胆碱酯酶在拮抗速激肽药物中的应用的制作方法

专利名称：：胆碱酯酶在拮抗速激肽药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及治疗或预防速激肽介导的病症的药物，特别地涉及首先在c-端Leu-Met位点水解氨基酸残基的胆碱酯酶在制备治疗速激肽介导的病症的药物中的应用。
背景技术：
：速激肽(Tachykinins,TKs)是具有下述共同酰胺化羧基末端系列的一簇肽。速激肽C末端有-Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2共同结构，是一种在哺乳动物包括人体内产生的具相似药理活性神经肽，有着多种生理功能，速激肽的名字源于它们对平滑肌组织的刺激作用。哺乳类动物的速激肽主要包括P物质(SubstanceP，SP)，神经激肽A(NeurokininA，NKA)和神经激肽B(NeurokininB，NKB)三种。速激肽广泛分布在中枢神经系统和周围神经系统，由神经释放，也可由非神经组织产生。以P物质(SP)为例，研究表明，SP能以神经内分泌的方式作用于各种免疫细胞，参与免疫调节；SP还影响活化的淋巴细胞合成细胞因子，进而介导和调节免疫炎症反应;SP对T淋巴细胞的趋化作用具有剂量依赖性和受体依赖性，在炎症时的免疫细胞募集过程中发挥重要作用；SP影响辅助性T细胞合成细胞因子；SP及其C-端片段对中性粒细胞有启动效应，还可延缓中性粒细胞的凋亡，表明SP在炎症的迁延过程中起作用。另外，SP还是中性粒细胞的趋化因子，10-9mol/L的SP可直接影响其向炎症部位的迁移。SP可以激活肥大细胞，引起胞内Ca^动员和细胞脱颗粒，释放组胺。人皮肤郎格罕斯细胞表面存在丰富的SP结合位点，它们被激活后可以抑制抗原提呈过程。SP也可诱导骨髓细胞产生IL-l和IL-6。SP对其他系统的作用有(1)神经系统，SP作为一种对耙组织起兴奋作用的介质，从初级传入终末释放，涉及痛觉传递；(2)消化系统，SP具有收縮消化道平滑肌的作用，可刺激唾液分泌增加，还可促进大肠和小肠内水和电解质的分泌；(3)循环系统，SP可使血管扩张，血管通透性增加和血浆蛋白渗出，脑室内注射SP可引起大鼠平均血压升高；(4)呼吸系统，SP神经元参与氧不足的换气发动，使呼吸道平滑肌紧张性加强，致支气管痉挛、肺内水肿；(5)泌尿系统，SP能使输尿管、膀胱平滑肌收縮，使ADH释放量增加，引起肾血流量增加、尿量增加；(6)被皮系统，人皮肤注射SP引起局部红肿、瘙痒反应；在皮肤损伤时期，SP参与局部炎症反应及免疫反应。综上所述，SP不仅是一种重要的神经递质，而且还是神经系统、内分泌系统和免疫系统共同的化学语言，是传递信息、调节机体反应的重要信使(参见方秀斌《神经肽与神经营养因子》42-55人民卫生出版社)。SP在各种组织中呈现出纷繁多样的生理效应，使其受体激动剂和拮抗剂具有了广阔的应用前景。SP的结构和活性关系密切，羧基端(C-端)的氨基酸断裂，活性则明显降低或消失。根据对SP不同长短的片段及各种D型氨基酸取代衍生物的活性研究，认为C端6个氨基酸为其生物活性所必需的。Duplaa等用相应的D型氨基酸分别取代SP的各个氨基酸残基后进行的生物活性及受体结合分析发现，第6，7，8，9，ll位的氨基酸残基被D型氨基酸取代后，受体结合能力几乎完全丧失(参见路长林等《神经肽基础与临床》134第二军医大学出版社)本领域已充分证明P物质和其它速激肽类与许多疾病的病理生理学上的广泛联系，例如，已证实P物质参与了疼痛或偏头痛的传导作用(参见B.E..B.Sandberg等，JournalofMedicinalChemistry，25,1009(1982);L.Urban等，TINS,1994，17，432-438;Seguin等，Pain,1995，61，326-343;S.H.Buck，1994，"TheTachykininReceptors",HumanaPress,Totowa，N丄)，也与中枢神经系统疾病(如焦虑和精神分裂症)有关(见C.A.Maggi等AutonomicPharmacol.,1993，13，23-93;M.Otsuka和K.YoshiokaPhysiol.Rev.1993，73，229-308)，与呼吸系统疾病(如气喘)有关(见J.Mizrahi等Pharmacology，1982，25，39-50;C.Advenier等，Eur.Reespir丄，1997，10，1892-1906;C.Advenier和X.Emonds-Alt，PulmonaryPharmacol.,1996，9，329-333)，还与过敏及炎症有关(见S.H.Buck，1994，"TheTachykininReceptors"),还与风湿病(如肌风湿病)、以及胃肠紊乱和胃肠道疾病(如溃疡性结肠炎和节段性回肠炎)等有关(见P.Holzer和U.Holzer-Petsche，Pharmacol.Ther.，1997，73，173-217和219-263及参见D.Regoli的文章，载于F.Sicuteri等人编的"TrendsinClusterHeadache，，一书第85—95页,此书由阿姆斯特丹市ElsevierScientificPublishers出版，1987年)。