进行了分析鉴定，并与文献对照确认分别为withametelin F、withametelin G、withametelin BWithametelin B，C28H36O5，为无色针状结晶，熔点283～285℃，[α]D-153.3°(CHCl3)，ESIMS显示m/z452，UV206(ε10241)；314(ε4430)，IR3450cm-1，(-OH)；1712cm-1，(αβ-不饱和内酯)。
1HNMR(C5D5N)δ6.93(1H，dd，J＝9.6，5.85)H-3δ6.04(1H，d，J＝9.75)H-2δ6.16(1H，d，J＝6)H-4δ4.64(1H，br，s)H-22δ4.59(1H，br，s)H-6δ0.77，1.22，1.48(each 3H，s)H-18，19，28δ3.89(1H，d，J＝13.3)；δ3.72(1H，dd，J＝13.2，2.45)H-21δ6.76，6.02(each 1H，s)H-27Withametelin F，C28H36O5，为无色针状结晶，熔点242～245℃，ESIMS显示m/z452，UV206(ε10241)；IR没有-OH吸收峰，也有1712cm-1，(αβ-不饱和内酯)。
1HNMR(CDCl3)δ6.82(1H，ddd，J＝9.9，6.3，2.1)H-3δ6.0(1H，dd，J＝9.9，2.1)H-2δ5.97，6.72(each 1H，s)H-27δ0.65，1.22，1.40(each 3H，s)H-18，19，28
δ3.83(1H，d，J＝13.3)；δ3.67(1H，dd，J＝13.3，3.2)H-21δ3.10(1H，br，d，J＝2.5)H-6δ4.60(1H，br，s)H-22Withametelin G，C28H38O6，为无色针状结晶，熔点159～161℃，ESIMS显示m/z470，UV220(ε15241)；IR3450cm-1，(-OH)；1712cm-1，(αβ-不饱和内酯)。
1HNMR(CDCl3)δ6.60(1H，ddd，J＝10.2，4.8，2.4)H-3δ5.86(1H，dd，J＝10.2，2.4)H-2δ6.72，6.00(each 1H，s)H-27δ0.70，1.27，1.42(each 3H，s)H-18，19，28δ3.89(1H，d，J＝13.2)；δ3.70(1H，dd，J＝13.2，2.7)H-21δ3.60(1H，br，d，J＝2.7)H-6δ4.63(1H，br，s)H-22.13CNMR数据见下表Table 1.13CNMR spectral assignments of Withametelin B，Withametelin F，Withametelin G
通过以上方法得到的产物withametelin B、withametelin G、withametelin F，其含量可达到80-98％，优选范围为75-98％。有效成分含量通过HPLC方法测定分析方法用十二烷基硅烷键合硅胶为填充剂的分析柱(Agilent XDB柱4.6*150mm，5μm)，柱温30℃；检测波长为220nm；乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min。
在以上色谱条件下，withametelin B、withametelin G、withametelin F的保留时间分别约为8.7min、16.0min和19.9min。以withametelin B、withametelin G、withametelin F标准品(纯度大于98％)为标准测定样品含量。
本发明涉及的withametelin B、withametelin G、withametelin F经体外肿瘤细胞株实验活性评价显示具有强大细胞毒作用。
(一)体外药效试验(1)材料
肿瘤细胞株人肺癌(A549)、人慢性髓原白血病(K562)、人胃腺癌(BGC-823)；培养液DMEM+10％NBS+双抗；受试药物withametelin B、withametelin G、withametelin F(通过实施例1方法制备)用DMSO溶解，用PBS稀释到所需浓度。
(2)方法及结果MTT法测定取细胞悬液(相当于1-2×105/孔的细胞)，取96孔微量培养板，加入一定密度的100μl/孔，每挡浓度设三复孔，阴性对照孔加入培养液来代替。振荡使混合，置于37℃，5％CO2培养箱(48hr)后再加入MTT液20μl/孔，继续培养4hr后，加入溶解液100μl/孔，在放置37℃培养箱中，次日，以A570波长测各孔的光密度。以回归曲线方法求得IC50值。
Table 2 Activity of withametelin B、withametelin G and withametelin F
以上实验表明，本发明的withametelin B、withametelin G、withametelin F具有明显的细胞毒作用。
(二)体内药效试验实验材料动物和瘤株昆明种小鼠70只，雌性，体重18-21g，由上海中科院实验动物中心提供，合格证号合格证号SCXK(沪)2003-0003。小鼠S180腹水模型，由上海医药工业研究院药理室传代维持。withametelin B、withametelin G无水乙醇溶解，再以生理盐水(浓度约5％)稀释至所需浓度。阳性对照药注射用环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞制药股份有限公司出品。批号05011021。
方法与结果小鼠随机分为阴性对照组、环磷酰胺(CTX)组(30mg/kg，i.p)、受试样品withametelin B、withametelin G各设高低两个剂量组，每组10只。无菌条件下取生长旺盛的S180腹水瘤源，用生理盐水以1∶10稀释制备成瘤细胞悬液，于相应宿主腋皮下接种0.2ml/鼠，接种次日开始withametelin B、withametelin G按体重腹腔注射给药，连续给药10天(CTX分别在第1、3天给药两次)。第11天处死小鼠，测小鼠体重及瘤重并记录结果，计算抑瘤率。抑瘤率＝(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100％。结果见下表。
