一种对神经损伤具有保护及治疗作用的药物组合物的制作方法

专利名称：：一种对神经损伤具有保护及治疗作用的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一组具有保护神经细胞及治疗神经组织损伤作用的活性小分子多肽胸腺素日i6，以及胸腺素ei6与其他不同e胸腺素及异型组成的组合制剂，其药物组合物可用于治疗各种原因引起的脑损伤，脊髓损伤及外周神经损伤。背景神经系统包括中枢神经系统(大脑、脊髓)及外周神经系统(周围神经组织)。神经系统损伤可由多种因素引起(l)物理损伤，直接造成损伤部位的神经组织损害，如外伤造成的脑神经组织损伤或脊髓损伤；(2)部分神经系统的临时或永久性缺血或缺氧，如中风或脑拴塞造成的脑神经组织损伤；(3)接触神经毒素，如用于治疗癌症的化学制剂或用于治疗AIDS的双脱氧胞甘；(4)慢性代谢疾病，如糖尿病或肾功能障碍引起的外周神经损伤；(5)神经退行性疾病，包括帕金森病、Alzheimer疾病等。受损的神经组织可累及一种或多种类型的神经细胞。神经损伤后的保护与修复一直是神经科学家们面临的严峻挑战之一。经过多年的努力，许多研究已经证实，神经系统具有可塑性，不仅表现为对外界各种刺激具有强烈的代偿与适应能力，更重要的是在结构与功能上具有损伤后自身修复或重建的能力。这个过程的实现既需要启动神经细胞自身某些基因调控程序，又需要相当复杂的局部环境与条件。近年来，随着神经生长因子的发现及神经组织干细胞移植的应用，在一定程度上给治疗神经损伤带来了希望。神经生长因子(NGF)及神经营养蛋白(NT)在神经细胞和胶质细胞发育成熟中起重要作用，并对神经细胞和胶质细胞的损伤有一定的保护作用。利用基因转染技术把神经营养因子相关基因导入哺乳动物细胞株，然后移植到脑内，或利用逆转录病毒基因载体直接感染脑内神经细胞和胶质细胞，使这些经过基因修饰的细胞在局部表达相关蛋白，从而达到治疗中枢神经系统损伤的目的。神经多潜能干细胞体外分离培养的成功为神经系统损伤后的结构重建提供了可能性。移植的干细胞可在宿主体内分化成为相应的神经细胞和胶质细胞以实现损伤修复。尽管从理论上讲这些方法有助于帮助损伤的神经细胞再生和修复，但距实际应用还有很大差距。由于受损神经细胞的再生修复是一个非常复杂的过程，单独使用这些方法很难使受损神经组织得以修复。目前转基因技术仍存在安全问题，并且受损神经细胞局部组织常伴有缺氧缺血，使移植后的祌经细胞很难存活。我们经过系列研究发现胸腺素P16能够调节肌动蛋白聚合，能够促进新血管形成及组织再生。胸腺素是存在于人体及动物体内的一组小分子多肽，可分成a及P型。a型家族的主要代表是胸腺素ai，具有增强免疫功能的作用，己广泛应用于临床治疗病毒性肝炎等。e型家族现已有16个成员，氨基酸序列具有高度同源性，其中含量最多、组织分布最广的是胸腺素e4，其次是胸腺素eio。胸腺素e4最早由胸腺中分离，具有43个氨基酸，分子量为4.9KDa，现已发现该蛋白具有多种功能，包括调节肌动蛋白聚合、促进细胞分化和迁移、促进血管形成、促进组织再生及伤口愈合等作用。胸腺素fH5最初发现于前列腺癌细胞，而胸腺素616发现于人神经母细胞瘤，各由45个氨基酸组成，分子量为5KDa。胸腺素P15和胸腺素ei6的分布及功能研究甚少。我们通过对人正常脑组织进行免疫组化染色研究，观察到脑神经细胞内同时具有胸腺素e4、胸腺素ei5、及胸腺素ei6的表达。体外实验显示胸腺素eie能增强视网膜神经细胞的抗损伤能力，对双氧水造成的神经细胞损伤具有保护作用。进一步以离体细胞迁移实验证明，将胸腺素ei6与胸腺素e4组合使用具有协同作用，可增强其促进细胞运动的功能。因此，将几种e胸腺素按各种比例组成组合制剂，可加强其促进血管形成、促进组织再生及保护神经细胞等作用，具有重要的临床应用价值。本发明的描述本发明起始于通过对人正常脑组织进行免疫组化染色研究，观察到脑神经细胞内同时具有胸腺素34、胸腺素015、及胸腺素fU6的表达。提示这些多肽很可能对神经细胞分化和功能具有重要作用。本发明进一歩以离体培养的视网膜神经细胞作为神经细胞模型，用双氧水造成神经细胞损伤，观察胸腺素eie对神经细胞的保护作用。实验结果显示，与对照组比较，胸腺素ei6能有效地防止由双氧水引起的神经细胞死亡。