由于P物质等速激肽与许多疾病的病理生理学上的广泛联系和作用，这使速激肽受体拮抗剂具有了广阔的应用前景。提供拮抗P物质等速激肽的药物组合物，文献作了许多报告，例如中国专利CN02131556.6,CN94194790.4,CN94195008.5,CN95194416.9,CN96123888.7,CN95195280.8,CN94192362.2,CN93114371.3,CN93100018.1，CN99810915.0，CN99810017.X及美国专利US6521621,US6329394,US6197772,US5939433等。它们的共同特点是提供了速激肽受体亚型的特异性受体拮抗剂，均为化学合成物质。美国专利6，709，651提供了一种有选择地在Xaa-Pro位点裂解多肽的肽酶用作P物质的拮抗剂，作用机理为裂解P物质专一性受体结合位点而拮抗P物质作用。胆碱酯酶(Cholinesterase)是一类糖蛋白，以多种同工酶形式存在于体内。一般可分为乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase)和丁酰胆碱酯酶(Butylcholinesterase)。乙酰胆碱酯酶(EC3丄1.7)(AChE)也称真性胆碱酯酶，主要存在于胆碱能神经末梢突触间隙，特别是运动神经终板突触后膜的皱摺中聚集较多；也存在于胆碱能神经元内和红细胞中。此酶对于生理浓度的Ach作用最强，特异性也较高。丁酰胆碱酯酶(EC3丄1.S)(BChE)也称血清胆碱酯酶、拟胆碱酯酶或非特异胆碱酯酶，广泛存在于神经胶质细胞、血浆、肝、肾、肠中，对Ach的特异性较低，丁酰胆碱酯酶可水解其他胆碱酯类，如琥珀胆碱。文献中未见将胆碱酯酶用于制备治疗或预防由P物质等速激肽介导的病症的药物的报道。
发明内容本发明的目的是提供胆碱酯酶在制药中的应用。本发明的一个方面，提供胆碱酯酶在制备治疗或预防哺乳动物包括人的由速激肽介导的病症的药物中的应用，所述的病症包括疼痛、炎症、中枢神经系统疾病、呼吸系统疾病、胃肠紊乱和胃肠道疾病、过敏、神经病理学疾病、与免疫增进或抑制有关的疾病以及风湿病、皮肤病和慢性疲劳综合症。所述的胆碱酯酶为单体或混合物。在一个优选方案中，所述的胆碱酯酶选自-乙酰胆碱酯酶；丁酰胆碱酯酶；乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶的同工酶及衍生物；乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶的基因重组物。在一个优选方案中，其中所述胆碱酯酶是从动植物组织或血液提取纯化或通过基因重组从表达载体分离纯化得到的、在以乙酰胆碱或丁酰胆碱为底物检测出具有胆碱酯酶活性的非均一状态的粗提物。在一个优选方案中，其中所述胆碱酯酶剂量范围为0.01微克至1毫克。本发明的另一个方面，提供一种拮抗哺乳动物体内速激肽作用的药物组合物，它包括速激肽拮抗有效量的上述胆碱酯酶，胆碱酯酶可以是单体也可以是混合物。本发明的另一个方面，提供一种拮抗哺乳动物体内速激肽作用的药物制剂，它包括上述的药物组合物和药学上可接受的赋形剂。本发明的另一个方面，包括将药学上可接受的赋形剂与上述的药物组合物混合均匀。本发明基于这样一个理念，利用胆碱酯酶或其同工酶首先在C-端Leu-Met位点水解氨基酸残基，继而多位点水解C-端肽链，可以给予体内存在非正常高水平P物质等速激肽的病人，用于治疗或预防他们的疾病及失调症状。胆碱酯酶首先将P物质C-端的Met"残基解离，继而多位点水解C-端肽链，由此产生的P物质的l一10肽段、或1一9、l一7、1—5肽段，不再具有受体激活或受体结合的效能。在这里，胆碱酯酶通过降低原肽的效能水平，扮演了"拮抗剂"的角色。它们可以全身或局部地用于治疗或预防依照文献报道的用P物质拮抗剂或速激肽拮抗剂治疗的任何病症。更进一步地说，本发明提供包含胆碱酯酶或其同工酶在内的药物组合物，其首先在C-端Leu-Met位点继而多位点水解包括P物质在内的速激肽C-端肽链，使P物质等速激肽失去药理生物活性或受体结合能力，起到速激肽拮抗剂的作用。通过降低P物质等速激肽介导的免疫调节作用或降低P物质等速激肽介导的神经传导作用，可用于治疗或预防包括P物质在内的速激肽介导的疾病。治疗是给予病人治疗有效量的上述药物组合物。由于根据本发明的药物组合物通过降解速激肽而具有拮抗速激肽作用，尤其是通过降解P物质而拮抗P物质的作用，它们适用于医用，尤其是由速激肽介导的哺乳动物包括人的病症的预防和治疗，例如，用作但不限于止痛剂，尤其是治疗如手术后或运动创伤引起的疼痛；臂神经丛痛；骨关节炎或风湿性关节炎引起的慢性疼痛；偏头痛；疱疹后神经痛，脉间、外周神经痛，糖尿病神经痛，化疗及AIDS导致的神经痛；幻痛；牙痛；癌痛；痛经，月经痛；坐骨神经或椎间盘下坠引起的疼痛；痛风；与瘢痕或痒疹有关的皮肤疼痛；神经或血管受压以及肌肉受损引起的周边疼痛如颈椎疼痛、肩肘疼痛。