口服施用的活减毒轮状病毒疫苗的制作方法

专利名称：：口服施用的活减毒轮状病毒疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及可用作药物组合物和疫苗的新型液体轮状病毒配方，制备它们的方法以及它们在预防轮状病毒，特别是人类轮状病毒相关疾病中的用途。
背景技术：
：急性传染性腹泻是世界上许多地方造成疾病和死亡的主要原因。在发展中国家，腹泻性疾病的影响是非常重要的。对于亚洲、非洲和拉丁美洲，估计每年有30-40亿腹泻病例，并且这些病例中约500-1000万最终死亡(Walsh,J.A.etal.:N.Engl.J.Med.，301:967-974(1979))。轮状病毒已被认为是嬰儿和幼儿严重腹泻的最重要的原因之一(Estes,M.K.RotavirusesandTheirReplicationinFieldsVirology,ThirdEdition,editedbyFieldsetal.，RavenPublishers,Philadelphia,1996)。估计轮状病毒疾病每年造成600000以上的人死亡。轮状病毒诱发的疾病最常见地感染6至24月龄的儿童，并且该疾病的流行高峰通常在温带气候地区发生于较冷的几个月，在热带地区常年发生。轮状病毒通常通过排泄物-口腔途径以约1至约3天的潜伏期在人与人之间传播。与6月至24月龄组感染不同，新生儿通常无症状或仅有轻度的疾病。与幼儿常见的严重疾病相比，大多数成人因以前轮状病毒感染而被保护，因此大多数成人感染是轻度的或者无症状(Offit，P.A.etal.Comp.Ther.,8(8):21-26，1982)。轮状病毒是球状的，并且其名称来自于其特征性的外部和内部或者双层衣壳结构。通常，轮状病毒的该双层衣壳结构包围着含有基因组的内部蛋白壳或核。轮状病毒的基因组由双链RNA的11个片段组成，该双链RNA编码了至少11种不同的病毒蛋白质。这些病毒蛋白质中命名为VP4(P蛋白)和VP7(G蛋白)的两种是排列在双层衣壳结构外部的结构蛋白。轮状病毒的内衣壳存在一种蛋白质，其为命名为VP6的轮状病毒蛋白。这三种特定的轮状病毒蛋白在引导轮状病毒感染之后的免疫应答中的相对重要性仍不清楚。然而，VP6蛋白决定了群和亚群抗原，并且VP4和VP7蛋白是血清型特异性的决定子。迄今为止，至少14种轮状病毒G血清型和ll种轮状病毒P血清型已被鉴别(LinharesA.C.&BresseJ.S.,Pan.Am.J.Publ.Health2000，9，305-330)。其中，已经鉴别10种G血清型和6种P血清型是在人类轮状病毒中。VP7蛋白是一种38,000MW的糖蛋白(当非糖基化时为34,000MW),其为取决于菌抹的基因组片段7、8或9的翻译产物。该蛋白刺激轮状病毒感染之后的大部分中和抗体的形成。VP4蛋白是一种大约88,000MW的非糖基化蛋白，其为基因组片段4的翻译产物。该蛋白还刺激轮状病毒感染之后的中和抗体。由于VP4和VP7蛋白是中和抗体所对准的病毒蛋白质，它们被认为是轮状病毒疫苗开发的主要备选者，其提供保护作用以防止轮状病毒疾病。已知在幼童时期天然的轮状病毒感染会引发保护性免疫。早期的预防轮状病毒感染的疫苗开发始于病毒发现后的1970s年代。最初，研究了来自动物和人类的减毒林，同时，更多最新成果集中于入类-动#勿重酉己才朱(reassortants)。新型轮状病毒配方的开发应当符合多种要求，包括世界范围内的分发的可能性和在宽范围的环境和贮藏条件下的稳定性。特别地，配方，尤其是药物或疫苗组合物的稳定性，一般地在较低温度下比之于在室温或更高温度下更好。因此，已有一种稳定方法，以开发可冷冻贮存(-2(TC至-7(TC)的疫苗配方，或者另选的开发可在冷藏设备温度附近(2。C至8。C)保持一延长时间的冻干疫苗。然而，已知的事实是，冷冻干燥操作具有一有限的能力，并且伴有高生产成本。此外，由于它们可能要求更复杂，冻干疫苗具有更复杂的用于施用的处理程序，因此相对昂贵的装置例如多室/瓶的疫苗，其活性成分在一室中，重构(reconstitution)液体在另一室中。冻千疫苗还伴有较高的运输和贮藏费用。这些要求对于某些发展中国家是不合适的，在这些地方施用装置成了财政担负，生产和贮藏基础设施的可得性可能是不存在的或可用性是不可靠的。由于轮状病毒是常规地被口服施用于人类婴儿，该途径给免疫原性轮状病毒组合物带来诸多挑战。轮状病毒在酸性环境中迅速失活，例如暴露于酸性緩冲溶液或者酸性胃液(C.WeissandH.F.Clark,1985,J.Gen.Virol.，66，2725-2730;T.Vesikarietal,，1984，TheLancet，page700;R.H.FosterandA丄Wagstaff,1998,BioDrugsFeb:9(2)155-178)。因此，以下述方式配制轮状病毒组合物是令人期望的，即该组合物在贮藏期间以及施用于宿主受试者后是稳定的。轮状病毒疫苗主要欲施用于早至4周龄的小孩。小的疫苗剂量体积，例如低于2ml或者甚至低于1.5ml的剂量体积对于该群体是有利的。因此，将轮状病毒组合物配制成小的剂量体积是令人期望的。液体病毒疫苗的稳定配方是已知的。例如，EP0065905—般性地公开了适合于一系列病毒例如引起麻渗或流感的那些病毒的稳定组合物，并且特别地，它公开了适合于活减毒病毒的稳定的含有磷酸盐緩沖液的溶液。另一稳定配方7>开于WO98/13065和Clark等(PediatrInfectDisJ.2003Oct;22(10):914-20)中。在其它组分当中，磷酸盐存在以发挥中和胃酸的緩冲剂作用的配方也是需要的。然而这些配方与上述关于成功开发轮状病毒配方的需要不相符，特别是它们与减小的疫苗剂量体积不适合，而该疫苗剂量体积又是最适合于人类嬰儿。特别地，本发明人发现，使该现有技术配方适应低体积的设定例如1.5ml或更低，同时维持有效的抗酸能力，引起由配方组成特别是磷酸盐緩沖剂的浓度不当而产生的问题。因此需要开发另外的轮状病毒配方，特别是另外的可经受住胃酸的液体配方，并且是在冷藏设备中稳定的，尽管不存在磷酸盐。另外需要该另选的配方还要成功地配制成尽可能小的疫苗剂量体积。因此，本发明不仅提供了另选的稳定的免疫原性组合物，其没有磷酸盐，或者仅含有最小量的磷酸盐，而且也可使轮状病毒配制成适合于口服施用于人类婴儿的低的剂量体积。图1-四种歡酸盐的标准酸石威滴定曲线。图2A-含有各种己二酸盐的配方的抗酸能力。图2B-BabyRossett-Rice测定法的试验装置。图3-含有己二酸盐的配方的折光率。图3A显示在己二酸盐緩冲溶液步骤目标值为蔗糖58.5%w/w,其在混合物中产生1.4W8的折光率。图3B显示在最终配方步骤目标值为蔗糖55。/。w/w，其产生1.4480的折光率。图4-II期临床研究设计概况。发明说明相应地，本发明的第一方面，提供了一种适合口服施用于人类婴儿的液体轮状病毒免疫原性组合物，包括轮状病毒抗原、糖类和羧酸盐，其中所述组合物具有约pH5.0至约pH8.0的pH，并且包括低于5mM磷酸盐。在要求专利保护的组合物中适合的磷酸盐浓度不超过lmM。在本发明具体的方面，适合的疫苗剂量一般地为1.5ml,或者适合的任何低于2.5ml的体积例如2ml或更低的体积，该体积适合于口服施用于小孩或婴儿。特别地，该剂量体积将是这样的，即配方的技术可行性是可能的，并且对配方的免疫原性能力没有有害的影响。所要求专利经受胃酸、保持免疫原性并且在长的贮藏期保持稳定，同时适合于剂量体积小于平常例如小于2.0ml的配方，或者甚至适合于1.5ml或更小的剂量体积。在一个具体的实施方案中，根据本发明的该液体免疫原性组合物具有6至23分钟的抗酸能力，其通过BabyRossett-Rice测定法(在实施例III.2.2中详述，其由基本的Rossett-Rice试验修改而得)评定。适合的抗酸能力是至少8分钟，通常至少12分钟，并且适合的范围是12至20分钟。令人惊讶的是，与含有磷酸盐的现有技术配方相比，所要求专利保护的组合物显示不但是可接受的而且即使在较小剂量体积下也具有较高抗酸能力。另一方面，提供了一种制备所述液体轮状病毒免疫原性组合物的方法，包括将轮状病毒抗原、糖类和羧酸盐与药学可接受的稀释剂混合。本发明还涵盖了另一方面，即，轮状病毒抗原与羧酸盐和糖类的混合物在制备用于预防或治疗人类轮状病毒相关疾病的口服免疫原性组合物中的用途，其中所述组合物不含有高于5mM磷酸盐，并且具有约pH5.0至约pH8.0的pH。在更进一步的方面，还提供了通过向需要的人受试者施用有效量的所述液体免疫原性组合物以预防或治疗人类轮状病毒相关疾病的方法。本发明其它的方面和益处在下文优选实施方案的详细描述中作进一步描述。发明详述本发明人开发了免疫原性的、在冷藏设备温度(2至7°C,通常在4。C)下稳定的新型液体轮状病毒组合物，当口服施用时该组合物能经受胃的内在酸性状态，并且适合于小的剂量体积。液体组合物意指液体形式的配方，这相对于千燥形式。其体积在恒定的特定条件下是固定的(例如，在室温或冷藏设备温度下，在大气压力下)，并且其形状取决于其填充的容器。在本说明书中提及的出版物和专利或专利申请中所公开的主题和信息通过引用并入本文。本文术语'包括，在每一种情况下意在任选地与术语'由…组成，互换。本发明提供了一种液体轮状病毒免疫原性组合物，包括轮状病毒抗原、糖类和羧酸盐，其中所述组合物具有约pH5.0至约pH8.0的pH，并且包括低于5mM磷酸盐。当与含有磷酸盐的配方相比时，本发明的组合物显示出非常好的稳定状况，同时保持着免疫原性状况。这些组合物至少与其含有磷酸盐的对应物一样稳定。本发明组合物的进一步优点是它们可以制备成小的剂量体积，例如比2.0ml低，例如通常为1.5ml,这是与存在磷酸盐的现有技术配方相比而言的。在一个具体的实施方案中，在该免疫原性组合物中的磷酸盐浓度不超过5mM，适合的为lmM,特别地它不超过0.5mM。磷酸盐是指磷酸(还称为正磷酸(H3P04))的盐，通常使用钠盐或钾盐或钠盐和钾盐的混合物(例如Na3P04、Na2HP04、NaH2P04、K3P04、K2HP04、KH2P04)。适合的，磷酸盐浓度为0.4mM或以下，通常为0.2mM或以下，理想的为O.lmM或以下。在另一具体的实施方案中，本文要求专利保护的该组合物是无磷酸盐的。通常的磷酸盐，当存在时，来自细胞培养基或者用作稀释剂的盐水緩冲溶液，例如DMEM(Dulbecco，s改良Eagle培养基)、EagleBME基础培养基或PBS。本说明书全文所指的磷酸盐浓度是一种计算的浓度，其根据在制备所要求专利保护的组合物操作中含有磷酸盐的化学药品的量确定。或者本文要求专利保护的该组合物中出现的该磷酸盐浓度可以使用分析操作技术试验性地测定。一种适合的4支术是称为'Nanocolor，的比色测定，其由Macherey-Nagel上市(目录编号n°91878)。该方法基于由磷酸-钼酸盐-钒酸盐在酸溶液中形成黄色复合物的光度测定。该测定法的定量限度为2|ig/ml磷酸盐或0.02mM。一种另选方法是通过原子发射光谱法技术例如电感偶合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)(Boss&Fredeen,inConcepts,Instrumentation,andTechniquesinInductivelyCoupledPlasmaOpticalEmissionSpectroscopy,PerkinElmer编,第二版,1997國见Methodology第72页前)定磷(P)的量。该测定法的定量限度为0.030(ag/ml磷，相当于0.00032mM磷酸盐浓度。在一种实施方案中，该组合物的pH为pH5.0至pH8.0。在另一具体的实施方案中，所要求专利保护的组合物的pH为约pH5.5至约pH7.5。'约pH，表示在所述pH值的0.2单位范围内。特别地，该组合物的pH值为pH5.5至pH7.5。例如，该组合物的pH值为约pH6.0至约pH7.0，特别是pH6.0至pH7.0,通常为pH6.2至pH6.8或者为pH6.2至pH6.6。期望约6.4的pH,特别是6.4。已经知道，轮状病毒在酸性pH下是受负面影响的，例如4.0以下pH,并且预期最大稳定性是在中性或甚至微碱性pH下获得的，即7.0至8.0的pH范围，这是例如在现有技术的磷酸盐緩沖配方中获得的。如试验部分所示，本发明的组合物，尽管无磷酸盐，它在所要求的pH范围内显示出良好的稳定状况，并且还令人惊讶地显示，甚至在稍酸性条件下也具有可接受的稳定性和免疫原性特性，即约pH6.0至7.0，例如在约6.4的pH下。本文要求专利保护的液体组合物包含羧酸盐。该羧酸根"(-COCT")是酸性官能团("-COOH")经碱性物质中和而生成的羧酸的解离形式。羧酸是一种含有羧基"-COOH"的化合物；其形式上由羰基("-CO-")和羟基("-OH"组合而成。然而，这两部分的相互作用而改变其化学性质，以致整个基团被认为是一个新的具有自身特征性能的官能团(OrganicChemistrybyJ.B.Hendrickson，D.J.Cram和G.S.Hammond,McGraw-HillBookCompany,第三版，1970，第131页)。尽管国际纯粹和应用化学联合会(IUPAC)推荐使用链烷酸(对于一元羧酸类而言)和链烷二酸(对于二元羧酸类而言)的名称，但大多数的羧酸类的俗名被用于本文，原因是这些产物是本领域熟练技术人员公知的。例如乙酸的IUPAC名称是乙烷酸，而己二酸称为己烷二酸。在一个具体的实施方案中，使用了来自无机酸的或者适当地来自有机酸的羧酸盐。在一个具体的实施方案中，所述羧酸盐是从弱酸得到的。例如，所述羧酸盐是一种选自己二酸盐、枸橼酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、丙酸盐、丁酸盐、丙二酸盐、戊二酸盐、马来酸盐、羟乙酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、庚二酸盐和其两种或多种的任意组合的羧酸盐。适合的羧酸盐是由具有pKa>4的羧酸得到的羧酸盐或者由具有数均pKa〉4的二-或三-羧酸(二-或三-羧酸盐)(表9)得到的羧酸盐。前面类别的实例包括由丙酸、丁酸或乙酸得到的羧酸盐。后面类别的实例包括由枸橼酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、己二酸、戊二酸和苹果酸得到的羧酸盐。在一个具体的实施方案中，所述羧酸盐属于GRAS名录，即为'美国食品药品管理局公认安全，的羧酸盐，并且选自该名录的包括乙酸盐，丙酸盐，苹果酸盐，戊二酸盐，己二酸盐，乳酸盐，富马酸盐和酒石酸盐。适合的羧酸盐是己二酸的盐，即己二酸的单钠盐、己二酸的单钾盐，适合的己二酸二钠或己二酸二钾或己二酸4丐。在一个具体的实施方案中，50mM至2M的羧酸盐浓度适合用于该液体轮状病毒组合物。可以理解，通过常规试验，根据羧酸盐的性质、要达到的抗酸能力和疫苗剂量体积，上述范围内的羧酸盐浓度可以适当地采用。例如，当要求高抗酸能力时可以使用超过1M以上的高羧酸盐浓度，例如由BabyRossettRice试验对1.5ml剂量体积评价超过8分钟、适合地超过10分钟或超过12分钟。1M或以下的浓度是常用的，例如100mM至1M的浓度，通常为200mM至800mM的浓度。适合的羧酸盐浓度包括约300mM至约800mM,适合的为400mM至700mM。特别是，当该羧酸盐是己二酸盐时，适合的浓度范围是400至500mM。然而，熟练技术人员公认，规定值的10-20%之间的浓度是适合的，即当规定为100mM时，80-90mM至110-120mM范围内也是被公开的，并且表示被涵盖的。对于各种羧酸盐，示例性的浓度见以下表l。表1-在具体浓度下羧酸盐的抗酸能力这些示例性参数是以1.Sml剂量体积给出的，并且与表1所给的所述实施例编号相符。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*通过根据实施例III.2.2的经修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价。本文要求专利保护的液体轮状病毒免疫原性组合物的pH可通过将羧酸与羧酸盐混合而得到。特别是，该羧酸可以与不同的羧酸盐混合使用，例如，枸橼酸盐与己二酸混合。当使用商业可得的化学品时这可能是有益的，所述化学品中的一些可能不容易得到，或者为了简化配方步骤而使用。例如，一种(或多种)所述羧酸可以选自己二酸、枸橼酸、苹果酸、乙酸、琥珀酸、碳酸、丙酸、丁酸、丙二酸、戊二酸、马来酸、羟乙酸、乳酸、葡萄糖酸、富马酸、酒石酸、庚二酸，并且是以适当比例与一种(或多种)选自己二酸盐、枸橼酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、丙酸盐、丁酸盐、丙二酸盐、戊二酸盐、马来酸盐、羟乙酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、庚二酸盐的羧酸盐类混合。本文要求专利保护的液体组合物包括糖。蔗糖特别适合。