汉防己碱在制备防治肝脏损伤的药物中的用途的制作方法

专利名称：汉防己碱在制备防治肝脏损伤的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于药学领域，具体涉及汉防己碱在制备防治肝炎和肝损伤的药物 中的用途。
背景技术：
肝炎是严重危害人类健康的重大疾病，从病因看，肝炎主要分为病毒性 肝炎，酒精性肝炎，自身免疫性肝炎等。肝炎特别是病毒性肝炎在中国的发病 率持续在较高水平，就乙型肝炎来说，全世界共有20亿人感染乙肝病毒，其中 6.9亿在中国，全球有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带者3.5亿人，其中三分之 一在中国；全世界每年有75万人死于乙肝病毒感染引起的疾病，其中28万人来 自中国。
汉防己碱(Tetrandrine ，简称Tet)是从中草药汉防己的根块中提取的双苄基 异喹啉类生物碱，是汉防己的主要有效成份。以往的研究发现，汉防己碱具有 钙拮抗作用，其可阻断50%以上的跨膜钙离子内流；汉防己碱具有扩张血管的 作用，可用作降血压药；汉防己碱具有促进睡眠的功效；汉防己碱可与甘草酸 或丹参联用治疗肝纤维化；汉防己碱可能是一种有效的抗肿瘤药物，并且其对 于糖尿病也可能有一定的防治作用。
此外，也有报道指出汉防己碱具有抗炎和免疫抑制作用，对于一些炎症有 一定的抑制作用，现有已知主要将汉防己碱用于治疗类风湿性关节炎等相关炎 症性疾病。
然而，现有技术中还没有将汉防己碱用于肝炎的防治。并且，人体各个器 官或组织的炎症机制也不尽相同，针对各个器官或组织的炎症治疗药物也不尽 相同。因此有必要进一步研究汉防己碱的抗炎机制，特别是对于特定器官或组 织，从而将之真正用于疾病的治疗。

发明内容
本发明的目的在于提供一种汉防己碱在制备防治肝炎和肝损伤的药物、或 抑制趋化因子表达的药物中的用途。
在本发明的第一方面，提供一种汉防己碱的用途，用于制备抑制趋化因子 表达的组合物。
在本发明的一个优选例中，所述的趋化因子是干扰素诱导蛋白IO (IP-10) 或巨噬细胞炎性蛋白1-a (MIPl-a)。
在本发明的另一优选例中，所述的趋化因子的高表达导致肝损伤。 在本发明的另一优选例中，所述的组合物用于抑制NF-K B的活性。 在本发明的另一优选例中，所述的组合物用于降低血清中肿瘤坏死因子-a
(TNF-a) 、 y-干扰素(y-IFN)、白介素-4 (IL-4)、或白介素-12 (IL-12)
的含量。
在本发明的另一优选例中，所述的汉防己碱选自下组
(a) 汉防己碱纯净物；
(b) 含汉防己碱的提取物；或
(c) 含成分(a)和/或(b)且汉防己碱浓度大于1%的混合物。
在本发明的第二方面，提供一种汉防己碱的用途，用于制备预防或治疗肝损 伤的组合物。
在本发明的另一优选例中，所述的肝损伤为肝炎。
在本发明的另一优选例中，所述的肝损伤是由趋化因子的高表达引起的。
在本发明的第三方面，提供一种预防或治疗肝损伤、或抑制趋化因子表达 的方法，包括步骤给需要的对象施用有效量(如0.001-50wt%;更佳地 0. 01-20wt呢)的汉防己碱。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。


图1显示了对对照组和汉防己碱处理组小鼠的诱导CIH及取样流程。 图2显示了汉防己碱对于CIH小鼠谷丙转氨酶活性的影响，可见汉防己碱能
够显著降低CIH小鼠的谷丙转氨酶活性。其中，与对照组相比，** P < 0.01。 图3A为PBS处理组小鼠H&E染色结果，图3B为汉防己碱处理组小鼠服E
染色结果，图3C为PBS处理组小鼠T丽EL染色结果，图3D为汉防己碱处理组
小鼠T丽EL染色结果。其中，图3A和图3B放大100倍，图3C和图3D放大200倍。
图4A为ConA注射2小时后取小鼠血清，采用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因 子-a的浓度；图4B-D为ConA注射8小时后取小鼠血清，采用ELISA法检测血清 中肿Y-干扰素，白介素-4，白介素-12的浓度，汉防己碱处理组小鼠血清中多 种炎性细胞因子的含量显著低于对照组。其中，与对照组相比，**P 〈 0.01， 氺水承P 〈 0.001。
图5显示了汉防己碱对于肝脏中趋化因子IP-10和MIP1-ct的基因表达的影 响。图5A为实时定量PCR检测趋化因子IP-10的表达水平的结果；图5B为实时定 量PCR检测趋化因子MIPl-a的表达水平的结果。
图6显示了汉防己碱对于NF-k B活化的影响，可见汉防己碱处理组NF-k B 的活性显著低于对照组(PBS组)。
具体实施例方式
本发明人经过长期而广泛的研究，意外地发现汉防己碱对于防治肝炎或肝 脏损伤具有极其优异的效果，且没有任何副作用。并且，所述的汉防己碱可抑 制炎症中趋化因子干扰素诱导蛋白10 (IP-10)或巨噬细胞炎性蛋白l-a (MIP1-ct )的表达，从而可避免炎症中由于趋化因子的过度释放而导致的过度 免疫反应、或细胞或组织功能障碍。基于此完成了本发明。
汉防己截
汉防己碱(Tetrandrine，简称Tet)，是一种双苄基异喹啉类生物碱，是中药 汉防己的主要有效成份，其化学式为6,6' 7,12-四甲氧基-2,2' - 二甲基