抗炎剂，尤其是治疗哮喘、流感、支气管炎(特别是COPD)、咳嗽、变态反应、支气管痉挛；风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎；胃肠系统炎症如克隆病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、感染引起的胃肠失调；膀胱炎。治疗过敏症，尤其是风疹等皮肤过敏、接触性皮炎和鼻炎。治疗中枢神经系统疾病，尤其是焦虑、抑郁症、精神分裂症、躁狂抑郁性精神病、性功能障碍、痴呆、与压力相关的障碍、睡眠障碍、认知障碍、情感障碍、分裂情感性障碍、饮食障碍、神经病变性障碍、嗜瘾性障碍、人格障碍、消沉、药物依赖、恐慌以及其他与CNS相关的病症。治疗急性或延迟预期的恶心和呕吐，如化疗、透析、毒素、眩暈、高海拔、消化不良、胃弱等引起的恶心和呕吐。治疗胃肠系统疾病，如肠应激综合症(旧S)、腹泻、分泌过多、胃炎、大便失禁、食物过敏。治疗皮肤病变，如牛皮癣、异位性皮炎、荨麻疹、瘙痒症和斑尤其是晒斑。治疗血管痉挛疾病，纤维组织与胶原疾病，与免疫加强或抑制相关的病变，以及风湿病与体重控制。治疗高血压，中风，癫痫，头部创伤，脊髓创伤，缺血性神经损伤如由中风或血管闭塞(如在开心手术中)引起的中枢缺血性损伤，兴奋毒性神经损伤(如中风癫痫中)和肌萎縮性侧索硬化。治疗慢性疲劳综合症。由于胆碱酯酶在体内能迅速灭活组织及体液中的前炎症因子一速激肽，不仅可以限制在高水平免疫过程中的炎症过度，也可以限制在免疫低下时出现的过剧炎症反应，还可以限制在免疫恢复过程中出现的局部与全身性炎症反应综合症，而所有的癌症、AIDS及器官移植者都有免疫低下。另外癌症病人身体除受癌症本身的损害外，更多的受到的是癌症引发的身体其它部位的炎性病变、化疗放疗造成的副作用以及治疗用药造成的免疫低下所引发的炎症反应，它们对癌症病人的生命期及生存质量，起着举足轻重的作用。使用本发明的药物组合物对这类病症患者是有益的。由于胆碱酯酶在体内能迅速灭活组织及体液中的传递信息、调节机体反应的重要信使一速激肽，当机体因感染受到外来全新抗原如SARS病毒、禽流感病毒及暴发型流感的侵袭时，某些情况下有可能产生过激反应，导致病情急剧变化甚至死亡，以及诸如此类因感染引发的过剧免疫反应的预防和治疗，使用本发明的药物组合物，相信对这类病症患者是有益的。本发明的组合物可以用作化妆品，尤其是作为用于抑制由P物质诱导的来自肥大细胞的组胺释放的试剂的用途。胆碱酯酶由于来源不同及纯化手段不同，其比活力差异巨大，每毫克蛋白从几十单位到几万单位不等，它们均可为本发明所利用。如折算酶比活力为iooo单位(U)/毫克蛋白的干物质，本发明的治疗有效量的剂量范围为0.01微克至1毫克，优选的剂量范围为0.1微克至1亳克。本发明的制剂，通常以药物组合物配制成水溶液剂、冻干粉或冻干粉复溶剂的形式使用。本发明提供胆碱酯酶治疗包括P物质在内的速激肽介导的病症的用途及其药物组合物和制剂，可以治疗或预防多种疾病。为由于体内过量P物质等速激肽引发病理生理变化的人群，提供一种有效的、副作用小的治疗手段。由于本发明的胆碱酯酶可以是乙酰胆碱酯酶、或丁酰胆碱酯酶及它们的同工酶、或它们的衍生物，它们可以来源于动物的细胞、组织或血液，也可以来源于植物及通过基因重组的方法得到，来源广泛，而且不需要高度提纯，适宜产业化。图1-图5分别为含铁离子丁酰胆碱酯酶水溶液水解SP反应0、25、60、120、180分钟时取样质谱分析的质谱图。图6-图9分别为丁酰胆碱酯酶双蒸水溶液水解SP反应0、25、60、180分钟时取样质谱分析的质谱图。图10-图15分别为乙酰胆碱酯酶水解SP反应0、2、4、6、8和30分钟时取样分析的质谱图。发明详解本发明的制药应用中，使用的胆碱酯酶优选自乙酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶，乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶的同工酶及衍生物，乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶的基因重组物。使用的胆碱酯酶可以是单体，也可以是混合物。它们的来源及提取纯化的技术，是本领域人员公知的，不同来源的胆碱酯酶，原料中的含量各不相同，收率差异巨大，因而出现不同来源的产品，如从苍蝇头部、电鳗、牛血清及动物血液等提取的胆碱酯酶，利用果蝇基因重组的胆碱酯酶(参考专利公开CN1472316,CN1727487)等。如专利公开CN1472316中提到一种用于果蔬中农药残留量测定的乙酰胆碱酯酶的制备方法，以动物血液为酶源，其工艺步骤包括从酶源中提取乙酰胆碱酯酶粗提液，以及用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶和用透析法脱硫酸铵，再将酶液浓缩，干燥，即得已纯化的乙酰胆碱酯酶制品。这里所称'已纯化'，是一种习惯的说法，即已把酶提纯到一恒定的比活，大多数的酶都需要进一步的纯化。本发明使用的胆碱酯酶或其同工酶，只需要纯化到一恒定的比活，在以乙酰胆碱或丁酰胆碱为底物检测出具有胆碱酯酶活性的情况下，就满足本发明的制药应用。