专利名称：：三七花总皂苷在制备治疗高血压病药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属中药制药领域，涉及中草药三七花中提取的活性部位三七花总皂苷在制备药物组合物中的应用。筑议不高血压病是常见的心血管疾病之一，据统计，目前我国的发病率为13.58%,与冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑血管疾病等密切相关，虽然现代医学有了飞跃的进展，但迄今仍是心血管疾病的主要死因之一。近年来随着大规模抗高血压临床实验和心血管分子生物学等基础研究的进展，人们逐渐认识到高血压病不只是血流动力学异常的疾病，还是多种心血管危险因素聚集、遗传的综合征。因此，在治疗上，不仅仅要将血压降低到靶目标水平，而且要综合干预上述危险因素，预防和逆转靶器官不良重塑，降低心血管发病率和死亡率，提高患者生活质量。随着利尿剂、e受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂及血管紧张素受体拮抗剂的不断应用，其在降压同时带来的诸多副作用亦日益困扰着学术界。挖掘祖国医学宝库精髓，运用中医中药防治高血压病已成为一种强有力的手段。中草药三七花是传统名贵中药五加科植物人参三七的花蕾，在袓国西部云南、广西、西藏等地，当地民间常采用三七花用于治疗咽痛音哑、津伤口渴等症。尚未见有用于治疗高血压病的报道。
发明内容本发明的目的是提供中草药三七花中提取的活性部位三七花总皂苷在制备药物组合物中的应用。尤其涉及三七花总皂苷在制备治疗高血压病药物中的应用。本发明通过化学和药理研究测得，所述的中药三七花蕾活性部位，其主要含有20(S)—原人参二醇型皂甙，经化学和光谱方法确定为人参皂甙Rb,，Rb2，Rb3，Rc，Rd，三七皂甙D，Fa;绞股蓝皂甙IX，XVII;3-谷甾醇，胡萝卜甙及新的五种化合物三七皂甙O，P，Q，S，T。本发明通过下述方法提取所述的活性成分采用醇提法一离心一大孔树脂一浓縮、干燥、粉碎，得到稳定，且纯度较高的三七花蕾有效活性成分的提取物。本发明的三七花蕾总皂苷提取物干燥粉碎后，呈黄棕色粉末，有芳香气味，稍苦，略有刺激性。经香草醛一冰醋酸法显色后，紫外分光光度法(UV)548nm处检测，提取物中三七花蕾总皂苷的重量百份含量占提取物总重的50%—100%。所述的活性部位可作为药物制剂的原料。本发明经初步临床实验治疗高血压病，结果显示三七花能一定程度降低血压，明显改善高血压患者头晕、头痛、心烦、面红生火、颈部板滞、舌质紫黯等症状。动物实验结果显示三七花粗提物在一定剂量下对自发性高血压大鼠具有降压作用，同时一定程度地逆转其肥大的心脏。在上述临床与动物实验基础上进一步进行三七花有效部位的相关药效学实验，经体外实验和体内动物实验结果证明，三七花总皂苷能明显降低自发性高血压大鼠的血压，三七花总皂苷能改善ET-1诱导的血管平滑肌细胞增殖的细胞活力，增加血管平滑肌细胞的凋亡率，增加血管平滑肌细胞内NO含量，促进iNOS表达，降低血管平滑肌细胞内Ca2+浓度，抑制血管平滑肌细胞原癌基因c-mycmRNA的表达，证实三七花总皂苷具有治疗原发性高血压病的作用。图1三七花总皂苷各剂量组细胞培养48小时后细胞活性的比较。图2三七花总皂苷各剂量组细胞培养96小时后细胞活性的比较。具体实施例方式实施例l提取制备三七花总皂苷采用醇提取，离心，大孔树脂，浓縮、千燥、粉碎法，得到一种转移率和得率稳定，且纯度较高的三七花蕾有效活性成分的提取物。经香草酵一冰醋酸法显色后，紫外分光光度法(UV)548nm处检测，提取物中三七花蕾总皂苷的重量百份含量占提取物总重的50%—100%。实施例2:三七花总皂苷对自发性高血压大鼠的降压作用实验1.选用18周龄SHR大鼠、WKY大鼠(购自上海市高血压研究所)2.实验分组正常WKY组(0.9%NS十二指肠给药)；S服大鼠分空白组(0.9%NS十二指肠给药)；三七花总皂苷低剂量组(三七花蕾总皂苷0.8g/kg十二指肠给药)；三七花总皂苷中剂量组(三七花蕾总皂苷1.6g/kg十二指肠给药)；三七花总皂苷高剂量组(三七花蕾总皂苷3.2g/kg十二指肠给药)；心痛定组(心痛定5mg/kg十二指肠给药)。3.急性降压试验各组用2%戊巴比妥钠腹腔内麻醉，做颈总动脉插管，气管插管，接多导生理记录仪。稳定30min，十二指肠给药，连续观察给药前、给药后5，10，15，30，60min的平均压、收縮压、舒张压、和EKG。表l为试验统计结果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>其中，*P〈0.05皂苷低剂量组、皂苷中剂量组、皂苷高剂量组、心痛定组用药前后血压明显下降#P〈0.05皂苷高剂量组与心痛定组、皂苷低剂量组、皂苷中剂量组比较有显著性差异实施例3:三七花总皂苷对血管平滑肌细胞增殖的影响试验选用人原代主动脉血管平滑肌细胞株(HASMC)，ET-1浓度2*10—8mmol/L预处理HASMC，弓|起HASMC的异常增殖，观察不同浓度三七花总皂苷(50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600Pg/ml)和对照药硝苯地平(50Pg/ml)对其的影响。结果显示，三七花总皂苷能改善ET-1诱导的血管平滑肌细胞增殖的细胞活力(见图1、图2)。实施例4.