专利名称：：多价hiv疫苗的制作方法
技术领域：
：总体上，本发明涉及含有多价HIV包膜(Erw)糖蛋白的组合物。本发明还涉及利用这些组合物引发免疫应答，例如引发广泛的中和抗体应答的方法。
背景技术：
：二十世纪晚期最具破坏性的疾病之一是HIV感染所致的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)(参见，例如Barre-Sinoussi等，(1983)Sc/e"ce220:868-871;Gallo等，(1984)Sc/e"ce224:500-503;Levy等，(1984)Sc/e"ce225:840-842;Siegal等，(1981)/MW.305:1439-1444)。已知HIV有几种毒株，包括HIV-1，其代表在欧洲或美洲分离的几种毒株的总称；和HIV-2，一种许多西非国家的地方性毒株。系统发生分析将HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV)分成三群，M群(主要)、O群(局外)和称为N群的HIV-1变体，其在喀麦隆集中鉴定到(Simon等，(1998)A^.MW.4:1032-1037)。所有3种HIV-1群均导致AIDS。AIDS患者通常长期无症状，然后免疫系统和中枢神经系统逐渐退化。病毒的复制受到严格调节，在组织培养物中均会发生T-淋巴细胞的CD4阳性辅助亚群的潜伏性和裂解性感染(Zagury等，(1986)Sc/e"ce231:850-853)。HIV-1的分子研究显示其编码许多基因(Ratner等，(1985)A^we313:277-284;Sanchez-Pescador等，(1985)Sc/e"ce227:484-492)，包括所有逆转录病毒共有的三种结构基因(gag、pol和env)。其它逆转录病毒，特别是HIV-2和猿免疫缺陷病毒，SIV(以前称为STLV-III)的病毒基因组的核苷酸序列也含有这些结构基因(Guyader等，(1987)A^^"326:662-669)。HIV-1、HIV-2和SIV的包膜蛋白是约160kd的糖蛋白(gp160)。在宿主细胞的病毒感染期间，宿主细胞蛋白酶切割gpl60从而形成gpl20和膜内在蛋白，gp41。gp41部分锚定在病毒颗粒的膜双层中，而gpl20区段伸入周围环境中。gpl20和gp41无共价结合，游离gpl20可以从病毒颗粒和受感染细胞的表面释放。对能与CD4和/或共同受体进行配体结合的gpl20进行晶体学研究表明该多肽折叠成具有特定散发结构(emanatingstructure)的两个主要结构域。内部结构域(对于N和C末端而言的内部)的特征在于两-螺旋、两-链束，在其末端近端具有小的五-链束夹心，而在其远端具有突出部分，Vl/V2茎从该处伸出。外部结构域是沿内部结构域的叠加双屏障(stakeddoublebarrel),从而使得外部屏障和内部束轴几乎平行。远端内部结构域和远端外部结构域之间是四-链桥连片层(four-strandedbridgingsheet),其使得特有的小结构域(minidomain)与内部结构域、外部结构域和Vl/V2结构域保持接触(但不同)。桥连片层由4个(3-链结构((5-3、(3-2、(3-21、p-20)构成。桥连区域主要包在内部结构域上，虽然外部结构域的一些表面残基，例如Phe382进入该桥连片层，从而形成其疏水核心的一部分。也可参见WO00/39303。Chen等((2005)A^w"433:834-841)最近证明，不与配体结合时Env糖蛋白(例如，SIVEnv)显示极为不同的结构。还研究了HIVEnv多肽的免疫原性，但未观察到广泛的中和抗体应答。参见，例如Javaherian，K等，(1989)TVoc.7Va"爿cfldSc/.86:6786-6772;Matsushita,M等，(1988)P7ra/.62:2107-2144;Putney,S等，(1986)Sc/e"ce234:1392-1395;Rushe，J.R等，(1988)iVoc.7VaA爿cacf.85:3198-3202;Matthews,T.(1986)7W^/.^ca^.Sc〖.83:9709-9713;Nara，P.L等，(1988)/.f7ro/.62:2622-2628;Palker，T.J等，(1988)Prac.A^/.v4cad"&485:1932-1936);Stamatatos等，(1998)Hwm7"画y廳14(13):1129-1139;Wyatt,R等，(1995)/69:5723-5733;Leu等，(1998)J/DSawc//wmaw及e&ov/n^es14:151-155。因此，仍需要能在对象中引发广泛的中和抗体应答的组合物。发明概述本发明涉及多价HIV包膜(Env)组合物。在一具体实施方式中，HIVEnv组合物包含两种或更多种(至少两种)HIV包膜多肽，其中包膜多肽中至少有两种各来自不同的HIV亚型。在另一实施方式中，HIVEnv组合物包含三种或更多种(至少三种)HIV包膜多肽，其中包膜多肽中至少有三种各来自不同的HIV亚型。在进一步的实施方式中，HIVEnv组合物包含一种或多种佐剂(MF59、CpG分子、微粒如PLG微粒、明矾等)。在一具体实施方式中，HIVEnv组合物包含免疫增强剂分子，例如CpG。因此，在某些实施方式中，本发明涉及包含两种或更多种(至少两种)添加了佐剂的HIVEnv糖蛋白的多价组合物。在其它实施方式中，多价HIVEnv组合物包含两种或更多种(至少两种)HIV包膜多肽，其中包膜多肽中至少有两种各来自不同的HIV类型(例如，HIV-1、HIV-2)。在还有其它实施方式中，多价HIVErw组合物包含两种或更多种(至少两种)HIV包膜多肽，其中包膜多肽中至少有两种各来自同一亚型的不同毒株(例如，HIV-1SF2、HIV-1SF162、HIV-lcM235等)。在某些实施方式中，HIVEnv糖蛋白包含gp120。在其它实施方式中，HIVEnv糖蛋白包含gp140。在还有其它实施方式中，HIVEnv糖蛋白包含gp160。在本文所述的任何组合物中，HIVEnv糖蛋白可以表达成单体或寡聚形式。在一具体实施方式中，HIVEnv糖蛋白包含寡聚gpl40(o-gp140)。在另一实施方式中，HIVEnv糖蛋白包含缺失V2环的一部分的寡聚gp140。在另一实施方式中，HIVEnv糖蛋白包含缺失VI环的一部分的寡聚gpl40多肽、缺失V3环的一部分的寡聚gpl40多肽或具有突变的蛋白酶切割位点的寡聚gpl40多肽。在具体的实施方式中，本文所述的多价组合物包含两种或更多种亚型的HIVEnv多肽，所述亚型选自亚型A(例如A1、A2)、B、C、D、F(例如Fl、F2)、G、H、J和K。在其它实施方式中，本文所述的多价组合物还包含两种或更多种亚型的HIVEnv多肽，所述亚型选自亚型A(例如A1、A2)、B、C、D、F(例如F1、F2)、G、H、J和K及循环重组形式(CRF)。在还有其它实施方式中，本文所述的多价组合物还包含两种或更多种亚型和/或CRF的HIVEnv多肽。CRF在本领域及本文中也称为亚型E和I。因此，多价组合物可包含两种或更多种亚型或CRF的HIVEnv多肽，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种亚型和/或CRF的HIVEnv多肽。在某些实施方式中，多价组合物包含亚型A和B的HIVEnv糖蛋白。在其它实施方式中，多价组合物包含亚型A和C的HIVEnv糖蛋白。在进一步的实施方式中，多价组合物包含亚型B和C的HIVEnv糖蛋白。在其它实施方式中，多价组合物包含亚型A、B和C的HIVEnv糖蛋白。在还有其它实施方式中，多价组合物包含亚型A、B和E的HIVEnv糖蛋白。在其它实施方式中，多价组合物包含亚型A和B;A和C;A和E;B和C;B和E;或C和E的HIVEnv糖蛋白。在某些实施方式中，HIVEnv糖蛋白与一种或多种其它分子(配体)形成复合物，所述其它分子选自CD4、CD4模拟物、CCR5共同受体或模拟物、tat、其它病毒蛋白、多核苷酸、多肽、小分子和它们的组合。在一具体实施方式中，本文所述的多价HIVEnv糖蛋白组合物包含一种或多种佐剂(例如，MF59,CpG分子，微粒如PLG微粒，明矶等)。在某些实施方式中，佐剂包含MF59。在其它实施方式中，佐剂包含一种或多种CpG分子。在还有其它实施方式中，佐剂包含MF59和一种或多种CpG分子。在还有其它实施方式中，佐剂包含明矾和/或一种或多种微粒(例如，PLG微粒)。另一方面提供了编码本文所述任何多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，这些多核苷酸由基因递送运载体，例如质粒、病毒载体(例如，腺病毒载体、痘病毒载体、(X病毒载体等)或非病毒递送载体携带。另一方面提供了包含本文所述任何多肽、多核苷酸和/或基因递送运载体的免疫原性组合物和疫苗组合物。还有另一方面提供了在对象中诱导免疫应答(例如，先天的、体液应答，如中和抗体应答和/或细胞免疫应答)的方法，包括将用量足以在对象中诱导免疫应答的本文所述任何组合物、多核苷酸和/或多肽给予对象。在某些实施方式中，这些方法包括在第一致敏步骤中给予包含本文所述任何多核苷酸的第一组合物和(b)给予包含本文所述任何添加佐剂的Env糖蛋白的第二组合物作为加强剂，其用量足以在对象中诱导免疫应答。在任一方法中，可以DNA(例如，质粒)或利用病毒(例如，腺病毒、痘病毒和/或a病毒)或非病毒载体递送多核苷酸。在某些优选的实施方式中，致敏步骤包括给予包含本文所述多核苷酸的一种或多种a病毒和/或痘病毒和/或腺病毒载体，加强步骤包括给予本文所述含有一种或多种多价HIVEnv糖蛋白的组合物。此外，在任何方法中，组合物能引发抵御各种毒株的HIV感染的保护性免疫应答。在某些实施方式中，本文所述方法诱导针对组合物中HIVEiw糖蛋白所代表亚型的保护性免疫应答。本文所述方法优选诱导针对多价Env糖蛋白所代表亚型的保护性免疫应答，此外优选诱导针对多价组合物中未代表的至少一种亚型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或甚至更多种亚型)的毒株的保护性免疫应答。在还有另一方面，本发明包括通过将用量足以在对象中诱导免疫应答的本文所述任何组合物、多核苷酸和/或多肽给予对象，从而提高对象免疫应答的效力、持续时间和/或广度的方法。在某些实施方式中，这些方法包括在第一致敏步骤中给予包含本文所述任何多核苷酸的第一组合物和(b)给予包含本文所述任何添加佐剂的Env糖蛋白的第二组合物作为加强剂，其用量足以在对象中诱导免疫应答。在任一方法中，可作为配制的或未配制的DNA(例如，含或不含运载体的质粒)或利用病毒(例如，腺病毒、痘病毒和/或a病毒)或非病毒载体递送多核苷酸。在某些优选的实施方式中，致敏步骤给予包含本文所述多核苷酸的一种或多种a病毒和/或腺病毒载体，加强步骤包括给予本文所述含有一种或多种多价HIVEiw糖蛋白的组合物。因此，某些实施方式描述了诱导保护性免疫应答的方法，例如其中这些组合物能保护免遭衍生多价组合物中HIVEnv糖蛋白的各亚型毒株感染。此外，这些组合物还可保护免遭所给予的组合物中未代表的亚型毒株感染。例如，可利用添加佐剂的多价HIVEnv糖蛋白(含有衍生自亚型B毒株和亚型C毒株的HIVEnv糖蛋白)实现在对象中诱导针对亚型A、B和C的HIV毒株的保护性免疫应答的方法；可利用添加佐剂的多价HIVEiw糖蛋白(含有衍生自亚型B毒株和亚型C毒株或亚型B毒株和亚型E毒株的HIVEnv糖蛋白)实现在对象中诱导针对亚型A、B、C和E的HIV毒株的保护性免疫应答的方法；等等。借鉴本文内容，本领域技术人员不难知道本发明的这些和其它实施方式。附图简述图1A和1B所示表格描述了用添加佐剂的HIVEnv糖蛋白组合物免疫的家兔在第三次免疫后两周和葶四次免疫后两周所得血清对HIV亚型B的中和情况。阴影或带框的阴影分别表明测试毒株中有>50%或>80%的病毒中和。图2描述了用竖条下所示各种添加佐剂的含gpl40的组合物免疫家兔后，抵御HIVSF162毒株的中和抗体滴度。显示了各组合物在采血前(浅色，左竖条)、第三次免疫后两周(灰色，中间竖条)和第四次免疫后两周(黑色，右竖条)的滴度。图3描述了用竖条下所示各种添加佐剂的含gpl40的组合物免疫家兔后所得血清对HIVSF162毒株的80。/。几何平均中和滴度(GMT)。显示了各组合物在采血前、第二次免疫后两周、第三次免疫后两周、第四次免疫后两周和第四次免疫后六个月的抗体滴度。结果显示在所有组中均引发了针对SF162的高中和抗体滴度。图4描述了用所示各种添加佐剂的含Erw糖蛋白的组合物免疫家兔后所得血清对HIVSF162毒株的80。/。几何平均中和滴度(GMT)。显示了第二次免疫后两周、第三次免疫后两周和第四次免疫后两周的结果。结果显示添加MF59和CpG佐剂均增强了针对SF162的中和抗体应答。图5描述了用沿横轴所示各种添加佐剂的含Env糖蛋白的组合物免疫家兔后所得血清对HIVSF162毒株的80%中和抗体滴度。显示了第四次免疫后两周的结果。结果显示CpG免疫组中引发的中和抗体应答明显增强。图6描述了用沿横轴所示各种添加佐剂的含Env糖蛋白的组合物免疫家兔后所得血清对HIVSF162毒株的80%中和抗体滴度。显示了第四次免疫后两周的结果。结果显示用MF59进行二价免疫提高了针对SF162的中和抗体滴度。图7描述了用沿横轴所示各种添加佐剂的含Env糖蛋白的组合物免疫家兔后所得血清对HIVSF162毒株的80%中和抗体滴度。显示了第四次免疫后两周的结果。结果显示用MF59加CpG进行二价免疫使得针对SF162的中和抗体滴度明显高于单独针对TV1的。图8所示表格描述了比较左侧所示免疫组在不同时间针对SF162的几何平均中和滴度的尸值。如图5所示计算尸值。阴影表明各组之间差异明显。显示了第二次免疫后两周、第三次免疫后两周、第四次免疫后两周和第四次免疫后六个月的结果。结果显示早在第二次免疫后两周便观察到针对HIVSF162毒株的组几何平均滴度(GMT)有显著差异。图9描述了用沿横轴所示各种添加佐剂的含Env糖蛋白的组合物免疫家兔后所得血清对HIVSF162毒株的50%中和抗体滴度。显示了采血前、第二次免疫后两周、第三次免疫后两周和第四次免疫后两周的结果。