右旋糖是另一种适合的糖。其它糖类或糖醇类也可用于替代蔗糖或右旋糖，例如包括甘油、赤藓糖、赤藓醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、塔格糖(tagalose)、甘露糖、半乳糖、果糖、肌醇、山梨醇、甘露醇、半乳糖醇、葡萄糖和果糖混合物、麦芽糖、槐糖、乳糖、纤维二糖、蜜二糖、海藻糖、蔗糖、帕拉汀糖(palatinose)、麦芽酮糖(maltulose)、乳果糖、麦芽糖醇、拉克替醇、棉子糖、麦芽三糖、松三糖、纤维三糖、ciritol、麦芽四糖、水苏糖、纤维四糖、麦芽五糖、纤维五糖、麦芽六糖、纤维六糖、寡糖类。典型的糖浓度范围为约1%w/w至约70%w/w，例如约25%w/w至约60。/ow/w。然而，熟练技术人员/>认，糖的性质和浓度应当优化至确保令人满意的病毒生存力，同时保持粘度至与配制下游处理步骤例如过滤相适应的水平。在一个具体的实施方案中，使用蔗糖。通常，其浓度保持在30%w/w的最小值。此外可以使用更高的，即超过30Q/。w/w的蔗糖浓度以保证长期的贮藏，如所期望的，该配方的高等渗压可以防止细菌生长。相应地，在本文要求专利保护的液体组合物中，较低限度的蔗糖浓度适合的为30%w/w或更高，例如35y。w/w或更高，适合的为40Q/()w/w或更高。适合的蔗糖浓度范围为约40%w/w至约70%w/w。例如，适合的蔗糖浓度为45%w/w至60%w/w，适合的为50%w/w至55%w/w。特别地，使用约50%w/w或约55%w/w的浓度的蔗糖。50%w/w或55%w/w的最终蔗糖浓度是适合的。熟练技术人员理解，当另一种糖代替蔗糖时，为了确保病毒稳定性，可以进行糖浓度的常规优化。此外，考虑到配方/制备参数例如剂量体积，糖类的规定值可以稍微修改。因此，熟练技术人员公认，规定值的10%范围内的浓度是适当的，即当规定为50%w/w时，45%w/w-55%w/w的范围也是祐乂>开的，并且表示^皮涵盖的。本发明的液体轮状病毒免疫原性组合物还包括轮状病毒抗原。特别地，本文要求专利保护的液体组合物是一种免疫原性组合物，例如一种疫苗组合物。轮状病毒抗原被理解为表示任意的适用于疫苗配方的轮状病毒抗原。口服活轮状病毒抗原是特别考虑的。例如，任何适合的轮状病毒抗原可以选自来自动物或人类的活减毒轮状病毒，特别是人活减毒轮状病毒；重配抹轮状病毒，特别是但不限于人-人重配林轮状病毒、牛-人重配抹轮状病毒或恒河猴-人重配抹轮状病毒。所有的轮状病毒林，人或动物抹，均被本发明所考虑。人轮状病毒林是合适的。特别地，在一种实施方案中，轮状病毒抗原是减毒人轮状病毒种群，包括单一变异体或基本单一变异体，所述变异体是由编码至少一种主要的如WO01/12797公开中的命名为VP4和VP7的病毒蛋白质的核苷酸序列所确定的，特别是任意的包括一种或多种由wo01/12797的表2、表3.1和3.2中所述突变所确定的变异体。在具体的实施方案中，该轮状病毒抗原是以下任意的人活减毒轮状病毒林以登记编号ATCCVR2272保藏的HRV89-12C2林(如EP0557427中所述)、其子代、重配林及其免疫活性繁衍物；以登记编号ECACC99081301保藏的HRVP43株(如WO01/12797所述)、其子代、重配抹及其免疫活性繁衍物。具有上述保藏抹的任何特征的轮状病毒种群也是适合的疫苗抹。通过对所述林进一步处理例如使用活病毒进一步传代、克隆或其它操作而将其繁殖，或者以包括基因工程技术或重配林技术的任何方式通过修饰所述保藏抹，可以获得所述保藏抹的繁衍物。这些步骤和技术是本领域公知的。特别关注的轮状病毒抗原是所述保藏抹及其免疫活性繁衍物的任何子代。免疫活性繁衍物是指来自或用任何所述保藏抹获得的材料，特别是来自或用以登记编号ECACC99081301保藏的HRVP43林获得的，特别是该病毒的抗原类，当它注射到宿主动物时能够诱导免疫应答，该免疫应答反作用地抑制轮状病毒。从以上列举的保藏抹得到的材料也适用于轮状病毒抗原，并且包括蛋白和遗传物质。特别关注的是重配抹轮状病毒，其包括至少一种抗原或至少一个所述保藏林的任何一片段，例如重配林，其包括轮状病毒的强毒抹，在该强毒林中11基因组片段的一个或其一的部分被所述保藏抹的任何基因组片段或其部分替代。特别是，轮状病毒重配株，其中编码NSP4的片段或部分片段是所述保藏抹的任何片段或部分片段，该轮状病毒重配抹可能具有有用的性质。重配抹轮状病毒和制备它们的技术是公知的(Foster,R.H.和Wagstaff,A.J.TetravalentRotavirusVaccine,综述。ADISdrugevaluation,BioDrugs，Gev，9(2)，155-178，1998)。所要求专利保护的组合物的轮状病毒抗原可以根据常规制备技术制备。典型的轮状病毒抗原制品可以通过用于繁殖病毒或表达重组轮状病毒抗原的组织培养方法得到。供病毒生长的适合的细胞基底包括，例如狗肾细胞例如MDCK或来自MDCK、MDCK-样细胞克隆而来的细胞，猴肾细胞例如AGMK细胞包括特别适合的Vero细胞，猴肾起源的其它细胞系例如BSC-1、LLC-MK2和MA104,适合的猪细胞系，或者适合供疫苗目的的轮状病毒生产的任何其它哺乳动物细胞类型。适合的细胞基底还包括人类细胞，例如MRC-5细胞。适合的细胞基底不限于细胞系；例如也包括原代细胞。同样在本发明范围内的是上述保藏抹与其它轮状病毒变异体例如其它克隆变异体或其它重配林轮状病毒的混合物，或者保藏抹与其它病毒特别是其它减毒病毒的混合物。特别地，根据本发明的该组合物含有两种轮状病毒抗原。特别地，在该组合物中的一种抗原是以登记编号ECACC99081301保藏的HRVP43株，并且另一种抗原是其重配4朱繁衍物或其任何免疫活性繁衍物。包含在要求专利保护的组合物中的轮状病毒抗原可以是单价轮状病毒抹，即含有单一的轮状病毒林，或者是多价的，即含有至少两个或多个轮状病毒林。熟练技术人员理解，其它源自人或动物源的可容易得到的减毒株，其是能够从保藏机构获得的，它们也是适合的，并且可以用作所述保藏林的替代品。根据本发明，在1.5ml剂量体积中，适合的免疫原性组合物含有浓度105—106ffu/剂量(或以CCIDS0/剂量表示，相当于1055-1065)的轮状病毒抗原，特别是人减毒P43抹(如以登记编号ECACC99081301保藏的，见WO01/12797)、55。/o蔗糖w/w、己二酸二钠0.465M(相当于132.74mg/剂量)，并且具有约6.2至6.6的pH。对于该组合物，DMEM含量是60/。w/w，由此相当于低于O.lmM磷酸盐。根据本发明的组合物可进一步包括另外的抗酸成分例如无机抗酸剂，如氢氧化铝Al(OH)3和氢氧化镁Mg(OH)2。氢氧化铝是特别适合的。其它商业可得的适用于本发明的抗酸剂包括MylantaTM，其含有氢氧化铝和氬氧化镁。这些物质不溶于水，并且以混悬液给予。另一特别适合的可添加地用于本发明疫苗组合物的抗酸剂是不溶性无机盐碳酸4丐(CaC03)。典型的CaC03浓度例如是每疫苗剂量80mg。其它适合的水不溶性抗酸剂为碳酸镁、碳酸铝、磷酸铝、氢氧化铝和碳酸镁的混合物、碱式碳酸镁铝、氢氧化铝-碳酸镁-山梨醇-甘露醇、碳酸羟基铝钠、碳酸二羟铝钾、镁加铝、碳铝镁石、almagcit、硅酸镁铝水合物。根据本发明的免疫原性组合物可以另外包括药学适当的化合物和/或载体，特别是本领域已知适用于口服施用，特别是嬰儿适用的那些。所述载体包括并且不限于碳水化合物类、多元醇类、氨基酸类、氢氧化铝、氢氧化镁、羟基磷灰石、滑石粉、二氧化钛、氢氧化铁、硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、明胶、植物胨(vegetalpeptone)、苍耳烷、鹿角菜胶(caraghenane)、阿拉伯胶、B-环糊精。根据本发明的组合物可以另外包括钙离子，其已被建议用于稳定轮状病毒。粘稠剂可以另外被包括存在于本组合物中。可以使用的可能的粘稠剂包括假塑性赋形剂。适宜的粘稠剂包括丙二醇、阿拉伯胶、黄耆树胶、琼脂、藻酸盐、果胶、羧曱基纤维素钠(TylosesC)、曱基纤维素(MethocelsA、ViscotmnsMC、TyloseMH及MB)、羟丙基曱基纤维素(Klucels⑧)、羟丙基纤维素(MethocelsE和K、VicotransMPHC)、Carbopol、苍耳烷胶、Veegum⑧(硅酸镁铝)、Avicd⑧(约89%微晶纤维素和11%羧曱基纤维素钠)。苍耳烷胶或淀粉是特别适宜的粘稠剂，供根据本发明的液体组合物中添加使用。还有利的是在要求专利保护的组合物中包括基于脂类的载体，如病毒体或脂质体，水包油乳剂或载体颗粒。另选的或另外还有的例如那些在口服疫苗领域中已知的免疫刺激剂可包括在本组合物中。此类免疫刺激剂包括细菌毒素，尤其是以全毒素(整个分子)或仅以B链(CTB)形式存在的霍乱毒素(CT)和大肠杆菌的不耐热肠毒素(LT)。较天然LT更不可能转化为其活性形式的突变型LTs(mLTs)描述于WO96/06627、WO93/13202和US5,182,109中。根据本发明的组合物可进一步包括佐剂或免疫刺激剂，例如但不限于任何来源的去毒脂质A和脂质A的非毒性衍生物、皂苷类和其它能刺激TH1型应答的试剂。早已知道肠杆菌脂多糖(LPS)是有效的免疫系统刺激剂，尽管其在佐剂中的应用已由于其毒性作用而被减少。LPS的非毒性衍生物，单磷酰脂质A(MPL)，其通过从还原端葡糖胺除去核心碳水化合物基团和磷酸盐生成的，该单石粦酰脂质A已由Ribi等进行了描述(1986,ImmunologyandImmunopharmacologyofbacterialendotoxins,PlenumPubl.Corp.,NY，p407-419),并具有下列结构另一种MPL的去毒形式是由从二糖骨架3-位除去酰基链产生的，并被称为3-0-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。其可通过GB2122204B中教导的方法纯化和制备，上述参考专利也公开了二磷酰脂质A及其3-O-脱酰变异体的制备。3D-MPL的适宜形式是具有直径小于0.2pm小颗粒尺寸的乳剂形式，并且其制备方法描述于WO94/21292中。包括单磷酰脂质A和表面活性剂的水性组合物已描述于WO9843670A2中。配制在本发明组合物中的细菌脂多糖衍生的佐剂可以是从细菌来源纯化和处理的，或其可以是合成的。例如，纯化的单磷酰脂质A由Ribi等1986(同上)描述，并且得自Salmonellasp的3-0-脱酰单磷酰或二磷酰脂质A描述于GB2220211和US4912094中。其它纯化的和合成的脂多糖类已被描述(Hilgers等，1986,Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4):392國6;Hilgers等，1987，Immunology,60(1):141-6;和EP0549074B1)。特别适宜的细菌脂多糖佐剂是3D-MPL。相应地，可用于本发明的LPS衍生物是那些与LPS或MPL或3D-MPL结构相似的免疫刺激剂。在本发明的另一方面，LPS衍生物可以是酰化的单糖，其是上述MPL结构的亚部分。合成的脂质A的衍生物是已知的，包括但不限于€^174(2-脱氧-6-0-[2-脱氧-2-[(11)-3-十二烷酰氧基四-癸酰氨基]-4-o-膦酰基-P-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-a-D-吡喃葡萄糖基二氢磷酸酯)，(WO95/14026)。OM294DP(3S，9R)-3—[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]癸-l,10-二醇，l,10-二(二氢磷酸酯)(W099/64301和WO00/0462)。OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]画4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]癸-l,10-二醇,l-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO01/46127)。作为口服佐剂的纯化的皂苷类描述于WO98/56415中。皂苷类和单磷酰脂质A可以单独或组合使用(例如WO94/00153)，并且可以与其它成分配制在佐剂系统中。3D-MPL是一种由RibiImmunochem,Montana制备的公知的佐剂，该佐剂的制备描述于GB2122204中。用于本发明的另一优选的免疫刺激剂是QuilA皂苷及其衍生物。皂苦类教导于Lacaille-Dubois,M和WagnerH.(1996.Areviewofthebiologicalandpharmacologicalactivitiesofsaponins.Phytomedicinevol2pp363-386)中。皂苷类是广泛分布于植物和海洋动物界的甾类化合物或三萜苷。皂苷类以其在水中形成摇动起泡的胶体溶液，以及沉淀胆固醇而被注意。当皂苷类接近细胞膜时，它们在膜上产生了孔状结构，引起膜破裂。红细胞的溶血是这一现象的实例，这是某些但不是全部皂苷类的性质。皂苷类在供全身施用的疫苗中作为佐剂是已知的。个别皂苷类的佐剂和溶血活性已在本领域中作了深入研究(Lacaille-Dubois和Wagner，同上)。例如，QuilA(由南美树QuillajaSaponariaMolina的树皮得到)及其级分已描述于US5,057,540和"saponinsasvaccineadjuvants",Kensil,C.R.,CritRevTherDrugCarrierSyst,1996，12(1-2):1國55;以及EP0362279B1。包括QuilA的级分的、称为免疫刺激复合物(ISCOMS)的微粒结构是溶血性的，并已被用于疫苗的制备(Morein，B.，EP0109942Bl;WO96/11711;WO96/33739)。该溶血性急苦类QS21和QS17(HPLC纯化的QuilA级分)已被描述为有效的全身佐剂，并且它们的制备方法公开于美国专利No5,057,540和EP0362279B1中。QS-21是一种由QuillajasaponariaMolina的树皮得到的天然的急苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)、Thl细胞和特优种IgG2a抗体应答，并且在本发明范围中是一种适宜的皂苷。已被用于全身性接种研究的其它皂苷类包括从其它植物种例如Gypsophila和Saponaria得到的那些(Bomford等，Vaccine,10(9):572-577,1992)。增强的系统包括非毒性脂质A衍生物和急苦衍生物的组合，特别是如WO94/00153中/>开的QS21和3D-MPL的组合，或者如WO96/33739中公开的用胆固醇将QS21抑制的较低反应原性的组合物。形成本发明的部分的该皂苷类可以以胶团的形式被分离，或者可以以大的有序结构例如ISCOMs(EP0109942Bl)或脂质体)的形式被分离，当用胆固醇和脂质配制时或者以水包油乳剂的形式(WO95/17210)被分离。该急苷类可以适当地与金属性盐例如氢氧化铝或磷酸铝联用(WO98/15287)。在水包油乳剂中包含QS21和3D-MPL的特别有效的佐剂组合物被描述于WO95/17210、WO99/11241和WO99/12565中，并且均是适合的纟且合物。供口服免疫法的疫苗和佐剂的一般性讨论可从在由Powell和Newman编辑的VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach,PlenumPress，NewYork,1995中找到。根据本发明的疫苗组合物可以含有添加的成分，其包括例如调味剂(特别是对于口服疫苗)和抑菌剂。在一个具体的实施方案中，根据本发明的该液体组合物具有6至23分钟的抗酸能力，该抗酸能力通过BabyRossett-Rice测定法(由基本的Rossett-Rice试验修改、在实施例III.2.2中详述)评价。根据本发明，'抗酸能力，含义是以分钟表示的时间周期，这该期间，根据实施例III.2.2中给出的试验操作评价，试验中的配方的pH保持高于4。适宜的抗酸能力为12至20分钟。从疫苗开发考虑，抗酸能力高于23分钟，例如29-30分钟，也是完全可接受的，但是这一高的能力是过剩的。特别是至少8分钟、至少10分钟、至少12分钟的抗酸能力是特别考虑的。至少12分钟，至少13分钟，至少14分钟，至少15分钟，至少16分钟的抗酸能力是合适的。已知未进食达3小时的小嬰儿的胃是非常酸的，并且轮状病毒受该酸性pH的不利影响。在我们的工作中，当研究期望的低体积配方时，测定经典的含有磷酸盐的配方的抗酸能力是不可能的，因为容易超过磷酸盐溶解度，以及在配制和/或短期贮藏期间发生各组分结晶。相反，所要求专利保护的组合物，与含有磷酸盐的现有技术配方相比，甚至在较小的剂量体积时也令人惊讶地显示出可接受的、但是较高的抗酸能力。