专利名称：具有促进血管形成、组织再生及伤口愈合作用的多肽组合制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组具有促进新血管形成、组织再生及伤口愈合作用的活性小分子多肽由多种不同e胸腺素组成的组合制剂，其药物组合物可用于促进皮肤、粘膜损伤的组织再生、 修复及愈合，改善缺血组织的血液供应。本发明药物组合物也可用于增进皮肤健康和美容， 使皮肤湿润、细嫩、柔软、洁白，减少皮肤组织瘢痕的形成，还可用于促进毛发再生。背景皮肤是包裹在整个身体表面的一层被膜状软组织，是人体最大和最重要的器官之一，具 有感觉、调节体温、吸收、分泌与排泄等重要生理功能，其完整性对机体维持正常生命活动 至关重要。皮肤充当抵御外部侵害的第一道防线，具有重要的屏障作用，因此也最易遭受各种损伤。常见的损伤因素有机械性如破裂、切割、摩擦；物理及化学性如烧烫伤、冻伤 及强酸、强硷损伤；手术刀口；以及各种慢性疾病导致的皮肤损害如褥疮、皮肤溃疡等。 机体具有一定的再生修复能力。正常情况下， 一般伤口可以自然修复愈合。但往往受病人身 体素质、创伤面积大小及严重程度和有无并发感染等因素的影响，多数情况下的伤口愈合需 要医疗干预。糖尿病所致的顽固性皮肤溃疡就是实例之一。糖尿病是一种常见的疾病，主要 是由于血中胰岛素绝对或相对不足，或靶细胞对胰岛素敏感性降低，导致血糖过高，出现尿 糖，进而引起脂肪和蛋白质代谢障碍。目前糖尿病的发病率，在我国已经高达2%，其中30%_50% 的病人伴有皮肤损害，出现久治不愈的皮肤溃疡，发生部位多在血液供应较差的下肢。许多 糖尿病患者因为小小的伤口不能愈合，最后导致截肢，甚至因感染而死亡。代谢障碍引起的 血管病变是造成这一皮肤组织病理性损伤的主要原因，治疗的关键是增强机体修复机能，提 高组织的新陈代谢水平，改善微循环，促进皮肤组织再生愈合。除了皮肤损伤外，胃肠粘膜也容易受到损伤形成溃疡(组织缺失)。在正常情况下，胃粘 膜表面有上皮细胞分泌的粘液覆盖，且与互相紧密联接的细胞及粘膜上皮有完整的上皮细胞 膜，共同形成粘液-粘膜屏障，保护胃粘膜，使其不被粗糙食物机械磨损，十二指肠上皮细胞 分泌碱性肠液中和胃酸。消化性溃疡是一种常见疾病，据报道，消化性溃疡患者约占全世界 人口的十分之一。全国以12亿人口计，则目前我国患消化性溃疡的人数己愈一亿。由于消化 性溃疡很高的发病率，致使治疗该病的药物具有较为广阔的市场。消化性溃疡的发生与前列 腺素生成、遗传因素、精神紧张、饮食不规则、吸烟、药物、环境等因素有关，并且大多数 消化性溃疡患者的胃窦部粘摸存在幽门螺杆菌。消化性溃疡多发生在暴露于酸和胃蛋白酶的 区域。最常见为十二指肠球部，称十二指肠球部溃疡胃小弯，称胃溃疡，还有幽门管溃疡， 球后溃疡，憩室溃疡，吻合口溃疡，空肠溃疡和食管下的溃疡等。当免疫防御机能和修复机 能低下时，不仅使其伤口感染率增加和病情加重，而且还造成组织修复的延迟甚至难以愈合， 修复质量也较差，复发率较高，给患者带来极大的不便和痛苦，严重的还会引发其它并发症， 如感染性休克、消化道穿孔、癌变等，可危及生命。因此，增强机体再生修复能力，使其溃 疡早日愈合是治疗消化性溃疡的一个重要方面。通常情况下，当伤口范围较小或损伤较轻时，可通过自然愈合过程进行修复。自然愈合 的过程包括封闭伤口以限制血液流失并阻止感染；去除受损的组织及血凝块；继之周围组 织中的成纤维细胞、纤维母细胞及血管内皮细胞侵入伤口部位并形成肉芽组织，各种组织细 胞替代肉芽组织并重建组织结构，使伤口完全愈合。表皮及其组织的再生修复是通过上皮细 胞迁移、细胞分裂和上皮分化三个过程来完成的。