胸腺素e16增强细胞的自我保护、抗损伤能力，对神经细胞具有明显的保护作用。同时，本发明确定了胸腺素fM6能够在体内有效地促进血管形成。鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管形成试验结果显示，胸腺素e16促进血管形成的效果与作为阳性对照的表皮细胞生长因子的效果相当或更好。动物伤口试验显示胸腺素ei6具有加速伤口愈合的效应。伤口局部用胸腺素eie处理后，伤口面积比对照组縮小一倍，伤口局部有完整的表皮再生，广泛的新血管形成，胶原合成也明显增加，伤口愈合时间比对照组明显縮短。在神经组织损伤修复过程中，胸腺素eie可促进新生血管生长，改善缺血缺氧环境，进而可促进神经组织再生及创伤修复。本发明还研究证明胸腺素eie具有促进细胞迁移的作用。离体试验证明胸腺素日i6作为细胞迁移促进因子可刺激人脐静脉内皮细胞的定向移动。用BoydenChomber方法测试证明胸腺素ei6能够特异性地刺激人脐静脉内皮细胞运动。细胞运动在血管形成中起重要作用。新生的毛细血管即开始从业巳存在的小静脉抽芽并向伤口处生长，内皮细胞需要运动。胸腺素P16能促进细胞迁移，因此具有促进血管形成作用。使用同一方法，进一步研究证发现，将胸腺素ei6与胸腺素p4按各50%的比例组合使用，其促进细胞运动的能力明显强于单独使用胸腺素ei6或胸腺素P4，说明e胸腺素具有协同作用。已知胸腺素e4和胸腺素ei5均能调节肌动蛋白的聚合及促进血管生成。因此，将几种e胸腺素按各种比例组成组合制剂，可加强其促进血管形成、促进组织再生及保护神经细胞等作用，具有重要的临床应用价值。因此，本发明提供一种含有效量的胸腺素ei6或胸腺素ei6与其它e胸腺素组成的组合制剂，或其可用盐或其生理功能衍生物，及可应用的载体配制而成的具有保护及治疗神经组织损伤作用的药物组合物。本发明可用于预防和治疗各种原因造成的神经系统损伤包括中枢神经系统(大脑、脊髓)及外周神经系统(周围神经组织包括)的损伤(l)物理损伤，直接造成损伤部位的神经组织损伤，如外伤造成的脑神经组织损伤或脊髓损伤；(2)部分神经系统的临时或永久性缺血或缺氧，如中风或脑拴塞造成的脑神经组织损伤；(3)接触神经毒素，如用于治疗癌症的化学制剂或用于治疗AIDS的双脱氧胞甘；(4)慢性代谢疾病，如糖尿病或肾功能障碍引起的外周神经损伤；(5)神经退行性疾病及衰老引起的脑组织及神经组织损伤，包括帕金森病、Alzheimer疾病等。(6)脑神经细胞功能障碍而引起的的神经精神紊乱症状等。本发明描述的胸腺素ei6及其它e胸腺素，是正常机体内固有的多肽成分。因此，使用高度纯化的e胸腺素制剂安全、可靠。本发明的实施方案中，e胸腺素可以是从组织细胞中分离提取，可以是直接化学合成，也可以是人工表达。另外，各种能够调节e胸腺素基因表达，诱发或刺激机体组织细胞产生e胸腺素的生物活性物质及化合物也可以加进本发明的药物组合物中。这类试剂包括但不限于各类生长因子，如胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板来源的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-3)、基本成纤维细胞生长因子(BFGF)、胸腺素al和血管内皮生长因子(VEGF)等。尤其优选的试剂为转化生长因子{3(TGF-e)或TGF-e家族的其它成员。胸腺素eie有多个同种异型体，其氨基酸序列同源性很高。胸腺素P16具有氨基酸序列LKKTNT，该序列与介导肌动蛋白的鳌合或结合相关。尽管不受任何特定理论的约束，胸腺素fU6及其同种异型体的活性可能部分是由于具有调节肌动蛋白聚合的能力。例如，胸腺素ei6能调节肌动蛋白的聚合。胸腺素ei6调节肌动蛋白聚合的能力全部或部分地由于它能通过LKKTNT序列与肌动蛋白单体结合。因此，其它具有结合肌动蛋白或调节肌动蛋白聚合功能的蛋白质，包括含有氨基酸序列LKKTNT的胸腺素fU6的同种异型体，也能够促进血管形成、改善组织代谢、增强细胞的正常生理功能，增强神经细胞的自我保护、抗损伤能力。