<formula>formula see original document page 6</formula>
berbaman， 结构式为
<formula>formula see original document page 6</formula>(i)
在本发明中，所述的"汉防己碱"可以是纯净形式存在的式I所示的化合 物，或纯度大于85%的式1所示的化合物，也可以是含有l-90wty。，更佳地5-85机％ 的汉防己碱或其衍生物的汉防己碱的提取物(如汉防己的根块提取物)。该术语 还包括汉防己碱的浓度大于1%的混合物。
所述的汉防己碱可提取自任何含有汉防己碱或其衍生物(如盐或酯)的植物 中，所述的植物包括但不限于汉防己(St印hania tetrandra)、毛叶轮环藤(Cyclea barbata Miers)、密花轮环藤(Cyclea densiflora)、夜花藤(Hypserpa nitida Miers)、金线吊乌龟(Stepahania c印haxantha Hayata)、海南地不容(Stephaniae Hai腿ensis)、蝙蝠葛(Menispe歷m dauricum DC)等。优选的，其可从中药汉防 己中提取获得。
此外，所述的汉防己碱也可通过化学合成的方式获得。
在本发明中，还包括汉防己碱的药学上可接受的盐。所述的"药学上可接 受的盐"是指汉防己碱与无机酸或有机酸反应生成的盐。
可将汉防己碱的植物提取物直接给药；或者可将汉防己碱的植物提取物进行 提纯和加工，制成纯净形式的汉防己碱、或各种形式的汉防己碱的制剂后，用于 给药。
用途
本发明提供了汉防己碱、其药学上可接受的盐或汉防己碱的植物提取物的 用途，用于制备预防或治疗哺乳动物肝炎或肝损伤的组合物；或者，用于制备 抑制趋化因子表达的组合物。
为了论证汉防己碱的上述用途，本发明人以ConA诱导的肝炎模型(ConA(刀 豆素)induced h印atitis， CIH)作为研究模型，该肝炎模型是一种T细胞介
导的肝炎模型，主要用作免疫介导的肝脏损伤的机理研究和保肝药物作用机理
的研究。在模型被诱导后8到24小时，血清谷丙转氨酶活性急剧增加，HE染色 可见肝脏正常结构被破坏，大量的肝实质细胞凋亡死亡，呈TUNEL阳性。
本发明利用汉防己碱，在CIH模型上证实了其对免疫介导的肝损伤有显著 的保护作用，汉防己碱可以使CIH小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的活性降低到 100U/L以下(正常小鼠ALT值约为50U/L， CIH小鼠ALT平均值在5000U/L以上)， 而其他已有报道的有类似作用的化合物可以将CIH的ALT值降低到1000U/L左 右。
肝脏的病理分析也显示，在汉防己碱处理组小鼠几乎看不到明显的肝脏正 常结构的破坏和TUNEL阳性的凋亡细胞。
本发明人的深入研究表明，汉防己碱对免疫介导的肝损伤的保护作用的机 理是其对NF-kB信号通路激活的抑制，导致介导肝损伤的多种炎性细胞因子， 包括Y干扰素和肿瘤坏死因子a表达的显著下降，从而保护肝脏免受损伤。
本发明人的深入研究还表明，汉防己碱可显著抑制炎症机制中趋化因子 (包括干扰素诱导蛋白IO (IP-10)或巨噬细胞炎性蛋白1-a (MIPl-a))的表 达。趋化因子在炎症中起着将其它免疫细胞向炎症中心趋化的作用，然而其过 度表达，会导致过激的免疫反应及趋化过多的免疫细胞，从而使得体内器官组 织受到损伤，造成高致病性及增加死亡率。因此，抑制趋化因子的表达可抑制 过激的免疫反应发生。
组合物
如本文所用，术语"本发明的组合物"包括药物组合物和饮食补充剂(如 保健品组合物)，只要它们含有汉防己碱作为预防或治疗哺乳动物代谢综合症 的活性成分。
通常，所述的饮食补充剂含有0.001-50wty。的汉防己碱或其药学上可接受 的盐；(b)食品上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供了一种药物组合物，含有(a)有效量的汉防己碱或其药学上 可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明中，术语"含有"表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组 合物中。因此，术语"主要由...组成"和"由...组成"包含在术语"含有"
中。
本发明中，"药学上可接受的"成分是适用于人和/或动物而无过度不良 副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，"药学上可接受的载体"是用于将本发明的汉防己碱或其生理 上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形 剂。载体可以是液体或固体。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂 和固体填充或液体填充的胶囊。药物组合物的口服给药是优选的。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成 分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自片剂、胶囊、粉 末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、或气雾剂。其中汉防己碱可以存在于适宜的 固体或液体的载体或稀释液中。