上皮受损后，缺损周围上皮断端的基底层 细胞向创面移动，上皮细胞分裂活跃，逐渐覆盖伤口表面，上皮进一步分化，重建失去的组 织结构和功能，如皮肤可以出现上皮的角化等。肉芽组织在伤口愈合过程中起以下几方面重 要作用(1)抗感染及保护创面；(2)机化血凝快、坏死组织及其他异物；(3)填补伤口或 其他缺损。大约从第三天开始，伤口底部长出肉芽组织，并向伤口内深入。肉芽组织的主要 成分是旺盛增生的新生毛细血管以及增生的纤维母细胞，其中还有多少不等的中性白细胞、 巨噬细胞等炎性细胞。最初由血小板发生聚集反应而分泌许多生长因子和细胞因子，然后由 巨噬细胞对低氧和乳酸中毒反应而分泌，这些因子能够刺激血管生成。新生的毛细血管即开 始从业已存在的小静脉抽芽并向受伤处生长，并相互连接形成毛细血管网。血管生成是组织 损伤修复的一个重要特征。目前临床用于伤口愈合的新药主要是各类生长因子，如表皮细胞生长因子，以及调节细 胞增殖和分化的蛋白转化因子-B家族(TGF-B)。基因重组牛硷性成纤维细胞生长因子 (Recombinant bovine bFGF)及基因重组人表皮细胞生长因子(Recombinant human EGF)已 经获得批准用于临床治疗伤口愈合。正在进行临床三期实验的还有四种基因重组蛋白，包括 人成纤维细胞生长因子等。在伤口愈合疗法中使用的这类治疗蛋白存在价格昂贵，疗效不确 定，不易储存，长期使用有可能引发肿瘤形成等不足。蛋白不稳定性(蛋白分解产物)还能引 起宿主意外的有害炎性反应。
我们经过研究证明胸腺素ei6能调节肌动蛋白聚合，刺激血管内皮细胞及皮肤上皮细胞迁移，具有明显的促进新血管形成、促进上皮细胞角化、组织再生及伤口愈合作用。胸腺 素是存在于人体及动物体内的一组小分子多肽，可分成a及P型。a型家族的主要代表是胸 腺素al,具有增强免疫功能的作用，已广泛应用于临床治疗病毒性肝炎等。e型家族现已有16个成员，氨基酸序列具有高度同源性，其中含量最多、组织分布最广的是胸腺素e4，其次是胸腺素ei0。胸腺素P4最早由胸腺中分离，具有43个氨基酸，分子量为4.9 KDa， 现已发现该蛋白具有多种功能，包括调节肌动蛋白聚合、促进细胞分化和迁移、促进血管形 成、促进组织再生及伤口愈合等作用。胸腺素P15最初发现于前列腺癌细胞，而胸腺素3 16发现于人神经母细胞瘤，各由45个氨基酸组成，分子量为5 KDa。胸腺素0 15和胸腺 素ei6的分布及功能研究甚少。我们通过对人正常皮肤组织进行免疫组化染色研究，观察到表皮细胞内含有大量胸腺素 P4、胸腺素P15及胸腺素ei6表达。已知胸腺素e4及胸腺素ei5均能促进血管生成。体 外刺激细胞运动实验进一步证明，将胸腺素P4与胸腺素P16组合使用，其促进人脐带静脉 内皮细胞定向移动的作用明显增强。因此将几种P胸腺素多肽按比例组成组合制剂，其增强 血管生成及伤口愈合的功能具有协同作用，优于单独使用一种e胸腺素。e胸腺素不同于市场上应用的或正在开发中的治疗伤口愈合的药物。P胸腺素不是生长 因子，与各种生长因子相比在治疗伤口愈合上有以下几方面优点1)特异性地刺激上皮细胞 移动，促进上皮细胞角化；2)特异性地刺激血管内皮细胞移动，促进血管形成；3)分子量 很小，只有四十几个氨基酸(生长因子属大分子蛋白)，易在组织内扩散；4)无副作用，可 局部反复应用；5)不易被蛋白水解酶所降解，作用持续时间长，可减少用药次数；6) P胸 腺素能直接作用于细胞骨架系统，具有支持细胞结构稳定性的作用。7)以上作用机制完全不 同于生长因子，不是通过直接刺激上皮细胞增殖，所以长期反复使用不会导致肿瘤发生。