本发明使用的胆碱酯酶也可以从市场购得。本发明的药物组合物，虽然不想受任何特定理论的限制，由于它们的药理活性可用作速激肽拮抗剂，尤其是用作P物质和神经激肽A神经激肽B以及类似物质的拮抗剂，本发明的目标之一是提供新的有用的速激肽拮抗剂，尤其是提供P物质和神经激肽A神经激肽B的拮抗剂。相信本发明的药物组合物通过首先在C端Leu-Met位点继而在C-端多位点水解P物质等速激肽使P物质等速激肽失去药理生物活性或受体结合能力，降低P物质等速激肽介导的免疫调节或神经传导发挥作用，使与疼痛、炎症、中枢神经系统疾病(如抑郁、焦虑和精神分裂症)、呼吸系统疾病(如气喘)、胃肠紊乱和胃肠道疾病(如肠易激综合症和溃疡性结肠炎)、过敏、神经病理学疾病、与免疫增进或抑制有关的疾病以及风湿病、皮肤病和慢性疲劳综合症得到缓解。本发明的进一步的目标是提供一种药物制剂，该药物制剂含有胆碱酯酶或它们的同工酶，或它们的衍生物，用于预防和治疗病人需要用它们来治疗的各种疾病。本发明也涉及治疗或预防哺乳动物包括人体内下列病症的方法，该方法包含对所说哺乳动物包括人治疗或预防这类疾病给予治疗有效量的本发明的药物组合物。其治疗或预防是通过首先在C端Leu-Met位点继而在C-端多位点水解P物质等速激肽使P物质等速激肽失去药理生物活性或受体结合能力，降低P物质等速激肽介导的免疫调节作用或神经传导作用而实现或促进实现的。不过，应理解到本发明不受任何用来解释最后应用的效力的理论或假定的机理的限制。由于本发明的药物组合物是速激肽拮抗剂，所以它们在治疗与速激肽有关的病症中有潜在的用途，包括但不限于疼痛、炎症、中枢神经系统疾病(如抑郁、焦虑和精神分裂症)、呼吸系统疾病(如气喘)、胃肠紊乱和胃肠道疾病(如肠易激综合症和溃疡性结肠炎)、过敏、神经病理学疾病、与免疫增进或抑制有关的疾病以及风湿病、皮肤病、慢性疲劳综合症。具体地说，本发明药物组合物可用于疼痛的治疗或预防，包括但不限于创伤疼痛如手术后疼痛；创伤撕裂疼痛如臂神经丛；慢性疼痛例如发生在关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性或银屑病性关节炎的关节痛；神经性疼痛如带状疤疹后神经痛、三叉神经痛、节段性或脉间神经痛、纤维肌痛、灼痛、末梢神经病变、糖尿病性神经病变、化学疗法诱发的神经病变引起的痛、枕神经痛、膝状神经痛、舌咽神经痛、交感反射性营养不良及幻肢痛；各种形式的头痛如偏头痛、急性或慢性紧张头痛、及丛集性头痛；牙痛；癌症痛；内脏痛;胃肠痛；神经受压性痛；运动伤害痛；经痛；月经痛；脑膜炎、蛛网膜炎引起的痛；肌肉骨骼痛；下背痛如脊狭窄、脱盘、坐骨神经痛、咽痛、关节强直性脊推炎痛；痛风；灼伤；疤痕、痒疹痛；颈椎痛；肩肘痛；及丘脑痛例如中风后的丘脑痛。具体地说，本发明药物组合物也可用于炎症的治疗或预防，包括但不限于哮喘、流行性感冒、慢性支气管炎及风湿性关节炎中的炎症；胃肠道炎症例如但不限于克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、大肠炎、胃炎及非甾体抗炎药诱发的伤害;皮肤炎症例如疱疹及湿疹；膀胱炎症例如膀胱炎及欲望性尿失禁；及眼和牙齿发炎。具体地讲，本发明药物组合物也可用于过敏性障碍的治疗或预防，包括但不限于皮肤过敏性障碍例如但不限于风疹；及气道过敏性障碍例如但不限于鼻炎。具体地说，本发明药物组合物可用于治疗或预防由多种原因造成的精神分裂症，包括狂躁型、抑郁型、混合型的精神分裂症；妄想型、错乱型、紧张型、混合型及残留型精神分裂症；精神分裂症样的疾病；妄想型精神病；短暂的精神病疾病；感应性精神病；物质诱发的精神病及无特别确定的精神病。具体地讲，本发明药物组合物可用于包括(但不限于)重性抑郁症的治疗或预防，包括两极性抑郁；单极性抑郁；有或无精神病特征、紧张性特征、忧郁性特征、非典型特征或产后发作的一次性或周期性重性抑郁症，以及在周期性发作情况下，有或无季节性模式。其他包括在术语"重性抑郁障碍"范围内的情绪障碍包括早期或晚期发作的及有或无非典型特征的心情恶劣障碍、循环性精神障碍、周期性短暂抑郁障碍、混合型情感障碍、神经性抑郁、创伤后应力障碍及社交恐惧症；有抑郁情绪的血管障碍痴呆；物质诱发的情绪障碍，如由酒精、可卡因、迷幻剂、鸦片、镇静剂、催眠药、抗焦虑剂及其他物质引起的情绪障碍；抑郁型精神分裂症；及具有抑郁情绪的适应性障碍。具体地说，本发明药物组合物可用于焦虑症的治疗或预防，包括但不限于恐慌发作；广场恐怖；特定的恐惧症；社交恐惧症；强迫性神经失调；创伤后应激障碍；急性应激障碍；一般性焦虑症；由于全身健康情况的焦虑症；物质诱发的焦虑症；及无特别确定的焦虑症。具体地讲，本发明药物组合物用于与抑郁和/或焦虑有关的应激相关障碍的治疗或预防，包括但不限于急性应激反应；适应性障碍，如短暂抑郁反应、延长抑郁反应、混合型焦虑和抑郁反应、显著干扰其他情绪的适应性障碍、带有显著干扰行为的适应性障碍、带有混合干扰情绪和行为的适应性障碍、具有其他特定显著症状的适应性障碍；及对严重应激的其他反应。