因此含LKKTNT氨基酸序列的完整胸腺素ei6、其变异体及氧化型，以及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型也包括在本发明中。本发明药物组合物中的e胸腺素组合制剂，可由胸腺素e16与胸腺素e4按各种比例组成，也可以由胸腺素ei6与胸腺素IU5按各种比例组成，还可以由胸腺素f316与胸腺素e4及胸腺素ei5按各种比例组成。另外，该组合制剂还可由胸腺素Pi6与胸腺素ei6的多个同种异型体，如胸腺素P4、胸腺素P9、胸腺素eio、胸腺素eii、胸腺素fH2、胸腺素ei3、胸腺素ei4、胸腺素fU5以及上述同种异型体的氧化型按各种比例组成，也可以由胸腺素ei6与含LKKTET及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型按各种比例组成，还可以由含LKKTET及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型按各种比例组成。总之，e胸腺素组合制剂可由e胸腺素及其氧化型、含LKKTET序列的氨基酸片段及其氧化型、以及含LKKTNT序列的氨基酸片段及其氧化型按各种方式、各种比例组合。以上均属于本发明范畴。另外，本发明药物组合物中还可添加其他神经保护药物，如加入神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白(NT)、表皮生长因子(EGF〉、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、运动神经生长因子(MNGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板来源的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-P)、血管内皮生长因子(VEGF)等，都包括在本发明内。本发明的药物组合物中还可以加入其他对神经组织和神经损伤具有保护和治疗作用的各种药物。本发明的药物组合物可以是注射液组合物，用于静脉内、腹腔内、脊髓腔内、肌肉内或皮下注射。制备注射液组合物的例子包括将有效剂量的氧化型胸腺素016或其衍生物或f)胸腺素组合制剂和所需量的液体基质混合制作而成，该基质的例子包括水或生理盐水，其中还可添加其它有益成分或辅料。本发明的药物组合物可以是口服胶囊、片剂、粉剂等固体剂型组合物，包括将有效剂量的氧化型胸腺素P]6或其衍生物或e胸腺素组合制剂干粉和所需量的药用辅料混合制作而成。本发明的药物组合物还可以是口服液组合物。制备口服液组合物的例子包括将有效剂量的氧化型胸腺素fH6或其衍生物或e胸腺素组合制剂和所需量的液体基质混合制作而成，该基质的例子包括水或生理盐水，其中还可添加其它有益成分或辅料。在本文中，"有效量"是指e胸腺素组合制剂的需要量。在组织修复过程中这种组合制剂使用到治疗剂量时就会促进组织再生效应。e胸腺素能够促进及调理组织修复过程。组织修复过程常常发生在损伤性疾病之后。组织修复过程出现障碍往往是由于在伤口处的各种细胞如成纤维细胞、干细胞、血管内皮细胞、组织细胞对生长的反映不足而造成的。因此，加入能诱导或刺激细胞生长的活性剂会有利于组织的修复。本文使用的"促进"一词是指对细胞生长机制或过程具有激活作用，刺激作用，增强作用，起始作用及维持作用。这些细胞生长机制或发生过程是组织形成，修复或发育所必须的。在本文中，"载体"是指含有活性氧化型胸腺素e16或e胸腺素组合制剂的基质或辅料，用来充当药物输送系统。在本发明中，"药物输送系统"指当药物组合物(药物配制品或剂型)被使用时，可以将活性氧化型胸腺素f316或P胸腺素组合制剂呈递给人或动物的机体。因此术语"药物输送系统"包括普通的药物组合物所能使用的所有形式的基质或辅料，如固体、半固体、和流体组合物。特殊相关的组合物是，例如，软膏、亲水软膏、乳膏、糊剂、霜、凝胶、水凝胶、溶液、乳液、悬浮液、洗液、擦剂、洗发剂、皂剂、粘贴物、喷雾剂、粉末、薄膜、垫料、敷剂、绷带、膏药等。局部应用本发明药物组合物优选是含有活性成分的软膏或霜。当制成软膏时，活性成分可以使用石蜡基或水混溶性软膏基，或者，制成活性成分含水相油霜基的霜剂。