治疗肿瘤性疾病的方式和方法

专利名称：：治疗肿瘤性疾病的方式和方法治疗肿瘤性疾病的方式和方法本发明涉及基于向患者施用抗体构建体尤其是双特异性单链构建体的免疫性医学干涉的药学方式和方法。具体而言，本发明涉及治疗惰性(indolent)或迅速蔓延性(aggressive)B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)或B细胞白血病的药学方式和方法，其中所述的方式和方法涉及施用双特异性单链抗体。本发明进一步涉及双特异性单链抗体在制备治疗惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)或B细胞白血病的药物中的用途。基于抗体的疗法广泛用于治疗人类疾病。此类治疗方案一般需要施用多次大剂量输注的抗体治疗剂，即在整个治疗期间间歇地多次、通常为静脉内地(i.v.)和高剂量地注射抗体-根据韦氏在线字典，"大剂量输注(bolusinfusions)，，表示通常在短时间内注射入血管的单次剂量药物；也参见www.nlm.nih.gov/medlineDlus和www.Dhoenix5.org/glossarVo例如，反复以每周剂量施用治疗复发性或顽固性低度或滤泡性CD20+B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的单克隆抗CD加抗体利妥昔单抗(Rituximab)(美罗华(Rituxan))超过4-8周(GhielminiM"J.Clin.Oncol.2004)。大剂量输注模式也描述于用于慢性淋巴细胞白血病的人源化抗CD52的单克隆抗体阿来组单抗(Alemtuzumab)(O'Brian，2003，Cancer,98，2657-63)、用于转移性乳腺癌的曲妥珠单抗(Trastuzumab)(赫赛汀(Herceptin)，抗Her2抗体)、用于急性骨髓样白血病(AML)的吉妥珠单抗(Gemtuzumab)(麦罗塔(Myelotarg),抗CD33抗体)、用于B细胞慢性淋巴白血病(CLL)的阿来组单抗(Campath，抗CD52抗体)和用于复发性或顽固性低度、滤泡性或转化的B细胞NHL的替伊莫单抗(Ibritumomab)(Zevalin,抗CD20抗体)(综述见Cersosimo，2003，Am.J.Health画Syst-Pharm.，60，1531-48)。抗17-lA的单克隆抗体依决洛单抗(Edrecolomab)(Panorex)也用作反复的输注剂，其中以高剂量(500mg)起始、两周后每28天经静脉内注射100mg(Makower，2003，CancerInvest.,2,177-84)。在抗体疗法中常见的现象是发生与输注相关的副作用，例如细胞因子释放综合征("CRS")。CRS是应答T细胞结合性抗体的输注而立即发生的并发症。CRS与T细胞/单核细胞活化相关，并继而与补体级联的活化相关。这些过程通过能够交联T细胞和单核细胞、并活化补体的抗体的Fc部分介导。CRS的发病机理归因于应答OKT3对T淋巴细胞的刺激而合成的肿瘤坏死因子(TNF)ot、IL-2、IL-6和y-干扰素。一般地，此类抗体结合T细胞受体，从而活化T细胞。由活化的T细胞释放的细胞因子(例如，TNFoc、白细胞介素(IL-2、IL-6)和干扰素(IFNy))产生与在严重感染中发现的反应类似的并且表征为低血压、发烧和僵直的类型的系统性炎症反应(systemicinflammatoryresponse)。患者感觉非常不舒服，如同发高烧一样-的确，CRS实际上是一种类型的非传染性发烧。所描述的其它与CRS相关的副作用为疲劳、呕吐、心跳过速、高血压、头痛和背痛。当施用多种单克隆抗体时也观察到CRS。例如，利用抗CD20抗体利妥昔单抗的抗肿瘤活性来治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。通过每周三次增量完成的剂量逐渐增加即增加剂量对利妥昔单抗作为单一试剂发挥显著临床活性是必需的(Lin，2003，SeminarOncol.30，483-92)。然而，这种施用方案触发细胞因子TNF-oc和IL-6的释放，其中TNF-ot和IL-6的血浆水平分别在起始输注后90分钟达到峰值。这种细胞因子的上升伴随着发烧、寒战、低血压和恶心(Winkler，1999，Blood，94,2217-24)。输注的毒性可以通过适当的预药物制剂(pre-pharmaceuticalagent)和加强的施用方案来降低(Lin，2003，SeminarOncol.30,483-492)。当施用其它抗体形式例如双特异性抗体时也观察到CRS。在乳腺癌患者中单次输注联合GCSF(粒细胞集落刺激因子)的双特异性抗体MDX-2H12(抗FcY受体Ix抗Her-2/neu)分别在输注MDX-2H12后的2和4小时导致TNF-a和IL-6的最高水平。TNF-a和IL-6的峰值水平不与所施用的双特异性抗体的剂量相关(Repp，2003，Br.J.Cancer,89，2234-43)。如在WO99/54440中所述，CRS在向B细胞衍生性慢性淋巴白血病(B-CLL)患者中以重复输注施用抗CD19x抗CD30的双特异性单链抗体(bscCD19xCD3)进行的内部临床研究中发现。