具体地讲，本发明药物组合物可用于睡眠障碍的治疗或预防，包括但不限于作为主要睡眠障碍的和/或深眠状态；失眠；睡眠呼吸暂停；嗜眠发作；生理节奏失调；与其他精神失调相关的睡眠障碍；及物质诱发的睡眠障碍。具体地讲，本发明药物组合物可用于认知障碍的治疗或预防，包括但不限于痴呆症；健忘症及无特别确定的认知障碍，尤其是由退化障碍、损伤、创伤、感染、血管疾病、毒物、缺氧、维生素缺乏或内分泌失调引起的痴呆症；退化障碍、血管疾病或其他原因造成的健忘症。此外，本发明药物组合物也可用于无认知和/或记忆缺陷的健康人的记忆和/或认知的提高。具体地说，本发明药物组合物可用于个性障碍的治疗或预防，包括但不限于妄想狂个性障碍；精神分裂个性障碍；精神分裂型个性障碍；反社会个性障碍;边缘型个性障碍；自恋型个性障碍；回避性个性障碍；依赖性个性障碍；强迫观念与强迫行为性个性障碍及无特别确定的个性障碍。具体地说，本发明药物组合物也可用于饮食障碍的治疗或预防，包括但不限于神经性厌食；非典型神经性厌食；神经性贪食；非典型神经性贪食；与其他心理干扰相关的过度饮食；与其他心理干扰相关的呕吐及不确定的饮食障碍。具体地说，本发明药物组合物也可用于神经变性疾病的治疗或预防，包括但不限于慢性舞蹈病；脱髓鞘障碍；其他神经病和神经痛；多发性硬化；肌萎縮性侧索硬化；中风及头创伤。具体地讲，本发明药物组合物也可用于上瘾障碍的治疗或预防，包括但不限于有或无生理依赖的物质依赖或滥用，特别是当物质是酒精、安非他明、安非他明样物质、咖啡因、可卡因、迷幻剂、吸入剂、尼古丁、鸦片(如大麻、海洛因及吗啡)、苯环己派吮、苯环己呱吮样药物组合物、镇静剂一催眠药、苯并二氮杂草和/或其他物质，具体是用于治疗戒除上述物质和酒精以及戒除妄想。具体地说，本发明药物组合物也可用于情绪障碍的治疗或预防，特别是由酒精、安非他明、咖啡因、大麻、可卡因、迷幻剂、吸入剂、尼古丁、鸦片、苯环己派吮、镇静剂、催眠药、杭焦虑药及其他物质引起的情绪障碍。具体地讲，本发明药物组合物也可用于性功能障碍的治疗或预防，包括但不限于性欲失调；性勃起障碍；性高潮障碍；性交疼痛障碍；由于一般医学疾病引起的性功能障碍；物质引起的性功能障碍及不确定的性功能障碍。具体地说，本发明药物组合物也可用于呕吐的治疗或预防，即反胃、干呕及呕吐，包括但不限于急性呕吐、延迟性呕吐及预期性呕吐；药物例如癌症化学疗法药剂诱发的呕吐；放射呕吐；放射治疗，例如癌症的治疗；毒药；毒素(例如由代谢失调或感染例如胃炎造成的毒素，或在细菌性或病毒性胃肠感染期间释放的毒素)；怀孕；前庭障碍(例如晕动病、眩晕、头晕及美尼尔氏症)；手术后晕；胃肠阻塞；降低的胃肠蠕动；增加的颅内压；降低的颅内压(例如高山反应)；鸦片类止痛药(例如吗啡)；胃一食管回流症；酸性消化不良；食物或饮料过度放纵；胃酸；反胃；胃灼热坡胃；胃灼热(例如发作性胃灼热、夜间性胃灼热及食物诱发的胃灼热)；及消化不良。具体地说，本发明药物组合物也可用于皮肤病的治疗或预防，包括但不限于皮癣、皮疹、牛皮癣、瘙痒症、虫叮咬、斑尤其是晒斑。具体地说，本发明药物组合物也可用于与免疫增进或抑制有关的疾病的治疗或预防，包括但不限于类风湿性关节炎、克隆病、糖尿病、红斑狼疮及排异反应。具体地说，本发明药物组合物也可用于治疗或预防风湿病、高血压、水肿、慢性疲劳综合症。本发明药物组合物可用于制造治疗或预防精神分裂症、呕吐、焦虑、抑郁、肠应激综合症、生理节律紊乱、疼痛、神经性炎症、哮喘、风湿性炎症、感染引起的炎症、过敏及痛觉的药物。本发明的胆碱酯酶也可用于化妆品，如祛斑、止痒、防止瘢痕增生。这里描述的被治疗的疾病在文献中都是已知的，并进行过评价。还应认识到，有经验的专业人员使用有效量的胆碱酯酶，对正受疾病折磨的病人进行治疗或预防，可以产生影响。这里使用的"病人"一词是指处于特殊的炎症状态的包括人在内的哺乳动物。这里使用的"治疗有效量"一词是指能够有效地控制与炎症、疼痛、及中枢神经系统有关的病情。比如治疗偏头痛时，治疗有效量应该是足以减轻头痛或病人的不舒服感的剂量。通过文献已知的倾向性诊断，即使用常规技术并观察在类似循环下得到的结果，很容易确定治疗有效量。在确定治疗的有效量时，通过倾向性诊断考虑一系列因素，包括动物的种，大小，年龄，一般健康状况，疾病类别，疾病的严重程度或深度或广度，个体响应情况，服用的特定药物组合物，服药模式，制剂的生物活性特点，选择的剂量规则，使用的辅加剂，以及别的有关情形，当然不仅仅限于这些。当使用酶比活力为1,OOOU/毫克蛋白质的胆碱酯酶时，治疗有效量为O.Olpg-lmg，优选O.l)ig-lmg，最佳量可由有经验的专家确定。为了对患有上述病情的病人进行有效的治疗，可以用任何能使胆碱酯酶在治疗治疗有效量内被利用的剂型服用胆碱酯酶，包括注射，吸入和非肠道或局部给药。例如，胆碱酯酶可以以气雾剂、喷雾剂或干粉形式吸入，皮下注射，肌肉注射，静脉注射，电极给药，鼻内给药，直肠给药，阴道给药，透皮或粘膜给药，局部给药，以及类似的给药途径服用。对于呼吸道疾病，例如哮喘，一般提倡吸入给药如对鼻腔或呼吸道使用气雾剂或喷雾剂，喷雾装置可附加发热机构，使水溶液有35。C至45。C温度，更有利于提高酶的活性；对于中枢神经系统疾病以及慢性疲劳综合症等，除了传统给药方式，对于本发明的胆碱酯酶，可以以水溶液的形式通过口腔粘膜给药，如将酶水溶液含于口腔并保留一段时间，以促进吸收。