制备涂液、软膏等外用型组合物的例子，包括将有效剂量的和所需量的添加剂混合而成。这些添加剂通常选自外用药物或化妆品的常用基质或辅料，例如凡士林、液体石蜡、羊毛脂、硬脂酸单甘油脂、聚乙二醇、十六醇、甘油、乙醇和水等如果需要，霜的水相可以包括，例如，至少30%W/W的多元醇，即含有两个或多个基的醇，如丙二醇、丁-1，3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇以及它们的混合物。局部用制剂可以根据需要而增加或减少所含活性成分。本发明还可以用可控制释放混合剂的方式使用。本文中的"可控制释放混合剂"是指任何一种复合物。这种复合物可以用来缓慢释放包含其中的有效氧化型胸腺素e16或e胸腺素组合制剂成分。这种复合物含有生物有效成分可以是固状的，渗透性的，半固状的，胶性的或液状的。图i.胸腺素e16在神经组织中的表达A大脑神经细胞B胃脏肌间神经束实施例实施例1促进血管增生实验胸腺素ei6对血管生成的促进作用采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测，在孵育7天的受精鸡胚蛋壳上开一1cm2左右窗口，将不同浓度的化学合成胸腺素fU6蛋白加样于灭菌滤纸片上，并放置于CAM，然后在恒温恒湿培养箱370C下继续培养48小时，观察血管生长情况。本实验以生理盐水为测试对照，phorbolmyristateacetate(PMA)0.5微克/10微升为阳性对照。实验测定结果表明胸腺素ei6蛋白加样组鸡胚绒毛尿囊膜血管生长明显旺盛，管径粗且分支多，呈叶状分布。以生理盐水组血管生长程度作为对照，胸腺素ei65微克/10微升的血管增生程度比生理盐水组显著增多，10微克/10微升的血管增生程度与PMA阳性对照组血管增生程度相当或略多。这一实验结果表明胸腺素e16具有明显促进血管增生作用。实施例2视网膜神经细胞保护实验大鼠视网膜神经细胞被分离出鼠体后，可在培养液中存活一定时间，进行正常的新陈代谢活动。首先，用不同浓度的胸腺素eie对实验组神经细胞进行保护性预处理一个小时，以未经处理的神经细胞为对照组。然后在实验组及对照组神经细胞培养液中加入双氧水，使双氧水在培养液中的终浓度为100yM，将实验组与对照组神经细胞在37。C培养24小时。采用MTT和TUNEL分析法，以神经细胞的抗氧化能力及存活时间作为指标，观察胸腺素ei6对大鼠视网膜神经细胞的保护作用。结果显示经胸腺素ei6保护性预处理后的视网膜神经细胞死亡数量与对照组相比明显减少，胸腺素e16具有明显的保护由过氧化引起的神经细胞死亡的作用，并且这种保护作用随着浓度的增加而加强(表l)。表1胸腺素e16对大鼠视网膜神经细胞的保护<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例3胸腺素P16在神经组织中的表达人体组织及脏器组织标本均经10%中性福尔马林固定，脱水，常规石蜡包埋，4um厚连续切片。作特异性胸腺素ei6抗体免疫组化标记。在脑组织中，与其它细胞比较，脑神经细胞内可见大量胸腺素fH6表达，胞浆呈深棕黄着色，部分细胞的胞核中亦可见到少量颗粒状的棕黄色阳性信号。另外，外周神经组织如胃壁肌层神经束内即可见到大量的胸腺素e16表达，而胃壁肌层及神经组织周围结缔组织则未见胸腺素016(图1)。实施例4细胞迁移实验为了测试胸腺素ei6与胸腺素e4的组合制剂对刺激细胞游走是否有协同作用，我们使用BoydenChomber方法对人脐带静脉内皮细胞进行了测试。先将BoydenChamber两室间隔的硝膜(孔径0.8誦)两侧均覆盖Fibronection，浓度为15微克/毫升，37'C下放置60分钟。上室加入细胞悬液，下室为完全培养液，5%C02孵箱内静置4小时，取出滤膜，将上室面细胞刮除，经固定染色后，在显微镜下细胞计数。每组3张膜。统计变量以均数标准差表示。结果表明将胸腺素fU6与胸腺素e4按各50%的比例组合使用，游走细胞的数量与单独使用胸腺素fH6或胸腺素e4相比明显增多。其促进细胞运动的能力明显加强，说明两种e胸腺素具有协同作用。权利要求1.一种用于治疗神经损伤(包括脑损伤，脊髓损伤及外周神经损伤)的药物组合物，含有效量的胸腺素β16，其生物活性变体或盐、和其可接受的药用载体。