三七花总皂苷对ET-1诱导的人主动脉血管平滑肌细胞凋亡和细胞周期的影响1.选用人原代主动脉血管平滑肌细胞株(HASMC)，ET-1浓度2*10-8mmol/L预处理HASMC，观察不同浓度三七花总皂苷(200、400、600ug/ml)和对照药硝苯地平(50(ig/ml)对其NO含量的影响。2.应用TUNEL染色法观察凋亡细胞形态学变化。TUNEL染色后荧光显微镜下观察，发现三七花总皂苷200、400、600Pg/ml与硝苯地平组(50Pg/ml)有较多的细胞出现凋亡现象。其中，三七花总皂苷600Pg/ni1组细胞凋亡现象最为突出。3.流式细胞仪检测凋亡细胞特征及凋亡率各组HASMC培养48小时后显微镜下见三七花总皂苷600Pg/ml组细胞绝大部分呈悬浮状，形态与正常细胞完全不同。DNA电泳结果显示具有典型的细胞凋亡特征，呈现ladder状。其余各组未见典型的ladder状。培养72小时后DNA电泳结果显示硝苯地平与三七花总皂苷20(^g/inl均呈现出ladder条带。表2是ET-1诱导HASMC增殖各组细胞凋亡率的变化(n=4)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>其中与ET-1造模组比较*p〈0.05，林p〈0.01;与硝苯地平组比较#p<0.05，tt#p〈0.01，。实施例5三七花总皂苷对ET-1诱导的人主动脉血管平滑肌细胞NO的影响选用人原代主动脉血管平滑肌细胞株(HASMC)，ET-1浓度2*10—s咖ol/L预处理HASMC,观察不同浓度三七花总皂苷(200、400、600ug/ml)和对照药硝苯地平(50Pg/ml)对其NO含量的影响。表3是三七花总皂苷对ET-1诱导HASMC细胞NO含量的影响(n=4)。表4是各组iN0S/P-actin(n=4)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>其中与￡丁-1组比较*p〈0.05，**p<0.01;与硝苯地平组比较$p〉0.05。3.三七花总皂苷对ET-1诱导各组HASMC细胞iNOSmRNA合成的影响:PCR产物2免琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶(EB)染色后，凝胶图象分析系统(FR-980)拍照、分析。以iNOS/e—ac't,in表示iNOSmRNA表达的含量。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与ET-l组比较ffp>0.05;与硝苯地平组比较$p>0.05。实施例6:三七花总皂苷对人主动脉血管平滑肌细胞内Ca"的影响选用人原代主动脉血管平滑肌细胞株(HASMC),ET-1浓度2氺l(rSmmol/L预处理HASMC，观察不同浓度三七花总皂苷(200、400、600ug/ml)和对照药硝苯地平(50Pg/ml)对其细胞内&2+含量的影响。表5三七花总皂苷对HASMC细胞内钙的影响(n=6)。表5_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其中与ET-l造模组比较*p<0.05，林p〈0.01;与硝苯地平组比较纟p〉0.05实施例7三七花总皂苷对ET-1诱导的人主动脉血管平滑肌细胞癌基因c-迈yc、c-fos表达的影响选用人原代主动脉血管平滑肌细胞株(HASMC)，ET-1浓度2*10—8mmol/L预处理HASMC，应用RT-PCR的方法，观察不同浓度三七花总皂苷(200、400、600ug/ml)和对照药硝苯地平(50^g/ml)对其癌基因c-myc、c-fos表达的影响。表6是三七花总皂苷对HASMC细胞c-myc、c-fosmRNA表达的影响。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其中与￡1-1造模组比较*P〈0.05;与硝苯地平组比较$P>0.0权利要求1、三七花总皂苷在制备治疗高血压病药物中的应用。2、三七花总皂苷在制备预防高血压病药物中的应用。3、三七花总皂苷在制备降低血压药物中的应用。4、三七花总皂苷在制备防治高血压病靶器官损伤血管重建药物中的应用。5、按权利要求4所述的应用，其特征是所述的防治高血压病靶器官损伤血管重建是通过改善ET-1诱导的血管平滑肌细胞增殖的细胞活力和/或增加血管平滑肌细胞的凋亡率和/或增加血管平滑肌细胞内N0含量，促进iN0S表达和/或降低血管平滑肌细胞内Ca2+浓度和/或抑制血管平滑肌细胞原癌基因c-mycmRNA表达。全文摘要本发明属中药制药领域，涉及中草药三七花中提取的活性部位三七花总皂苷在制备治疗高血压病药物中的应用。本发明的活性部位经体外实验和体内动物实验结果表明，能明显降低自发性高血压大鼠的血压，改善ET-1诱导的血管平滑肌细胞增殖的细胞活力，增加血管平滑肌细胞的凋亡率，增加血管平滑肌细胞内NO含量，促进iNOS表达，降低血管平滑肌细胞内Ca2+浓度，抑制血管平滑肌细胞原癌基因c-mycmRNA的表达等，证实三七花总皂苷可作为的原料，制备防治原发性高血压病的药物制剂。文档编号A61K36/185GK101199564SQ200610119529公开日2008年6月18日申请日期2006年12月12日优先权日2006年12月12日发明者岭刘,浩周,端周,奕杜,胡林森,苑素云,莉魏申请人:上海中医药大学附属龙华医院;上海信谊百路达药业有限公司