第三次免疫后两周血清的背景滴度水平是25，其余血清样品的背景滴度水平是20。结果显示只在含CpG的组中引发了TV1.21中和抗体应答。发明详述除非另有表述，实施本发明将采用本领域技术人员已知的蛋白质化学、病毒免疫生物学、分子生物学和重组DNA技术等常规方法。参考文献中充分解释了这些技术。参见，例如T.E.Creighton，《蛋白质结构和分子特性》(/Voe/mv5Yrw由re51Mo/ecw/ar尸ro/eWe力(W.H.F.公司(W.H.FreemanandCompany),1993);NelsonL.M,和JeromeH.K.，"HIV方案"(///F/Votoco/>s)，干U于《分子医学方法》(M"/cxi51z>7M/ecw/orMeWc/"e)，第17巻，1999;Sambrook，J.等，《分子克隆实验室手册》(Mo/ecw/arCVom'"g.-J丄"6omtoo;Mam^/)，第三版(冷泉港实验室出版社，2001);Ausubel，F.M.等(编)，《分子生物学的简单方案》(幼^Y/Vo"co"/"Mo/ecw/ar5/o/ogy)，第五版(CurrentProtocols,2002);Lipkowitz和Boyd，《计算化学综述》(iev/e體/"C;齒"'om7/C7zem/WAj)，第一巻-目前(W-V公司(Wiley-VCH)，纽约，纽约州，1999)。必须注意，除非文中另有明确表述，本说明书和随附的权利要求书中所用的单数形式"一个"、"一种"和"该"包括复数形式。因此，例如述及"一个多肽"时包括两个或多个多肽的混合物，等等。无论在上文还是下文中，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全文纳入本文。定义以下术语将用于描述本发明，这些术语如下所示定义。在本文中术语"多肽"和"蛋白质"可互换使用以表示氨基酸残基的聚合物。这些术语包括肽、寡肽、二聚体、多聚体等。这种多肽可衍生自天然来源或可合成或重组产生。这些术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。本文所述的多肽通常由20种天然氨基酸构成Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、lie(1)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)和Val(V)，还可包括几种已知的氨基酸类似物(天然产生和合成类似物)，例如但不限于高异亮氨酸、氮亮氨酸、2-(亚甲基环-丙基)甘氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-(丙-l-烯基)半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、高精氨酸、3-(3-羧基苯基)丙氨酸、环己基丙氨酸、含羞草氨酸、六氢吡啶羧酸、4-甲基谷氨酸、刀豆氨酸、2,3-二氨基丙酸等。本发明可用的多肽物质的其它例子见下文。多肽或蛋白质的"几何"或"三级结构"表示该蛋白质的总体3-D构型。可通过，例如晶体学研究或采用各种程序或算法测定本文所述的几何结构，这些方法根据构成一级和二级结构的氨基酸之间的相互作用预测几何结构。"野生型"多肽、多肽试剂或多肽药物表示天然产生的多肽序列及其相应的二级结构。"分离的"或"纯化的"蛋白质或多肽是与在自然界中与该蛋白质天然相连的完整生物体分开且不连续的蛋白质。该术语明显表示各种纯度水平的蛋白质。含有纯化蛋白质的组合物通常是其中至少约35%，优选至少约40-50%(40%、45%、50%)，更优选至少约75-85%(例如，75%、80%、85%)，最优选至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多的总蛋白质是所讨论的蛋白质的组合物。系统发生分析将HIV-1分类成三群M群(主要)、O群(局外)和称为N群的HIV-1变体。亚型(进化枝)代表着不同HIV谱系并具有地理联系。HIV-1的亚型是HIV-1序列的系统发生相关群，在它们整个基因组中，任何一种亚型或亚亚型内的序列彼此比不同亚型的序列更相似。参见，例如洛斯阿拉莫斯国家实验室HIV序列数据库(LosAlamosNationalLaboratoryHIVS叫uenceDatabase)(http:〃hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/HelpDocs/subtypes-more.html)(洛斯阿拉莫斯，新墨西哥州)。HIV-1M群亚型是HIV-1序列的系统发生相关群或进化枝，包括亚型A(例如，Al、A2)、B、C、D、F(例如，Fl、F2)、G、H、J和K。据认为HIV-1M群的亚型或亚亚型在一次黑猩猩向人的传递后会在人中产生差异。各种HIV-1M群的世界分布不同，亚型B在北美洲和欧洲最普遍，而亚型A在非洲最普遍。虽然大多数亚型在中非是常见的，但其它地区的基因型分布有限。例如，亚型C在印度和南美洲常见，而亚型F在罗马尼亚、巴西和阿根廷普遍。HIV-1M群还包括循环重组形式(CRF)，这些形式是其整个基因组是重组体或嵌合体的病毒，在系统发生分析中所述重组体或嵌合体包含的一些区域与一种亚型成簇而基因组的其它区域与另一种亚型成簇。CRF的例子可见洛斯阿拉莫斯国家实验室HIV序列数据库(http:〃hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/HelpDocs/subtypes-more.html)(f各斯卩可拉莫斯，新墨西哥州)。本领域以及本文也将CRF称为亚型E和I。CRP(亚型E)在泰国非常普遍。HIV-1O群包括不与M群毒株成簇的差异最大的病毒。在喀麦隆和毗邻国家，例如赤道几内亚和加蓬等中西部非洲国家已鉴定到o型感染。已证明o群感染向欧洲扩散以及最近向美国扩散，虽然所有患者均与中西部非洲有关系。据认为单独的黑猩猩向人传递导致了HIV-10群，其中每次传递后的群内变化成"亚型"进化枝导致了人种群。HIV-1N群(也称为"新"群)包括不同于HIV-1M群和O群的病毒。也有人认为单独的黑猩猩向人传递导致了HIV-1N群，其中每次传递后的群内变化成"亚型"进化枝导致了人种群。HIV-2分类成5种进化枝A、B、C、F和G进化枝。"Env多肽"表示衍生自包膜蛋白，优选衍生自HIVEnv的分子。该术语包括Env多肽和编码Env多肽的多核苷酸。HIV-1的编码蛋白质是约160kd的糖蛋白(gpl60)。在宿主细胞的病毒感染期间，宿主细胞蛋白酶切割gpl60从而形成gpl20和膜内在蛋白，gp41。gp41部分锚定(和跨越)在病毒颗粒的膜双层，而gpl20区段伸入周围环境中。由于gpl20和gp41未共价结合，游离的gpl20从病毒颗粒和受感染细胞的表面释放。Env多肽还可包括gpl40多肽。Env多肽(gpl20、gpl40等)可以单体、二聚体或多聚体(寡聚体，例如三聚体)存在。"寡聚gpl40多肽"或"o-gpl40"表示任何寡聚形式的gpl40多肽。寡聚形式的gpl40包括缺失VI环的一部分的o-gpl40、缺失V2环的一部分的o-gpl40多肽、缺失V3环的一部分的o-gpl40多肽、具有突变的蛋白酶切割位点的o-gpl40多肽。寡聚-gpl40糖蛋白可采取HIV病毒颗粒表面存在的天然、三聚erw刺突(spike)的构型，因此对于免疫原性组合物是理想的。参见，例如Yang等，(2000)/Wro/.74(12):5716-5725;Grundner等，(2005)Wra/ogy331(1):33-46;Srivastava等，(2003)Wro/.77(29):11244-11259;Barnett等，(2001)/75(12):5526-5540;WO00/39302;美国专利号6,602,705;Srivastava等，(2002)F&o/.76(6):2835-2847。此外，本文定义的"Env多肽"不限于具有本文所述确切序列的多肽。实际上，HIV基因组处于持续变化中，并含有在分离物之间显示高度可变的几个可变区。不难明白这些术语包括任何鉴定的HIV分离物以及新鉴定的分离物和这些分离物的亚型的Env(例如，o-gpl40)多肽。本文参考HXB-2描述了结构特征。本领域普通技术人员借鉴本文内容和本领域的指导可以确定其它HIV变体(例如，分离物HIVmb、HIVSF2、HIV-1SF162、HIV-lSF17o、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-1US4)、不同亚型的其它HIV-1毒株、HIV-2毒株和不同亚型(例如，HIV-2ud和HIV-2uc2)和猿免疫缺陷病毒(SIV)中的相应区域。(这些和其它相关病毒的描述可参见，例如《病毒学》(KVo/og;;)，第3版(W.K.Joklik编，1988);《基础病毒学》(F認c/ame"fa/h>o/ogy)，第2版，(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991);Fields,B.N.等(编)，《菲尔兹病毒学》(尸&/&P7ro/og力，第4版，(L.W和W公司(LippincottWilliams&Wilkins)，2001))，采用例如序列比较程序(例如，BLAST和本文所述的其它程序)或鉴定和比对结构特征(例如，本文所述能鉴定卩-片层区域的程序，如"ALB"程序)。经修饰的Eiw多肽的实际氨基酸序列可依据任何HIV变体。此外，术语"Env多肽"包括与天然序列相比，包含其它修饰，例如其它的内部缺失、添加和取代的蛋白质。这些修饰可以是有意为之，例如通过定点诱变，或者可以是偶发的，例如通过天然发生的突变。Env的修饰包括但不限于产生编码其中具有突变和/或缺失的Env多肽的多核苷酸。例如，可以删除或修饰超可变区V1、V2、V3、V4和/或V5，特别是区域V1、V2和V3中的一些或全部。V1和V2区域可遮蔽CCR5共同受体结合位点(参见，例如Moulard等，(2002)/Voc.A^/.JcfldSc/.14:9405-9416)。因此，在某些实施方式中，例如，可以删除超可变环区域中的一些或全部，从而暴露潜在的保守中和表位。此外，N-连接位点的去糖基化也是潜在的修饰靶位，因为高度糖基化也能用于遮蔽蛋白质表面上的潜在中和表位。单用或与可变区删除和/或去糖基化修饰联用的其它任选修饰包括修饰(例如，删除)卩-片层区域(如WO00/39303中所述)，修饰前导序列(例如，加入Kozak序列和/或用天然或经序列修饰的tpa前导序列取代修饰的野生型前导序列)和/或修饰蛋白酶切割位点(参见，例如Chakrabarti等，(2002)76(11):5357-5368，其描述了在切割位点含有缺失的gpl40DeltaCFI，gp41的促融合结构域，通过与已知的单克隆抗体或CD4结合来确定保留了天然抗原性构型决定簇的gp41七重复1和2的间距，寡聚形式和体外病毒中和)。如果Env多肽要用于疫苗组合物，修饰必须不丧失免疫学活性(即，引发针对该多肽的抗体应答的能力)。类似地，如果多肽要用于诊断目的，必须保留这种能力。这种Env多肽的例子包括但不限于以下缺失VI环的一部分的gpl40、缺失V2环的一部分的gpl40多肽、缺失V3环的一部分的gpl40多肽、具有突变的蛋白酶切割位点的gpl40多肽、缺失Vl环的一部分的gp160、缺失V2环的一部分的gpl60多肽、缺失V3环的一部分的gpl60多肽、具有突变的蛋白酶切割位点的gpl60多肽。Env多肽可以在宿主细胞中重组产生。这些多肽可分泌入培养表达蛋白质的生物体的生长培养基中。或者，还可胞内回收这种多肽。采用许多检测技术包括，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳等，和免疫学技术，例如蛋白质印迹和诸如国际公布WO96/04301号所述的免疫沉淀试验不难测定分泌入生长培养基中(的多肽)。例如，可如Srivastava等，(2002)J.K>o/,76(6):2835國2847和Srivastava等，(2003),77(29):11244-11259所述产生和/或纯化Env多肽，例如三聚o-gpl40多肽。"免疫原性"Env糖蛋白是包含(或编码)至少一个表位的分子(Env多肽或编码Env多肽的多核苷酸)，从而使得该分子能在给予该蛋白质的个体中引发免疫反应，或者就诊断而言，能与针对所研究HIV的抗体反应。"多价"表示组合物或疫苗包含至少两种(即，两种或多种)相同或不同的HIV肽。在一具体实施方式中，HIV肽来自不同HIV类型(例如，HIV-1、HIV-2等)、不同HIV亚型(例如，HIV-1亚型A、HIV-1亚型B、HIV-1亚型C等)或相同亚型的不同毒株(例如，HIV-1SF2、HIV-1sih62等)。例如，本文所述的多价组合物或疫苗包括含有两种或多种不同HIV类型、毒株和/或亚型的HIVEnv糖蛋白的组合物。术语"亚型"包括目前鉴定的亚型以及循环重组形式(CRF)。HIV亚型(包括CRF)正不断表征，可通过因特网从洛斯阿拉莫斯国家实验室的HIV数据库获得。因此，多价疫苗可包含衍生自两种或多种不同亚型(包括A(例如，Al、A2)、B、C、D、E、F(例如，Fl、F2)、G、H、J和K，以及各种CRF)的肽，例如衍生自亚型A和B;A和C;B和C;A和E;B和E;C和E;A、B和C;A、B和E等的HIVEnv糖蛋白。类似地，术语"二价"指包含两种相同或不同包膜肽的组合物或疫苗。在一具体实施方式中，本文所述的二价组合物或疫苗包含不同HIV类型、不同HIV亚型或相同亚型的不同毒株的两种HIVEnv糖蛋白。在更具体的实施方式中，本文所述的二价组合物或疫苗包含不同亚型(例如，亚型B和C，亚型B和E等)的两种HIVEnv糖蛋白。"表位"表示抗原上与特性B细胞和/或T细胞反应的位点，从而使得包含这种表位的分子能引发免疫反应或能与生物样品中存在的HIV抗体反应。该术语还可与"抗原决定簇"或"抗原决定位点"互换使用。表位可包含三(3)个或更多个对其而言空间构象独特的氨基酸。表位通常由至少五(5)个这种氨基酸，更常见由至少8-10个这种氨基酸构成。