因此，由几种e胸腺素多肽组成的组合制剂在组织再生修复，伤口愈合中作用明显优于生长因子，具有重要和广泛的临床应用价值。 本发明的描述本发明起始于研究胸腺素ei6对细胞分化及对细胞迁移的影响。离体试验证明胸腺素P16作为细胞迁移促进因子可剌激人脐带静脉内皮细胞及表皮细胞的定向移动。用Boyden Chomber方法测试了多种不同类型的细胞，证明胸腺素0 16能够特异性地刺激人脐带静脉内 皮细胞及表皮细胞的运动。细胞运动在伤口愈合中起重要作用。新生的毛细血管即开始从业
已存在的小静脉抽芽并向伤口处生长，需要细胞运动；缺损周围上皮断端的基底层细胞向创面移动覆盖伤口表面，需要细胞运动。胸腺素ei6能促进细胞迁移，因此具有加速伤口愈合的作用。本发明研究证明胸腺素e 16还具有调节肌动蛋白聚合的功能。肌动蛋白是细胞内含量丰 富的蛋白质，是细胞骨架蛋白，它能通过单体与聚合体形式的转换参与多种细胞功能活动，如细胞运动、细胞收縮、吸收、分泌、代谢、DNA复制、细胞分裂等等。胸腺素P16能结合 到肌动蛋白单体上，通过抑制肌动蛋白的聚合来调节肌动蛋白的功能状态，调节细胞的生理 功能，加速细胞运动、细胞分裂等细胞功能活动，增强细胞的抗损伤能力，促进新血管形成、 组织再生及伤口愈合。本发明确定了胸腺素ei6能够在体内有效地促进血管内皮细胞移动，促进血管形成，促 进组织再生及伤口愈合。鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管形成试验结果显示，胸腺素ei6促进血管形成的效果与作为阳性对照的表皮细胞生长因子的效果相当或更好。动物伤口试验显示胸 腺素eie具有加速伤口愈合的效应。伤口局部用胸腺素ei6处理后，伤口面积比对照组縮 小一倍，伤口局部有完整的表皮再生，广泛的新血管形成，胶原合成也明显增加，伤口愈合 时间比对照组明显縮短。本发明进一步通过对人正常皮肤组织进行免疫组化染色研究，观察到表皮细胞内含有大量胸腺素e4、胸腺素ei5及胸腺素ei6表达。多项研究表明胸腺素e4、胸腺素eis均有促进细胞运动及血管形成、促进组织再生及伤口愈合的作用。本发明用Boyden Chomber方 法测试人脐静脉内皮细胞及表皮细胞迁移，将胸腺素ei6与胸腺素e4按各50%的比例组合使用，其促进细胞运动的能力明显强于单独使用胸腺素ei6或胸腺素e4，说明两种e胸腺素具有协同作用。如将几种e胸腺素多肽按比例组成组合制剂，其增强血管生成及伤口愈合的功能会有协同作用，优于单独使用某一种e胸腺素。因此，本发明提供一种含有效量的e胸腺素组合制剂，或其可用盐或其生理功能衍生物， 及可应用的载体配制而成的具有促进新血管形成、组织再生及伤口愈合作用的药物组合物。本发明药物组合物中的e胸腺素组合制剂，可由胸腺素eie与胸腺素e4按各种比例组 成，也可以由胸腺素ei6与胸腺素ei5按各种比例组成，还可以由胸腺素e 16与胸腺素e4及胸腺素ei5按各种比例组成。另外，该组合制剂还可由胸腺素e 16与胸腺素ei6的 多个同种异型体，如胸腺素e4、胸腺素e9、胸腺素eio、胸腺素eii、胸腺素ei2、胸腺素ei3、胸腺素P14、胸腺素P15以及上述同种异型体的氧化型按各种比例组成，也可以由胸腺素ei6与含LKKTET及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型按各种比例 组成，还可以由含LKKTET及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型按各种比例组成。