在另一具体的实施方案中，所述液体免疫原性组合物在至少一种下列条件下是稳定的37。C下7天、4。C下1年、4。C下18月、4。C下2年。根据本发明，给定组合物的稳定性是该配方在给定温度下贮藏达一确定时间后，根据实施例III.l所述操作，通过测定病毒滴度(即病毒稳定性)而评价的。该组合物的稳定性可以通过加速稳定性试验，例如该配方在37。C下贮藏1周时间之后进行评价。该组合物的稳定性可以另选地在一较长的时间来评价，例如在数月期间，或者在冷藏设备温度(2至7°C,通常在4。C下)下或者在室温(20-22。C)下。在这些条件下，稳定的组合物具有最大的、在定义的试验条件下以1ogK)ffu/剂量表示的1的轮状病毒滴度损失。特别适合的组合物是最大值0.51ogm的那些，例如，在37t:下1周期间加速稳定性试验损失0.4或更低、0.3或更低、0.2或更低，或者适合的0.11ogu)ffu/疫苗剂量者。或者，本文要求专利保护的液体免疫原性组合物可以被冷冻，并且冷冻贮藏在-20。C或以下，或者在-70。C达数年，并且一旦融化在4。C下保持稳定达至少1年。通常该冷冻配方可以稳定地达到至少6月、至少12月、至少18月、至少2年或至少3年，并且一旦融化在4'C下保持稳定达至少l年，适宜地18月或2年。根据本发明的组合物是一种免疫原性组合物，例如疫苗。例如，所要求专利保护的免疫原性组合物能够，通常在l剂量之后，适合地在隔离l或2个月的2个剂量之后，引发免疫应答，例如优良的疫苗反应和血清轮状病毒特异性IgA应答。'疫苗反应，定义为具有下述表现的受试者的百分数，即血清应答例如在免疫后血清滴度S20U/ml(ELISA)时血清IgA对轮状病毒的表型(appearance)，和/或在任何粪便样品中轮状病毒脱落(ELISA)。疫苗反应可以定义为在第1剂量直至第2剂量之后1到2月之间收集的任何粪便样品中的疫苗病毒脱落。在一个具体的实施方案中，与安慰剂相比，根据本发明的该疫苗能够减少任何的、并且优选严重的轮状病毒胃肠炎事件。通常该疫苗能够给予交叉保护作用以防止除存在于疫苗中的以外的循环林。通常，当该疫苗含有Gl型林例如减毒人病毒P43时，免疫应答诱导G1以及至少一种选自如下的非-Gl血清型G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、GIO、Gll、G12、G13和G14血清型。适合地，含有Gl抹的疫苗能够给予保护作用以防止Gl和非-Gl林例如G2、G3和/或G4抹，并且特别地防止全球性出现的G9血清型。在一个具体的实施方案中，所述的胃肠炎或严重胃肠炎是由与包含在要求专利保护的组合物中的不同血清型的轮状病毒抹引起的。特别是，如果存在于所要求专利保护的组合物中的该轮状病毒抹是Gl血清型，例如但不限于活减毒人轮状病毒抹HRVP43(ECACC99081301)，预防作用是给予防止可由Gl血清型的轮状病毒林，也可由非-Gl血清型的轮状病毒林引起的胃肠炎或严重胃肠炎，例如由具有选自下列的血清型的轮状病毒抹引起G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、GIO、Gll、G12、G13和G14。在一特别的实施方案中，本文要求的免疫原性组合物能够诱导免疫应答以防止，和/或提供保护作用以防止胃肠炎或严重胃肠炎，该胃肠炎或严重胃肠炎由至少一种，适宜地由以下全部的非-Gl血清型引起G2、G3、G4和G9。在另一具体的实施方案中，如果存在于所要求专利保护的组合物中的该轮状病毒抹是P[8]轮状病毒型，例如但不限于活减毒人轮状病毒抹HRVP43(ECACC99081301),预防作用是给予防止胃肠炎或严重胃肠炎，该胃肠炎或严重胃肠炎由P[8]型的轮状病毒抹和由例如选自如下的具有血清型的轮状病毒抹非-P[8]型引起Pl、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P9和Pll型。特另'J地，本文要求的免疫原性组合物能够诱导免疫应答以防止，和/或提供保护作用以防止胃肠炎或严重胃肠炎，该胃肠炎或严重胃肠炎由至少一种，适宜地由以下全部的非-P[8]型引起P4、P6。在另一实施方案中，所要求专利保护的组合物能够诱导免疫应答以防止，和/或提供保护作用以防止胃肠炎或严重胃肠炎，该胃肠炎或严重胃肠炎是由与存在于施用的组合物中不同的G型和不同的P型的轮状病毒抹引起。具体地，所要求专利保护的组合物包括G1P[8]轮状病毒抹，并且能够诱导免疫应答以防止，和/或提供保护作用以防止胃肠炎或严重胃肠炎，该胃肠炎或严重胃肠炎由G2P[4]轮状病毒林引起。根据本发明的适合的组合物是通过口服施用的。适合的组合物是在单剂量装置中供应的，例如，适合于给小婴儿递送的玻璃瓶或塑料瓶或者注射器。本发明的疫苗可以通过已知技术、使用适宜量的活病毒配制并施用，提供有效的保护作用以防止轮状病毒感染，而无通常疫苗中的明显的不良副作用。相应地，本发明提供了如本文描述的制备液体轮状病毒配方或免疫原性组合物的方法，包括将轮状病毒抗原、糖类和羧酸盐与药学可接受的稀释剂混合。适宜量的活病毒通常为104至1(^ffu/剂量。疫苗的典型剂量可以包括105106ffu/剂量，并且可以以多个剂量在一段时间内给予，例如2个剂量以2个月间隔给予。轮状病毒滴度可以以CCID50表示，并且它可以在本发明范围中被估计，即1060的CCID50相当于10"ffu/剂量。然而，益处可以通过给予多于2个剂量而获得，例如3或4个剂量方案，特别是在发展中国家。第一剂量可以适合地给予4周至14或15周龄的婴儿，适合地6至14周龄。各剂量之间的间隔为至少4周，但是可以多于或少于2个月长，例如第二剂量以及如果适当的话任何后来的剂量可以在前次剂量之后1月或3月给予，这取决于当地的免疫接种程序表。用于单剂量或多剂量方案的活病毒的最佳量，以及各剂量的最佳时间，可以通过标准研究来确定，该标准研究包括抗体滴度以及受试者中的其它应答的观察。根据本发明的疫苗剂量的通常体积一般为2.5ml或更低，通常为0.5ml至2.5ml。在本发明的具体方面，适合的疫苗剂量通常为1.5ml，或者适合的小于2.5ml的任何体积例如2ml或更低的体积，该体积适合于给幼儿或婴儿口服施用。特别地该剂量体积应为，配方的技术可行性合理，并且对配方的免疫原性可能性无不利作用。所要求专利保护的组合物提供了超过现有技术中含有磷酸盐的配方的益处，它们可以经受胃酸、在长的贮藏期保持免疫原性和稳定，同时符合在剂量体积方面比通常更小，例如小于2.0ml或更甚，适合的，1.5ml或更小。根据本发明的疫苗的剂量的通常体积为0.5ml至2.0ml，适合地约l.Oml至1.5ml,例如约1.3ml或约1.4ml或约1.5ml。典型的剂量体积还可以是2ml或以下，例如l.lml、1.2ml、1.3ml、1.4ml或1.5ml。lml的体积或小于lml的体积，例如200^1至800(Lil的体积也是本发明范围内所考虑的。可以口月良施用的液体体积还可以通过疫苗递送装置4姿部分地确定。本发明的免疫原性组合物还可以被配制以包含其它抗原，特别是来自其它适合的活病毒的抗原以防止其它疾病，例如脊髓灰质炎病毒。适合于口服施用的所述另外的活性成分可以以与轮状病毒组合物的混合物形式给予，或者也可以与本文要求专利保护的轮状病毒组合物共同施用(即在分别的剂量中，但是在相同的时候)。所要求专利保护的组合物还可以与其它非口服疫苗同时给予，例如与适合于儿科接种人群的注射疫苗同时给予，例如DTPw或DTPa疫苗(对抗百日咳杆菌一百日咳、白喉、破伤风的疫苗)，对抗流感嗜血杆菌B诱发的脑脊膜炎、乙型肝炎、或麻渗、流行性腮腺炎、风渗(MMR)的疫苗，抗肺炎链球菌疫苗，以便优化向医生就诊的次数。在另一实施方案中，本发明还提供了一种在人类中治疗或预防轮状病毒相关疾病的方法，特别是在年幼的儿童例如幼儿或婴儿中，该方法通过向需要的所述人类受试者施用有效量的如本文所要求专利保护的液体配方，特别是免疫原性组合物或疫苗。特别地，所要求专利保护的组合物可预防轮状病毒感染。在一个具体的实施方案中，本文要求专利保护的该组合物能够提供保护作用以防止轮状病毒胃肠炎，特别是防止严重胃肠炎。严重胃肠炎定义为一种需要入院治疗和/或在医疗设施中重新补水治疗(相当于WHO方法B或C)的事件，或者是一种在20-点Vesikari标度分值>11的事件(RuuskaTandVesikariT.RotavirusdiseaseinFinnishchildren:useofnumericalscoresforseverityofdiarrhealepisodes.ScandJInfectDis1990，22:259-67)。在再进一步的实施方案中，本发明提供了轮状病毒抗原、羧酸盐和糖在制备用于治疗或预防人类轮状病毒相关疾病的免疫原性组合物例如疫苗中的用途，其中所述免疫原性组合物具有pH5.0至pH8.0的pH,并且包括低于5mM磷酸盐。特别地，预防轮状病毒感染，和/或保护以防止胃肠炎以及更特别地防止严重胃肠炎是特别考虑的。在另一具体的实施方案中，本发明还提供了人活减毒轮状病毒用于制备本文所要求的免疫原性组合物以用于治疗或预防轮状病毒相关性疾病而不引起肠套叠的用途。特别地，所述治疗或预防包括向嬰儿施用两个或多个口服剂量的安全、有效量的人活减毒轮状病毒组合物，在第1剂量时该婴儿在4至14或15周龄内。通常，第一剂量时嬰儿为6至14周龄。在本发明的上下文中该婴儿表示出生后4至14或15周的婴儿。在另一实施方案中，本发明还提供了液体免疫原性组合物，包括轮状病毒抗原、糖、磷酸盐和羧酸盐，其中所述组合物具有约5.0至约8.0的pH,并且其中所述羧酸盐选自己二酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、丙二酸盐、戊二酸盐、羟乙酸盐、葡萄糖酸盐、庚二酸盐以及它们的两个或多个的任何组合。在一个具体的实施方案中，所述羧酸盐为己二酸盐。通常磷酸盐是以10mM至1M的浓度存在。本发明人发现，这些与口服疫苗配方的开发无关的特定的羧酸盐实现了全部期望的要求稳定性、耐酸性、免疫原性和小剂量体积配方，这些要求如在本说明书关于对供人类婴儿用的适合的口服轮状病毒疫苗的开发中所述。特别地，所述羧酸盐对配方中的轮状病毒滴度没有不利作用。这些羧酸盐可以适当地作为常规羧酸盐的替代品，该常规羧酸盐例如在含有磷酸盐的轮状病毒配方中的琥珀酸盐、谷氨酸盐和枸橼酸盐。上文所述的所有其它的具体实施方案可以等同地用于本发明的这一方面。通常该组合物的pH范围如本文所定义的，其具有所述的抗酸能力和贮藏期稳定性。本发明还提供了制备所述组合物的方法，使用所述组合物预防或治疗人类婴儿的用途和方法。本发明将通过以下非限制性的实施例作进一步的描述。实施例I-活减毒人轮状病毒液体疫苗的配方i)没有添加的磷酸盐和羧酸盐，和ii)存在作为羧酸盐的枸橼酸盐但没有添加的磷酸盐1.1.配方的制备I丄l.DMEM培养基的组成(制备1升DMEM):注射用水0.8升依次将以下化合物溶解氯化钠6.40g氯化钾0.40g硫酸镁.7H20:0.20g加入0.1g/L硝酸铁溶液1.00mlNaH2P04.2H20:0'1412g丙酮酸钠O.llg无水葡萄糖4.50g维生素溶液(500x浓的)2.00ml注射用水1.50ml氢氯酸(浓的)0.083mlL-胱氨酸0.048gL-酪氨酸0.072g注射用水2.00ml氨基酸类溶液20.00mlL-谷氨酰胺0.5846氯化钩.2H20:0.2649g碳酸氢钠3.70g注射用水至1升。DMEM表示实施例II详述中的5%、6%或8%的配方。其相当于:-最终磷酸盐浓度分别为0.059mM、0.071mM和0.094mM，和誦最终丙酮酸盐浓度分别为0.065mM、0.078mM和0.104mM。维生素溶液(500x浓的)注射用水80.00L叶酸200.10g泛醇4丐200.10g氯化胆碱200.10g肌醇350.00g烟酰胺200.00g酸吡喷醇200.10g盐酸硫胺200.10g核黄素20.002g注射用水至100升。氨基酸溶液注射用水144.00LL-精氨酸755,70g甘氨酸270.10gL-组氨酸378.00gL-异亮氨酸943.40gL-亮氨酸943.50gL画赖氨酸2HC1:1315.80gL-蛋氨酸270.00g2L-苯丙氨酸594.10gL-苏氨酸856.30gL-色氨酸144.00gL-丝氨酸377.90gL-缬氨酸842.00g注射用水至180升。硝酸铁溶液注射用水1035.000ml硝酸铁.9H20:0.115g注射用水至1.150升。1.1.2.没有添加的磷酸盐和羧酸盐的轮状病毒配方的制备显示于表2的配方60以325g(250ml)总规模制备,相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。配方n°60:向143g水(定量确定以便达到最终325g制品)中加入162.5g蔗糖(50。/。w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10^ffu/剂量的19.5g的DMEM培养基。在此情况下，剂量体积为l.5ml。将该混合物勾化并分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM为6%w/w。抗酸能力、初始病毒滴度和病毒稳定性的结果见表2至4。表2:1.5ml剂量体积<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>*通过根据实施例III.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价表3:1.5ml剂量体积-在室温下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>*=月；ND二未测定表4:1.5ml剂量体积-在4。C下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>*=月；ND-未测定1.1.3.含有羧酸盐的轮状病毒配方的制备将枸橼酸(当存在时)和枸橼酸盐以表5和6所述比例和条件混合。配方的轮状病毒稳定性和抗酸能力分别根据实施例ni.i和m.2所给的方法测定。制备配方110-115和128-130。配方110-115的剂量体积为2.5ml，配方128-130的为1.5ml。显示于表5中的配方110-115以325g(250ml)总规模制备，相当于100剂量,每剂量2.5ml(3.25g)。配方110制备如下。向123.71g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续地加入19.29g枸橼酸三钠(枸橼酸三钠.2H20，Mw294)(相当于最终浓度262mM)和162.50g蔗糖(50n/。w/w)。完全溶解后通过在0.2(Lim膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10^ffu/剂量的19.5g的DMEM培养基。在此情况下，单次剂量体积为2.5ml或3.25g。将该混合物匀化并分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM培养基为6%w/w，相当于最终磷酸盐浓度0.059mM。配方111-115根据有关配方110说明的类似操作制备，除了各成分的量采用表5详述的之外。例如，配方111是通过混合以下各成分制备123.73g水(定量确定以便达到最终325g制品)、19.07g枸橼酸三钠(枸橼酸三钠.2!120，Mw294)(相当于最终浓度259mM)、0,197g枸橼酸(Mwl92)(相当于最终浓度4mM)和162.50g蔗糖(50。/ow/w)。其余才喿作如配方110进行。抗酸能力、初始病毒滴度和病毒稳定性的结果见表5至8。表5:2.5ml剂量体积<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>*通过根据实施例III.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价显示于表6的配方以325g(250ml)总规模制备，相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质枸橼酸.lH20(Mw210)、枸橼酸三钠.2H20(Mw294)。配方128通过将110.89g水(定量确定以便达到最终325g制品)与下列成分混合制备31.78g枸橼酸三钠(枸橼酸三钠.2H20,Mw294)(相当于最终浓度432mM)、0.328g枸橼酸(枸橼酸.lH20,Mw210)(相当于最终浓度6mM)和162.50g蔗糖(50%w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10^ffu/剂量的19.5g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将该混合物勾化并分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM培养基为6%w/w，相当于最终磷酸盐浓度0.059mM。