本领域已知的测定氨基酸空间构象的方法包括，例如x-射线晶体学和两维核磁共振。此外，采用本领域熟知的技术，例如采用疏水性研究和定点血清学不难鉴定某给定蛋白质中的表位。还可参见Geysen等，(1984)ZVoc.胸/.^cac/.Sc,.固81:3998-4002(快速合成肽以测定某给定抗原中免疫原性表位位置的通用方法)；美国专利号4,708,871(鉴定和化学合成抗原表位的方法)；和Geysen等，(1986)Mo/ecw/w/m/mmo/ogy23:709-715(鉴定对给定抗体的亲和力高的肽的技术)。可利用能显示某抗体阻断另一抗体与靶抗原结合的能力的简单免疫测定来鉴定识别相同表位的抗体。针对某抗原或组合物的"免疫学应答"或"免疫应答"是在对象中产生了针对感兴趣的组合物中所存在抗原的先天、体液和/或细胞免疫应答。本文所用的术语"抗体"包括从多克隆和单克隆制品中获得的抗体以及以下物质(i)杂交(嵌合)抗体分子(参见，例如Winter等，(1991)7Va&"349:293-299;和美国专利号4,816,567);(ii)F(ab，)2和F(ab)片段；(iii)Fv分子(非共价异二聚体，参见，例如Inbar等，(1972)/Voc.7Va"JcW.Sc/.69:2659-2662;和Ehrlich等，(1980)19:4091-4096);(iv)单链Fv分子(sFv)(参见，例如Huston等，(1988)/Voc.A^/.Jcacf.85:5879-5883);(v)二聚和三聚抗体片段构建物；(vi)人源化抗体分子(参见，例如Riechmann等，(1988)淑匿332:323-327;Verhoeyan等，(1988)&/面239:1534-1536;和美国专利公布号GB2,276,169，1994年9月21日出版)；(vii)小抗体或小体(minibody)(即，sFv多肽链，其在C-末端包含寡聚化结构域，由绞链区与sFv分开；参见，例如Pack等，(1992)AocAem.31:1579-1584;Cumber等，(1992)/wwm"o/,149B:120-126);和(vii)从这些分子获得的任何功能片段，其中这些片段保留了亲代抗体分子的特异性结合特性。因此，术语"抗体"指包含至少一个抗原结合位点的多肽或多肽组。某抗体分子的可变区折叠形成三维结合位点，该结合位点具有与抗原表位的特征互补的内表面形状和电荷分布从而形成"抗原结合位点"，因而能进行特异性结合进而形成抗体-抗原复合物。重链和/或轻链结构域(分别是Vh和vo可形成抗原结合位点，进而形成有助于抗原结合的超变环。术语"抗体"包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、代表的抗体、单价抗体、Fab蛋白和单域抗体。在许多情况中，抗体与抗原的结合现象等于其它配体/抗配体结合。如果需要多克隆抗体，用携带HIV表位的免疫原性多肽免疫选择的哺乳动物(例如，小鼠、家兔、山羊、马、非人灵长类、人等)。收集免疫动物的血清，按照已知方法处理。如果含有针对HIVEnv糖蛋白表位的多克隆抗体的血清含有针对其它抗原的抗体，可通过免疫亲和层析纯化该单克隆抗体。本领域已知产生和加工多克隆血清的技术，可参见例如Mayer和Walker编，(1987)《细胞生物学和分子生物学的免疫化学方法》(/m/mmoc/zew/cfl/iWe^oA/nCW/Mo/ecw/"r(学术出版社(AcademicPress)，伦敦)。本领域技术人员也不难制备针对HIVEnv糖蛋白表位的单克隆抗体。熟知利用杂交瘤制备单克隆抗体的通用方法。可通过细胞融合，还可通过其它技术，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞或用EB病毒转染来产生无限增殖的产抗体细胞系。可参见，例如M.Schreier等，(1980)《杂交瘤技术》(77少6nWowarec/zm々"e力；Hammerling等，(1981)《单克隆抗体和T细胞杂交瘤》(Mowoc/owa""幼0(i/"r-CW/外6r油mos);Kennett等，(1980)《单克隆抗体》(Mo"oc/o"a/^"他0&");美国专利号4,341,761;4,399,121;4,427,783;4,444,887;4,466,917;4,472,500;4,491,632和4,493,890。可以筛选针对HIV表位所产生的一组单克隆抗体的各种特性；即同种型、表位亲和力等。本文所用的"单域抗体"(dAb)是由HL结构域构成的与指定抗原特异性结合的抗体。dAb不含VL结构域，但可含有抗体中己知存在的其它抗原结合结构域，例如K和X结构域。本领域已知制备dAb的方法。可参见，例如Ward等，(1989)淑w"341:544-546。抗体还可由Vh和VL结构域以及其它已知的抗原结合结构域构成。本领域已知这些类型的抗体及其制备方法的例子(参见例如美国专利号4,816,467)。例如，"脊椎动物抗体"指其四聚体或聚集体的抗体，包含通常聚集成"Y"构型的轻链和重链，诸链之间可以有或没有共价连接键。在脊椎动物抗体中，诸链的氨基酸序列与在脊椎动物中无论原位或体外(例如，杂交瘤中)产生的抗体中发现的那些序列同源。脊椎动物抗体包括，例如纯化的多克隆抗体和单克隆抗体，下文描述了这些抗体的制备方法。"杂交抗体"是诸链分别与参比哺乳动物抗体链同源并代表哺乳动物抗体链的新组合的抗体，从而该四聚体或聚集体能沉淀两种不同的抗原。在杂交抗体中，一对重链和轻链与针对第一抗原而产生的抗体中发现的那些同源，而第二对链与针对第二抗体所产生的抗体中发现的那些同源。这导致了"二价"特性，即同时结合两种抗原的能力。如下文所示，还可利用嵌合链形成这种杂交体。"嵌合抗体"指其中重链和/或轻链是融合蛋白的抗体。通常，某链的氨基酸序列的一部分与衍生自具体物种或具体种类的抗体的相应序列同源，而该链的其余区段与衍生自另一物种和/或种类的序列同源。轻链和重链的可变区通常模拟衍生自一种脊椎动物物种的可变区或抗体，而恒定区通常与衍生自另一脊椎动物物种的抗体的序列同源。然而，该定义不限于此具体例子。还包括其中重链或轻链之一或二者由不同来源抗体中序列的模拟序列组合构成的任何抗体，而无论这些来源是不同种类或不同的物种起源，也无论融合点位于可变泡定边界。因此，可能制备其中恒定区或可变区均不模拟已知抗体序列的抗体。随后，例如也可能构建其中可变区对特定抗原的特异性亲和力较高，或者恒定区能引发增强的补体结合的抗体，或能对特定恒定区所具有的特性作出其它改进。另一例子是"改变的抗体"，表示其中脊椎动物抗体中的天然氨基酸序列得到改变的抗体。可采用重组DNA技术重新设计抗体使之获得所需特征。可能的变化有很多，从改变一个或多个氨基酸到完全重新设计某区域，例如恒定区。恒定区中的变化通常可以获得所需的细胞途径特征，例如补体结合中的变化，与膜相互作用和其它效应子功能。可在可变区中作出变化以改变抗原结合特征。还可工程改造抗体，从而有助于将分子或物种特异性递送至特定细胞或组织部位。可通过已知的分子生物学技术，例如重组技术、定点诱变等作出所需变化。还有另一例子是"单价抗体"，其是由重链/轻链二聚体与第二重链的Fc(即，茎)区域结合构成的聚集体。该类抗体逃避抗原性调节。参见，例如Glennie等，(1982)淑訓295:712-714。该抗体定义还包括抗体的"Fab"片段。"Fab"区指重链和轻链中与构成重链和轻链分支部分的序列大致相等或类似，并显示能与特定抗原免疫学结合但缺乏效应子Fc部分的那些部分。"Fab"包括一条重链和一条轻链的聚集体(通常称为Fab，)以及含有2H和2L链的四聚体(称为F(ab)2)，它们能与指定的抗原或抗原家族选择性反应。Fab抗体可分成类似于上述那些的亚组，即"脊椎动物Fab"、"杂交Fab"、"嵌合Fab"和"改变的Fab"。本领域已知制备抗体的Fab片段的方法，包括，例如蛋白水解以及通过重组技术合成。"抗原-抗体复合物"指抗体与抗原上的表位特异性结合形成的复合物。本领域熟知测定氨基酸序列"相似性"的技术。"相似性"一般表示两条或多条多肽在适当位置的氨基酸与氨基酸的精确比较，其中氨基酸相同或具有相似的化学和/或物理特性，例如电荷或疏水性。然后可测定所比较的多肽序列之间所谓的"相似性百分比"。本领域也熟知测定核酸序列和氨基酸序列相同性的技术，包括测定该基因的mRNA的核苷酸序列(通常经cDNA中间体)和测定其所编码的氨基酸序列，并将其与第二条氨基酸序列相比较。通常，"相同性"分别指两条多核苷酸或多肽序列的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的确切对应性。通过测定"相同性百分比"可比较两条或多条多核苷酸序列。类似地，通过测定"相同性百分比"可比较两条或多条氨基酸序列。两条序列(无论是核酸或肽序列)的相同性百分比通常描述为两条比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度再乘以100。Smith和Waterman(AdvancesinAppliedMathematics2:482-489(1981))的局部同源性算法可对核酸序列进行大致比对。该算法可利用由Dayhoff开发(《蛋白质序列和结构图集》(AtlasofProteinSequencesandStructure),M.O.Dayhoff编，5增刊3:353-358，国家生物医学研究基金会(NationalBiomedicalResearchFoundation),华盛顿，哥伦比亚特区，美国)、Gribskov标准化((1986)7Vmc/,爿cz'A14(6):6745-6763)的评分矩阵而扩展用于肽序列。遗传学计算机组公司(GeneticsComputerGroup)(麦迪逊，威斯康星州)在他们的实用新型申请中对核酸和肽序列实施了该算法。《威斯康星序列分析包程序手册》(WisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManual),第8版(1995)(从威斯康星州麦迪逊市的遗传学计算机组公司购得)描述了该方法的默认参数。本领域通常知道用于计算序列间相同性或相似性百分比的其它同样的合适程序。例如，可利用Smith和Waterman的同源性算法，以默认评分表和6个核苷酸位置的空位罚分来测定具体核苷酸序列与参比序列的相同性百分比。本发明确定相同性百分比的另一方法是利用JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok开发，智力遗传学有限公司(IntelliGenetics,Inc.)(芒廷维尤，加利福尼亚州)经销，爱丁堡大学版权所有的MPSRCH程序包。该套程序包利用Smith-Waterman算法，其中评分表采用默认参数(例如，空位开放罚分12，空位延伸罚分1，空位(罚分)6)。由产生的数据可知"匹配"值反映了"序列相同性"。本领域通常知道计算序列之间相同性或相似性百分比的其它合适程序，例如也可利用默认参数的比对程序BLAST。例如，BLASTN和BLASTP可采用以下默认参数遗传代码(geneticcode)=标准(standard);过滤器(filter)二无(none);链(strand)=两条(both);截断值(cutoff)=60;预期值(expect)=10;矩阵(Matrix)=BLOSUM62;描述(Descriptions)=50条序列；分类(sortby):高评分(HIGHSCORE);数据库(Databases)=非冗余(non-redundant),GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻译(translations)+瑞士蛋白质(Swissprotein)+Spupdate+PIR。这些程序的细节可在以下因特网网址找到http:〃www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。本领域技术人员不难为以上程序中的某给定序列确定所用的合适检索参数。例如，检索参数可依所研究序列的大小而有所不同。因此，例如本发明的代表性实施方式包括具有X个毗连核苷酸的分离多核苷酸，其中(i)所述X个毗连核苷酸与衍生自本文所述任何序列的Y个毗连核苷酸有至少约50%相同性，(ii)X等于Y，和(iii)X大于或等于6个核苷酸，最多5000个核苷酸；优选大于或等于8个核苷酸，最多5000个核苷酸；更优选10-12个核苷酸，最多5000个核苷酸；甚至更优选15-20个核苷酸，最多本文所述全长序列中存在的核苷酸数目(例如，参见序列表和权利要求书)，包括上述范围内的所有整数值。本发明的合成表达盒(和纯化的多核苷酸)包括将本发明序列用作查询序列时，与本文所述合成表达盒序列(例如，要求权益的序列或本发明的其它序歹!j)有约80%-100%，大于80-85%(例如，大于80%、81%、82%、83%、84%或85%)，优选大于90-92%(例如，大于90%、91%或92%)，更优选大于95%(例如，大于95%、96%或97%)，最优选大于98%(例如，大于98%、99%、99.5%或更高)的序列相同性(包括这些所述范围内的所有整数值)的有关多核苷酸序列。还可利用计算机程序来测定特定多肽形成诸如P-片层的结构的可能性。本文所述的一种程序是蛋白质和多肽二级结构计算和预测的"ALB"程序。此外，可从以及氨基酸序列预测二级蛋白质结构，例如利用蛋白质晶体结构并比对与晶体结构相关的蛋白质序列(例如，利用购自加拿大魁北克省蒙特利尔的化学计算组有限公司的分子操作环境(MOE)程序(MolecularOperatingEnvironment(MOE)programs,ChemicalComputingGroupInc.,Montreal,P.Q.，Canada))。例如，Gamier等，(1996)M"/zoA五"z;;mo/.266:540-553;Geourjon等，(1995)Cow;W.11:681-684;Levin(1997)/Vo^/"10:771-776;和Rost等，(1993),Mo/ec.232:584-599描述了预测二级结构的其它方法。还可通过在同源区域之间能形成稳定双螺旋的条件下使多核苷酸杂交，然后用单链特异性核酶消化并测定消化片段的大小来测定同源性。