总之，e胸腺素组合制剂可由e胸腺素及其氧化型、含LKKTET序列的氨基酸片段及其氧化型、以及含有LKKTNT序列的氨基酸片段及其氧化型按各种方式、各种比例组合。 以上均属于本发明范畴。本发明可局部用于治疗皮肤表层组织的擦伤、创伤、烧伤、烫伤、冻伤及其它形式的表 面损伤，各种皮肤病引起的皮肤损伤，皮肤深层组织的感染性溃疡、营养障碍性溃疡、堵塞 性溃疡，眼角膜损伤、眼角膜溃疡，也可用于某些疾病造成的胃肠粘膜损伤。另外，还可用 本发明的组合物处理外科手术造成的伤口，例如在手术皮肤伤口上涂布活性药剂等，以加快 手术伤口愈合。本发明可用于治疗消化性溃疡。患有消化性溃疡的病人胃壁分泌粘液量减少，胃酸分泌 量相应增多，过多的胃酸分泌对胃粘膜及对酸抵抗力较弱的十二指肠必然会导致消化与抗消 化的平衡失调，防御机能减弱，造成组织的自我消化。胃十二指肠溃疡从粘膜开始并侵及粘膜下层，常深达肌层。e胸腺素组合制剂具有促进损伤局部血管形成，改善血液供应，使胃壁分泌粘液量增加，提高抗消化能力，促进损伤局部肉芽组织生长，填补缺损，促进组织再 生，加速伤口愈合。本发明可以用来治疗由糖尿病引起的皮肤溃疡。细小血管阻塞及循环障碍是长期患糖尿 病患者中常见的病理变化。糖尿病患者由于血糖持续偏高而导致血脂升高，小动脉出现动脉 粥样硬化及血管阻塞，使得流至下肢的血液量减少。血液的功能是把营养物质运送到身体的 各部组织，同时也把各组织中产生的废物运送出体外，血液循环功能降低之后，首先受到影 响的便是脚部，因为脚部距离心脏最远，血液最不容易到达。因此，下肢的皮肤及软组织容 易缺血坏死，形成难以愈合的皮肤溃疡。e胸腺素组合制剂可用于下肢皮肤溃疡处，促进损 伤局部血管形成，改善血液供应，促进伤口愈合。本发明可以用来治疗或预防由大疱性表皮松解症及其各种原因引起的皮肤和周围组织
的退化性变、自身免疫性疾病如银屑病和其它紊乱症状。大疱性表皮松解症是一种罕见的基 因紊乱性疾病，表现为皮肤水泡，进而导致开放性疮伤、溃疡和结疤。这种疾病的程度可从 轻微到严重性残疾，甚至危机生命。P胸腺素组合制剂具有促进损伤组织修复、愈合的能力， 具有诱导末端脱氧核甘酸转移酶、降低炎症细胞因子或化学因子的水平，作为一种内皮细胞 趋化因子和血管生成因子，从而治愈和预防患者的皮肤病变。本发明可以用来刺激器官组织的再生和修复。例如手术切除部分结肠或其它组织后，在 手术局部或全身给予本发明药物组合物以促进器官组织的新生血管形成和组织再生，加快器 官的愈合过程。另一方面，本发明能减少疤痕组织的形成并促进由各种原因导致的疤痕组织的改建及吸 收。导致疤痕组织的各种因素包括手术过程，辐射，破伤，化学毒素，病毒及细菌感染或创 伤。本文使用的"疤痕组织"是指伤愈过程中和其它病理过程中形成纤维和胶原组织。例如，将e胸腺素组合制剂制成混合剂并投放在损伤组织附近，进而促进组织再生，血管增生及微循环系统形成，加速组织的改建，减少疤痕组织的形成。本发明可用于改善皮肤状况及抗皮肤衰老作用，促进皮肤组织的代谢更新、增进皮肤健 康，使皮肤湿润、细嫩、柔软、洁白。角化是表皮细胞的最重要功能之一。基底细胞逐渐移 行到角质层，由圆椎形细胞演变成无核扁平形的角质细胞，这个演变所需的时间为生长周期， 约需3 4周，各层细胞转换时间不同，称为表皮换新率。皮肤衰老时表皮换新率逐渐降低。胸腺素具有明显的促进上皮细胞迁移功能，能加速由深层的基底细胞向表面的角质层过渡，从而促进上皮细胞角化，维持表皮的不断代谢更新，因此e胸腺素组合制剂具有美容及抗皮肤衰老等作用。本发明为血液供应不足的某些组织提供了一种促进新血管增生的方法。各种原因导致的 毛囊血液供应减少可使毛囊营养不良(但无毛囊结构破坏)，引起脱发。有效剂量的e胸腺 素组合制剂可以通过促进毛囊组织的血管增生而增加毛囊组织的血流量，改善血液供应，为 缺血的毛囊组织提供营养。此外，e胸腺素组合制剂还可以促进毛囊基底干细胞移行及基底 细胞的新生，促进毛发再生。所以，本发明药物组合物可用于各种原因导致的脱发治疗。本发明阐述的方法也可以应用于诱导性组织再生工程。目前，医疗人员在进行创伤性手