如WO99/54440的图19和20所示，发现应答每次输注而释放TNF、IL-6和IL-8，其中所述的输注为两次施用20分钟的输注(分别为3jag和10ng双特异性单链抗体)，伴随每次施用后释放细胞因子。在施用10Mg双特异性单链抗体后观察到最大的细胞因子释放。TenBerge等人，1996，Transplant.Proc.28,3217-20描述了涉及连续输注抗CD3的单克隆抗体OKT3两小时的研究。这项研究的目的是确定已知与施用OKT3相关的血栓栓塞并发症并发症是否取决于这个分子施用的方式。一般地，通过连续输注施用OKT3比单次大剂量输注较好地耐受。连续输注也在抗体相关药剂的现有技术中进行了描述。例如，连续输注GD3神经节苷脂特异性单克隆抗体R24主要在25和50mg/m2的剂量导致R24相关的毒性(Alpaugh，1998，Med.Oncol.，15,191-8)。在患有转移性黑素瘤的患者中连续输注两次24小时性GD3神经节苷脂特异的人IgM单克隆抗体输注48小时会在输注期间和之后诱导小的副作用(Irie,2004，CancerImmunol.Immunother.53，110-7)。在本文，需要极高的治疗性抗体施用率、即克抗体的级别来完成临床效果。此外，将从杂交瘤作为鼠IgGl生产的抗CD16x抗CD30的双特异性抗体应用于患有霍奇金病的患者的不同输注方案中(Hartmann，2001，Clin.CancerRes.，7，1873-1881)。这个抗体通过结合0016^0y受体III)活化NK细胞。输注以连续4天超过24小时的连续输注或者以每隔一天l小时的输注进行。每次输注的双特异性抗体的绝对剂量为在5%人白蛋白溶液中的4x25mg。不论何种施用方案，输注双特异性抗体后未在外周血细胞计数中观察到一致变化，尽管后者在个体间截然不同。不管抗体治疗方案是连续还是间歇的，患者都发展出发烧。连续而非间歇地以大剂量输注治疗性抗体不能减轻患者遭受的副作用的发生或严重性。讨论了例如通过同时施用细胞因子来达到靶向的效应细胞数量和/或活化状态的增加可能对于增加双特异性抗体疗法的抗癌效力也是必需的。尽管在上文所述研究中使用总量100mg的治疗性抗体，双特异性抗体成为成功且可广泛应用的疗法的主要障碍确定为双特异性抗体有限的利用率。作者提出，可以通过下列途径来非常大地改善临床效力，所述途径为l)增加双特异性抗体的剂量；和2)增加治疗周期数量。因此，需要降低不希望的副作用。因此，本发明的目的是为基于抗体的医学疗法提供具增加的患者耐受性的药学方式和方法。具体而言，目的在于此类方式和方法允许所施用的抗体保持最大生物活性，同时最小化这种施用引起的不希望和不利的副反应。本发明涉及双特异性单链抗体构建体在制备预防、治疗或改善癌或非实体或实体瘤的药物组合物中的用途，其中所述的双特异性单链抗体构建体用于持久地施用较长的一段时间。因此，本发明的第一个方面提供了双特异性单链抗体构建体在制备预防、治疗或改善惰性或迅速芟延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)或B细胞白血病的药物组合物中的用途，其中所述的双特异性单链抗体构建体包含对人CD3和人CD19特异的结合结构域，其中相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(VL)从N端到C端以以下次序排列VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)(SEQIDNO.:2),Vh(CD19)-Vl(CD19)Vh(CD3)Vl(CD3)(SEQIDNO.:4)，VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)(SEQIDNO.:6)，或者VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)(SEQIDNO.:8)，并且其中所述双特异性单链抗体构建体至少以每平方米患者身体表面积10照至80將的日剂量施用1周，并且其中所述的日剂量施用超过至少6小时。在另一实施方案中，本发明涉及预防、治疗或改善惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金'淋巴瘤(BNHL)或B细胞白血病的方法，所述方法包括向需要其的个体施用包含双特异性单链抗体构建体的药物组合物，所述双特异性单链抗体构建体包含对人CD3和人CD19特异的结合结构域，其中相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(Vj从N端到C端以以下次序排列Vl(CD19)-Vh(CD19)-Vh(CD3)-Vl(CD3)(SEQIDNO.:2)，VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)(SEQIDNO.:4)，VH(CD3)VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)(SEQIDNO.:6)，或者VH(CD3)VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)(SEQIDNO.:8),其中所述的双特异性单链抗体构建体至少以每平方米患者身体表面积10照至80照的日剂量施用1周，并且其中所述的日剂量施用超过至少6小时。