如果利用上述方法测定到两条DNA或两条多肽序列在分子的限定长度上显示至少约80%-85%(例如，至少约80%、81%、82%、83%、84%或85%)，优选至少约90%,最优选至少约95%-98%(例如，至少约95%、96%、97%或98%)的序列相同性，则这些序列彼此"基本上同源"。本文所用的"基本上同源"还指与所述DNA或多肽序列显示完全相同的序列。可在，例如具体系统所确定的严格条件下采用Sourthern杂交实验鉴定基本上同源的DNA序列。本领域技术人员能确定合适的杂交条件。参见，例如Sambrook等，同上；《DNA克隆》CDA^4C/om'"g)，同上；《核酸杂交》(7Vwc/e/c//j;6nVfea"o")，同上。"编码序列"或"编码"所选择蛋白质的序列是在置于合适调节序列控制下能在体外或体内转录(如果是DNA的话)并翻译(如果是mRNA的话)成多肽的核酸序列。编码序列的边界确定为5'(氨基)末端的起始密码子和3，(羧基)末端的翻译终止密码子。编码序列可包括但不限于病毒核苷酸序列的cDNA以及合成和半合成DNA序列和包含碱基类似物的序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'。总的来说，"控制元件"指启动子序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控区、增强子等，它们在宿主细胞中一起转录和翻译编码序列。并不总需要存在这些控制元件，只要所需基因能转录和翻译。RNA聚合酶与启动子序列结合并将编码序列转录成mRNA，然后该mRNA翻译成该编码序列所编码的多肽，则称控制元件在细胞中"指导"编码序列"转录"。"操作性相连"指元件的排列方式，其中所述组件配置成能执行它们的常规功能。因此，与编码序列操作性相连的控制元件在RNA聚合酶存在时能影响该编码序列表达。控制元件无需与编码序列毗连，只要它们能起到指导编码序列表达的作用。因此，例如不翻译但转录的间插序列可以存在于，如启动子序列和编码序列之间，而启动子序列仍可视作与该编码序列"操作性相连"。本文用于描述核酸分子的"重组"表示基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，根据其来源或操作这些多核苷酸可以(1)不与天然与其相连的多核苷酸的全部或部分相连；和/或(2)与除天然与其相连的多核苷酸以外的多核苷酸相连。本文用于蛋白质或多肽的术语"重组"表示表达重组多核苷酸所产生的多肽。"重组宿主细胞"、"宿主细胞"、"细胞"、"细胞系"、"细胞培养物"和表示作为单细胞实体培养的原核微生物或真核细胞系的其它这种术语可互换使用，这些术语表示可以或已经用作重组载体或其它转移DNA的接受者的细胞，包括转染的原始细胞的后代。应该知道，因为偶发或有意的突变，一个亲代细胞的后代无需在形态或基因组或总DNA补体上与原始亲代完全相同。因相关特性，例如存在编码所需肽的核苷酸序列而表征为与亲代足够相似的亲代细胞后代应包括在该后代定义内，并且应为上述术语所涵盖。"脊椎动物对象"表示脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，如黑猩猩、弥猴、狒狒和其它猿和猴子；农业动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠、家兔和豚鼠；鸟类，包括家养的、野生的和猎禽，如鸡、火鸡和其它鹑鸡类鸟、鸭、鹅等。该术语不表示具体的寿命。因此，同时涵盖了成年和新生个体。本文所用的"生物样品"指从个体分离的组织或液体样品，包括但不限于例如血液、血浆、血清、粪便物质、尿、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴液、皮肤样品、皮肤的、呼吸道、肠道和生殖泌尿道的外分泌物、获自胃上皮细胞和胃粘膜的样品、泪液、唾液、乳汁、血细胞、器官、活检品，还包括体外细胞培养成分，包括但不限于细胞和组织在培养基中生长所得的条件培养基，例如重组细胞或细胞组分。概述本发明涉及包含至少两种HIV包膜糖蛋白(和任选的一种或多种佐剂)的组合物和这些组合物在，例如引发针对多种HIV、毒株、类型或亚型的中和抗体应答中的应用。本文所述的组合物因包含多种HIV毒株、类型、亚型和/或分离物的HIVEnv多肽而是多价的。与单价组合物相比，这种多价组合物能在对象中引发免疫应答，在某些实施方式中，可用于拓宽和/或增强在对象中引发的免疫应答。多价组合物中所代表的不同分离物可以表示不同病毒血清型，可利用不同方式进入宿主细胞(例如，复合受体(coreceptor))。"拓宽"或"增强"表示与针对构成多价组合物的任一种Erw多肽组分相比，针对更分散的一系列HIV分离物的免疫应答在幅度(例如附加或协同作用)上更大和/或导致的中和(抗病毒)活性更强。可以组合各种形式的本文所述本发明的不同实施方式。Env多肽本文所述复合物的Env多肽部分可以衍生自包膜蛋白，优选衍生自HIVEnv。如上所述，HIV-1的包膜蛋白是约160kd的糖蛋白(gp160)。在宿主细胞感染期间，宿主细胞蛋白酶切割gpl60从而形成gpl20和膜内在蛋白，gp41。gp41部分锚定在(和跨越)病毒颗粒的膜双层，而gpl20区段伸入周围环境中。由于gpl20和gp41无共价结合，游离gpl20可以从病毒颗粒和受感染细胞的表面释放。Env多肽还包括gpl40多肽，特别是o-gp140。在某些实施方式中，组合物的Env多肽组分是单体或二聚体。在一优选的实施方式中，Env多肽组分是寡聚(例如，三聚)Env多肽(例如，o-gpl40)。此外，本文所述的任何Env糖蛋白还可与一种或多种分子，包括例如CD4和/或CD4模拟物(参见，例如美国专利号6,689,879;国际专利公布WO04/037847;Fouts等，(2002)iVoc.TVa".乂cad<Sc/.99(18):11842-11847)、CCR5共同受体(Mkrtchyan等,(2005),Wro/.79(17):11161-11169)或其模拟物、tat(WO2005/090391)、多核苷酸(例如，寡核苷酸，如CpGs等)、多肽(例如，其它病毒蛋白)、小分子和(它们的)组合和/或其它病毒蛋白结合(例如，形成复合物)。本文所述的Env糖蛋白可以衍生自一种或多种已知的HIV分离物以及新鉴定的分离物，和这些分离物的亚型。因此，本领域普通技术人员借鉴本文和本领域的指导能确定其它HIV分离物(例如，分离物HIVIIIb、HIVSF2、HIV-1画、HIV-1固、HIVLAV、HIVLAI、HIV顧、fflV-lc画、HIV-lus4)、不同亚型的其它HIV-1毒株、HIV-2毒株和不同亚型(例如，HlV-2ud和HIV-2uc2)和猿免疫缺陷病毒(SIV)中的相应区域。(这些和其它相关病毒的描述可参见，例如《病毒学》(K>o/ogy)，第3版(W.K.Joklik编，1988);《基础病毒学》(尸w"^me"to/fWogy)，第2版，(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991);Fields,B.N.等(编)，《菲尔兹病毒学》(i^/An>o/ogy)，第4版，(L.W和W公司，2001))，采用例如序列比较程序(例如，BLAST和本文所述的其它程序)或鉴定和比对结构特征(例如，本文所述能鉴定(3-片层区域的程序，如"ALB"程序)。经修饰的Env多肽的实际氨基酸序列可依据任何HIV变体。与天然序列相比，本文所述的Erw多肽可包含其它修饰，例如其它的内部缺失、添加和取代。这些修饰可以是有意为之，例如通过定点诱变，或者可以是偶发的，例如通过天然发生的突变。因此，例如，如果Env多肽要用于疫苗组合物，修饰必须不丧失免疫学活性(即，引发针对该多肽的抗体应答的能力)。类似地，如果多肽要用于诊断目的，必须保留这种能力。本文所述的Env多肽可以是单体或寡聚的。优选实施方式利用至少两种不同HIV亚型的Env糖蛋白。根据HIV-1核苷酸和氨基酸序列的系统发生分析，HIV-1分离物分成三群M群(主要的)、0群(局外的)和N群(新变体)。M群包括至少IO种亚型(称为A(例如A1、A2)、B、C、D、E、F(例如F1、F2)、G、H、J禾PK)禾卩CRF。不同进化枝之间包膜氨基酸序列的变化可超过30%。此外，HIV-特异性中和抗体和CTL的有效部分(significantproportion)是类型特异性的。因此，优选组合物包含多种Env糖蛋白，例如包括以下亚型的HIVEnv糖蛋白亚型A和B;B和C;A和C;A和E;B禾BE;C和E;A、B禾卩C;A、B和E;A、C和E;B、C禾卩E;A、B、C禾卩E;A、B、C禾卩F，等等。在其它实施方式中，Env糖蛋白来自两种或多种(至少两种)HIVEnv多肽，其中至少两种Env多肽各来自不同的HIV类型(例如HIV-1、HIV-2)。还有其它实施方式利用两种或多种(至少两种)HIVEnv多肽的Env糖蛋白，其中至少两种Env多肽各来自相同亚型的不同毒株(例如，HIV-1SF2、HIV-1SF162、HIV隱lc画等)。佐剂在一聚体实施方式中，本文所述的Env多肽添加了佐剂，即与一种或多种佐剂或免疫调节剂联用。佐剂是特异性或非特异性增强针对某抗原的免疫应答的物质，包括，例如免疫加强性分子，例如CpG寡聚物。本文所述组合物可用的佐剂的例子包括但不限于下文所列的一种或多种A.油乳剂适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物和制剂(含或不含其它具体的免疫刺激剂，例如胞壁酰肽或细菌细胞壁组分)包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59(利用微流化仪配制成亚微米颗粒的5%角鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85)。参见WO90/14837。也参见Podda(2001)Facc/w19:2673-2680;Frey等，(2003)Facc/"e21:4234-4237。MF59在FLUADTM流感病毒三价亚单位疫苗中用作佐剂。特别优选用于组合物中的佐剂是亚微米水包油乳剂。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选含有不同含量的MTP-PE的角鲨烯/水乳剂，例如含4-5%w/v角鲨烯、0.25-1.0%w/v吐温80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)和/或0.25-1.0%司盘85(失水山梨醇三油酸酯)和任选的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(1^丁？-￡)的亚微米水包油乳剂，例如称为"MF59"的亚微米水包油乳剂(国际公布号WO90/14837;美国专利号6,299,884和6,451,325;和Ott等，"MF59—人用疫苗的一种安全而强效佐剂的设计与评估，，(MF59—DesignandEvaluationofaSafeandPotentAdjuvantforHumanVaccines)()，刊于《疫苗设计亚单位和佐剂方法》(&cc/"eDeWg":7Te5"w6wmYaw"咖v朋"//n3ac/z)(Powell,M.F.禾口Newman,M丄编)，普莱纳姆出版社(PlenumPress),纽约，1995，第277-296页)。MF59含有4-5%w/v角鲨烯(如4.3%)、0.25-0.5%w/v吐温80和0.5%司盘85，并任选含有各种含量的MTP-PE，用微流化仪，例如110Y型微流化仪(微射流公司(Microfluidics),牛顿市，马萨诸塞州)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE的含量可以是约0-500叫/剂，更优选0-250iLig/剂，最优选0-100pg/剂。本文所用的术语"MF59-0"指不含MTP-PE的以上亚微米水包油乳剂，而术语"MF59-MTP"表示含有MTP-PE的制剂。例如，"MF59-100"含有100)ngMTP-PE/剂，等等。MF69是本文所用的另一种亚微米水包油乳剂，其含有4.3%w/v角鲨烯、0.25%w/v吐温80tm和0.75%w/v司盘857"和任选的MTP-PE。还有另一种亚微米水包油乳剂是MF75，也称为SAF，其含有10%角鲨烯、0.4%吐温80、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，也微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP表示含有MTP的MF75制剂，例如100-400pgMTP-PE/剂。国际公布号WO卯/14837;美国专利号6,299,884和美国专利6,451,325详细描述了用于组合物中的亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫剌激剂，例如胞壁酰肽。完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可用作本发明佐剂。B.含矿物质的组合物适合用作本发明佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和,丐盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等(如参见《疫苗设计亚单位和佐剂方案》(&cc/"ejDes/f77zeiS^ZmmYawt/yi咖iw^^4/proac/z)的第8禾口9章，(1995)，Powell和Newman编，普莱纳姆出版社，纽约)，或不同矿物质化合物的混合物(例如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选磷酸盐过量)，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，这些盐优选、(具有)吸附性。