术时采用诱导性组织再生工程技术来促进和加快伤口愈合。方法是将具有促进组织细胞迁移、 分化的生物活性物质殖入伤口处，使形成组织结构的细胞在伤口处大量聚集。本发明可用于 帮助人或动物肉芽组织的再生。方法是将含有生物可吸收性的多聚体、可溶性的溶剂和e胸腺素组合制剂的复合物放置于人或动物肉牙组织再生处。该复合物通过释放有效剂量的e胸 腺素组合制剂促进人或其它哺乳动物的肉芽组织再生。本发明描述的e胸腺素，包括但不限于胸腺素e4、胸腺素ei5及胸腺素ei6，是正常 机体内固有的多肽成分。因此，使用高度纯化的e胸腺素制剂安全、可靠。本发明的实施方 案中，e胸腺素可以是从组织细胞中分离提取，可以是直接化学合成，也可以是人工表达。 另外，各种能够调节e胸腺素基因表达，诱发或刺激机体组织细胞产生e胸腺素的生物活性 物质及化合物也可以加进本发明的药物组合物中。这类试剂包括但不限于各类生长因子，如胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板来源的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长 因子e(TGF-e)、基本成纤维细胞生长因子(BFGF)、胸腺素a 1和血管内皮生长因子(VEGF)等。尤其优选的试剂为转化生长因子e (tgf-e)或tgf-e家族的其它成员。本发明的药物组合物中还可以加入各种甾族、非甾族类抗炎剂及各种抗菌素、具有抗感 染作用的各种化合物，具有抗感染作用的中药配方，以及具有抗感染作用的其它天然物质。在本文中，"有效量"是指e胸腺素组合制剂的需要量。在组织修复过程中这种组合制 剂使用到治疗剂量时就会促进组织再生效应。e胸腺素能够促进及调理组织修复a程。组织 修复过程常常发生在损伤性疾病之后。组织修复过程出现障碍往往是由于在伤口处的各种细 胞如成纤维细胞、干细胞、血管内皮细胞、组织细胞对生长的反映不足而造成的。因此，加 入能诱导或刺激细胞生长的活性剂会有利于组织的修复。本文使用的"促进"一词是指对细 胞生长机制或过程具有激活作用，刺激作用，增强作用，起始作用及维持作用。这些细胞生 长机制或发生过程是组织形成，修复或发育所必须的。在本文中，"载体"是指含有活性e胸腺素组合制剂的基质或辅料，用来充当药物输送 系统。在本发明中，"药物输送系统"指当药物组合物(药物配制品或剂型)被使用时，可以 将活性me胸腺素组合制剂呈递给人或动物的机体。因此术语"药物输送系统"包括普通的药 物组合物所能使用的所有形式的基质或辅料，如固体、半固体、和流体组合物。特殊相关的 组合物是，例如，软膏、亲水软膏、乳膏、糊齐ij、霜、凝胶、水凝胶、溶液、乳液、悬浮液、