配方129和130以配方128所述操作类似制备，同时采用根据表6成分的量。简而言之，配方129是通过将0.77g枸橼酸(枸橼酸.lH20,Mw210)(相当于最终浓度15mM)和31.36g枸橼酸三钠(枸橼酸三钠.2H20(Mw294)相当于最终浓度426mM)混合而制备。配方130是通过将2.75g枸橼酸(枸橼酸.1H20，Mw210)(相当于最终浓度52mM)和34.7g枸橼酸三钠(枸橼酸三钠.2H20(Mw294)相当于最终浓度472mM)混合而制备。其余成分和比例见表6。表6:1.5ml剂量体积<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>通过根据实施例III.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价表7:1.5ml剂量体积-在室温下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>=月；ND-未测定表8:1.5ml剂量体积-在4。C下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>=月；ND-未测定1.2轮状病喜稳定性和抗酸能力-结果根据实施例III.l所给操作评价了不同时间点的轮状病毒滴度，还按照实施例m.2所给方案评价了配方的抗酸能力。结果见表2至8。羧酸盐和添加的磷酸盐均没有的对照配方60的pH无抗酸能力，并且进一步表现为pH接近于病毒稳定性的pH8.0的上限。对于所有在表5至8中试验的试验配方，pH维持在约5.0-7.0的范围，除了表现为高于8.0的pH的配方110夕卜。从病毒滴度和病毒损失结果可见，在液体配方中的轮状病毒稳定性与该配方的pH有关。在约pH5.4(即配方115)至pH7.0(即配方111和128)的范围内，在37。C下7天后的病毒损失保持在一低水平(即低于0.5log),并将它与配方110获得的结果(pH〉8,病毒滴度损失0.91og)对比。此外，根据BabyRossett画Rice测定法(见实施例IH.2.2)评价，配方111-115和128-130显示出与配方110相似的抗酸能力。这一抗酸能力完全超过了2.5ml和1.5ml剂量体积配方的8min低限，并且居然达到了12分钟的最小值，因此被认为是非常令人满意的。还试验了另选的羧酸盐类，因为它们可能是技术上可行的替代品，例如当以极小的剂量体积操作时，此时相对小量的羧酸盐可能是需要的。含有该另选的羧酸盐类的配方实例给于实施例II和表10-39。实施例II-没有添加的磷酸盐的另选羧酸盐的配方下列羧酸盐类被用于产生緩冲能力乙酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，戊二酸盐，己二酸盐和苹果酸盐。根据给定羧酸的pKa，并取决于其分子量，可能找到配制的用量以达到至少8分钟的目标抗酸能力，合适的至少12分钟，其通过BRR试验评价，同时在pH5.0至pH8.0的pH窗内。从化学上讲，"緩冲"作用是在将强酸(如HC1)和弱酸产生的盐(如乙酸钠)混合时获得的。相应于緩冲坪中间的pH值等于弱酸的pKa。羧酸的pKa是酸性强度的度量，换言之，是化合物有效緩冲范围的指标。由于pH4以下轮状病毒迅速退化(C.WeissandH.F.Clark，1985J.Gen.Virol.,66，2725-2730),pH4以上的緩冲冲是需要的，即合适的pKa>4的羧酸盐或平均pKa>4的二羧酸盐。合适的羧酸盐给于表9中。给出了数均pKa值。表9:各种羧酸盐的性质<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*5种羧酸有"食品添加剂"的地位枸橼酸E330、乙酸E260、丙酸E280、苹果酸E296和己二酸E355。四种羧酸盐的标准酸碱滴定曲线(苹果酸钠、乙酸钠、枸橼酸钠和己二酸钠)示于图1。结果显示，在pH4.0至pH7.0之间的有益的抗酸能力例如，对于己二酸钠、乙酸钠、枸橼酸钠和苹果酸钠分别是72.50%、68.75%、57.70%和41.25%。用下列羧酸盐制备配方乙酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，戊二酸盐，己二酸盐和苹果酸盐。在该实施例中所示的全部配方均以1.5ml剂量体积制备。II.1.乙酸盐的配方II.l.l.显示于表10的配方以325g(250ml)规模制备，相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质乙酸(Mw60)、NaOH(Mw40)。配方36:向148.84g水(适量足以达到最终325g制品)中连续添加10.66gNaOH、，冰乙酸至pH7.16和130g蔗糖(40%w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，将含有需要量的轮状病毒的19.5g的DMEM培养基加至该溶液中，获得1060ffu/剂量。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方37和42:如配方36进行,但是量根据表10调节。配方87:向75.00g水中连续加入8.00gNaOH、15.00g冰乙酸、足够的1NNaOH溶液至7.00的pH(在此情况下加入2g的1NNaOH)，另外的水至足量325g(在此情况下加入43.00g的水)和162.50g的蔗糖(50%w/w)。其它操作如配方36进行。配方88-90的实施例:除了量采用如表10所述的以外，其如配方n。87进行。配方33-35的实施例:除了量采用如表10所述的以及NaOH被Ca(OH)2代替以外，其如配方n。36进行。配方33-35未包括在短期稳定性研究中，原因是未能符合37。C下1周的稳定性试验。但是在存在添加的4丐离子时令人满意的结果还是显示于己二酸盐组中(见实施例II.5.4和表26)。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*通过根据实施例HI.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价;°=重复IL1.2.表11显示的配方以325g(250ml)规模制备,相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质乙酸钠.3H20(Mw136)。配方58的实施例:向113.00g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加30.00g乙酸钠.3H20和162.50g蔗糖(500/。w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，将含有需要量的轮状病毒的19.5g的DMEM培养基加至该溶液中，获得106Qffu/剂量。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方59、66、69和70:以调整的量(见表1l)与配方58相似进行。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>*通过根据实施例m.2.2.修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价；°=重复IU.3.轮状病毒稳定性和抗酸能力-结果不同时间点的轮状病毒病毒滴度根据实施例nu给出的操作评价，配方的抗酸能力按实施例ni.2.2给出的方案评价。结果如表IO、11、12和13所示。总之，在液体乙酸盐配方中的轮状病毒稳定性与pH相关。适合的工作范围为pH6.0至7.5。表12-在室温下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>=月；空白格-标准未确定表13-在4。C下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>=月；空白格=标准未确定II.2.丙二酸盐的配方H.2丄配方67(见表14)以325g(250ml)总规模制备，相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质丙二酸(Mwl04)、NaOH(Mw40)。配方54(见表14)以44g(35ml)总规模制备，相当于20剂量，每剂量1.75ml(2.2g)。抗酸物质丙二酸(Mwl04)、NaOH(Mw40)。配方n。67:向110.70g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加14.00gNaOH、18.230g丙二酸和162.5g的蔗糖(50%w/w)。完全溶解后通过在0.2(iim膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10^ffu/剂量的19Jg的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将该混合物匀化并分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方n°54:向16.64g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加2.4gNaOH、3J213g丙二酸和19.5g的蔗糖(44%w/w)。完全溶解后通过在0.2(Lim膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10"ffu/剂量的2.34g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化并分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>*通过根据实施例III.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价。°°配方54被从长期稳定性研究中排除，原因是它的初始pH超过8.0。II.2.2.表15显示的配方以325g(250ml)总规模制备，相当于147.7剂量，每剂量1.75ml(2.20g)。抗酸物质丙二酸二钠(Mw148)。配方n°62:向138.50g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加23.00g丙二酸二钠和144.00g的蔗糖(44Q/ow/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，将含有需要量的轮状病毒的19.5g的DMEM培养基加至该溶液中，获得1()SGffu/剂量。在此情况下剂量是1.75ml或2.20g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>通过根据实施例HI.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价。II.2.3.轮状病毒稳定性和抗酸能力-结果总之，在液体丙二酸盐配方中的轮状病毒稳定性与pH相关在37。C下l周期间，pH6.5产生良好的稳定性，而在pH8.2时观察到0.9log以上的损失。II.3琥珀酸盐的配方H.3丄配方127(见表16)以325g(250ml)规模制备，相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质琥珀酸(Mwl18)、NaOH(Mw40)。配方51(见表16)以44g(35ml)规模制备，相当于20剂量，每剂量1.75ml(2.2g)。抗酸物质琥珀酸(Mwl18)、NaOH(Mw40)。配方127:向120.16g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加9.10gNaOH、13.74g琥珀酸和162.5g的蔗糖(50%w/w)。其余配方步骤与配方67所述相同。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方51:向16.22g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加2.4gNaOH、3.5414g琥珀酸和19.5g的蔗糖(44%w/w)。完全溶解后通过在0.2(im膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10^ffu/剂量的2.34g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化并分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>*通过根据实施例IH.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价。°°配方51被从长期稳定性研究中排除，原因是其抗酸能力测定的太长II.3.2.配方56见表17，并且以325g(250ml)总规模制备，相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质琥珀酸二钠(Mw162)。配方56:向122.50g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加20.50g琥珀酸二钠和162.50g的蔗糖(50%w/w)。其余配方步骤与配方62所述相同。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>*通过根据实施例III.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价;°=重复n.3.3.轮状病毒稳定性和抗酸能力-结果总之，在液体琥珀酸盐配方中轮状病毒稳定性与pH相关在37。C下1周期间，pH6.3产生良好的稳定性，而在pH8.1时观察到0.8log的损失。II.4.戊二酸盐的配方11.4丄戊二酸盐的配方显示于表18。配方65以320.8g(246ml)总规模制备，相当于164剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质戊二酸(Mwl32)、NaOH(Mw40)。向114.1g水(定量确定以便达到最终320.8g制品)中连续添加9.3gNaOH、15.40g戊二酸和162.5g的蔗糖(50.6o/ow/w)。完全溶解后通过在0.2itim膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10"ffu/剂量的19^g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将该混合物匀化并分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.08%w/w。配方50以44g(35ml)总规模制备，相当于20剂量，每剂量1.75ml(2.2g)。抗酸物质戊二酸(Mwl32)、NaOH(Mw40)。向15.8g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加2.4gNaOH、3.964g戊二酸和19.5g的蔗糖(44%w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10"ffu/剂量的2.34g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化并分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方125和126以325g(250ml)总规模制备，相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质戊二酸(Mwl32)、NaOH(Mw40)。配方125:向100.35g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加9.10gNaOH、15.40g戊二酸和162.5g的蔗糖。其余配方步骤与配方67所述相同。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方126:其如配方125进行，但是用调整的量(见表18)。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*通过根据实施例III.