含有矿物质的组合物也可配制为金属盐颗粒(W000/23105)。本发明疫苗中可包含铝盐，A产的剂量在0.2-1.0mg/剂之间。在一个实施方式中，本发明所用的铝佐剂是明矾(硫酸铝钾(A1K(S04)2))或明矾衍生物，例如通过在磷酸缓冲液中混合抗原与明矾，然后用碱，例如氢氧化铵或氢氧化钠滴定并沉淀而原位形成的。本发明疫苗制剂所用的另一种铝佐剂是氢氧化铝佐剂(A1(0H)3)或结晶碱式氢氧化铝(A100H)，这种佐剂是优良的吸附剂，其表面积约为500m2/g。或者，可用含有磷酸基团替代了氢氧化铝佐剂中的一些或全部羟基的磷酸铝佐剂(A1P04)或羟基磷酸铝。本文所述的优选磷酸铝佐剂是无定形的并可溶于酸性、碱性和中性介质。在另一实施方式中，本发明佐剂包含磷酸铝和氢氧化铝。在其更具体的实施方式中，佐剂中磷酸铝的含量高于氢氧化铝，例如以重量计，磷酸铝与氢氧化铝之比为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或高于9:1。更具体地说，疫苗中铝盐的含量是每疫苗剂量0.4-1.0mg，或每疫苗剂量0.4-0.8mg，或每疫苗剂量0.5-0.7mg，或每疫苗剂量约0.6mg。一般通过优化分子间的静电吸引使抗原在所需pH时携带与佐剂相反的电荷，从而能选择优选的铝佐剂或多种铝佐剂，例如磷酸铝与氢氧化铝之比。例如，pH7.4时磷酸铝佐剂(iep:4)吸附溶菌酶，但不吸附白蛋白。如果白蛋白是靶标，则应选择氢氧化铝佐剂(iep11.4)。或者，用磷酸预处理氢氧化铝可降低其等电点，使其成为碱性更高的抗原的优选佐剂。C.皂苷制剂皂苷制剂也适用作本发明佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologousgroup)。皂树(gw/〃a/a犯po"an'aMolina)树皮中分离的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可商品化购自丽花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophillapaniculata)(婚纱花(bridesveil))和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根(soaproot))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。皂苷佐剂制剂包括STIMULON佐剂(抗原有限公司(Antigenics,Inc.),莱克星顿，马萨诸塞州)。也可利用高效薄层色谱(HP-LC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术专门纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。美国专利号5,057,540披露了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇(参见W096/33739)。可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM—般还含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。EP0109942、W096/11711和W096/33739进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它洗涤剂。参见WO00/07621。皂苷佐剂开发的综述见Barr等，(1998)^/v."rwg"e/.Tev.12:247-271。也参见Sjolander等，(1998)Jdv.Z)n^De/.iev.11:321-338。D.病毒体和病毒样颗粒(VLP)病毒体和病毒样颗粒(VLP)也适用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种任选与磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白质。它们通常无致病性、不能复制，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP中的这些病毒蛋白包括源自以下的蛋白质流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Q卩-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白pl)。WO03/024480、WO03/024481;Niikura等，(2002)，Wro/ogy293:273-280:Lenz等，(2Q01)，J/画腳/166(9):5246-5355;Pinto等，(2003)，/■/"/e".1M:327-338;和Gerber等，(2001)，P7ra/.21(10):4752-4760进一步讨论了VLP。例如，Gluck等，(2002)，Facc/"e巡:B10-B16进一步讨论了病毒体。鼻内三价INFLEXALTM产品(Mischler和Metcalfe,(2002)Faccf打e20，增刊5:B17-B23)和INFLUVACPLUSTM产品中使用免疫增强型重建流感病毒体(IRIV)作为亚单位抗原递送系统。E.细菌或微生物衍生物适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如(1)肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物这种衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-0-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是含有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。EP0689454公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选"小颗粒"形式。3dMPL的这种"小颗粒"足够小从而可经0.22pm膜无菌过滤(参见EP0689454)。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529。参见Johnson等，(1999)^oorg.AfecZ.C/zem.Le".9:2273-2278。(2)脂质A衍生物脂质八衍生物包括大肠杆菌(￡^/^〃/^/"^//)的脂质A衍生物，例如OM-174。OM-174描述于，例如Meraldi等(2003)Facc/we21:2485-2491;禾BPajak等(2003)Facc/"e21:836-842。(3)免疫刺激性寡核苷酸适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸或多聚分子包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与随后的鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰并且可以是双链或单链。可任选用类似物，例如2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。可能的类似物取代可参见Kandimalla等，(2003)，A^c/.Jc/AU(9):2393-2400;WO02/26757和W099/62923。Krieg，(2003)，A^f.Med9(7):831-835;McCluskie等，(2002)，F￡M9/mmwwo/.M^/.Mc油W.11:179-185;WO98/40100;美国专利号6,207,646;美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199进一步讨论了CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla等(2003)5/oc/ew.Soc.7>麵.31(部分3):654國658。CpG序列，例如CpG-AODN可特异性诱导Thl免疫应答，或者，例如CpG-BODN可更特异地诱导B细胞应答。Blackwell等(2003)/mmwwo/.170(8):4061-4068;Krieg(2002)J7五JVDS/附mw"o/.23(2):64-65;和WO01/95935讨论了CpG陽A和CpG隱BODN。CpG优选CpG-AODN。优选将CpG寡核苷酸构建为5'端易于为受体识别。任选将两条CpG寡核苷酸序列在它们的3，端相连以形成"免疫聚体"(immunomer)。参见，例如Kandimalla等(2003)55JC306:948-953;Kandimalla等(2003)Soc.7Vfl肌31(部分3):664-658;Bhagat等(2003)557C300:853-861;和WO03/035836。免疫刺激性寡核苷酸和多聚分子还包括其它聚合物骨架结构，例如但不限于聚乙烯骨架(Pitha等(1970)万/ocAe附.爿"a204(1):39-48;Pitha等，(1970)S一/戸ny9(8):965-977)，和吗啉骨架(美国专利号5,142,047;美国专利号5,185,444)。本领域知道各种其它带电荷和不带电荷的多核苷酸类似物。本领域知道许多骨架修饰，包括但不限于不带电荷的连接键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺(phosphoamidate)和氨基甲酸酯)和带电荷的连接键(例如，硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯)。(4)ADP-核糖基化毒素和它们的脱毒衍生物细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自大肠杆菌(即，大肠杆菌热不稳定肠毒素"LT")、霍乱(弧菌)("CT")或百日咳(杆菌)("PT")。W095/17211描述了脱毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，W098/42375描述了其作为胃肠外佐剂的应用。佐剂优选脱毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72禾nLTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见以下参考文献Beignon等，(2002)/"/e"./mmw".70(6):3012-3019;Pizza等，(2001)Fac"'"e19:2534-2541;Pizza等，(2000)/"A丄A/edM/c油'o/.290(4-5):455-461;Scharton曙Kersten等，(2000)/"/e"./mmtm.68(9):5306-5313;Ryan等，(1999)/"/e"./mww",67(12):6270-6280;Partidos等，(1999)/www"o/.^e".67(3):209-216;Peppoloni等，(2003)r縱/腦2(2):285-293;和Pine等，(2002)丄Co"&o/We/eose85(1-3):263-270。氨基酸取代的数字基准优选以Domenighini等，Mol.Microbiol(1995)Jl(6):l165-1167所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基排列对比为基础。F.生物粘合剂和粘膜粘合剂生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球(Singh等，(2001)/.Cow.7e/eaw.70:267-276)，或者粘膜粘合剂，例如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂(参见WO99/27960)。G.微粒微粒也可用作本发明的佐剂。可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(a-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选用聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直径约100nm到150pm，优选约200nm到约30pm，最优选约500nm到约10|Lim的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。H.脂质体适合用作本发明佐剂的脂质体制剂的例子描述于美国专利号6,090,406;美国专利号5,916,588和EP0626169。I.聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯制剂适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯(参见，例如W099/52549)。这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂(WO01/21207)以及联用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(W001/21152)。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。J.聚磷腈(PCPP)适用于本发明佐剂的PCPP制剂描述于，例如Andrianov等，(1998)，J^(l-3):109-115和Payne等，(1998)，Adv.Drug.Del.Rev.li(3):185曙196。K.