本发明的汉防己碱及其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具 中。通常，在本发明的药物组合物中，汉防己碱作为活性成分占总重量的 1-50%(较佳地2-40%，更佳地3-30%)，其余为药学上可接受的载体以及其他添 加剂等物质。
给药方式和剂型
本发明的药物组合物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。 通常，当所述化合物或其药学上可接受的盐及其组合物用于上述用途时， 它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等， 而且可以用如下形式口服给药片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含
有如约0.05-5%悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50%糖)、和酏剂(含有约20-50°/。乙 醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约O. 05-5%悬浮 剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约25-90%，通 常约为5-60%(重量)的活性成分。
所用的活性成分的有效剂量可随所用的化合物、给药的模式和待治疗的疾病 的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约l-300mg/kg动物体重 的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予， 或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为5-1000mg，
较佳地约为10-500mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受 的载体密切混合的约l-200mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗 应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量 按比例地减少。
所述化合物或其药学上可接受的盐及其组合物可通过口服以及静脉内、肌 内或皮下等途径给药；优选的是口服给药。固态载体包括淀粉、乳糖、磷酸二 钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括无菌水、聚乙二醇、非离子 型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性 和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包 括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、 BHT和BHA。
所述活性化合物或其药学上可接受的盐及其组合物也可肠胃外或腹腔内给 药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物 (作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二 醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含 有防腐剂以防止微生物的生长。
适应于注射的药物形式包括无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备
无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体 以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生 物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇 (如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。
汉防己碱或其药学上可接受的盐及其组合物还可与其它活性成分或药物 联合给药。
当两种或两种以上的药物联合给药时， 一般具有优于两种药物分别单独给 药的效果。
汉防己械及其药学上可接受的盐的制备方法
汉防己碱的制备方法可采用本领域现有技术人员所了解的方法，比如化学 合成的方法，或从植物中提取的方法。优选的，可采用从植物中提取汉防己碱 的方法。
本发明的主要优点在于