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价。°°配方50被从长期稳定性研究中排除，原因是它的初始pH(超过8.0)和它的抗酸能力(测定的太长)II.4.2.轮状病毒稳定性和抗酸能力-结果总之，在液体戊二酸盐配方中轮状病毒稳定性与pH相关在37。C下l周期间，pH6.17产生良好的稳定性，而在pH8.1时观察到0.71og的损失。II.5.己二酸盐的配方IL5丄显示于表19的含有己二酸盐的配方以325g(250ml)规模制备，相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)，除了配方n。45以44g(35ml)规模制备，相当于20剂量，每剂量1.75ml(2.2g),以及n。63以320.8g(247ml)规模制备，相当于164剂量，每剂量1.5ml(1.95g)之外。抗酸物质己二酸(Mwl46)、NaOH(Mw40)。配方45:向15.38g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加2.4gNaOH、4.3809g己二酸和19.5g的蔗糖(44%w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10^ffu/剂量的2.34g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.%w/w。配方63:向112.50g水(定量确定以便达到最终320.8g制品)中连续添加9.3gNaOH、17.00g己二酸和162.5g的蔗糖。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10^ffu/剂量的19.5g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.08%w/w。配方81:向116.70g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加9.28gNaOH、17.00g己二酸和162.5g的蔗糖(50%w/w)。其余配方步骤与配方67所述相同。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方82、83、91-97、100-109、122-124、131-134、136-145、147、M8.向水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加如表19和23所述量的NaOH、己二酸和蔗糖。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得106Qffu/剂量的19.5g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将得到的混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。以黑体显示于表19中的若干参数已作改变，以试验所得配方的关于抗酸能力和病毒稳定性的性能。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>糖'/的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>不同来源的市售己二酸盐1220.920.46655%6%6.36126.05.90.11230.920.46655%6%6.32135.85,70.1不同来源的市售蔗糖1330.920.46655%6%6.34135.85.801470.920.46655%6%6.3211-126.05.70.31340.920.46655%6%6.34136.35.80.51480.920.46655%6%6.3411-125.85.90*通过才艮据实施例III.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试—睑评价；ND二未测定；°=重复。。配方45被排除，原因是抗酸能力太长°°配方103、104和108、109被排除，原因是己二酸在4-8。C静置重结晶°°配方n。107、141和142被排除，原因是它们相似于已经被评价的配方°°配方n。136-140被排除，原因是初始pH太高II.5.2.轮状病毒稳定性和抗酸能力-结果在不同时间点的轮状病毒病毒滴度已根据实施例in.i给出的操作进行了评价，并且该配方的抗酸能力已按实施例m.2.2给出的方案进行了评价。结果说明于表19、20、21和22。表20-在室温下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表21-在4°C下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>*=月；空白格-未测定配方91-94的抗酸能力是通过'BabyRossett-Rice方法，(见实施例in.2.2)测定的，并且在pH>4时显示有望达到8、12、16或20min。结果显示于表22和图2A。表22<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>总之，如其它羧酸盐配方所观察到的，在己二酸盐系列中，高pH值未得到良好的稳定性数据(例如见配方124，其具有9.5的pH，并且在37。C下贮藏1周后显示高于2.85log的病毒损失)。pH的最高可接受限值约为8.0(例如见配方143获得的7.96的pH值)，其在37。C下1周后观察到0.51og的病毒损失。对于这些配方，适合的pH范围是约pH5.5至约pH8，最适合的范围为pH6.0至pH7.7。己二酸盐(食品添加材料)配方是一种良好的综合平衡，具有最佳pKa值(pKa!5.4和pKa24.43)，其使用合理量的材料(约100mg/剂量)而达到目标抗酸能力(例如t^2min)。此外，这些量与溶解度参数相适应，从而容许以1.5ml的剂量体积配制疫苗。这用经典的枸橼酸盐磷酸盐配方是不可能的，原因是技术上不可行，例如磷酸盐结晶(见比较实施例IV)。与其它羧酸盐相比，对于己二酸盐，它们还与毒性参数相适应，因为毒性数据相当低(大鼠口服LD50:5.7g/kg)。II.5.3.疫苗剂量中的病毒滴度对病毒稳定性的作用以1.5ml的疫苗剂量进行下列试验来评价初始轮状病毒滴度(106()、10"、1052)对轮状病毒稳定性的作用。在不同时间点的轮状病毒病毒滴度已根据实施例m.i给出的操作进行了评价，并且该配方的抗酸能力已根据实施例m.2.2给出的方案进行了评价。结果说明于表23、24和25。表23<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>*通过根据实施例HI.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价。表24:在室温下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>=月；空白格=未测定表25:在4。C下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>=月；空白格-未测定总之，在评价的范围内，不论初始病毒滴度如何，轮状病毒稳定性都保持相似，并且是可接受的。II.5.4.在钙离子存在下己二酸盐的配方已报道钙可能影响在盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)中表达的轮状病毒SA11糖蛋白VP7的稳定性和构象(K.R.Emslieetal.，1996，JournalofBiotechnology50,149-159)。向本发明的己二酸盐轮状病毒液体配方中加入钙离子可能是有益的，因为它们有助于该配方中轮状病毒的稳定性。相应地，不同量的钙离子已在己二酸盐配方(表26)中进行了试验。试验了两种供选方案CaCl2和Ca(OH)2。配方98、116-118:向9.28gNaOH中连续加入水(定量确定以便达到最终325g制品)、17.00g己二酸、如表26中说明的CaCh(发生沉淀，但是在室温下搅拌1小时之后沉淀重新溶解，除了配方n。117之外)和178.75g的蔗糖。其余配方步骤与配方82所述相同。在该配方中DMEM相当于6%w/w。配方99:向水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加如表26中说明的Ca(OH)2、17.00g己二酸、9.02gNaOH和178.75g的蔗糖。其余配方步骤与配方82所述相同。在该配方中DMEM相当于6%w/w。在不同时间点的轮状病毒病毒滴度已根据实施例nu给出的操作进行了评价，并且该配方的抗酸能力已按实施例m.2.2给出的方案进行了评价。结果说明于表26、27和28。配方119-121:向如表26中说明的CaCl2中连续加入水(定量确定以便达到最终325g制品)、9.28gNaOH(在此情况下Ca(OH)2的沉淀发生，但是在添加己二酸后该沉淀重新溶解，除了配方n°121之外)、17.00g己二酸和178.75g的蔗糖。其余配方步骤与配方82所述相同。在该配方中DMEM相当于6%w/w。表26<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>通过根据实施例III.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价。°配方117和121被排除，原因是在它们的制备期间发生一些不溶性物质的沉淀表27:在室温下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*=月；空白格=未测定结论存在钙离子的轮状病毒稳定性说明在37。C下1周后，经历不多于0.3log损失，其与在相同条件下并含有除加入钙离子之外的相同组分制备的配方而获得的结果相似(例如见表19-21中的配方83)。II.5.5在口力l脊髓灰质炎病毒存在下己二酸盐的配方某些常规免疫接种方案可以在同一时间点联合口服脊髓灰质炎和轮状病毒疫苗。以下试验的目的是评价两种疫苗接种是否能相容。因此制备试验性口服脊髓灰质炎/轮状病毒联合疫苗。用于配方149,151-155的OPV培养基组成注射用水80.00L水解乳蛋白1500.00g注射用水200.00L氯化钠2040.00g氯化钾120.00g硫酸镁7.&0:30.00gKH2P04:38.00g无水葡萄糖1200.00g石克酸新霉素(Neomycinesulfate):15.00g吐温80:6.00g氯化钙.2H20:80.00g氢氧化钠30.00g碳酸氬钠660.00g酚红6.00gL-胱氨酸30.00g盐酸IN:550.00g硫酸多粘菌素(PolymixixineBsulfate):30.00g注射用水至300.00L配方149-155:向水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加如表'29所述量的NaOH和己二酸，以及178.75g蔗糖。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，根据表29所述量，加入DMEM培养基，其含有需要量的轮状病毒以获得1065CCID50/剂量，并且加入OPV培养基，其含有需要量的脊髓灰质炎病毒以获得1066的I型、105'6的II型、1061的III型CCID50/剂量。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将得到的混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在这些实施例中DMEM相当于6%w/w、蔗糖为55%w/w、NaOH为0.92M、己二酸为0.466M。表29<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>在不同时间点的轮状病毒病毒滴度已根据实施例m.i给出的操作进行了评价，并且该配方的抗酸能力已按实施例ni.2.2给出的方案进行了评价。结果说明于表30。表30(在该表中全部病毒滴度以CCID50/剂^为单位)<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>*通过根据实施例IU.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价。**可以估计，ffu和CCID50相符之处在于差约0.5log(例如以CCID50表示的1060大致与以ffu/剂量表示的1055相等)。空白格=未测定"no"表示相应的病毒未混入该配方中结论1)脊髓灰质炎培养基与抗酸能力相容(在配方n°149中，BRR12min)。2)脊髓灰质炎培养基与轮状病毒相容(将配方n。150与配方n。151比较，其中可以看到，两个配方，均在4。C下t=0时和在37。C下1周曰后，获得相同的病毒滴度)。3)轮状病毒组合物与脊髓灰质炎病毒相容(在配方n。152中获得期望的脊髓灰质炎病毒滴度)。II.5.6己二酸盐配方在冷冻事件下的稳定性11.5.6.1.在-2(TC下冷冻轮状病毒配方n。95,在+4。C至+8。C贮藏6个月后，根据以下时间历经3次连续冷冻(J(TC)事件(表31)11.5.6.2.在-70。C下冷冻轮状病毒配方n。95，在+4。C至+8。C贮藏14个月后，根据以下时间历经1次-70。C冷冻(表31》表31<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>分析各样品，并与1=0(4°(3)时的病毒滴度比较，还与在通常冷藏设备温度下相同时间贮藏的各样品(在此情况下，在+4。C下15个月)的病毒滴度比较。结果见表32。表32<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>总之，配方n°95(己二酸盐配方)的组成在-20。C下至少3次连续冷冻事件是稳定的。它还在-7(TC下至少1次冷冻事件是稳定的。II.6.革果酸盐作为羧酸盐的配方II.6.1.显示于表33的配方(除了配方46、64、84、85和86之夕卜)以325g(250ml)规模制备，相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质D,L-苹果酸(Mw146)、NaOH(Mw40)。配方n。46以44g(35ml)规模制备，相当于20剂量，每剂量1.75ml(2.2g)。抗酸物质D,L-苹果酸(Mw146)、NaOH(Mw40)。配方46:向15.74g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加2.4gNaOH、4.021lg苹果酸和19.5g的蔗糖(44%w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得106Gffu/剂量的2.34g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.%w/w。配方n。64以318.4g(244.5ml)规模制备,相当于163剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质D,L-苹果酸(Mw146)、NaOH(Mw40)。配方n。84以130g(100ml)规模制备，相当于66.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质D-苹果酸(Mw146)、NaOH(Mw40)。配方n。85以130g(100ml)规模制备，相当于66.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质L-苹果酸(Mw146)、NaOH(Mw40)。配方n°86以130g(100ml)规模制备，相当于66.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。抗酸物质D,L-苹果酸(Mw146)、NaOH(Mw40)。配方64:向97.3g水(定量确定以便达到最终318.4g制品)中连续添加14.6gNaOH、24.50g苹果酸和162,5g的蔗糖(51%w/w)。完全溶解后通过在0.2nm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10^ffu/剂量的19.5g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.12%w/w。