胞壁酰肽适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normummyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺CMTP-PE)。L.咪唑并喹啉化合物适合用作本发明佐剂的咪唑并喹啉化合物的例子包括Stanley(2002)C7/w.Dermal/.27(7):571-577;Jones(2003)Cwr.Op/w./wve^/g.Drwgs4(2):214隱218;和美国专利号4,689,338;5,389,640;5,268,376;4,929,624;5,266,575;5,352,784;5,494,916;5,482,936;5,346,905;5,395,937;5,238,944;和5,525,612中进一步描述的咪喹莫特(Imiquimod)及其同系物。M.縮氨基硫脲化合物适合用作本发明佐剂的縮氨基硫脲化合物的例子以及配制、制备和筛选这种化合物的方法包括WO04/60308所述的。縮氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子，例如TNF-中特别有效。N.色胺酮化合物适合用作本发明佐剂的色胺酮化合物的例子以及配制、制备和筛选这种化合物的方法包括WO04/64759所述的。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子，例如TNF-a中特别有效。本发明还可包括联用一种或多种以上鉴定的佐剂的各方面。例如，以下佐剂组合物可用于本发明(1)皂苷和水包油乳剂(W099/11241);(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO94/00153);(3)皂苷(例如0821)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)(W098/57659);(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂混合物(参见EP0835318;EP0735898禾口EP0761231);(6)含有10%角鲨烯、0.4%吐温80、5%普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF,微流化成亚微米乳剂或旋振(vortex)产生粒度较大的乳剂；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)，(Ribi免疫化学公司(RibiImmunochem))，其含有2%角鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)组成的细菌细胞壁组分；和(8)—种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL);(9)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的寡核苷酸序列)。0.人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如，干扰素-y)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)。在某些实施方式中，可经粘膜给予组合物，组合物优选还包含粘膜佐剂。合适的粘膜佐剂包括含CpG的寡聚物，生物黏合聚合物，参见WO99/62546和WO00/50078;大肠杆菌热不稳定肠毒素("LT")或其脱毒突变体，或霍乱毒素("CT")或其脱毒突变体或由生物可降解和无毒材料形成的微粒。优选的LT突变体包括K63或R72。参见，例如WO93/13202、EP0620850B1、WO97/02348和WO97/29771。在一特别优选的实施方式中，Env糖蛋白添加了MF59、CpG寡聚物(例如，CpG-7909)或同时添加了MF59和CpG寡聚物作为佐剂。虽然CpG-7909和MF-59的佐剂作用的确切机制仍是许多研究的主题，但大量证据提示CpG-7909/2006活化了B细胞并提高类浆细胞树突细胞中共刺激分子的产量(Kerkmann等(2003)/./mww"o/.170(9):4465陽4474)，而MF59与抗原呈递细胞相互作用并在肌内注射部位为树突细胞所内在化(Dupois(1998)Ce〃./画謂/.186(1):18-27)。CpG-7909和MF59均已批准应用于人体，并在临床试验中耐受良好(Kahn等(1994)/"/e".版70(5):1288誦1291;Ott等(1995)尸/i麵._S/ofec/mo/.6:277-296;Cooper等(2004)F,/"e22(23-24):3136-3143)，包括在携带HIV的人中进行的乙肝疫苗和流感疫苗试验(Cooper等(2005)v4/A19(14):1473-1479;Gabutti等(2005)//"AMW.版33(4):406-416)。本文所述的实验证明MF59和CpG-7909有提高多价HIVo-gpl40所引发的免疫应答质量和广度的能力。制备多肽可采用本领域己知的任何方法制备本发明的Env多肽。在一个实施方式中，采用本领域熟知的重组技术制备多肽。在这点上，对于Env基因，可根据Env(例如，gpl40)多肽基因组的己知序列设计寡核苷酸探针，用此探针检测基因组或cDNA文库。然后可采用标准技术进一步分离基因，例如可利用限制性内切酶在全长序列的所需位置截短基因。类似地，可釆用已知技术，例如苯酚提取从细胞或含细胞的组织中直接分离Env基因，进一步操作序列以产生任何所需的截短物。获得和分离DNA所用的技术可参见，例如Sambrook等，同上。可根据已知序列合成产生编码Env糖蛋白的基因。可用所需具体氨基酸序列的合适密码子设计核苷酸序列。一般使通过标准方法制备并装配成完整编码序列的寡核苷酸重叠来装配完整序列。参见，例如Edge等(1981)Wfl^w292:756-762;Nambair等(1984)Sc/e"ce223:1299-1301;Jay等(1984)乂C7em,259:6311-6317;Stemmer等(1995)164:49-53。不难采用重组技术克隆编码Env多肽基因的基因，然后通过取代合适的碱基(对)以获得所需氨基酸的密码子从而体外诱变该基因。这种变化可包括最少一个碱基对，导致一个氨基酸改变，或者可包括数个碱基对改变。或者，可利用错配引物实现突变，所述引物能在低于错配双联体的解链温度时与亲代核苷酸序列(通常是对应于RNA序列的cDNA)杂交。通过将引物长度和碱基组成维持在较窄的界限内并使得突变碱基位于中心可制备特异性引物。参见，例如Innis等(19卯)《PCR应用功能基因组学方法》(PCRApplications:ProtocolsforFunctionalGenomics);Zoller禾卩Smith(1983)A/eAotfc五"2^mo/.100:468-500。利用DNA聚合酶实现引物延伸，选择通过分离引物延伸链而获得的克隆产物和含有突变DNA的克隆。利用突变引物作为杂交探针进行选择。该技术也适用于产生多点突变。参见，例如Dalbie-McFarland等(1982)iVoc.淑/.Jcac/.Sc/腦79:6409-6413。一旦分离或合成了所需Env糖蛋白的编码序列，可将它们克隆入由于表达的任何合适载体或复制子。本领域技术人员知道许多克隆载体，选择合适的克隆载体不难。用于克隆的重组DNA载体和它们所能转化的宿主细胞的例子包括噬菌体X(大肠杆菌)、pBR322(大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、pKT230(革兰氏阴性细菌)、pGV1106(革兰氏阴性细菌)、pLAFRl(革兰氏阴性细菌)、pME290(非大肠杆菌革兰氏阴性细菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草芽胞杆菌(5ac〃/wsw6"7/力)、pBD9(芽孢杆菌)、pIJ61(链霉菌OS&e/^omjce力)、pUC6(链霉菌)、YIp5(酵母(SaccAaromyce力)、YCpl9(酵母)和牛乳头瘤病毒(哺乳动物细胞)。总体上参见《DNA克隆》(DAC4C/om'"g)，第I和II巻，同上；Sambrook等，同上；B.Perbal，同上。还可利用本领域技术人员已知的昆虫细胞表达系统，例如杆状病毒系统，所述系统描述于，例如Summers和Smith(1987)《德克萨斯农业实验站公告第1555号》(7"exa51Jgn.cw/Zwra/五x/en'me/^5Ya^/ow5w〃e0."TVo./555)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒的形式商品化购自加利福尼亚州圣迭戈市的英杰公司(Invitrogen)("MaxBac"试剂盒)等。还可用植物表达系统产生修饰的Eiw蛋白。这些系统通常利用含异源基因的病毒载体转染植物细胞。这些系统的描述可参见，例如Porta等，(1996)Afo/.^ofec/i.5:209-221;Hackland等，(1994)y^c/z.Wro/.139:1-22。本发明还可利用病毒系统，例如Tomei等(1993)JWro/.67:4017-4026和Selby等(1993)丄Ge".74:1103-1113所述的牛痘感染/转染系统。在该系统中，首先用编码噬菌体T7RNA聚合酶的牛痘病毒重组体在体外转染细胞。该聚合酶所显示的精确特异性在于其只转录携带T7启动子的模板。感染后，由T7启动子驱动用感兴趣的DNA转染细胞。牛痘病毒重组体的细胞质中表达的聚合酶将转染的DNA转录成RNA，然后宿主翻译机制将该RNA翻译成蛋白质。该方法能在胞质中高水平、瞬时产生大量RNA及其翻译产物。可将基因置于启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)和任选的操纵子(本文统称为"控制"元件)的控制下，从而能在用含有该表达构建物的载体转化的宿主细胞中将编码所需多肽的DNA序列转录成RNA。编码序列可以含有或不含有信号肽或前导序列。本发明可利用天然产生的信号肽或异源序列。通过宿主翻译后加工可除去前导序列。参见，例如美国专利号4,431,739;4,425,437和4,338,397。这种序列包括但不限于TPA前导序列以及蜜蜂蜂毒溶血肽(honeybeemellitin)前导序歹U。与宿主细胞的生长相比，还可能需要其它调节元件以调节蛋白质序列的表达。本领域技术人员已知这种调节序列，例子包括对化学或物理刺激(包括存在调节化合物)起反应而启动或终止基因表达的那些序列。载体中还可存在其它类型的调节元件，例如增强子序列。可先将控制序列和其它调节序列与编码序列相连，再插入载体中。或者，可将编码序列直接克隆入早已含有控制序列和适当的限制性位点的表达载体中。在一些情况中可能需要修饰编码序列使其以适当取向与控制元件相连；即，为维持正确的读框。可通过删除蛋白质编码序列的一部分、插入某序列和/或取代该序列中一个或多个核苷酸来制备突变体或类似物。本领域技术人员熟知修饰核苷酸序列的技术，例如定点诱变。参见，例如Sambrook等，同上；《DNA克隆》，第I和II巻，同上；《核酸杂交》，同上。然后用表达载体转染合适的宿主细胞。本领域已知的许多哺乳动物细胞系包括获自美国模式培养物保藏所(ATCC)的无限增殖细胞系，例如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、Vero293细胞以及其它细胞。在一优选的实施方式中，从CHO细胞产生和/或纯化o-gpl40(三聚体)。参见Srivastava等(2002)/P7ra/.76(6):2835-2847;Srivastava等(2003),P7ra/.77(29):11244-11259。本发明表达构建物还可利用诸如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和链球菌(&re^ococcw^p.)等细菌宿主。本发明可用的酵母菌宿主包括酿酒酵母(Sacc/flromycescerev/57.ae)、白色念珠菌(Cawd/caa/Wca"力、麦芽糖假丝酵母(C朋&V/ama//asa)、多形汉森酵母(Z/a"""M/a;o/ymorp/za)、脆壁克鲁维酵母(AT—verom戸s/rag7'fe)、学L酸克鲁维酵母(A7甲erom少ces/"cto)、季也蒙毕赤酵母(尸/c/n'agw/〃m'mo"力7)、巴斯德毕赤酵母(尸/c//fl;flWo&)、粟酒裂殖酵母OSWn'zoracc/w^omj;cejpom6e)禾口耳卩罗维亚酵母(Fa/row/a/^o(y〃ca)，等等。杆状病毒表达载体所用的昆虫细胞包括埃及伊蚊04e&s"eg;;;^)、苜蓿银纹夜蛾04^ogra;/^ca/z/om/c(3)、家蚕(5omZ)少xmo"〕、黑腹果虫黾(Dn^o//n7awe/a"og(X^er)、草地贪夜蛾0S^od丰er"/rwg—nia)禾口粉纹夜蛾(7Wc/zo//緩."m〕，等等。根据所选择的表达系统和宿主，可通过在能表达感兴趣蛋白质的条件下培养上述表达载体转化的宿主细胞来制备本发明蛋白质。本领域技术人员不难选择合适的生长条件。在一个实施方式中，转化细胞将多肽产物分泌入周围介质中。载体中可包含某些调节序列，从而能增强蛋白质产物的分泌，例如利用组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)前导序列、干扰素((3或Y)信号序列或己知分泌性蛋白质的其它信号肽序列。然后可通过本文所述的各种技术分离分泌的多肽产物，例如采用标准纯化技术，例如但不限于羟基磷灰石树脂、柱层析、离子交换层析、体积排阻层析、电泳、HPLC、免疫吸附技术、亲和层析、免疫沉淀等。或者，可采用能裂解细胞但仍能维持Env多肽基本上完整的化学、物理或机械方法破坏转化的细胞。通过除去细胞壁或细胞膜组分也可获得胞内蛋白质，例如，可利用洗涤剂或有机溶剂使Env多肽发生渗漏。