(1) 首次发现了汉防己碱在防治肝炎或肝损伤方面的新用途，其药理作用 强，且没有毒副作用，具有极好的药用前景。
(2) 所述的汉防己碱可以直接提取自植物中，在毒性低，服用方便的同时， 还具有来源丰富，价格低廉，制备工艺简单的优点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例l汉防己碱的配制及注射
1. 汉防己碱注射剂的配制
配制汉防己碱注射液，方法如下取100mg购自陕西慧科植物开发有限公 司公司的汉防己碱(纯度98%以上)固体粉末，加入O. 1M盐酸至溶解，然后将溶 解后形成的溶液加入到PBS中至终浓度为20mg/ml，制成汉防己碱的注射剂。
2. 实验分组和注射
选用C57bl/6小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)作为试验对 象，将小鼠进行随机分组，每组3-5只小鼠，建立对照组和汉防己碱处理组l和 汉防己碱处理组2。
其中，对照组用PBS腹腔注射小鼠，汉防己碱处理组l用25mg/kg体重的汉 防己碱腹腔注射小鼠，汉防己碱处理组2用50mg/kg体重的汉防己碱腹腔注射小鼠。
在距离第一次注射4小时后，进行第二次注射，即对照组用PBS腹腔注射小鼠，汉防己碱处理组l用25mg/kg体重的汉防己碱腹腔注射小鼠，汉防己碱处理 组2用50mg/kg体重的汉防己碱腹腔注射小鼠。
随后，所有的小鼠由尾静脉注射15mg/kg体重的ConA (购自Vector公司)， 诱导CIH，最后，在不同的时间点处死小鼠，获取样品。用于评价汉防己碱的 治疗效果的标本包括血清，肝脏组织切片，以及肝脏组织RNA等，上述流程也 可参见图l。
实施例2汉防己碱对于CIH小鼠谷丙转氨酶(ALT)活性的影响
本实施例中，对小鼠的处理如实施例l所述，在所有的小鼠由尾静脉注射 剂量为15mg/kg的ConA 17小时后，取小鼠血清测定谷丙转氨酶活性，采用上 海伊华医学科技有限公司生产的血清谷丙转氨酶活性测定试剂盒，按照说明书 操作。简要步骤如下血清适当稀释后，取25微升加至96孔板，加入100微升 酶工作液，37摄氏度孵育15分钟，加入150微升终止液，酶标仪492nm读数，根 据试剂盒提供的标准血清和稀释倍数计算谷丙转氨酶活性数值。
数据以平均数士标准差的形式表示，测得的数据为PBS组5783士368， 25mg/kg组671士27， 50mg/kg组75±18，见图2，图2代表了3次试验的结果的 平均值(林P < 0.01)。
由结果可知，小鼠在给予25mg/kg汉防己碱时，血清谷丙转氨酶活性比对 照组降低了约90%，在给予50 mg/kg汉防己碱剂量时，血清谷丙转氨酶活性由 接近6000 U/L骤降至约100U/L(正常小鼠的血清谷丙转氨酶活性约为50U/L)，
也即接近于正常值。
因此，汉防己碱能够显著降低CIH小鼠的谷丙转氨酶活性。
实施例3肝脏组织切片染色
本实施例中，对小鼠的处理如实施例l所述，在所有的小鼠由尾静脉注射 剂量为15mg/kg的ConA17小时后，取小鼠的肝脏组织，制备切片，进行常规 的服E染色或者TUNEL染色。结果见图3A-图3D。
图3A为PBS处理组小鼠H&E染色结果，其中可观察到肝脏组织的出现大 面积坏死现象，正常结构被严重破坏。
图3B为汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠服E染色结果，未见肝脏组织出现大面积坏死现象，肝脏组织结构基本正常。
图3C为PBS处理组小鼠TUNEL染色结果，可观察到出现大量的TUNEL阳 性的凋亡细胞。
图3D为汉防己碱处理组(50mg/kg)小鼠T丽EL染色结果，可见小鼠的肝脏 组织中未见炎性病灶和坏死区域。
实施例4汉防己碱对CIH小鼠血清细胞因子的影响
本实施例中，对小鼠的处理如实施例l所述，在小鼠由尾静脉注射剂量为 15mg/kg的ConA 2小时或8小时后，取小鼠血清，分别用ELISA方法检测血清中 肿瘤坏死因子-a (TNF-a) 、 y -干扰素(IFN-y )、白介素-4 (IL-4)、白 介素-12 (IL-12)的浓度。
使用Duoset ELISA kit (R&D， MN， USA),按照生产商提供的说明书操作。 简要步骤为
100微升一抗(R&D， MN， USA)包板过夜，洗板后300微升封闭缓冲液封闭2 小时，洗板后加入100微升样品和标准品，孵育2小时，洗板后加入二抗(R&D， 丽，USA)孵育2小时，洗板后加入酶标链亲和素，加入底物显色，硫酸中止， 酶标仪450nm读数(参考波长540nm)。根据标准曲线计算样品中各细胞因子的浓度。
结果见图4A-图4D。
图4A为ConA注射2小时后，取小鼠血清，ELISA检测血清中肿瘤坏死因子-a 的浓度。可见汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠血清中肿瘤坏死因子-a的含量
显著低于对照组。
图4B为ConA注射8小时后，取小鼠血清，ELISA检测血清中y -干扰素的浓 度。可见汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠血清中y-干扰素的含量显著低于对 照组。