洗液、擦剂、洗发剂、皂剂、粘贴物、喷雾剂、粉末、薄膜、垫料、敷剂、绷带、膏药等。伤口局部应用本发明药物组合物优选是含有活性成分的软膏或霜。当制成软膏时，活性 成分可以使用石蜡基或水混溶性软膏基，或者，制成活性成分含水相油霜基的霜剂。制备涂 液、软膏等外用型组合物的例子，包括将有效剂量的和所需量的添加剂混合而成。这些添加 剂通常选自外用药物或化妆品的常用基质或辅料，例如凡士林、液体石蜡、羊毛脂、硬脂酸 单甘油脂、聚乙二醇、十六醇、甘油、乙醇和水等。如果需要，霜的水相可以包括，例如，至少30%W/W的多元醇，即含有两个或多个基的 醇，如丙二醇、3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇以及它们的混合物。局部 用制剂可以根据需要而增加或减少所含活性成分。本发明的药物组合物还可以是注射液组合物，用于静脉内、肤膜内、肌内或皮下注射。制备注射液组合物的例子包括将有效剂量的e胸腺素组合制剂或其衍生物和所需量的液体基 质混合制作而成，该基质的例子包括水或生理盐水，其中还可添加其它有益成分或辅料。本发明的药物组合物可以是口服胶囊、片剂、粉剂等固体剂型组合物，包括将有效剂量 的e胸腺素组合制剂或其衍生物干粉和所需量的药用辅料混合制作而成。本发明的药物组合 物还可以是口服液组合物。制备口服液组合物的例子包括将有效剂量的e胸腺素组合制剂或 其衍生物和所需量的液体基质混合制作而成，该基质的例子包括水或生理盐水，其中还可添 加其它有益成分或辅料。本发明还可以用可控制释放混合剂的方式使用。本文中的"可控制释放混合剂"是指任 何一种复合物。这种复合物可以用来缓慢释放包含其中的有效e胸腺素组合制剂。这种复合 物含有生物有效成分可以是固状的，渗透性的，半固状的，胶性的或液状的。本发明的e胸腺素组合制剂还可用于化妆品或其它皮肤护理产品的组合物中。这些组合 物包括但不限于清洁剂、眼霜、眼影、面霜、牛奶状洗剂、皮肤洗剂、香水、香粉、化妆用 油、糊状香水、粉末、护肤膏、护肤凝胶、润肤膏、剃须用膏、剃须用洗剂、防晒油、抗晒 油、防晒洗剂、抗晒洗剂、指甲膏、洁肤洗液、清洁霜、清洁露、洁肤奶、清洁乳、化妆基 料、面膜、含锌化妆水、润手香脂、香粉、增白粉、粉底霜、化妆底粉、沐浴化妆品、胭脂、
染眉毛油、唇膏、唇霜、眼线膏、生发油、美发液、发乳、发用凝胶、滋发剂、头发滋润剂、香波、护发素、除臭、科隆香水等。
图i显示的是胸腺素ei5及胸腺素eie染色结果人-正常皮肤组织中胸腺素3 15及P 16的免疫组化染色。表皮中间层及真皮小汗腺的腺体细胞内亦可 见大内可见大量胸腺素ei5 (图1A、 C)及6 16 (图1C、 D)染色。实施例 实施例1细胞培养入脐静脉内皮细胞用RPMI1640培养基培养。培养基内含有5%牛血清，100单位/毫 升青/链酶素，50微克/毫升庆大酶素，2-7微克/毫升两性酶素B，5单位/毫升肝素及200 单位/毫升血管内皮细胞生长因子等补充剂。人表皮角化细胞及前额纤维母细胞用DMEM及 10%小牛血清培养。实施例2促进血管增生实验胸腺素P16对血管生成的促进作用采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测，在孵育7天的 受精鸡胚蛋壳上开一 1 cm2左右窗口，将不同浓度的化学合成胸腺素e 16蛋白加样于灭菌滤纸片上，并放置于CAM ，然后在恒温恒湿培养箱370C下继续培养48小时，观察血管生长情况。本实验以生理盐水为测试对照，phorbol myristate acetate (PMA) 0.5微克/10微 升为阳性对照。实验测定结果表明胸腺素ei6蛋白加样组鸡胚绒毛尿囊膜血管生长明显旺 盛，管径粗且分支多，呈叶状分布。以生理盐水组血管生长程度作为对照，胸腺素e 16 5微 克/10微升的血管增生程度比生理盐水组显著增多，10微克/10微升的血管增生程度与 PMA阳性对照组血管增生程度相当或略多。这一实验结果表明胸腺素ei6具有明显促进血管 增生作用。