还可以以酶水溶液同木聚糖或木糖醇混合为流质，封装于软胶囊，用时咬破，含于口中；对于创伤、体表疼痛，一般以喷雾剂、凝胶剂、贴剂、透皮吸收剂等在疼痛部位直接施用，或以水溶液剂在疼痛部位作皮内、皮下或关节腔注射；对于肠道或阴道疾病，可以适宜的载体浸有胆碱酯酶水溶液，塞入肛门或阴道。药剂专家，根据服用的药物组合物的特型，被治疗的疾病的情形和状况，疾病的发展阶段，以及其它相关的情形，可以很容易地选择合适的剂型和给药模式。本发明的胆碱酯酶可以单独给药，也可与其它可以药用的载体或赋形剂一块以药物组合物的形式给药，组合物中的比例和性质由选择的药物组合物的溶解度和化学性质，选择的给药途径，以及标准的制药实践决定。本发明的胆碱酯酶，可以以单体给药，也可以以混合物给药。在另一个具体例中，本发明还提供了包括治疗有效量的胆碱酯酶与一种或多种可以药用的载体或赋形剂混合或联合的药物组合物。该药物组合物按照药学文献中的己知方法制备。使用的载体或赋形剂可以是固体、半固体或液体物料，这些物料作为活性成分的载体或介质起作用。适宜的载体或赋形剂为文献已知。该药物组合物适合于局部给药，也适合于全身给药，包括口服、吸入和非肠道给药，并可以釆用胶囊、气雾剂、喷雾剂、吸入剂、栓剂、凝胶剂、溶液剂、悬浮剂以及类似的剂型给药。本发明的药物组合物可以口服给药，例如与可使用的载体一块服用。它们可装入胶囊或为了达到治疗的目的，这类药物组合物可以与赋形剂配方，以胶囊，悬浮剂，糖浆剂，薄荷糖，口香糖，木糖醇口含片等类似的剂型使用。这些制剂中至少应含千万分之一酶比活力折算为l，000的本发明的酶为活性组分，不过根据特定的剂型，活性成分的含量可以100%-300%之间变化。本发明的酶在组合物中的含量应以能够获得适合的剂量为宜。本发明的优选的组合物和制剂由专业人员确定。为了达到非肠道给药的目的，本发明的药物组合物可制成溶液或悬浮剂。本发明的药物组合物亦可以吸入剂，例如气雾剂或干粉的形态使用，通过液化气或压縮气或泵系统可以释放本发明的药物组合物。用于吸入给药的优选的气雾剂和干粉剂型可由专业人员确定。本发明的药物组合物还可以局部给药，这样给药时可以适宜地包括溶液、糖类、脂质体等赋形剂。非肠道制剂可以放入安瓿中，可分散的注射器中或玻璃或塑料制作的多次剂量的小瓶中。为更好地理解本发明的实质，以下用生物化学实验来说明胆碱酯酶水解P物质在内的速激肽的活性，用药理实验来说明胆碱酯酶的制药用途。应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。实施例1水解SP试验用市场上用作酶抑制法检测农药残留的丁酰胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶分别做水解P物质试验。反应及检测条件一.所用胆碱酯酶(1)丁酰胆碱酯酶，比活力200U冻干粉50mg以5ml含铁离子水(F"含量lmg/L)溶解，10000转离心4分钟；(2)丁酰胆碱酯酶，比活力200U冻干粉50mg以5ml双蒸水溶解，10000转离心4分钟；(3)乙酰胆碱酯酶，比活力300U冻干粉20mg以lml双蒸水溶解，10000转离心4分钟。二.底物SP纯度98%,水溶液浓度0.5ug/ml。三.反应底物+酶100ul+100ul，反应初始温度22"。四.检测飞行质谱法，基质CHCA+反应物，lul+lul，混合直接进行质谱测定。参考图1图5，分别为含铁离子丁酰胆碱酯酶水溶液水解SP反应0、25、60、120、180分钟时取样质谱分析的质谱图。由质谱图可以看出，在25分钟时检测到分子量为1217的产物，其为SP(分子量1348)肽链被切去Met(分子量131)的片断，在60分钟时检测到新增产物分别是分子量为1104及分子量为900的两个片断，他们分别是SP肽链被切去了Met+Leu(分子量113)和Met+Leu+Gly(分子量57)+Phe(分子量147)。参考图6图9，分别为丁酰胆碱酯酶双蒸水溶液水解SP反应O、25、60、180分钟时取样质谱分析的质谱图。由质谱图可以看出，在25分钟出现分子量分别为1217、1104产物，它们分别是SP肽链(分子量1348)被切去Met(分子量13U、Met+Leu(分子量113)的片段。图8与图3中图谱相似，只是前者中分子量为1104的产物稍多。参考图10-图15，分别为乙酰胆碱酯酶水解SP反应O、2、4、6、8和30分钟时取样分析的质谱图。底物SP在乙酰胆碱酯酶的作用下，位于C端的Metll迅速地被水解，最先出现的酶切点是Leu"'-Met11,其后是Gly9-leu"';Phe7-Phe8，最后只留下1一5肽段。由此，确定无论是乙酰胆碱酯酶还是丁酰胆碱酯酶，均具有水解P物质的能力，且第一酶切点均在SP的C端的LeiT和Met"之间；其后的酶切点在Gl/和Leu"'和Phe7ph^之以及Gli^Gln6之间。而我们知道，SP的C端六个氨基酸中任何一个氨基酸被置换或被切去，SP的活性都基本丧失。