图4C为ConA注射8小时后，取小鼠血清，ELISA检测血清中白介素-4的浓度。 可见汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠血清中白介素-4的含量显著低于对照 组。
图4D为ConA注射8小时后，取小鼠血清，ELISA检测血清中白介素-12的浓
度。可见汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠血清中白介素-12的含量显著低于对
昭相o
因此，汉防己碱可降低CIH小鼠血清中多种炎性细胞因子的含量。
实施例5汉防己缄对肝脏中趋化因子基因表达的影响
本实施例中，对小鼠的处理如实施例l所述，在小鼠由尾静脉注射剂量为 15mg/kg的ConA8小时后,取小鼠肝脏组织，提取RNA，实时定量PCR检测趋化 因子IP-10和MIP1-a的表达水平。
检测过程如下
使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)从小鼠肝脏组织抽提总 RNA，在cDNA合成前进行RNA纯化，使用去RNase的DNase (Qiagen, Hilden， Germany)将基因组DNA从总RNA中移走，将RNA储存在-8(TC 。
每一RNA样品使用Sensiscript RT Kit (Qiagen, Hilden， Germany)以6核苷酸 随机引物来合成cDNA。
通过实时PCR来检测趋化因子(MIP-la， IP-10)的mRNA的表达，采用SYBR Green master mix (Applied Biosystems， Foster City, USA)。 PCR循环的条件包括 50°C 2分钟，95°C IO分钟；接着进行2步PCR程序，包括95'C 15秒、60°C 60 秒，进行40个循环。在ABI Prism 7900序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City,USA)上采集和分析数据。使用0-actin基因作为内参，以标准化每一样品中 的总RNA量。所有的量均用相对于/3-actin的表达量的倍数表示。
实时PCR中，采用的引物如下 i3國actin正向引物(SEQ ID NO: 1): 5'TGTCCACCTTCCAGCAGATGT 3，； /3-actin反向引物(SEQIDNO: 2): 5 ，AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA 3'。 MIP-la正向引物(SEQ ID NO: 3): 5'CACCCTCTGTCACCTGCTCAA 3，；
MIP-la正向引物(SEQ ID NO: 4):
5 ，ATGGCGCTGAGAAGACTTGGT 3 ，。
IP-10正向引物(SEQ ID NO: 5):
5，GCCGTCATTTTCTGCCTC 3，；
IP-IO正向引物(SEQ ID NO: 6):
5，ATGGCGCTGAGAAGACTTGGT 3，。
结果见图5A和图5B。
图5A为实时定量PCR检测趋化因子IP-IO的表达水平，可见汉防己碱处理组 (50mg/kg组)小鼠肝脏的相对IP-10表达水平显著低于对照组。
图5B为实时定量PCR检测趋化因子MIP1-a的表达水平，可见汉防己碱处理 组(50mg/kg组)小鼠肝脏的相对MIP1- a表达水平显著低于对照组。
综上可知，汉防己碱可显著降低CIH小鼠肝脏中IP-10和MIP1-a两种趋化 因子的表达水平。
实施例6汉防己碱对NF-KB活化的影响
本实施例中，对小鼠的处理如实施例l所述，在小鼠由尾静脉注射剂量为 15mg/kg的ConA 3小时后，取小鼠肝脏组织，获得细胞核提取物，EMSA(电泳 迁移率试验，Electrophoretic Mobility Shift Assay)检测NF- k B的活性。
电泳迁移率试验过程如下
米用文献M. Nagaki等，Tumor necrosis factor alpha prevents tumor necrosis factor receptor-mediated mouse hepatocyte apoptosis， but not fas-mediated apoptosis: role of nuclear factor曙kappaB. Hepatology 32 (2000) 1272-9中所述的方 法制备肝组织的核抽提物。NF- k B结合保守单链寡核苷酸(5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'(SEQ ID NO: 7))被先与与其互补的寡核苷酸(5，-GCCTGGGAAAGTCCCTCAACT-3， (SEQ ID NO: 8))退火。退火的DNA片段用[Y—32P] dATP (Amersham， Piscataway, USA)标记(T4聚核苷酸激酶(Promega, Madison, USA) 催化)。核蛋白(15118)与2微升的，标记的双链寡核苷酸探针在4°(:孵育30分钟。 混合物加入到O. 5XTris-硼酸-EDTA中，在4。C ，在4%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。 以冷探针(cold probe)为阴性对照。