实施例3伤口愈合实验小鼠麻醉后，用4毫米的组织取样器除去小鼠背部的皮肤，造成直径约为4毫米大小 的伤口，随后随机将动物分成胸腺素e 16治疗组和对照组(每组8只动物)。50微升(含有5 微克胸腺素ei6)的药液滴于伤口上，对照组使用生理盐水。动物每隔一天接收一次治疗， 连续观察7天后处死小鼠。伤口面积用于评估胸腺素ei6的疗效。伤口皮肤固定于10%福 尔马林溶液内。H & E和胶原染色法用于观察皮肤的病理学变化。重复实验结果相同。结果显示，胸腺素ei6处理组的伤口面积比对照组縮小一倍，伤口局部有完整的表皮再生，广泛 的新血管形成，胶原合成也明显增加。伤口愈合时间比对照组明显縮短，统计学具有极其显 著性差异(p < o.ooi)。这些结果表明胸腺素eie具有明显的促进伤口愈合作用。实施例4人皮肤组织免疫组化染色研究人皮肤组织标本经10%中性福尔马林固定，常规石蜡切片脱蜡、水洗，切片作HE染色及e胸腺素免疫组化染色。结果显示，表皮细胞内含有大量胸腺素e4、胸腺素ei5及 胸腺素eie表达。图中显示的是胸腺素ei5及胸腺素eie染色结果。表皮中间层内可 见大量胸腺素ei5(图ia)及eie (图ic)染色，阳性表达者主要是棘层里的棘细胞， 胞膜及胞浆呈大量深棕黄着色，部分细胞的胞核中亦可见到少量颗粒状的棕黄色阳性信 号。颗粒层及透明层内也有少量的阳性反应。另外，真皮小汗腺的腺体细胞及导管上皮细胞内亦可见大量胸腺素ei5 (图1B)及0 16 (图1D)。另外，真皮毛囊组织也有胸腺素ei5及胸腺素eie表达。以pbs代替一抗的阴性对照中，细胞的胞核和胞浆区均无阳 性信号。实施例5细胞迁移实验为了测试胸腺素P16与胸腺素P4的组合制剂对刺激细胞游走是否有协同作用，我们使 用Boyden Chomber方法对人脐带静脉内皮细胞进行了测试。先将Boyden Chamber两室间 隔的硝膜(孔径0.8鹏)两侧均覆盖Fibronection，浓度为15微克/毫升，37 "C下放置 60分钟。上室加入细胞悬液，下室为完全培养液，5% C02孵箱内静置4小时，取出滤膜， 将上室面细胞刮除，经固定染色后，在显微镜下细胞计数。每组3张膜。统计变量以均数标 准差表示。结果表明将胸腺素0 16与胸腺素e4按各50%的比例组合使用，游走细胞的数量 与单独使用胸腺素P16或胸腺素P4相比明显增多(结果见表l)。其促进细胞运动的能力明 显加强，说明两种e胸腺素具有协同作用。
表1 胸腺素刺激人脐带静脉内皮细胞细胞游走胸腺素种类 胸腺素浓度(毫微克/毫升)讓100 10 1 0胸腺素16 164土8.4133土8.587土3.263土5.926丄1.5胸腺素4 157土7. 1 121土4.579土7.061土7,527±3. 1胸腺素16 +4 232土7.8188土8.0112土7. 1 79土3.528土3.7注将胸腺素P16与胸腺素P4按各50%的比例组合使用，表中例出的数据是三次实验中细胞游走数的平 均值。
权利要求
1.一种具有促进组织再生及伤口愈合作用的药物组合物，含几种不同有效量的β胸腺素组合制剂，其生物活性变体或盐、和其可接受的药用载体。