表3、withametelin B、withametelin G对小鼠肉瘤S180(皮下接种)模型的疗效
**P值＜0.01与阴性对照组相比.
结果表明withametelin B、withametelin G在小鼠S180肿瘤模型上显示出显著抗肿瘤作用，高剂量抑瘤率均超过40％，withametelin G活性强于withametelin B，但毒性也较大。
因此，本发明的withametelin B、withametelin G、withametelin F可作为有效组分，通过与药用辅料按常规方法制成口服或非口服制剂。
具体实施例方式
洋金花10公斤，每次加入100升85％乙醇回流提取1小时，提取3次，合并提取液，挥去乙醇，得到提取浸膏，加入4倍重量水稀释，用石油醚萃取此溶液3次，然后以乙酸乙酯萃取水溶液5次，合并乙酸乙酯层，以0.5％的盐酸水溶液洗涤乙酸乙酯层3次，以水洗涤乙酸乙酯层至中性，将乙酸乙酯层蒸干得到总甾部位。
此部位经硅胶柱(300-400目)层析，以石油醚-丙酮进行梯度洗脱，用HF254硅胶板薄层层析检测，合并相同流分，在石油醚-丙酮9∶1洗脱下来的流份再经硅胶柱层析，二氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脱，以30∶1洗脱下来的流份在乙酸乙酯中析出结晶Withametelin F；石油醚-丙酮6∶1洗脱下来的流份析出结晶Withametelin B；石油醚-丙酮4∶1洗脱下来的流份再经硅胶柱层析，二氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脱，以4∶1洗脱下来的流份在乙酸乙酯中析出结晶Withametelin G。
上述化合物晶体再分别用乙酸乙酯或乙醚进行重结晶，得到纯度较高的化合物withametelinF、withametelin B、withametelinG。
权利要求
1.一种洋金花提取物甾内酯类成分withametelin B、withametelin G和withametelin F，其特征在于它们通过以下方法制备得到①提取称取洋金花生药，加入3-50倍重量溶剂，溶剂为水、低级丙或乙酸乙酯或它们的2种或2种以上混合溶剂，采用冷浸、超声波、渗漉或加温方法提取1-5次，合并提取液，除去溶剂，得到洋金花提取物；②分离取上述洋金花提取物，加入4倍重量水稀释，用石油醚萃取此溶液3次，然后以乙酸乙酯萃取水溶液5次，合并乙酸乙酯层，以0.5％的盐酸水溶液洗涤乙酸乙酯层3次，以水洗涤乙酸乙酯层至中性，将乙酸乙酯层蒸干得到总甾部位；③纯化取上述洋金花总甾部位通过硅胶柱层析，从石油醚丙酮或乙酸乙酯100∶0到0∶100进行梯度洗脱，得到withametelin F、withametelin B和withametelin G的晶体；进一步以有机溶剂进行重结晶，有机溶剂为乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯或石油醚，或它们的2种或2种以上混合溶剂，滤去母液即得。
2.一种洋金花提取物甾内酯类成分withametelin B、withametelin G和withametelin F的制备方法其特征在于该方法包括下列步骤①提取称取洋金花生药，加入3-50倍重量溶剂，溶剂为水、低级醇、丙酮或乙酸乙酯或它们的2种或2种以上有混合溶剂，采用冷浸、超声波、渗漉或加温方法提取1-5次，合并提取液，除去溶剂，得到洋金花提取物；②分离取上述洋金花提取物，加入4倍重量水稀释，用石油醚萃取此溶液3次，然后以乙酸乙酯萃取水溶液5次，合并乙酸乙酯层，以0.5％的盐酸水溶液洗涤乙酸乙酯层3次，以水洗涤乙酸乙酯层至中性，将乙酸乙酯层蒸干得到总甾部位；③纯化取上述洋金花总甾部位通过硅胶柱层析，从石油醚丙酮或乙酸乙酯100∶0到0∶100进行梯度洗脱，得到withametelin F、withametelin B和withametelin G的晶体；进一步以有机溶剂进行重结晶，有机溶剂为乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯或石油醚，或它们的2种或2种以上混合溶剂，滤去母液即得。
3.一种洋金花提取物甾内酯类成分withametelin B、withametelin G和withametelin F在制备治疗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了洋金花中分离得到的甾内酯类成分withametelin B、withametelin G和withametelin F的新用途及其制备方法。本发明以洋金花为原料，采用含水或不含水的有机溶剂为提取溶媒，常规方法提取，通过溶剂萃取方法分离得到总甾部位，此部位再经硅胶柱层析和重结晶后得到withametelin B、withametelin G和withametelin F。上述化合物具有显著抗肿瘤作用，可用于制备治疗肿瘤的药物。
文档编号A61K36/81GK1935830SQ20061011710
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月13日 优先权日2006年10月13日
发明者王晓川, 吴威巍, 王作鹏, 潘源虎 申请人:卡南吉医药科技(上海)有限公司