配方71:向103.9g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加14.90gNaOH、25.00g己二酸和162.5g蔗糖(50%w/w)。其余配方步骤与配方67所述相同。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方72-77、84-86:其如配方71进行，但是用调整的量(见表33)。配方78:向75.00g水中连续加入8.00gNaOH、25.00g苹果酸、足够的1NNaOH溶液以达到6.48的pH、另外的水以达到325g和162.50g蔗糖(50%w/w)。其余配方步骤与配方67所述相同。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方79和80:其如配方78进行，但是用调整的量(见表33)。表33<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>*通过根据实施例III.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价；°=重复°°配方73被排除，原因是因溶液高粘度在无菌过滤期间发生困难°°配方75被排除，原因是蔗糖緩慢溶解在不同时间点的轮状病毒病毒滴度已根据实施例III.l给出的操作进行了评价，并且该配方的抗酸能力已按实施例m.2.2给出的方案进行了评价。结果说明于表33、34和35。表34:在室温下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>*=月；ND-未测定表35-在4°C下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>=月；ND:未测定II.6.2.轮状病毒稳定性和抗酸能力-结果在液体苹果酸盐配方中轮状病毒稳定性与pH相关。研究了pH的范围，即在37。C下1周期间，6.0至7.0的pH范围内产生了良好的稳定性。II.7.谷氨酸盐的配方天冬氨酸盐和谷氨酸盐是在其侧链上有羧酸盐基团的氨基酸。这些侧链羧酸的pKa值分别为3.65和4.25。因此，具有pKa高于4的谷氨酸盐可用作緩冲剂以产生抗酸能力。见表36。配方41:向水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加如表36中所述量的NaOH、谷氨酸和蔗糖。完全溶解后通过在0.2nm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得106Qffu/剂量的19.5g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将得到的混合物勻化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方43:向水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加7.1g谷氨酸一钠1H20和19.50g蔗糖(44。/。w/w)。完全溶解后通过在0.2jam膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，将含有需要量的轮状病毒的2.64g的DMEM培养基加至该溶液中，获得106Qffu/剂量。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方61:向水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加52.43g谷氨酸一钠1H20和144g蔗糖(44Mw/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，将含有需要量的轮状病毒的19.5g的DMEM培养基加至该溶液中，获得10^ffu/剂量。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方68:向水(定量确定以便达到最终250g制品)中连续添加0.2g谷氨酸一钠1H20、2.5g牛血清白蛋白、0.250gNa2HPO4.2H20、0.125gKH2PO4、0.5gEDTA和18.75g蔗糖(7.50/。w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，将含有需要量的轮状病毒的19.5g的DMEM培养基加至该溶液中，获得106Qffu/剂量。在此情况下剂量是1.5ml或接近于1.5g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于7.8%w/w。在不同时间点的轮状病毒病毒滴度已根据实施例III.l给出的操作进行了评价，并且该配方的抗酸能力已按实施例m.2.2给出的方案进行了评价。结果说明于表36、37和38。表36<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>*通过根据实施例HI.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价。°°配方41被排除，原因是初始pH太高°°配方68被从长期稳定性研究中排除，原因是在37'C下1周后获得的病毒损失结果不能令人满意表37:在室温下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>*=月；空白格=未测定在液体谷氨酸盐配方中轮状病毒稳定性与上述用其它羧酸盐获得的稳定性相似。简而言之-在pH约7时(在配方n。61中为6.93)与更碱性的培养基(在配方n。43中pH10.36)相比稳定性更好-在高的蔗糖百分比时(在配方n。61中44%蔗糖，与在配方n。68中7.5%蔗糖相比)稳定性也更好-在37。C、室温和4-8X:下1周，稳定性特性曲线与上述其它羧酸盐相似。11.8.富马酸盐的配方配方44:向16.28g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加2.4gNaOH、3.481lg富马酸和19.5g的蔗糖(44%w/w)。在室温下搅拌l小时之后不溶性物质残留在混悬液中。该制品被排除。11.9.乳糖酸盐的配方配方47:向16.02g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加1.2gNaOH、10.7414g乳糖酸和13.7g的嚴糖(31°/。w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得106Gffu/剂量的2.34g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.%w/w。11.10.马来酸盐的配方配方48:向16.88g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加2.4gNaOH、2.8821g马来酸酐和19.5g的蔗糖(44%w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得106Gffu/剂量的2.34g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.%w/w。配方57:向110.3g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续添加32.7g马来酸二钠和162.5g的蔗糖(50%w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10^ffu/剂量的19.5g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.5ml或1.95g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.%w/w。11.11.葡糖醛酸盐的配方配方49:向16.14g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加1.2gNaOH、5.821lg葡糖醛酸和18.5g的蔗糖(42%w/w)。完全溶解后通过在0.2iim膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得106Qffu/剂量的2.34g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.%w/w。11.12.半乳糖醛酸盐的配方配方52:向16.14g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加1.2gNaOH、5.8218g半乳糖醛酸和18.5g的蔗糖(42%w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得10^ffu/剂量的2.34g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.%w/w。11.13.半乳糖二酸盐的配方配方53:向15.96g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加2.4gNaOH、6.3008g半乳糖二酸和17.0g的蔗糖(38°/。w/w)。在室温下搅拌1小时之后不溶性物质残留在混悬液中。该制品被排除。11.14.酒石酸盐的配方配方55:向15.26g水(定量确定以便达到最终44g制品)中连续添加2.4gNaOH、4.4996g酒石酸和19.5g的蔗糖(44%w/w)。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下，加入含有需要量的轮状病毒以获得106Qffu/剂量的2.34g的DMEM培养基。在此情况下剂量是1.75ml或2.2g。将该混合物匀化，再分装到合适的剂量容器中。在该实施例中DMEM相当于6.%w/w。11.15.在没有添加的磷酸盐时含有羧酸盐的配方的全部结论用不同的羧酸盐，但没有添加的磷酸盐，制备若干稳定的配方。存在于这些试验性配方中的仅有的磷酸盐来源于DMEM緩沖剂，并且从未超过0.059mM(5%w/wDMEM)、0.071mM(6%w/wDMEM)或0.094mM(8%w/wDMEM)。在中和胃酸从而预防或使存在于配方中的活性成分即轮状病毒抗原的失活降至最低中，全部试验的羧酸盐显示了用作緩沖剂的能力。以不同施用剂量体积(即1.5ml、2.0ml和2.5ml)制备的全部的试验配方显示了约pH5.0至约pH8.0的pH,并且对于大多数配方约pH5.5至约7.5的pH。在稳定性试验期间在三个试验贮藏温度(即37°C、室温或4。C)下，这些配方表现良好。此外，如通过BRR试验(见实施例III.2.2中的操作)评价的，这些配方显示出令人满意的抗酸能力，即至少8分钟的抗酸能力，并且对于大多数配方至少12分钟。在以下表39中显示了根据配方pH选择的己二酸盐配方所获得的稳定性数据的简要概述。评价了下列指标i)在37。C下1周贮藏时间之后的病毒损失(加速稳定性)(*),ii)以月表示的时间，在该时间内病毒滴度损失保持低于1.0log(在室温下贮藏之后)和在所述时间期间所达到的病毒滴度(**)，iii)在4。C下贮藏1年(12个月)之后所达到的以ffu/疫苗剂量为单位的病毒滴度(***)。表39<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>$=pH，在T-0(4'C)时通过根据实施例III.2.2的BRR试验评价*根据37'C下1周的稳定性试验的最佳结果一0.5log的最大病毒滴度损失是容许的**根据室温稳定性试验的最佳结果一1.0log的最大病毒滴度损失是容许的***根据4-8'C稳定性试验的最佳结果一0.5log的最大病毒滴度损失是容许的****累积的最佳结果一病毒滴度损失^).5log但<1.0log和滴度损失<0.5log均是容许的，并且根据该标准均是可接受的灰色阴影相对于标准评价的可接受的配方(*、**、***或***)，病毒损失<0.5log;划线框相对于标准评价的可接受的配方(*、**、***或***),病毒损失^).51og但〈1.0log;黑色阴影因发生结晶而不能接受的配方。显然，在试验的己二酸盐配方中，约6.0至约8.0(6-8)的pH范围显示出良好的、可接受的、符合1.01og的最大病毒滴度损失的稳定性，并且约6.0至6.8(6-6.8)的pH次级范围显示出良好的、可接受的、符合0.5log的最大病毒滴度损失的稳定性。实施例III-方法轮状病毒病毒滴度传染性轮状病毒的检测是在许可的MA104细胞(ATCCCRL2378)中通过培养含有轮状病毒和多种组分的配方而进行的。如上述实施例配制轮状病毒(例如P43轮状病毒，ECACC99081301)。病毒样品接种之后，将细胞培养16至18小时。然后用80%丙酮将细胞固定并透化处理。通过间接免疫荧光法，使用VP6蛋白(Mab9F6)的单克隆抗-轮状病毒抗体的特异性，经由荧光素-结合的IgG检测，在UV显微镜下检查，鉴别受感染的细胞。任何商业可得的抑制轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体均是合适的，并且适宜的工作稀释度可通过常规试验确定。例如以下单克隆抗体是合适的-RV11-2(IgG2a,结合异硫氰酸荧光素的腹水液体)，来自RuralTechnologiesInc(www,r则ltechinc,com)國5F8F9(IgGl,目录编号RVM-1601A國5)或2F219(IgG2b，目录编号RVM-1601B國5)来自AustralBiologicals(www.a她albiQlogicals,com)rTmhh(www.afsbio.com)抗-Vp6轮状病毒多克隆抗体，例如来自的C1ierrH謹(www.cliemicon.com)的AB1129F也是合适的。每个荧光转化灶相应于一个感染的病毒。滴度是以每ml转化灶形成单位的对数(log(ffu/ml))表示。病毒滴度的精密度约为±0.2log。根据初始样品体积剂量，将以ffu/ml为单位的病毒滴度的结果换算为ffu/剂量。显示于表中的全部数据是log底10(1ogm)ffu/剂量。良好的结果是"在37。C下1周"(加速稳定性试验)期间获得<0.5log降低的那些。显示出1log或以上的病毒损失的配方在进一步的稳定性试验中被排除。HI.2抗酸剂测定的方法BabyRossett-Rice(BRR)滴定III.2.1.引言BabyRossett-Rice(BRR)滴定试验适合于嬰儿人群，该试验是从最初开发用于成人人群的Rossett-Rice滴定试验修改而得的。Rossett-Rice滴定是一种用于抗酸剂领域的/^知方法(见N.E.RossettandMarionL.RiceinGastroenterology,1954，26巻，490-495页'Aninvitroevaluationoftheefficacyofthemorefrequentlyusedantacidswithparticularattentiontotablets，)。Rossett-Rice滴定测定试一验中的抗酸物质与0.1N盐酸的反应速率和升高的pH的持续时间。为了模拟在空胃中的条件，在测定开始时立即加入新鲜的盐酸。为了模拟消化过程期间胃中的条件，以恒定的速率将新鲜的盐酸加至试-验中的反应混合物中。简而言之，成人Rossett-Rice滴定分为两部分-最初添加30ml的0.1NHCl，其相当于空胃团的酸含量；-接着以4ml/min的速率连续添加0.1NHC1,其为消化期间胃酸分泌的模拟。这些是试验性条件，它们通常被认为是一般成人胃的代表。III.2.2.BabyRossett-Rice滴定测定根据原始操作中描述的标准Rossett-Rice条件，该试验被修改以代表6月龄婴儿胃，并且以下称为'BabyRossett-Rice(BRR)滴定测定。根据GeigyScientificTables(l巻，126页，Ciba誦Geigy1981,eds),就胃HC1分泌而言以下数据是有价值的(见表40):表40基础酸排出量最大酸排出量儿童平均值极值范围平均值极值范围9-11周0.149mmol/h0.05-0.30mmol/h0.56mmol/h0.39-0.84mmol/h6-7月0.193mmol/h0.07-0.40mmol/h2.08mmol/h1.33-2.88mmol/h因此，根据这些数据，我们选择了包括全部情况的最苛刻的条件-初始HC1量0.40mmol(4ml的0.1NHC1)-连续添加的0.1NHC1量2.90mmol/h(或0.048mmol/min)。