2. 按照权力要求i所述，其药物组合物中的e胸腺素组合制剂，可由多种不同e胸腺素组成。例如， 由胸腺素fM6与胸腺素e4按各种比例组成，也可以由胸腺素ei6与胸腺素ei5按各种比例组成，还 可以由胸腺素e 16与胸腺素e4及胸腺素e 15按各种比例组成。另外，该组合制剂还可由胸腺素e i6与 胸腺素ei6的多个同种异型体，如胸腺素e4、胸腺素P9、胸腺素pio、胸腺素eu、胸腺素ei2、胸 腺素fM3、胸腺素ei4、胸腺素ei5以及上述同种异型体的氧化型按各种比例组成，也可以由胸腺素e16与含LKKTET和/或含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型按各种比例组成，还可以 由含LKKTET序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及 其氧化型按各种比例组成。总之，e胸腺素组合制剂可由e胸腺素及其氧化型、含LKKTET序列的氨基 酸片段及其氧化型、以及含LKKTNT序列的氨基酸片段及其氧化型按各种方式、各种比例组合。以上均 属于本发明范畴。
3. 按照权力要求2所述，组合制剂中的e胸腺素、含LKKTET序列的氨基酸片段、以及含LKKTNT 序列的氨基酸片段及其氧化型可以是自然提取、化学合成或人工表达。
4. 按照权力要求1所述，本发明可用于治疗各种原因引起的皮肤、粘膜损伤，如创伤、烧伤、烫伤、 冻伤、褥疮、其它形式的表皮损伤、皮肤深层组织的感染性溃疡、糖尿病引起的皮肤溃疡、堵塞性溃疡、 外科手术造成的伤口、眼角膜损伤、眼角膜溃疡、胃肠粘膜损伤、消化性溃疡等。
5. 按照权力要求1所述，本发明还可用于预防及治疗各种皮肤病、0身免疫性疾病如银屑病、大疱性 表皮松解症、皮肤及周围组织的退行性病变等。
6. 按照权力要求1所述，本发明药物组合物也可用于增进皮肤健康和美容，使皮肤湿润、细嫩、柔软、 洁白，用于抗皮肤衰老，治疗皮肤干燥、痤疮、皮肤皱纹、老年斑和/或老化皮肤，增加皮肤弹性，减少皮 肤组织瘢痕的形成，改善皮肤营养。
7. 按照权力要求1所述，本发明还可用于促进毛发再生，预防及治疗各种原因导致的脱发。
8. 按照权力要求1所述，其药物组合物中还可添加其他神经保护性药物，如神经生长因子(NGF)、神 经营养蛋白(NT)、血管内皮生长因子(VEGF)及成纤维细胞生长因子(FGF)，以及其它具有调节胸腺素e 16生成的各种生长因子、细胞因子及各种化合物。
9. 按照权力要求1所述，其药物组合物中还可以加入各种甾族、非甾类族抗炎剂及各种抗菌素，具钉 抗感染作用的中药配方及其它天然物质。
10. 按照权力要求1所述，其药物组合物中可药用的载体包括普通的药物组合物所能使用的所有形式 的基质或辅料，如固体、半固体、和流体组合物。例如，软膏、亲水软膏、乳膏、糊剂、霜、凝胶、水凝 胶、溶液、乳液、悬浮液、洗液、擦剂、洗发剂、皇剂、粘貼物、喷雾剂、粉末、薄膜、垫料、敷剂、绷 带、膏药、注射液、口服胶囊、片剂、粉剂等。
全文摘要
本发明涉及一组具有促进新血管形成、组织再生及伤口愈合作用的活性小分子多肽由多种不同β胸腺素组成的组合制剂，其药物组合物可用于改善缺血组织的血液供应、促进皮肤、粘膜损伤的组织再生、修复及愈合。本发明药物组合物还可用于增进皮肤健康和美容，使皮肤湿润、细嫩、柔软、洁白，并用于促进毛发再生。本发明药物组合物中的有效成分，β胸腺素组合制剂，首选胸腺素β16与胸腺素β4的组合，还可以选胸腺素β16与胸腺素β4及胸腺素β15的组合。然而，由β胸腺素及其氧化型、含LKKTET序列的氨基酸片段及其氧化型、以及含LKKTNT序列的氨基酸片段及其氧化型按各种方式、各种比例组合成的β胸腺素组合制剂均属于本发明范畴。
文档编号A61K38/32GK101152568SQ20061015268
公开日2008年4月2日 申请日期2006年9月25日 优先权日2006年9月25日
发明者宝勒日, 干春玉, 王大公 申请人:宝勒日;干春玉