实施例2制备乙酰胆碱酯酶水溶液采用SIGMA公司生产的乙酰胆碱酯酶冻干粉，加水溶解，同时加入稳定剂丙二醇、抗菌剂苯酚，按照每毫升溶液含乙酰胆碱酯酶酶活力从10到1000U分若干数量级，根据使用方式，分别装入一次性注射器、喷雾瓶或其它可医用的小瓶，冷藏保存。存期可达1年，用时可直接施用或按治疗要求再稀释。活力测定1、理论依据依据Ellman法碘化硫代乙酰胆碱(BTCI)在胆碱酯酶(AChE)作用下，被水解成硫代胆碱和乙酸，硫代胆碱可与二硫对硝基苯甲酸(DTNB)反应生成黄色产物，该产物在紫外波长405nm处有最大吸收峰，因此可在此波长下进行比色测定。2、试剂配制a磷酸缓冲液用0.lmol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液以适当比例混合，pH8.0。b胆碱酯酶液根据酶活性情况按要求用磷酸缓冲液溶解，A值控制在0.4、.8之间。c碘化硫代乙酰胆碱(BTCI)溶液取100mgBTCI溶于10ml上述pH8.0磷酸缓冲液中。d二硫对硝基苯甲酸(DTNB)溶液取60mgDTNB溶于10ml上述磷酸缓冲液中。3、测定步骤取A、B两支试管，分别加入0.lmol/L.pH8.0磷酸缓冲液3.Oml，加入胆碱酯酶酶液50W和二硫对硝基苯甲酸(DTNB)溶液50W，置于37C水浴中保温15min后于A试管中加入0.lmpl/LpH8.0磷酸缓冲液，作为标准调零；B试管加入50W碘化硫代乙酰胆碱(BTCI)溶液，混匀后立即倒入玻璃比色杯中比色，记录3分钟前后的0D值，每一酶液重复测定三次，取平均值(A0D412)进行分析。酶活力为U二A0D412/0.0136*T，其中T为反应时间，T=3(分钟)。酶粉中的蛋白含量，可参照Bradford考马斯亮蓝G-250(CBBG-250)染色酶比活力=酶活力(U)/毫克蛋白质。实施例3水溶液剂2水溶液1加入丙二醇5%、月桂氮卓酮0.5%作为促渗剂，配合离子导入法或超声波法等透皮吸收方法，作皮外使用。实施例4水溶液甘油剂按照水溶液l的配置方法，将其中的部分水置换为甘油，甘油所占比重可从20%到70%不等，制成不同使用场合的剂型，分别装入小瓶，冷藏或常温保存。常温可保存6个月。实施例5水凝胶剂聚丙烯酸即卡波姆0.8%，甘油23%，两者充分研磨使湿润，加水适量，按水溶液1的配置比例加入酶粉，慢速搅拌均匀即可。主要用于皮肤涂敷。实施例6对小鼠醋酸扭体法的镇痛作用实验(一)材料和试剂1.药品醋酸，由广东新宁化工厂生产；参照实施例2中的方法制得的每毫升溶液含酶活力200U的丁酰胆碱酯酶水溶液；芬必得擦剂(布洛芬)，由中美史克生产，产品批号04050471。2.动物昆明小鼠，40只，体重20士2克，雌雄兼用。(二)方法1.分组生理盐水组(阴性对照组)；实验1组，用丁酰胆碱酯酶水溶液涂药实验2组，用丁酰胆碱酯酶水溶液腹腔注射芬必得组(阳性对照组)2.实验操作将40只昆明小鼠随机分组，每组10只；阴性对照组腹腔注射0.9%生理盐水0.1ml/10g;实验l组先在背部剪毛，剪成lxlcm，并涂每毫升溶液含酶比活力200U/毫克蛋白质的丁酰胆碱酯酶水溶液；实验2组腹腔注射每毫升溶液含酶比活力200U/毫克蛋白质的丁酰胆碱酯酶水溶液0.1ml/10g;阳性对照组先在背部剪毛，剪成lxlcm，并涂上芬必得。每组小鼠分笼饲养，给药5分钟后，参照《药理实验方法学》(第三版，徐叔云等主编，人民卫生出版社，2002，l)记载的方法，每只小鼠腹腔注射0.6n/。醋酸0.1ml/10g，记录15分钟内小鼠扭体的次数，与0.9%生理盐水组比较，并计算小鼠扭体反应抑制率。(三)结果见表l表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注与生理盐水组比较求P〈0.05;与芬必得组比较AP〈0.05。从表1看出，丁酰胆碱酯酶水溶液无论是腹腔注射还是皮肤涂擦，与生理盐水组比较，均明显降低醋酸腹腔注射后所致小鼠的扭体次数(P〈0.05);与阳性抗炎镇痛药物芬必得相比，丁酰胆碱酯酶水溶液也有较明显的作用优势(实验腹腔注射组比芬必得组，(P<0.05);对小鼠扭体反应抑制率丁酰胆碱酯酶水溶液明显高于芬必得组。提示丁酰胆碱酯酶水溶液对小鼠醋酸扭体法的急性疼痛反应具有良好的镇痛作用。实施例7对大鼠免疫佐剂性关节上的消炎作用实验(一)材料与试剂1.药品参照实施例2中的方法制得的每毫升溶液含酶活力300U的丁酰胆碱酯酶水溶液；芬必得(布洛芬)由中美史克生产(批号04050471)。2.动物Wister大鼠，30只，体重200土20克，雌雄兼用，由中山大学实验动物中心提供。(二)方祛1.分组-阴性对照组实验组芬必得组2.实验操作将Wister大鼠随机分成3组，每组10只；参照《药理实验方法学》(第三版，徐叔云等主编，人民卫生出版社，2002，1)记载的方法，每组动物在给药前进行右后足跖皮内注射弗氏佐剂(FCA)O.lml/只，致炎0.5h后，实验组、芬必得组分别在致炎处(右后跖皮肤)所列的丁酰胆碱酯酶水溶液和芬必得，每天一次，连续给药一周，并在2h、6h、12h、24h、48h、72h、7天用游标卡尺测右后跖的肿胀度。