实际使用0.5ml/min的速率的O.lNHCl。BRR的试验装置略图见图2B。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>2°将该烧杯安置于水浴中。3°为了在烧杯中获得37t:，调节水浴温度。4°将测定的抗酸剂的样品加至烧杯。5°在此阶段测定的pH值表示"初始pH"(在表中，t=0)。6。立即加入4ml的0.1NHCl(0.40mmo1)，同时启动计时器并启动泵(连续添加0.5ml/min的O.lNHCl)。这三项操作在计时器启动点的最初5秒内进行。7。随着时间记录pH值，直至获得pH4。作为操作者的选项，可以允许进行pH降低直至获得pH3(如在原始Rossett-Roce方法中)，但是相关的抗酸能力值在达到pH4之后才被记录。8°停止计时器和泵。111.2.2.2.试验数据描述试验数据显示于表中，例如见表22，根据这些数据可以绘制图形表示例如见图2A。111.2.2.3.结果说明当置于pH低于4时轮状病毒被破坏。为了保护病毒，高于pH4的时间是被考虑的。BabyRossett-Rice滴定的结果以时间单位(分钟)表示。其为测定pH值高于4的时间，即所谓的该配方的抗酸能力。在某些情况下，记录了两个值(例如11-12分钟，像表22中配方n。92,其中在llmin时pH为4.08,在12min时pH为3.98，表明在pH4.00的时间与1lmin相比更4妄近于12min)。111.2.2.4.标定用标定的温度计(-10°(3-+50匸范围)测定温度。pH计使用pH7和pH4的商业可得的标准緩冲剂标定。为了获得0.5ml/min,通过相对于时间的体积测定值来调节泵速。蠕动泵为来自IsmatecS.A.ModelMS-Reglo的8滚轮型。为了避免液滴形成，将管道末端在液体水平面以上沿着烧杯壁放置。盐酸0.1N是商业化标准滴定溶液。在未知的抗酸剂样品分析之前用已知标准緩冲溶液校检该试验装置。该标准緩沖溶液是将24.066g磷酸三钠十二水合物(Merck产品n。1.06578.1000)溶于足够的水中获得1升的溶液而制备的。通常，在所描述的BabyRossett-Rice滴定装置中，10ml的该溶液会产生在n°6和7分钟之间发生的9.0的pH(第一磷酸盐pH突跃)，和在n°19和20分钟之间发生的4.0的pH(第二磷酸盐pH突跃)。结果见表42。表42<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>III.3给定配方的折光率测定本发明描述的多个配方是以小体积制备的(例如1.5ml剂量体积及以下)，含有高的蔗糖浓度(例如55%)，并且还必须符合稳定性和抗酸能力的要求。因此，验证配方已成功地制备，并且各组分达到完全溶解可能是重要的。进行该验证的一个简单方法是测定配方的折光率。折光率是公知的简单的测定方法，其既能在羧酸盐緩冲阶段(添加轮状病毒之前)使用，也能在最终的配方步骤(轮状病毒添加之后)使用。III.3.1.方法水溶液的折光率指数是一种标准的测定溶液中蔗糖浓度的方法。折光率对蔗糖浓度的表可以在手册ChemistryandPhysics70th版1989-1990CRCPress,E386页中找到。使用IndexInstrumentAutomaticRefractometerGPRU陽37^f义,将1滴溶液置于该仪器上，并记录折光率。使用水作为标准校验该仪器(1.3330的折光率)。制备若干含有不同量的蔗糖的己二酸盐配方并进行折光率测定。进行重复测定。ni.3.2.结果这些测定的结果显示于图3A和3B。总之，在试验的浓度窗中，糖浓度和其它溶解的成分与测定的折光率之间有线性关系。例如，在配方n。95中，在羧酸盐緩冲阶段各成分完全溶解之后(添加轮状病毒之前)获得1.4578折光率值(在此情况下目标蔗糖浓度为58.5%w/w);而在配方的最终阶段(在添加轮状病毒或者在安慰剂制品情况下添加6%w/wDMEM之后)获得1.4480的折光率(在此情况下目标蔗糖浓度为55%w/w)。在这两种情况下，测定的折光率值均高于58.5%(折光率1.4385)或55%(折光率1.4307)单一的蔗糖水溶液所获得的折光率值，表明该折光率有緩冲制品中其它成分的贡献。III.3.3.结论因此，在工序控制期间，折光率测量法可用于快速地校验配方的全部加入成分的完全溶解。实施例IV-枸橼酸盐磷酸盐緩冲剂的配方-比较实施例IV.1.配方的制备(表43和44)表43<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>'通过才艮据实施例III.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价;"其相当于在2.5ml剂量体积的0.390M'。配方12-16被排除，原因是在4-8。C静置发生重结晶表44-在1.5ml剂量体积中减少的磷酸盐量N。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>°=重复$通过根据实施例m.2.2修改的BabyRossettRice(BRR)试验评价；*配方31和32是以相似日期、不同的从头开始的试验进行重复(分别为配方38和39未显示)。**其相当于在2.5ml剂量体积中的0.271M;即减少的磷酸盐***其相当于在2.5ml剂量体积中的0.0051M;即减少的磷酸盐袅44中配方18-24、26-30的结果的注释配方18-24和30被从长期稳定性研究排除，原因是在37。C下1周稳定试验期间获得不能令人满意的结果。配方26和28被排除，原因是在4-8。C静置发生结晶。配方25、27和29被排除，原因是在4-8。C静置期间结晶风险高。IV.1丄配方l-ll:2.5ml剂量体积配方配方l-ll(见表43)是以325g(250ml)规模制备，相当于100剂量，每剂量2.5ml(3.25g)。抗酸物质NaH2P04.2H20(Mwl56);Na2HP04.2H20(Mwl78);枸橼酸三钠.2H20(Mw294)。液体配方1是如下制备。向125.84g水(定量确定以便达到最终325g制品)中连续地加入7.605gNaH2P04.2H20、8.677g的Na2HP04.2H20、9.555g的枸橼酸三钠.2H20和162.5g的蔗糖。完全溶解后通过在0.2pm膜上过滤将该溶液除菌。在无菌条件下加入含有需要量的轮状病毒的10.82g的DMEM培养基，获得10^ffu/剂量。将该混合物匀化并分装到合适的剂量容器中。在此情况下一剂量由2.5ml或3.25g的最终配制的制品组成。在该实施例中DMEM培养基相当于3.33%w/w。配方2-11是相似地制备(见表43中的成分和比例)。在该系列中，试验了不同量的蔗糖和DMEM。获得了相似的结果，除了用低(20%)蔗糖浓度制备的配方7和11之外，后两个配方未能使轮状病毒充分地稳定。IV.1.2.配方17:2.0ml剂量体积配方配方17(见表43)是以325g(250ml)规模制备，相当于125剂量，每剂量2.0ml(2,60g)。抗酸物质NaH2P04.2H20(Mwl56);Na2HP04.2H20(Mwl78);枸橼酸三钠.2H20(Mw294)。简而言之，称取110.7g水(定量确定以便达到最终325g制品)，并连续加入9.51gNaH2P04.2H20、10.84g的Na2HP04.2H20、U.94g的枸橼酸三钠.21120和162.5g的蔗糖(50%w/w)。在该实施例中使用19.5gDMEM，其相当于6%w/w。IV.1.3.配方12-16:1.5ml剂量体积配方将这些枸橼酸盐/磷酸盐配方的施用剂量体积(详见表43)减少到低于2ml的体积的进一步尝试失败。将用于配方17(2ml剂量体积)的各成分的含量调节至1.5ml剂量体积。该配方在4。C下贮藏，磷酸盐组分的重结晶迅速发生。该现象的原因是在磷酸盐枸橼酸盐组分中Na2HP04的溶解度相当低(见表45)。表45-磷酸盐和枸橼酸盐的理论溶解度限度<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>根据这些参数，尝试以1.5ml剂量体积配制配方17将理论上产生0.65M的最终磷酸盐浓度((0.244M+0.244M)承2/1.5),其高于Na2HP04溶解度数据(0.52M)。为了避免这一磷酸盐的低溶解度问题，建议不使用额外的磷酸盐，并通过利用羧酸形式(R-COOH)与羧酸盐形式(R-COO，之间的平衡调节pH。其实例是在配方100-115中给出的以2.5ml施用体积制备的(见表5)或者以1.5ml施用体积实现的配方128-130(见表6)。IV.1.4.配方25-32和38-40:1.5ml剂量体积配方和减少量的磷酸盐含有减少量的磷酸盐的若干配方(详见表44)是以325g(250ml)规模制备，相当于166.6剂量，每剂量1.5ml(1.95g)。为了补偿该磷酸盐的减少，同时保持可接受的抗酸能力，增加了枸橼酸盐浓度。简而言之，配方25是通过将8.76gNaH2P04.2H20、lO.OOg的Na2HP04.2H20、21.00g的枸橼酸三钠.2H20混合，再连续加入130g的蔗糖(40%w/w)而制备的。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。配方26-29是相似地制备，期待蔗糖和DMEM浓度稍微改变(见表44)。配方30是通过将0.1653gNaH2P04.2H20、0,1884g的Na2HP04.2H20、32.16g的枸橼酸三钠.2!120混合，再连续加入130g的蔗糖(40%w/w)而制备的。在该实施例中DMEM相当于6%w/w。期待蔗糖和DMEM浓度稍;敞改变，配方31和32是相似地制备(见表44)。尽管事实上在配方25-29中总磷酸盐浓度为0.45M，即低于的Na2HPO40.52M的理论溶解度限度，某些配方(例如配方26和28)在+4。C贮藏期间也出现重结晶。这一理论溶解度值与实际溶解度值之间的实际差异可能是由于存在溶解在培养基中的其它组分(蔗糖、枸橼酸盐或其它通过DMEM培养基加入的)，尽管相似配方(实施例配方26和27比较)获得了不一致的结果。当制备要在最短的时间内保持物理稳定性的大规模配方时，该配方试验的变异性与需要的可靠性是矛盾的。再进一步减少配方中磷酸盐的量(见表44中的n。30-32和38-40)得到在4-8。C下病毒稳定性差的结果(见表47)。其它的1.5ml剂量体积配方(18-24)也以没有添加的磷酸盐制备(详见表44)。使用高浓度枸橼酸三钠(438mM)，这些配方的抗酸能力保持在12min的目标值。简而言之，配方18是通过将水143.34g(定量确定以便达到最终325g制品)、32.16g的枸橼酸三钠.2H20混合，再连续加入130g的蔗糖(40%w/w)而制备的。对于配方n。19-23，试验了不同量的蔗糖和DMEM(见表44)。对于配方24，蔗糖是以50%w/w浓度(162.5g)使用的。在这些配方中，DMEM相当于6%w/w。这些配方(n。18-24)的pH超过8.3，在37。C下贮藏1周之后病毒损失高于0.8证明了此时轮状病毒稳定性受到影响。在37。C下快速试验期间这些配方产生差的稳定性，在室温或4。C下未进行中期稳定性计划。这些结果表明，当配方中包含更少的磷酸盐与更多的枸橼酸盐(以保持抗酸能力)时，那么，该配方产生的pH增加更多画在配方25-29中pH约6.7-在配方30-32和38-40中pH约7.7,和-在无磷酸盐配方n。18-24中pH约8.3。如下文所示的(表46和47),那些更高的pH值不利于良好的轮状病毒稳定性。此外，这些结果与配方110-115(见表5)和128-130(见表6)获得的结果一致，在这些配方中pH是通过仅调节枸橼酸/枸橼酸钠比例(为此没有添加的磷酸盐)而校正。IV.2.轮状病毒病毒滴度和抗酸能力在不同时间点的轮状病毒病毒滴度已根据实施例III.l给出的操作进行了评价，并且该配方的抗酸能力已按实施例m.2给出的方案进行了评1介。结果i兌明于表46和47。表46-在室温下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>空白格=未测定°°配方7、11和38从长期稳定性中排除，原因是在37。C下1周期间获得差的结果表47-在4°C下的病毒稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>*NA=未得到-室温下稳定性试验期间失败空白格=未测定IV.3.结果和结论配方2-3(2.5ml的剂量体积)和配方17(剂量体积从2.5ml减至2ml):如表46和47所示，病毒滴度l-log损失是由配方2、3和17在室温下的6月贮藏产生的。在4。C下，在长达12月的贮藏期间无明显的病毒滴度损失。配方25、27、29和31-32(剂量体积减至1.5ml):在室温下，病毒滴度l-log损失通常是在3月或更早达到的，除了配方29之外，其经过4月的时间。如上所述，配方25至27在4。C下贮藏期间重结晶，由此表明磷酸盐浓度减少是不充分的。因此该配方不适合在4。C下应至少1年的贮藏期。当再进一步减少磷酸盐浓度时(配方30-32)，最终配方的pH增加，原因是枸橼酸盐的量相对增加，这对于维持相同的抗酸能力值是需要的。这一pH的增加影响了轮状病毒的稳定性，并且在室温稳定性研究期间能迅速地被检测。当将磷酸盐从配方(配方18和24)中完全去掉时证明了这些趋势。实施例IV的全部结论这些结果显示，为了达到低于2ml的剂量体积，与2.5ml的剂量体积相比，存在于配方中的磷酸盐的量必需减少，原因是它的相当低的水中溶解度以及它的重结晶倾向(propency)。结果，为了保持同样的抗酸能力目标值(即通过BRR试验评价，至少8min的最小值，适合的至少12min),枸橼酸盐量必需增加。这就导致配方的最终pH增加，这对于液体配方中的轮状病毒的稳定性是不利的。实施例V-另外的配方制备如下配方(表48)，但是未包括在长期稳定性计划中，因为未能符合至少1种设定标准。排除某些配方的具体原因在表48的注释栏中说明。表48<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>131.5ml枸橼酸盐；磷酸盐40%蔗糖IV.1表43在+4'C下静置结晶141.5ml枸橼酸盐；磷酸盐40%蔗糖IV.1表43在+4'C下静置结晶151.5ml枸橼酸盐；磷酸盐45%蔗糖IV.1表43在+4'C下静置结晶161.5ml枸橼酸盐；磷酸盐45%蔗糖IV.1表43在+4'C下静置结晶181.5ml枸橼酸盐；40%蔗糖；pH8.42IV.l表44在37C下l周，〉llog损失191.5ml;枸橼酸盐；40%蔗糖；pH8.42IV.1表44在37。C下l周，〉llog损失201.5ml;枸橼酸盐；40%蔗糖；pH8.31IV.1表44在37。C下l周，〉llog损失211.5ml;枸橼酸盐；45%蔗糖；pH8.35IV.1表44在37。C下1周，>1log损失221.5ml;枸橼酸盐；45%蔗糖；pH8.35IV.1表44在37。C下1周，>1log损失231.5ml;枸橼酸盐；45%蔗糖；pH8.37IV.1表44在37。C下1周，>1log损失241.5ml;枸橼酸盐；50%蔗糖；pH8.31IV.1表44在37。C下1周，>1log损失251.5ml;枸橼酸盐；磷酸盐；40%蔗糖IV.1表44在+4。C下有结晶风险261.5ml;枸橼酸盐；磷酸盐；40%蔗糖IV.1表44在+4'C下静置结晶271.5ml;枸橼酸盐磷酸盐；40%蔗糖IV.l表44在+4'C下有结晶风险281.5ml;枸橼酸盐磷酸盐；45%蔗糖IV.1表44在+4'C下静置结晶291.5ml;枸橼酸盐磷酸盐；45%蔗糖IV.l表44在+4'C下有结晶风险301.5ml;枸橼酸盐磷酸盐40%蔗糖IV.l表44在37。C下1周，>0.8log损失331.5ml;乙酸盐+4丐IU表10在37'C下1周，〉1log损失341.5ml;乙酸盐+4丐表10在37。C下1周，>1log损失<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>实施例VI-两种口服剂量的人单价轮状病毒液体疫苗在健康婴儿中的n期免疫原性、反应原性和安全性vi丄引言进行随机、双盲、安慰剂对照的n期试验评价含有人减毒GiP8轮状病毒林(以保藏编号99081301保藏在ECAAC-见WO01/12797)的疫苗对婴儿免疫接种的免疫原性、反应原性和安全性。该研究在芬兰的多个研究中心进行。研究设计概况在图4中给出。在该试验中，将第一剂量的疫苗，或候选HRV(人轮状病毒)疫苗的液体配方(N-100)或HRV疫苗的冷冻千燥配方(N400),以及各自的安慰剂(2组，每组N二25)施用于约2.5月龄(6至12周龄)婴儿，在第一次去看医生时。将第二剂量施用于约3.5月龄(在第二次去看医生时，一般是第一剂量后4周)。第二剂量之后1月进行随访，约4.5月龄抽血并评价免疫原性。