在另一实施方案中，本发明涉及药盒，其包含用于在人中预防、治疗或改善惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)或B细胞白血病的药物组合物和说明书，其中所述药物组合物包含的双特异性单链抗体构建体包含对人CD3和人CD19特异的结合结构域，其中相应的可变重链区(Vh)和相应的可变轻链区(VL)从N端到C端以以下次序排列VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)(SEQIDNO.:2)，Vh(CD19)-Vl(CD19)-Vh(CD3)-Vl(CD3)(SEQIDNO.:4)，VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)(SEQIDNO.:6),或者Vh(CD3)-Vl(CD3)-Vl(CD19)曙Vh(CD19)(SEQIDNO.:8)，并且所述说明书描述了双特异性单链抗体构建体的施用方案，包括以每平方米患者身体表面积10jag至80jig的日剂量施用至少l周，并且其中所述的日剂量施用超过至少6小时。本发明的另一实施方案涉及用来在人中预防、治疗或改善惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)或B细胞白血病的药盒，其中包括施用包含人CD3和人CD19特异结合结构域的双特异性单链抗体构建体，其中相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(Vl)从N端到C端以以下次序排列VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)(SEQIDNO.:2)，Vh(CD19)-Vl(CD19)曙Vh(CD3)陽Vl(CD3)(SEQIDNO.:4)，VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)(SEQIDNO.:6),或者VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)(SEQIDNO.:8)，其中所述的双特异性单链抗体构建体以每平方米患者身体表面积10照至80照的日剂量至少施用1周，并且其中所述的日剂量施用超过至少6小时，并且其中所述的药盒含有下列组分(a)至少7份l40pg-320ng双特异性单链抗体构建体的单独的日剂量；和(b)将组分以促进对治疗方案顺应性的方式安排的装置(means)。因此，在方法、药盒或用途的上下文中根据本发明计算的患者平均身体表面积在1,7-2,2m2的范围。有利地，本发明的药盒进一步包含任选的(a)反应緩冲液、储藏溶液和/或所述用途需要的剩余试剂或物质。此外，本发明药盒的组分包独立地包装在管或瓶子中、或者联合包装在容器或多容器单位中。药盒的制备优选遵循本领域技术人员已知的标准方案。为了评估本文所述抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体(bscCD19xCD3)的安全性和耐受性，向两名患有复发性非霍奇金淋巴瘤(BNHL)的患者通过长期连续的输注施用化合物。在2000年第一名患者祐珍断为滤泡性淋巴瘤。虽然这位患者在过去接受了多种化学疗法和免疫疗法，但疾病仍然恶化了。在根据本文提供的用途和方法用本文所述的抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体构建体进行治疗后，疾病不仅首次得到停止，而且实现了淋巴瘤病灶的显著缩小。如下列非限制性实施例中所述，当这名患者以15照/m2/24小时剂量水平的本文所述抗CD3x抗CD19双特异性单链抗体构建体接受4周连续输注时，治疗得到很好的耐受，即未观察到显著的副作用。治疗导致强的T细胞活化和增殖。具细胞毒性表型的T细胞主要是因为CD8+T细胞增殖。T细胞的活化和增殖在肿瘤中由本文所述抗CD3x抗CD19双特异性单链抗体修^饰的B淋巴瘤细胞诱导。测定治疗期间的B细胞数显示，所述构建体能够由于其对淋巴瘤细胞的细胞毒性而完全地消除循环的b(淋巴瘤)细胞。在治疗后的再分期(restaging)，发现根据NHL的反应测定的淋巴瘤块明确减小通过对应肿瘤反应测试中部分的反应(PartialResponse,PR)的计算性X射线断层术(CT),六个参考淋巴瘤病灶的总产物直径(SumProductDiameters,SPD)i貪断为下降58.0%。1999年第2名患者诊断为患有小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL或B-CLL)。在疾病7年的历史里，患者接受了7种不同的化学疗法方案以及免疫疗法和放射疗法，但未显示任何主要反应，而根据本发明的药学方式和方法用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体构建体治疗这名患者首次提供了成功疗法，其中可以实现参考淋巴瘤病灶的缩小高于50%。