(三)结果见表2表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>注与生理盐水组比较承P〈0.05从表2看出，丁酰胆碱酯酶水溶液在用药后48h、72h、7天与阴性对照组比，有较明显的减轻大鼠佐剂性关节炎的关节肿胀度的作用(P〈0.05)，与阳性对照药物作用接近。提示丁酰胆碱酯酶水溶液有较好地减轻炎性肿胀的作用。实施例8创伤及其炎症的预防和治疗喷雾瓶装乙酰胆碱酯酶(酶活力300U)水溶液1至3喷，直接喷在创口，另用同药喷湿创口面积同样大小纱布，覆盖在创伤处(如不需作保护可不用)。患者创伤及炎症状况不同，反应各不相同，但均明显见效。如伤口未发炎者，疼痛消失，再未发炎，伤口自然收复，一周后死皮开始脱落；已出现炎症者，疼痛消失，炎症不再进展，三天后，自然收复明显可见。这类患者有外伤、烧伤、烫伤。实施例9牙龈炎患者牙龈红肿、疼痛，消毒棉用乙酰胆碱酯酶(酶活力300U)水溶液浸湿，放置患部10分钟，当即疼痛消失，每日一至二次，两天后炎肿消失，无复发，无副作用。实施例10足癣乙酰胆碱酯酶(酶活力300U)水溶液2毫升，加40度以下温水2升置盆中轻微搅动，患者足部浸入其中30分钟，早晚各一次，连续三天，患者疼痛即消，一周后癣斑、气味等体征均消失。实施例11过敏性鼻炎喷雾瓶装乙酰胆碱酯酶(酶活力300U)水溶液甘油剂按常规喷鼻法喷鼻，每日三至五次，每次一喷，一周为l个疗程，随访一个月，多数患者鼻塞、喷嚏、流清涕、鼻痒等症状消失，不再发作。检査下鼻甲不大，鼻腔粘膜色淡红，鼻腔清洁，无水样分泌物。实施例12感冒感冒初患，喷雾瓶装丁酰胆碱酯酶(酶活力200U)水溶液甘油剂按常规喷鼻法喷鼻，每日三至五次，每次一喷，l个小时内，头疼、发热症状消失，三天后，其它症状消失，精神状态恢复正常。实施例13夏季腹泻夏天，饮食稍不注意，即容易发生肠胃失调，出现腹泻症状，丁酰胆碱酯酶(酶活力200U)水溶液0.5毫升，滴入3毫升凉开水，含入口中，其间稍轻微鼓漱，5至10分钟后吞下，间隔两小时，连续三次，患者当天腹泻次数即大为减少，有的完全消失，有的腹泻一、二次后不再出现。权利要求1.胆碱酯酶在治疗或预防哺乳动物包括人体内由速激肽介导的病症的药物中的应用，所述的病症包括疼痛、炎症、中枢神经系统疾病、呼吸系统疾病、胃肠紊乱和胃肠道疾病、过敏、神经病理学疾病、与免疫增进或抑制有关的疾病以及风湿病、皮肤病和慢性疲劳综合症。2.根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述胆碱酯酶为单体或混合物。3.根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述胆碱酯酶选自乙酰胆碱酯酶；丁酰胆碱酯酶；乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶的同工酶及衍生物；乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶的基因重组物。4.根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述胆碱酯酶为从动植物细胞、组织或血液提取纯化或通过基因重组从表达载体分离纯化得到的、以乙酰胆碱或丁酰胆碱为底物作酶活检测具有胆碱酯酶活性的非均一状态粗提物。5.根据权利要求l所述的应用，其特征在于治疗或预防作用是通过所述胆碱酯酶首先在C-端Leu-Met位点及C端多位点水解包括P物质在内的速激肽使其失去原有药理生物活性或受体结合能力因而降低速激肽介导的免疫调节作用或神经传导作用而实现或促进实现的。6.根据权利要求24任一项所述的应用，其特征在于胆碱酯酶剂量范围为0.01微克至1毫克。7.—种治疗或预防哺乳动物体内由速激肽介导的病症的药物组合物，包括治疗或预防所述病症有效量的如权利要求2或3或4所述的至少其中之一的胆碱酯酶以及可药用载体。8.—种拮抗哺乳动物体内速激肽作用的药物制剂，包括如权利要求7所述的药物组合物及药学上可接受的赋形剂。9.一种制备权利要求8的药物制剂的方法，其特征在于将药学上可接受的赋形剂与如权利要求7所述的药物组合物混合均匀。全文摘要本发明属于生物制药
技术领域：
，公开胆碱酯酶的制药应用。胆碱酯酶在治疗或预防哺乳动物包括人体内由速激肽介导的病症的药物中的应用，所述的病症包括疼痛、炎症、中枢神经系统疾病、呼吸系统疾病、胃肠紊乱和胃肠道疾病、过敏、神经病理学疾病、与免疫增进或抑制有关的疾病以及风湿病、皮肤病和慢性疲劳综合症。胆碱酯酶用于药物中，为由于体内过量P物质等速激肽引发病理生理变化的人群，提供一种有效的、副作用小的治疗手段。由于本发明的胆碱酯酶可以是乙酰胆碱酯酶、或丁酰胆碱酯酶及它们的同工酶、或它们的衍生物，它们可以来源于动物的细胞、组织或血液，也可以来源于植物及通过基因重组的方法得到，来源广泛，不需要高度提纯，适宜产业化。文档编号A61K38/46GK101190330SQ20061015732公开日2008年6月4日申请日期2006年11月30日优先权日2006年11月30日发明者徐汉虹,陶国良申请人:深圳市鼎兴生物医药技术开发有限公司;华南农业大学;陶国良