2.按照权利要求1所述，胸腺素ei6是指具有LKKTNT氨基酸序列的完整胸腺素e16、其变异体及氧化型，以及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型。3.按照权利要求i所述，其药物组合物中的有效成分还可以是e胸腺素组合制剂，可由胸腺素ei6与胸腺素e4按各种比例组成，也可以由胸腺素ei6与胸腺素ei5按各种比例组成，还可以由胸腺素ei6与胸腺素P4及胸腺素ei5按不同比例组成。此外，该组合制剂还可由胸腺素e16与胸腺素P16的多个同种异型体，如胸腺素e4、胸腺素P9、胸腺素eio、胸腺素eii、胸腺素ei2、胸腺素ei3、胸腺素M4、胸腺素P15以及上述同种异型体的氧化型按各种比例组成，也可以由胸腺素ei6与含LKKTET和/或含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型按各种比例组成，还可以由含LKKTET序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型按各种比例组成。总之，e胸腺素组合制剂可由e胸腺素及其氧化型、含LKKTET序列的氨基酸片段及其氧化刑、以及含LKKTNT序列的氨基酸片段及其氧化型按各种方式、各种比例组合。以上均属于本发明范畴。4.按照权利要求3所述，胸腺素P16及组合制剂中的其它P胸腺素、含LKKTET序列的氨基酸片段、以及含LKKTNT序列的氨基酸片段及其氧化型可以是自然提取、化学合成或人工表达。5.按照权利要求1所述，本发明可用于治疗各种神经损伤，包括中枢神经系统及外周神经系统疾病。如由于各种疾病造成的缺血、缺氧引起的各种脑损伤、脊髓损伤及外周神经损伤，还可用于治疗各种物理性神经损伤。如机械损伤、外伤、交通肇事等造成的脑损伤、脊髓损伤及周围神经损伤。6.按照权利要求1所述，本发明还可用于预防及治疗各种原因引起的神经退行性疾病及衰老引起的脑组织及周围神经组织损伤，包括帕金森病、Alzheimer疾病等以及脑神经细胞功能障碍而引起的神经精神紊乱症状等。7.按照权利要求1所述，其药物组合物中还可添加其他神经保护性药物，如神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白(NT)、血管内皮生长因子(VEGF)及成纤维细胞生长因子(FGF)，以及其它具有调节胸腺素P16及其它0胸腺素生成的各种生长因子、细胞因子及各种化合物。8.按照权利要求1所述，其药物组合物中还可与其他对神经组织和神经损伤具有保护和治疗作用的各种药物合用。9.按照权利要求1所述，其药物组合物可以是注射液，用于静脉滴注、静脉注射、腹腔注射、脊髓腔内注射、肌肉或皮下注射，可以是用于口服的胶囊、片剂、粉剂等固体剂型组合物，还可以是用T吸入途径给药的雾化剂型。10.按照权利要求1所述，其药物组合物中可药用的载体包括普通的药物组合物所能使用的所有形式的基质或辅料，如固体、半固体、和流体组合物。特殊相关的组合物是，例如，软膏、亲水软膏、乳膏、糊剂、霜、凝胶、水凝胶、溶液、乳液、悬浮液、洗液、擦剂、洗发剂、皂剂、粘贴物、喷雾剂、粉末、薄膜、垫料、敷剂、绷带、膏药等。全文摘要本发明提供一种用于治疗神经损伤的药物组合物，其药物组合物中的有效成分可以是胸腺素β16，还可以是由多种β胸腺素组成的组合制剂，例如，可由胸腺素β16与胸腺素β4及胸腺素β15按各种比例组成。本发明药物组合物可用于治疗各种神经损伤，包括中枢神经系统及外周神经系统疾病，可用于心血管疾病造成的缺血、缺氧引起的脑损伤、脊髓损伤及外周神经损伤。本发明还可用于治疗各种物理性神经损伤，如机械损伤、外伤、交通肇事等造成的脑损伤、脊髓损伤及周围神经损伤。此外，本发明还可用于预防及治疗各种原因引起的神经退行性疾病及衰老引起的脑组织及神经组织损伤，包括帕金森病、Alzheimer疾病等以及脑神经细胞功能障碍而引起的神经精神紊乱症状等。文档编号A61K38/17GK101152559SQ20061015268公开日2008年4月2日申请日期2006年9月25日优先权日2006年9月25日发明者宝勒日,干春玉,王大公申请人:宝勒日;干春玉