本领域技术人员已知的这种方法描述于，例如《蛋白质纯化应用实用方法》(/^0^/"尸"〃//￡^/0"J/jp/ZcaHowr^尸rac"ca/j;;ratfc/z)(E丄.V.Harris禾口S.Angal(编))，1990。例如，本发明用于破坏细胞的方法包括但不限于声裂法或超声处理；搅拌；液体或固体挤压；热处理；冻融；干燥；爆发性减压；渗透压震扰；用裂解酶，包括蛋白酶如胰蛋白酶、神经氨酸酶和溶菌酶处理；碱处理；利用洗涤剂和溶剂，例如胆汁盐、十二烷基硫酸钠、Triton、NP40和CHAPS。根据表达多肽的细胞类型、培养条件和所用的任何预处理不难选择破坏细胞所用的具体技术。细胞破裂后，一般通过离心除去细胞碎片，采用标准纯化技术，例如但不限于柱层析、离子交换层析、体积排阻层析、电泳、HPLC、免疫吸附技术、亲和层析、免疫沉淀等进一步纯化胞内产生的Env多肽。例如，获得本发明胞内Env多肽的一种方法包括亲和纯化，例如利用抗-Env特异性抗体的免疫亲和层析，或通过凝集素亲和层析。特别优选的凝集素树脂是能识别甘露糖部分的那些树脂，例如但不限于衍生自雪花莲fG^/"W/zwmVa/^凝集素(GNA)、小扁豆(丄e"scw/Z"flnX)凝集素(LCA或小扁豆凝集素(lentillectin))、豌豆(尸/ww犯"vwm)凝集素(PSA或豌豆凝集素(pealectin))、黄7jC仙(Narcissuspseudonarcissus)凝集素(NPA)禾卩熊葱(Alliumursinum)凝集素(AUA)的树脂。本领域技术人员不难选择合适的亲和树脂。亲和纯化后，可采用本领域熟知的常规技术，例如上述的任何技术进一步纯化这些多肽。可通过，例如肽领域技术人员已知的任何技术常规化学合成较小的多肽，即，最多长约50个氨基酸。这些方法通常釆用将一个或多个氨基酸顺序加入延伸中的肽链。通常利用合适的保护基团保护第一个氨基酸的氨基或羧基。然后在允许形成酰胺键的条件下使该保护的或衍生的氨基酸与惰性固体支持物相连或通过加入序列中的下一氨基酸而在溶液中使用，所述另一氨基酸具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团。然后除去新加入的氨基酸残基上的保护基团，随后加入下一氨基酸(适当保护的)，依此类推。所需的氨基酸以正确顺序相连后，顺序或同时除去任何剩余保护基团(和任何固体支持物，如果要用固相合成技术的话)，从而获得最终多肽。通过简单地修改该通用方法，可能将多个氨基酸一次性加入一条延伸中的链，例如将受保护的三肽与适当保护的二肽偶联(在不是手性中心外消旋化的条件下)，从而在脱保护后形成五肽。固相肽合成技术可参见，例如J.M.Stewart和J.D.Young，《固相肽合成》(So/W尸/zawPe/7^/e5y"AeW力(皮尔斯化学公司(PierceChemicalCo.)，洛克福特，伊利诺斯州，1984)，G.Barany和R.B.Merrifield，《肽分析、合成、生物学》(T7ze尸ep"cfes:v4wa(y57'51,jSy"Aes/51,5/o/ogy)，E.Gross禾口J.Meienhofer编，第2巻，(学术出版社，纽约，1980)，第3-254页；经典液相合成可参见M.Bodansky，《肽合成原理》CPW""》/mo/Pep"V/eSj;"A^/力(S-V公司(Springer-Verlag)，伯林，1984)，E.Gross和J.Meienhofer(编)，《肽分析、合成、生物学》(T7ePe/"(iM:^"a/)Ay&,5y"A"&'5/o/ogy)，第1巻。典型的保护基团包括叔丁氧基羰基(Boc);9-芴基甲氧基羰基(Fmoc);节氧基羰基(Cbz);对甲苯磺酰基(TX);2,4-二硝基苯基；苄基(Bzl);二苯基异丙氧基羧基-羰基；叔戊氧基羰基；异冰片氧基(isobomyloxy)羰基；邻-溴苄氧基羰基；环己基；异丙基；乙酰基；邻-硝基苯磺酰基等。典型的固体支持物是交联的聚合支持物。这些支持物可包括二乙烯基苯交联的苯乙烯聚合物，例如二乙烯基苯-羟甲基苯乙烯共聚物、二乙烯基苯-氯甲基苯乙烯共聚物和二乙烯基苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。还可通过其它方法制备本发明的多肽类似物，例如通过同时多个肽合成方法。参见，例如Houghten(1985)尸匿.脂/.园82:5131-5135;美国专利号4,631,211。抗体针对本文所述添加佐剂的HIV糖蛋白的单克隆和多克隆抗体可用于诊断和治疗应用，例如那些中和性抗体可用于被动免疫治疗。特别是单克隆抗体可用于产生抗独特型抗体。抗独特型抗体是免疫球蛋白，其携带所需保护作用针对的感染物质抗原的"内影像(internalimage)"。本领域知道产生抗独特型抗体的技术。参见，例如Grzych等(1985)7VWww316:74-76;MacNamara等(1984)Sc/e"ce226:1325-1326;Uytdehaag等(1985)/mmw"o/.134:1225-1229。这些抗独特型抗体还可用于治疗和/或诊断HIV。病毒抗原的免疫测定可利用，例如，针对病毒表位的单克隆抗体，针对一种病毒多肽的表位的单克隆抗体的组合，针对不同病毒多肽的表位的单克隆抗体，针对相同病毒抗原的多克隆抗体，针对不同病毒抗原的多克隆抗体或单克隆和多克隆抗体的组合。免疫测定方案可基于，例如，竞争、直接反应或夹心测定。例如，方案还可利用固体支持物，或可通过免疫沉淀。大多数测定包括利用标记的抗体或多肽。标记物可以是，例如荧光分子、化学发光分子、放射性分子或染料分子。放大探针信号的试验也是已知的。这些试验的例子是利用生物素和亲和素的试验及酶标记和介导的免疫测定，例如ELISA。可采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗原或抗体浓度。该方法依赖于酶与抗原或抗体的偶联，并利用结合的酶活性作为定量标记。为检测抗体，将已知抗原固定在固相上(例如，微量滴定板或塑料杯)，用测试血清稀释液温育，洗涤，用酶标记的抗-免疫球蛋白温育并再次洗涤。本领域知道适合于标记的酶，包括，例如辣根过氧化物酶。加入特异性酶并通过比色法测定产物形成或底物利用来检测与固相结合的酶活性。结合的酶活性是所结合抗体数量的直接函数。为检测抗原，将已知的特异性抗体固定于固相，加入含抗原的测试物质，温育后洗涤固相，再加入酶标记的第二抗体。洗涤后，加入底物，通过比色法估算酶活性，并将其与抗原浓度相关联。将融合蛋白给予哺乳动物，例如小鼠、家兔、山羊或马可产生多克隆抗体。收集免疫动物的血清，通过，例如用硫酸铵沉淀，然后层析，优选亲和层析而从血浆中纯化抗体。本领域已知产生和加工多克隆抗血清的技术。还可制备单克隆抗体。可将用例如突变型NS3多肽或NS-核心融合蛋白免疫的哺乳动物，例如小鼠的正常B细胞与，例如HAT-敏感性小鼠骨髓瘤细胞融合从而产生杂交瘤。可采用RIA或ELISA鉴定杂交瘤，通过在半固体琼脂中克隆或有限稀释来分离。经另一轮筛选分离产生所需特异性抗体的克隆。针对表位的单克隆和多克隆抗体特别可用于检测样品，例如HIV感染的人的血清样品中是否存在抗原。HIV抗原的免疫测定可利用一种抗体或几种抗体。HIV抗原的免疫测定可利用，例如针对HIV表位的单克隆抗体，针对一种Env的表位的单克隆抗体的组合，针对不同多肽的表位的单克隆抗体，针对相同HIV抗原的多克隆抗体，针对不同HIV抗原的多克隆抗体或单克隆和多克隆抗体的组合。例如，免疫测定方案可基于利用例如标记抗体的竞争、直接反应或夹心测定。标记物可以是，例如荧光分子、化学发光分子、放射性分子。还可利用多克隆和单克隆抗体，通过免疫亲和柱分离Env。可通过，例如吸附或通过共价连接将抗体连接于固体支持物，从而使抗体保留其免疫选择活性。可任选包含间隔基团，从而使抗体的抗原结合位点可以接近。然后可用固定的抗体结合生物样品，例如血液或血浆中的靶标。通过，例如改变pH从柱基质上回收结合的蛋白质或复合物。诊断、疫苗和治疗应用本发明的组合物或其编码多核苷酸可用于多种诊断和治疗目的。例如，蛋白质和多核苷酸或用其产生的抗体可用于各种试验来测定生物样品中是否存在反应性抗体和/或Env蛋白，从而有助于诊断HIV感染或疾病状态或检测免疫反应。如上所述，可采用标准电泳和免疫诊断技术，包括免疫测定，例如竞争、直接反应或夹心试验来检测与Env(例如，o-gpl40)多肽有反应的抗体和相反，与所产生的抗体有反应的抗原。这种试验包括但不限于蛋白质印迹；凝集测试；酶标记和介导的免疫测定，例如ELISA;生物素/亲和素型试验；放射性免疫测定；免疫电泳；免疫沉淀，等等。这些反应通常包括显色标记(revealinglabd)，例如荧光分子、化学发光分子、放射性分子或酶标记物或染料分子，或检测抗原和与其反应的一种或多种抗体之间形成复合物的其它方法。试验中可利用固体支持物，例如膜或微量滴定孔板形式的硝酸纤维素；片状或微量滴定孔板形式的聚氯乙烯；珠或微量滴定板形式的聚苯乙烯乳胶；聚偏氟乙烯(polyvinylidinefluoride);重氮化纸；尼龙膜；活化珠，等等。本文所述添加佐剂的Env糖蛋白组合物，或针对该组合物的抗体可提供在试剂盒中，试剂盒中还装有合适的使用说明书和其它必需的试剂，从而能实施上述免疫测定。根据所用的具体免疫测定，试剂盒还可装有合适的标记物和其它包装试剂和材料(即，洗涤缓冲液等)。可利用这些试剂盒实施标准免疫测定，例如上述那些。还可将这些组合物用作疫苗从而能在对象中诱导预防性(即，防止感染和/或疾病进展)和/或治疗性(在感染后治疗HIV)。疫苗组合物可包含衍生自多种病毒分离物和/或亚型的Env糖蛋白(或编码这些蛋白质的核苷酸序列)混合物。在某些实施方式中，这些组合物可包含衍生自至少两种不同亚型(例如，亚型B和C)的Env糖蛋白(或编码这些蛋白质的核苷酸序列)混合物。在其它实施方式中，这些组合物可包含衍生自至少三种不同亚型(例如，亚型A、B和C)的Env糖蛋白(或编码这些蛋白质的核苷酸序列)混合物。在进一步的实施方式中，这些组合物可包含衍生自至少两种不同HIV类型(例如，HIV-l和HIV-2)的Env糖蛋白(或编码这些蛋白质的核苷酸序列)混合物。在还有其它实施方式中，这些组合物可包含衍生自相同亚型的至少两种不同毒株(例如，HIV-1SF2、HIV-1SF162、HIV-1CM235，等等)的Env糖蛋白(或编码这些蛋白质的核苷酸序列)混合物。在具体的实施方式中，可利用本文所述的多价组合物诱导保护免遭多种HIV类型、毒株和/或亚型的感染和/或治疗这种感染的免疫应答。在其它实施方式中，可利用本文所述的多价组合物诱导抵御多种HIV亚型的HIV毒株的保护性和/或治疗性免疫应答。例如，可利用本文所述的多价组合物诱导针对HIV亚型的保护性和/或治疗性免疫应答，所述亚型包括衍生组合物中HIVEnv糖蛋白的毒株。在一具体实施方式中，可利用本文所述的多价组合物诱导针对以下HIV亚型的保护性和/或治疗性免疫应答，所述亚型包括衍生组合物中HIVEnv糖蛋白的毒株和多价组合物中未代表的HIV亚型。本文所述的组合物和疫苗可产生抵御包括不构成免疫组合物一部分的亚型在内的各种亚型的广泛中和活性。例如，在实施例1中，申请人证明用包含亚型B和CEnv糖蛋白的多价组合物免疫引发了抵御各种亚型B、C和AHIV毒株的中和抗体。还可联合以下其它抗原和免疫调节剂给予本文所述的组合物，例如免疫球蛋白、细胞因子、淋巴因子和趋化因子，包括但不限于IL-2、修饰的IL-2(cysl25-ser125)、GM-CSF、IL-12、y-干扰素、IP-IO、MIP1和RANTES。可将这些组合物作为多肽或编码多肽的多核苷酸给予。可将多核苷酸作为裸核酸疫苗(例如，DNA)递送或利用病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、a病毒载体(参见，例如美国专利号6,465,634;6,458,560;6,451,592;6,426,196;6,376,236;6,015,694;6,342,372;6,015,686;5,843,723;和5,789,245)和腺伴随病毒载体递送。还可利用非病毒载体(例如，脂质体、包被有核酸或蛋白质的颗粒)递送多核苷酸。本领域技术人员己知这些和其它多核苷酸递送系统，所述系统描述于，例如美国专利号6,943,153;6,602,705;和美国专利公布号20050214256;20030194800;20030170614;20030223964;20030143248;和20020198621。这些组合物还可包含蛋白质和核酸的混合物，进而可利用相同或不同的载体递送。可在一次或多次用药样中给予组合物和疫苗(例如，DNA或病毒致敏，蛋白质加强)，不同的用药样式可以顺序或同时给予。例如，在某些实施方式中，可给予本文所述的组合物以致敏哺乳动物对象。本文所用的"致敏"表示任何方法，藉此用本文所述组合物进行的第一免疫能在用本文所述第二种组合物进行第二免疫后产生针对一种或多种靶抗原的免疫应答，其中与未提供第一免疫或给予的第一免疫含有的组合物不表达所述一种或多种抗原所获得的免疫应答相比，所述第二免疫应答更强。致敏包括每小时一次、每天一次、每周一次、每月一次或每年一次给予的单剂量或多剂量方案。在一具体实施方式中，致敏(或致敏免疫)包括至少两次给药(包括一份或多份剂量)。例如，在一具体实施方式中，通过给予一种或多种本文所述组合物进行致敏要求给予(包括一份或多份剂量)至少一次(例如，1、2、3、4、5、6、7次或更多次)所述一种或多种组合物。给药之间的时间间隔可以是小时、天、周、月或年。在其它实施方式中，可将本文所述组合物作为加强剂给予以加强致敏哺乳动物对象后获得的免疫应答。可在致敏后的某时刻给予作为加强剂给予的组合物。在一具体实施方式中，可以在致敏(或致敏免疫)后约两(2)到二十七(27)周后进行加强(或加强免疫)。加强包括每小时一次、每天一次、每周一次、每月一次或每年一次给予的单剂量或多剂量方案。在某些实施方式中，加强(或加强免疫)包括至少一次给药。在其它实施方式中，加强(或加强免疫)包括至少两次给药(包括一份或多份剂量)。例如，在这种情况中，在一具体实施方式中，通过给予一种或多种本文所述组合物进行加强要求给予(包括一份或多份剂量)至少一次(例如，1、2、3、4、5、6、7次或更多次)所述一种或多种组合物。