临床试验是随机的、安慰剂对照的和自主式的。总计250名受试者加入，每一HRV组100人，每一安慰剂组25人。在各HRV疫苗配方及其各自的安慰剂之间以双盲方式进行。然而，2个不同配方盲之间在技术上是不可能的。根据当地的实践，可进行常规的儿童期接种，但与HRV疫苗的每一剂量隔开至少14天。VI.2.疫苗概述具体地说，所使用的疫苗包括以ECACC保藏号9卯81301(WO01/12797)保藏的减毒Gl人抹轮状病毒组分。该疫苗是来自89-12HRV抹的减毒的人轮状病毒(HRV)候选疫苗，其属于血清型G1P1A和基因型[P8],是从美国Cincinnati的15月龄儿童的粪便分离的。在2年的前瞻性研究中，用89-12株自然感染显示提供了保护作用，防止继发性疾病并防止童复感染(BernsteinDI，etal.Protectionfromrotavirusreinfection:2yearsprospectivestudy.JInfectDis.1991;164:277-83)。在穿过胃期间抗酸剂可预防HRV的失活。表49比较了己二酸盐液体配方和根据WO01/12797制备的冷冻干燥配方的组成，并且证明在大规模临床试验中是有效的(DeVos等.PediatrInfectDisJ.2004Oct23(10增刊)S179誦82)。表49HRV疫苗的己二酸盐液体配方和冷冻千燥配方的定量组成(标称剂量)<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>*BRR=BabyRossett-Rice(BRR)滴定试验测定抗酸物质与O.IN盐酸的反应速率以及维持pH超过4的持续时间。参见实施例III.2.2中的操作。将单剂量配制的己二酸盐液体HRV疫苗按关于医药品等制造和质量管理的最佳标准(GMP)填充到单剂量玻璃注射器中。轮状病毒病毒滴度(即轮状病毒效价)可以根据实施例III.l中详述的操作，使用MA104感染细胞，通过间接免疫荧光法筌别进行测定。另选的，它是采用通过直接免疫荧光法使用特异性抗-轮状病毒抗体检测的病毒，进行病毒对MA104细胞的体外滴定而测定的。该方法测定了细胞培养物50%感染的剂量，轮状病毒滴度是以细胞培养物感染剂量中间值(CCID5o)表达的。评价了测定之间和之内的重现性，并且得到相同的结果(变异性估计为0.31og)。VI.3.施用VI.3丄HRV疫苗或安慰剂的冷冻千燥配方为了制备供施用的疫苗或安慰剂，将一个含有碳酸钙緩冲溶液的预填充注射器的全部内容物注射到冷冻千燥产品的瓶中(疫苗或安慰剂)，然后将再次混悬的产物以单次口服剂量平稳施用。VI.3.2.HRV疫苗或安慰剂的液体配方使用之前将预填充玻璃注射器振摇。然后将该产物(疫苗或安慰剂)以单次口服剂量平稳施用。VI.4.安全性和反应原性搜集以下安全性和反应原性的依据征求的一般性不良事件为发热、易激惹/易激怒(fussiness)、腹泻、呕吐、食欲不振和咳嗽/鼻漏(runnynose)。使用提供给受试者的父母/监护人的日志卡片记录观察到的症状，在各研究疫苗给药后15天期间记录上述症状。各次就诊之间发生的全部胃肠炎事件(腹泻)均用文件证明，并收集粪便样品(至迟在胃肠炎发生之后的7天)。记录在各次给药后31天之内发生的未征求的不良事件。在整个研究期间记录严重的不良事件。VI.5.实-验室测定VI.5丄粪便分析在各研究疫苗服用当天或之前一天、在各次服用后第7±1天和第15±1天、以及第3次就诊当天或之前一天，将收集的全部受试者的粪便样品在GSKBiologicals或GSKBiologicals指定的实验室分析，使用评价病毒脱落的酶联免疫吸附测定(ELISA-见第VI.6.1部分)，以检测疫苗RV的存在。在第1剂量之后到第3次就诊的预定时间点收集的任何粪便中，通过ELISA证明的轮状病毒抗原的存在被认为是疫苗病毒脱落，并作为疫苗应答(即疫苗反应)的证据，假定在HRV疫苗或安慰剂的第1剂量的当天，该受试者轮状病毒呈阴性。以此情况，对安慰剂受试者进行了检验程序设计。最初轮状病毒呈阴性的受试者被定义为这样的受试者，即，在接种之前的时间点，该受试者血清中的抗-轮状病毒IgA抗体以及粪便样品中的轮状病毒抗原呈阴性，如果两结果均有效；或者，该受试者这些指标中的至少一个呈阴性，如果仅一个结果有效。并且，第1次就诊直至第3次就诊的各GE事件期间收集的粪便样品在GSKBiologicals或由GSKBiologicals指定的实验室使用ELISA试验以检测RV。如果是阳性，使用基于PCR的方法测定G型。这些分子方法靶向VP7基因中的区域，该VP7基因在各不同G型之间非常不同的，并且在各给出的G型中非常保守。例如，由Gouvea等(1990,JClinMicrobiol.，28:276-282)开发的RT画PCR方法，使用了不同的基因型-特异性引物的鸡尾酒，该引物位于VP7基因的不同区域。由凝胶电泳法测定的产生的PCR产物的量提供了识别相应G-基因型的信息。如果任何GlRV被检测，通过序列分析或等效方法将疫苗病毒与野生型的血清型区别开。在直到第3次就诊收集的任何粪便中，疫苗病毒的任何检出被作为疫苗应答(即疫苗反应)的证据。VI.5丄血清分析在各次研究就诊中从受试者采集的全血样品所获得的血清通过ELISA在GSKBiologicals指定的实验室试验，以测定血清抗-轮状病毒IgA抗体浓度。该测定截断值为20U/ml。抗-轮状病毒IgA抗体的血清阴性受试者被确定为抗体浓度低于测定截断值的受试者。抗-轮状病毒IgA抗体的血清阳性受试者被确定为抗体浓度高于或等于测定截断值的受试者。VI.6.免疫原性血清分析VI.6.1.通过ELISA的IgA抗体测定该测定法使在人血清中检测轮状病毒IgA成为可能，并且最初由R.Ward(l，2)设计并由GSKBiologicals修改。该测定法用于测定在接种和/或感染之后的免疫应答。在GSKBiologicals，Rixensart,Belgium(或指定的实验室)分析样品。ELISA测定的说明通过用抗-轮状病毒抗体稀释物过夜培养将96-孔板涂覆。将各孔洗;争动平台上培养之i，洗涤各板，^再将'i清样品或标准血清的稀释物在两种类型的孔中培养(阳性和阴性)。阴性孔用于评价非特异性IgA结合。洗涤各板，通过添加生物素化的兔抗人IgA(搅拌30分钟)检测结合的人IgA。洗涂各板之后，以最佳浓度的过氧化物酶结合的亲和素-生物素加至各孔中并培养(30分钟，室温，搅拌)。将各板再次洗涤，并加入邻苯二胺(OPD)。然后将各板培养(30分钟，室温(RT)暗处)，接着用2NH2S04终止反应。在490/620nm处测定光吸收。通过测定阳性和阴性孔之间的差异计算各样品/标准品的比光密度。通过使用由标准曲线生成的四参数逻辑函数测定各样品的浓度。确定用于结果计算的标准曲线的最精确部分(工作范围)。通过求算落入标准曲线的工作范围内的各未知值平均数，与标准品(浓度4000U/ml)比较计算以单位/毫升(U/ml)计的抗体浓度，然后用稀释因子校正。各个试验均包括阴性和阳性对照。对于全部试剂，最佳浓度是预先确定的。参考文献1.BernsteinDI,SmithVE,SherwoodJRetal.Safetyandimmunogenicityofaliveattenuatedhumanrotavirus89-12vaccine.Vaccine.1998;16:381-7.2.BernsteinDI,SackDA，RothsteinEetal.Efficacyofliveattenuatedhumanrotavirusvaccine89-12ininfants:arandomisedplacebo-controlledtrial.Lancet1999;354:287-卯.VI.7.结果抗-轮状病毒IgA抗体应答表51显示了抗-轮状病毒IgA抗体GMC和血清转化率(总接种同期群组的免疫原性)。表52显示了，以总接种同期群组计，以抗-轮状病毒IgA抗体血清阳性受试者计算的抗-轮状病毒IgA抗体GMC。就血清转化率而言，在第二剂量之后1月，抗体对HRV疫苗的应答在各疫苗组两者中是相似的(HRV一Lyo组为82.2%,HRV—Liq组为90.1%)。在混合的安慰剂组中，第二剂量之后1月血清转化受试者为0%,表明该研究是在该群体中无野生型感染时进行的。表51抗-轮状病毒IgA抗体GMC和血清阳性率一总接种同期群组的免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>1.N二有效结果的受试者的数目2.11/%=浓度高于截断值的受试者的数目/百分数3.95%(31=95%置信区间；Ll^下限，UI^上限4.PRE—矣种前5.PI(M1)=HRV疫苗或安慰剂的第1剂量之后1月(第2次就诊)6.PII(M2)=HRV疫苗或安慰剂的第2剂量之后1月(第3次就诊)7.数据库发布07DEC2005表52以抗-轮状病毒IgA抗体血清阳性受试者计算的抗-轮状病毒IgA抗体GMC—总接种同期群组的免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>1.N-抗-轮状病毒IgA抗体血清阳性受试者的数目2.95%(^1=95%置信区间；Ll^下限，UL-上限3.PI(M1)=HRV疫苗或安慰剂的第I剂量之后1月(第2次就诊)4.PII(M2)=HRV疫苗或安慰剂的第2剂量之后1月(第3次就诊)5.数据库发布-07DEC2005VI.8.结论就血清转化速率而言，免疫原性在两个疫苗配方之间是相似的。当根据O、1月时间表施用于儿童时，疫苗的液体配方是非常具有免疫原性的。由于IgA是一种轮状病毒疫苗的效能的良好标记物，这些数据支持了在临床中试验配方的保护作用。权利要求1.一种适合口服施用于人类婴儿的液体轮状病毒免疫原性组合物，包括轮状病毒抗原、糖类和羧酸盐，其中所述配方具有约pH5.0至约pH8.0的pH，并且包括低于5mM磷酸盐。2.根据权利要求1所述的液体组合物，其中所述组合物包括低于lmM磷酸盐。3.根据权利要求2所述的液体组合物，其中所述组合物包括低于O.lmM磷酸盐。4.根据权利要求1至3任意一项所述的液体组合物，其中所述组合物不含磷酸盐。5.根据权利要求1至4任意一项所述的液体组合物，其中所述组合物的pH为约pH5.5至约pH7.5。6.根据权利要求5所述的液体组合物，其中所述组合物的pH为约pH6.0至约pH7.0。7.根据权利要求1至6任意一项所述的液体组合物，其中所述羧酸盐是由pKa〉4的羧酸得到的，或者由平均pKa>4的二-或三-羧酸得到的。8.根据权利要求6或7所述的液体组合物，其中所述羧酸盐选自己二酸盐、枸橼酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、丙酸盐、丁酸盐、丙二酸盐、戊二酸盐、马来酸盐、羟乙酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐、富马酸盐、酒石酸盐，以及它们的两种或多种的^f壬意组合。9.根据权利要求8所述的液体组合物，其中所述羧酸盐是己二酸盐。10.根据权利要求1至9任意一项所述的液体组合物，其中所述羧酸盐是以约5OmM至约2M的浓度存在。11.根据权利要求10所述的液体组合物，其中所述羧酸盐是以约100mM至约1M的浓度存在。12.根据权利要求11所述的液体组合物，其中所述羧酸盐是以约400mM至约700mM的浓度存在。13.根据权利要求1至12任意一项所述的液体组合物，其中所述糖类选自甘油、赤藓糖、赤藓醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、塔格糖(tagalose)、甘露糖、半乳糖、果糖、肌醇、山梨醇、甘露醇、半乳糖醇、葡萄糖和果糖组合、麦芽糖、槐糖、乳糖、纤维二糖、蜜二糖、海藻糖、蔗糖、帕拉汀糖(palatinose)、麦芽酮糖(maltulose)、乳果糖、麦芽糖醇、拉克替醇、棉子糖、麦芽三糖、松三糖、纤维三糖、ciritol、麦芽四糖、水苏糖、纤维四糖、麦芽五糖、纤维五糖、麦芽六糖、纤维六糖、寡糖类。14.权利要求13所述的液体组合物，其中所述糖类是蔗糖或右旋糖。15.根据权利要求1至14任意一项所述的液体组合物，其中所述糖类的浓度为约lw/w至约70%w/w。16.根据权利要求15所述的液体组合物，其中所述糖类的浓度为约25w/w至约60%w/w。17.根据权利要求16所述的液体组合物，其中所述糖类的浓度为50%w/w或55%w/w。18.根据权利要求1至17任意一项所述的液体组合物，还包括羧酸。19.根据权利要求18所述的液体组合物，其中所迷羧酸选自己二酸、枸橼酸、苹果酸、乙酸、琥珀酸、碳酸、丙酸、丁酸、丙二酸、戊二酸、马来酸、羟乙酸、乳酸、葡萄糖酸、富马酸、酒石酸。20.根据权利要求1至19任意一项所述的液体组合物，进一步包括钙离子。21.根据权利要求1至20任意一项所述的液体组合物，其中所述轮状病毒抗原是活轮状病毒，例如活减毒轮状病毒。22.根据权利要求21所述的液体组合物，其中所述活减毒轮状病毒是活减毒人轮状病毒。23.根据权利要求22所述的液体组合物，其中所述活减毒人轮状病毒选自以登记编号ATCCVR2272保藏的HRV89-12C2林，其子代、重配林及免疫活性繁衍物；以登记编号ECACC99081301保藏的HRVP43林，其子代、重配林及免疫活性繁衍物。24.根据权利要求1至23任意一项所述的液体组合物，其中所述组合物具有通过BabyRosett-Rice测定法评^介的至少8分4中的抗酸能力。25.根据权利要求24所述的液体组合物，其中所述组合物具有通过BabyRosett-Rice测定法评〗介的至少12分4中的抗酸能力。26.根据权利要求24所述的液体组合物，其中所述组合物具有通过BabyRosett-Rice测定法评^介的8至23分4中的抗酸能力。27.根据权利要求25所述的液体组合物，其中所述组合物具有通过BabyRosett-Rice测定法评价的12至23分钟的抗酸能力。28.根据权利要求25或27所述的液体组合物，其中所述组合物具有通过BabyRosett-Rice测定法评价的12至20分钟的抗酸能力。29.根据权利要求1至28任意一项所述的液体组合物，其中所述组合物在至少一种下列条件下是稳定的在37。C下7天、在4。C下1年、在4。C下2年。30.根据权利要求1至29任意一项所述的液体组合物，其为疫苗。31.如权利要求1至30任意一项所述的液体组合物，其中所述组合物是以0.2ml至2.0ml的剂量体积提供。32.如权利要求31所述的液体组合物，其中所述组合物是以0.5ml至1.5ml的剂量体积提供。33.如权利要求32所述的液体组合物，其中所述组合物是以约1.5ml的剂量体积提供。34.轮状病毒抗原、糖类和羧酸盐在制备用于治疗或预防轮状病毒相关疾病的免疫原性组合物中的用途，其中所述免疫原性组合物具有约pH5.0至约pH8.0的pH,并且包括低于5mM磷酸盐。35.人活减毒轮状病毒在制备如权利要求1至30任意一项的用于预防轮状病毒相关疾病的液体组合物的用途。36.根据权利要求34或35的用途，其中所述预防或治疗包括向婴儿施用两个口服剂量的安全、有效量的人活减毒轮状病毒组合物，在第1剂量时该婴儿在4-15周龄内。37.—种通过向需要的人受试者施用有效量的根据权利要求1至30任意一项的液体配方以预防或治疗人类轮状病毒相关疾病的方法。38.用于预防人类轮状病毒感染的如权利要求34至36任意一项的用途或如权利要求37的方法。39.用于预防人类轮状病毒胃肠炎的如权利要求34至36任意一项的用途或如权利要求37的方法。40.用于预防人类轮状病毒严重胃肠炎的如权利要求39的用途或方法。41.如权利要求38至40任意一项的用途或方法，其中所述的胃肠炎或严重胃肠炎是由与包含于所述液体配方中的轮状病毒抹不同血清型的轮状病毒抹引起。42.如权利要求34至36和38至41的任意一项的用途或如权利要求37至41的任意一项的方法，其中所迷组合物是以0.2ml至2.0ml的剂量体积提供。43.如权利要求42所述的用途或方法，其中所述组合物是以0.5ml至1.5ml的剂量体积提供。44.如权利要求42或43所述的用途或方法，其中所述组合物是以约1.5ml的剂量体积提供。45.—种制备根据权利要求1至33任意一项的液体轮状病毒组合物的方法，包括将轮状病毒抗原、糖类和羧酸盐与药学可接受的稀释剂混合。全文摘要本发明提供了适合口服施用于人类婴儿的液体轮状病毒配方。本发明尤其提供了包括轮状病毒抗原、糖类和羧酸盐的药物组合物和疫苗，其中所述配方具有pH5.0至pH8.0的pH，并且未包括磷酸盐或者包括低于5mM磷酸盐。本发明还提供了制备所述轮状病毒配方的方法以及它们在预防或治疗人类轮状病毒相关疾病中的用途。文档编号A61P1/00GK101300028SQ200680005318公开日2008年11月5日申请日期2006年2月15日优先权日2005年2月17日发明者V·范德韦尔德申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司