电泳结果见图6，可见汉防己碱处理组NF-k B的活性显著低于对照组(PBS组)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。 序列表
<110〉中国科学院上海生命科学研究院
<120>汉防己碱在制备防治肝脏损伤的药物中的用途
<130〉 066571
<歸8
<170> Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211〉 21
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223〉 引物
<400> 1
tgtccacctt ccagcagatg t 21
<210〉 2
<211> 23
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<221〉 misc—feature
<223> 引物
<400> 2
agctcagtaa cagtccgcct aga 23
<210> 3
<211〉 21
<212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400> 3
caccctctgt cacctgctca a
<210> 4
〈211〉 21
<212〉 腿 <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223> 引物
<400> 4
atggcgctga gaagacttgg t
<210> 5
<211〉 18
<212〉 腿 <213〉人工序列
<220>
<221〉 misc_feature <223〉引物
<■〉 5
gccgtcattt tctgcctc
<210> 6
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
〈220〉
<221> misc_feature
<223〉 引物
<400〉 6
atggcgctga gaagacttgg
<210〉 7
<211〉 22
<212> DNA <213>人工序列
说明书第15/16页
21
21
18 <220>
<221> misc—feature <223>单链i核苷酸
<400> 7
agttgagggg actttcccag gc 22
<210〉 8
<211〉 22
<212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<221> misc_feature <223>单链;核苷酸
<400〉 8
gcctgggaaagtccctcaact 2权利要求
1.一种汉防己碱的用途，其特征在于，用于制备抑制趋化因子表达的组合物。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的趋化因子是干扰素诱导 蛋白10或巨噬细胞炎性蛋白l-a 。
3. 如权利要求1或3所述的用途，其特征在于，所述的趋化因子的高表达导致 肝损伤。
4. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于抑制NF-tc B 的活性。
5. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于降低血清中 肿瘤坏死因子-a、 Y-干扰素、白介素-4、或白介素-12的含量。
6. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的汉防己碱选自下组(a) 汉防己碱纯净物；(b) 含汉防己碱的提取物；或(c) 含成分(a)和/或(b)且汉防己碱浓度大于1%的混合物。
7. —种汉防己碱的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗肝损伤的组合物。
8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肝损伤为肝炎。
9. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肝损伤是由趋化因子的 高表达引起的。
10. —种预防或治疗肝损伤、或抑制趋化因子表达的方法，其特征在于， 包括步骤给需要的对象施用有效量的汉防己碱。
全文摘要
本发明公开了一种汉防己碱的用途，用于制备抑制趋化因子表达的组合物以及防治肝损伤。本发明首次发现了汉防己碱在防治肝炎或肝损伤方面的新用途，其药理作用强，且没有毒副作用，具有极好的药用前景。并且，所述的汉防己碱可以直接提取自植物中，在毒性低，服用方便的同时，还具有来源丰富，价格低廉，制备工艺简单的优点。
文档编号A61K31/4748GK101199529SQ20061011953
公开日2008年6月18日 申请日期2006年12月13日 优先权日2006年12月13日
发明者冯德春, 徐凌云 申请人:中国科学院上海生命科学研究院;上海交通大学医学院