给药之间的时间间隔可以是小时、天、周、月或年。在某些实施方式中，可将相同的组合物作为致敏剂和加强剂给予。在其它实施方式中，可利用不同组合物致敏和加强。例如，在某些实施方式中，可将多肽组合物作为致敏(剂)和/或加强(剂)进行多次免疫。在其它实施方式中，先进行一次或多次多核苷酸(例如，质粒、a病毒载体、痘病毒载体、腺病毒载体或它们的组合)致敏免疫，再给予一次或多次多肽加强。本文所述的疫苗通常包含一种或多种"药学上可接受的赋形剂或载体"，例如水、盐水、甘油、乙醇等。此外，这种载体中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。运载体可任选存在，其是本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的一种分子。合适的运载体通常是较大而代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质凝聚物(例如油滴或脂质体)和无活性的病毒颗粒。本领域普通技术人员熟知这种运载体。此外，Env多肽可以与细菌类毒素，例如白喉、破伤风、霍乱等的类毒素偶联。一般将疫苗组合物制备成可注射的液体溶液或悬液；还可制备成适合于先溶解或悬浮在液体载体中再注射的固体形式。还可将该制品乳化或包裹在脂质体中以增强佐剂作用，如上所述。本文所述的疫苗包括治疗有效量的添加佐剂的HIVEnv糖蛋白组合物，或编码其的核苷酸序列、针对这些复合物的抗体和任何其它上述组分，如果需要的话。"治疗有效量"表示能在给予疫苗的未感染、受感染或未接触(感染物质)的个体中诱导保护性免疫应答的用量。这种应答通常导致对象中产生针对该疫苗的分泌型、细胞和/或抗体介导的免疫应答。细胞介导的免疫应答包括CD4+T辅助细胞应答、细胞毒性T淋巴细胞、CD8+细胞抗病毒应答和抗病毒趋化因子应答。抗体介导的免疫应答包括通过血清学试验(例如，病毒中和试验、ADCC试验、ELISA、免疫印迹试验等)检测的那些应答。因此，保护性免疫应答包括但不限于一种或多种以下作用产生任一免疫学类型的抗体，例如免疫球蛋白A、D、E、G或M;B和T淋巴细胞增殖；提供免疫细胞的活化、生长和分化信号；辅助T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞的扩增。有效量优选足以治疗或预防疾病症状。所需的精确用量依据所治疗的对象；待治疗个体的年龄和总体状况；个体的免疫系统合成抗体的能力；所需的保护程度；所治疗病症的严重程度；所选择的具体多价组合物及其给药方式等其它因素而有所不同。本领域技术人员不难测定合适的有效量。"治疗有效量"应处于通过常规试验即可测定的较宽范围内。可以通过皮下、表皮、真皮内、粘膜内如经鼻、直肠和阴道、腹膜内、静脉内、口服或肌内注射核酸和/或多肽。其它给药方式包括口服和肺部给药、栓剂、无针注射、经皮和透皮应用。剂量治疗方案可以是单剂量给药法或多剂量给药法。可联合给予核酸与肽或其它物质。虽然结合优选的具体实施方式描述了本发明，但应该知道，以上描述以及下文的实施例只是为了说明而不是限制本发明的范围。本发明所属领域的技术人员明显知道属于本发明范围的其它方面、优点和改进。实施例以下是实施本发明的具体实施方式的实施例。提供这些实施例只是为了说明的目的，而不是要以任何方式限制本发明的范围。虽然已作出努力来确保所用数值(例如，含量、温度等)的精确性，但当然应考虑到有一些实验误差及偏差。实施例用多价O-GP140多肽免疫在增强HIVenv免疫原性的尝试中，我们和他人寻求基于HIVenv抗原设计的寡聚HIVenv糖蛋白(o-gpl40)亚单位疫苗方法，所述抗原可模拟HIV病毒颗粒表面存在的天然三聚体env刺突。参见，例如Yang等，(2000)K>o/.74(12):5716-5725;Grundner等，(2005)n>o/ogv331(1):33-46;Srivastava等，(2003)丄P7ro/.77(29):11244-11259;Barnett等，(2001)/.^>o/.75(12):5526-5540。因此，我们开发了在第二超变环(AV2)中发生改变的可溶性HIVo-gp140，其衍生自北美洲，进化枝-BHIV毒株SF162，最近也衍生自南美洲，进化枝-CHIV毒株TV1(Lian等(2005)K/ro/.79(21):13338-13349)。采用的致敏/加强疫苗方案包括DNA或腺病毒致敏免疫，然后用MF59佐剂中的寡聚蛋白质免疫，我们证明这些AV2o-gpl40在家兔(Barnett等(2001)丄75(12):5526-5540)、恒河猴(Otten等(2005)/,79(13):8189-8200)和黑猩猩(Peng等(2005)/W/.79(16):10200-10209)中是免疫原性的。虽然用复制型腺病毒-HIV重组体致敏黑猩猩，然后用SF162AV2o-gpl40加强时出现有希望的广泛中和抗体活性迹象(Peng等(2005),K>o/.79(16):10200-10209)，但采用DNA致敏/o-gp140加强疫苗方案在家兔和恒河猴中产生的针对异源HIV毒株的体液应答的广度有限(Lian等(2005)/.Wm/.79(21):13338-13349)。尽管如此，当在DNA致敏/蛋白质加强方案中联用时，在几项研究中AV2TV1和SF162gpl40免疫原同样产生最高滴度的针对中和敏感性SF162毒株的中和抗体(Lian等(2005)J^>o/.79(21):13338-13349)，提示至少就效力而言，在一种二价疫苗中联用这些gpl40抗原是有希望的。与近年来的证据一致表明，多价和多进化枝HIV疫苗在恒河猴(Seaman等(2005)/79(5):2956-2963;Pal等(2005)她d,尸n扁,oZ.34(5-6):226-236)和豚鼠(Chakrabarty等(2005)F固'"e.23(26):3434-3445)中能引发中和抗体应答广度改善，进行以下只含蛋白质的二价AV2o-gpl40实验来评估针对一组良好表征的HIV假型毒株的中和抗体应答广度，所述毒株源自急性/早期HIV感染。选择的分离物是源自HIV感染期间早期的那些分离物，因为早期分离物能更好地代表传播的HIV毒株，因此与HIV疫苗设计更相关(Moore等(2004)A^.10(8):769-771)。此外，根据近年来HIV中和抗体总体评估的建议，选择亚型-B组来维持疫苗免疫监测一致性(Li等(2005)/Wro/.79(16):10108-10125;Mascola等(2005)/79(16):10103-10107;Esparza(2005)Af/croWo/.8(2):93-101)。A.家兔动激、度滞^/乾^/如以前在Srivastava等(2003)/.77(20):11244-11259和Lian等(2005)/.FZro/.79(21):13338-13349中所述制备研究级SF162AV2envo-gpl40禾卩TV1AV2envo-gp140。每个免疫组使用10只新西兰白色家兔。第0、4、12和24周，家兔在臀肌中接受总共四次肌内免疫。疫苗剂量是每只动物25i!g所示o-gpl40疫苗。二价疫苗组(组5和6)中的动物接受合并在同一注射器中的12.5|ngSF162o-gpl40和12.5pgTV1o-gpl40。1、3和5组中的动物接受与250(alMF59佐剂联用的蛋白质免疫；2、4和6组中的动物接受与250piMF59佐剂和500pgCpG-7909联用的蛋白质免疫。用MF59佐剂配制的单价或二价AV2o-gpl40疫苗免疫家兔，所述疫苗含有或不含下表所示的免疫增强剂CpG-7909:<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>如以前Li等((2005)/■Wra/.79(16):10108-10255)和Montefiori((2004)(约翰威立父子公司(JohnWiley&Sons)，纽约，纽约州》所述，根据TZM-bl细胞被病毒感染一轮后萤光素酶基因表达的降低来测量中和抗体活性。以1:10的稀释度平行筛选之前(采血前)、第三次免疫后两周(2wp3)和第四次免疫后两周(2wp4)获得的血清样品的中和活性，一式两份。与存在采血前血清时的相对发光单位(RLU)相比，计算RLU的降低百分比。类似地，通过监测1:15-1:32805范围的连续稀释血清的活性来测定中和滴度。就抵御进化枝BSF162的效力而言，特别是当用MF59佐剂联合CpG-7909配制并且动物免疫了三次或四次时，本文所述的二价o-gpl40疫苗显示优于它们相应的单价疫苗。除(或代替)TV1夕卜，可利用衍生自泰国亚型E毒株HIV-lcM235的HIVEnv多肽进行其它实验。可以合理预期这些实验的结果，其类似地显示与单价疫苗组合物相比，免疫应答增强。B.弥猴基本上如下文所述，还用上述添加了佐剂MF-59和CpG-7909的单价o-gpl40疫苗免疫非人灵长类(弥猴)<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>第一次免疫(第0周)如下所示组h3X50pg各gpl40Env蛋白抗原(亚型A、B、C)，混合在1mlMF59+CpGIM中(左上肢)；组4:1mlMF59十CpG(左上肢)。第二次免疫(第6周)如下所示组l:3X50pg各蛋白质抗原，(混合)在1mlMF59+CpG中(左上肢)；组4:1mlMF59+CpG(左上肢)。第三次免疫(第16周)如下所示组l:3X50pg蛋白质抗原，(混合)在1mlMF59+CpG中(左上肢)；组4:1mlMF59+CpG(左上肢)。第四次(任选的)免疫(第28周)如下所示组l:3X50pg蛋白质抗原，(混合)在1mlMF59+CpG(左上肢)；组4:1mlMF59+CpG(左上肢)。本文的结果证明给二价HIVenv糖蛋白疫苗添加MF59和CpG-7卯9佐剂(单用或联用)能增强中和抗体应答的效力。权利要求1.一种免疫原性组合物，其包含第一HIV包膜多肽和第二HIV包膜多肽，其中所述第一和第二包膜多肽来自不同的HIV亚型。2.如权利要求l所述的免疫原性组合物，其特征在于，还包含一种或多种佐剂。3.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述一种或多种佐剂选自下组MF59、CpG分子、微粒、明矾和它们的组合。4.如以上权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述HIV包膜多肽包含选自下组的多肽gpl20、gpl40和gpl60多肽。5.如权利要求4所述的免疫原性组合物，其特征在于，至少一种HIVEnv多肽包含gpl40多肽，所述gpl40多肽是寡聚gpl40(o-gp140)。6.—种包含两种或更多种HIV包膜多肽的免疫原性组合物，其中所述包膜多肽中的至少两种各来自不同的HIV亚型。7.如权利要求6所述的免疫原性组合物，其特征在于，包含三种或更多种HIV包膜蛋白，其中所述包膜多肽中的至少三种各来自不同的HIV亚型。8.如权利要求6或7所述的免疫原性组合物，其特征在于，还包含一种或多种佐剂。9.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述一种或多种佐剂选自下组MF59、CpG分子、微粒、明矾和它们的组合。10.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述微粒包含PLG微粒。11.如权利要求6-10中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述HIV包膜多肽包含选自下组的多肽gpl20、gpl40和gp160。12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其特征在于，至少一种HIV包膜多肽包含gpl40多肽，所述gpl40多肽是寡聚gpl40(o-gp140)。13.如权利要求12所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述o-gpl40在蛋白酶切割位点中包含突变。14.如以上权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述HIV包膜多肽中的一种或多种在V2环中有缺失、在VI环中有缺失、在V3环中有缺失或它们的组合。15.如以上权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述HIV包膜多肽衍生自选自下组的两种或更多种亚型亚型A、B、C、D、E、F、G、H、J、K和循环重组形式(CRF)。16.如权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述两种或更多种亚型包括亚型A和B。17.如权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述两种或更多种亚型包括亚型A和C。18.如权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述两种或更多种亚型包括亚型B和C。19.如权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述两种或更多种亚型包括亚型B和E。20.如以上权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述HIVEnv多肽中的一种或多种与选自下组的一种或多种其它分子形成复合物CD4、CD4模拟物、CCR5共同受体或模拟物、tat、其它病毒蛋白、多核苷酸、多肽、小分子和它们的组合。全文摘要本发明描述了包含多价和添加佐剂的HIVEnv糖蛋白的组合物。本发明也提供了使用这些组合物来治疗和预防HIV的方法。文档编号A61K39/295GK101351223SQ200680045059公开日2009年1月21日申请日期2006年10月17日优先权日2005年10月17日发明者B·伯克,I·K·斯里瓦斯塔瓦,S·W·巴尼特,V·R·戈麦斯-罗马,英廉申请人:诺华有限公司