当所述第二名患者用15pg/m2/24小时的本文所述抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体构建体连续治疗两周时，循环的B(淋巴瘤)细胞得到有效耗竭。此外，观察到骨髓中的总淋巴瘤细胞被本文所述的抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体构建体的全部消除。这个发现与通过例如常规化学疗法难以实现的完全骨髓瘤反应一致。在治疗的再分期，发现淋巴瘤瘤块明确减少通过对应肿瘤反应测试中部分的反应(PR)的计算性X射线断层术(CT)，六个参考淋巴瘤病灶的大小诊断为下降57.2%。根据本发明的术语"双特异性单链抗体，，或"单链双特异性抗体"或相关术语表示通过将至少两个抗体可变区连接在缺乏完整免疫球蛋白恒定和/或Fc部分的单个多肽链中产生的抗体构建体。本文所用的"接头"连接相同特异性的V结构域，而本文所用的"间隔物"连接不同特异性的V结构域。例如，双特异性单链抗体可以是具总共两个抗体可变区例如两个VH区的构建体，其中所述的每个可变区能够特异地结合分别的抗原，并且彼此通过短的(通常少于10个氨基酸)合成性多肽间隔物连接以便这两个抗体可变区与插入其中的间隔物以单一的连续多肽链存在。另一个双特异性单链抗体的实例可以是具有三个抗体可变区的单一多肽链。此处，两个抗体可变区例如一个VH和一个VL可以組成scFv，其中这两个抗体可变区通过合成性多肽接头彼此连接，通常对所述的多肽接头进行基因设计以便最小化免疫原性、同时保持对蛋白水解作用最大的抗性。这个scFv能够特异地结合特定抗原，并且连接于能够进一步结合与scFv所结合抗原不同的抗原的抗体可变区，例如VH区。此外，另一双特异性单链抗体的实例为具四个抗体可变区的单一多肽链。此处，前两个抗体可变区例如VH区和VL区可以形成一个能够结合一个抗原的scFv，而第二个的VH区和VL区可以形成第二个能结合另一抗原的scFv。在单一的连续多肽链中，一种特异性的单独抗体可变区可以有利地通过如上文所述的合成性多肽接头隔开，而各个scFv可以有利地通过如上文所述的短肽间隔物分开。WO99/54440,WO2004/106381，Mack,J.Immunol.(1997)，158，3965-70;Mack，PNAS,(1995)，92，7021-5;Kufer，CancerImmunol.Immunother.，(1997),45，193-7;L6ffler，Blood，(2000),95，6，2098-103;Brtihl，J.Immunol.,(2001)，166,2420-2426中显示了双特异性单链抗体及其生产方法的非限制性实例。如本文所用，"人CD3"表示在人T细胞上作为多分子T细胞受体复合体的部分表达的抗原，CD3由五种不同链组成CD3-s，CD3-y，CD3-5，CD3-ti和CD3C。如上文所迷，CD3例如通过抗CD3抗体在T细胞上的成簇导致T细胞类似于结合抗原、但不依赖于T细胞亚群克隆特异性的活化。因此，如本文所用，术语"以其一种特异性特异结合人CD3抗原的双特异性单链抗体"涉及能够结合在T细胞上表达的人CD3复合体、并且能够诱导靶细胞消除/裂解的CD3特异性构建体，其中所述的此类靶细胞携带/显示与双特异性单链抗体的另一非CD3结合部分结合的抗原。如本领域已知地，CD3复合体与CD3特异结合物(例如根据本发明的药学方式和方法施用的双特异性单链抗体)的结合导致T细胞活化，见，例如WO99/54440或WO2004/106381。因此，适合本发明药学方式和方法的构建体能有利地在体内和/或体外消除/裂解靶细胞。相应的靶细胞包含表达肿瘤抗原例如CD19的细胞，其中所述肺瘤抗原通过所述构建体的第二种特异性(即双特异性单链抗体的非CD3结合部分)识别。优选地，所述第二种特异性是已在WO99/54440或WO2004/106381中描述的对人CD19的特异性。根据该实施方案，双特异性单链抗体的每一抗原特异性部分包含抗体VH区和抗体VL区。这种双特异性单链抗体的有利变体从N末端到C末端为Vl(CD19)-Vh(CD19)画Vh(CD3)-Vl(CD3)(SEQIDNO.:2)，VH(CD19)-VL(CD19)VH(CD3)-VL(CD3)(SEQIDNO.:4),Vh(CD3)画Vl(CD3)國Vh(CD19)國Vl(CD19)(SEQIDNO.:6)，或者Vh(CD3)-Vl(CD3)-Vl(CD19)-Vh(CD19)(SEQIDNO.:8)。更加具体地，在本发明含义内，将术语"特异地结合"或相关术语例如"特异性"理解为主要通过以下两个参数表征定性参数(结合表位，或抗体结合部位)和定量参数(结合亲和力，或该抗体结合其结合的位置有多强)。抗体结合哪个表位可以有利地通过例如FACS方法、ELISA、肽-点表位作图或质i普法测定。抗体结合特定表位的强度可以有利地通过例如已知的Biacore和/或ELISA法测定。联合这些技术使得可以将计算信号噪音比作为结合特异性的代表性量度。在所述信号:噪音比中，信号代表抗体结合目的表位的强度，而噪音代表抗体结合其它不同于目的表位的非相关表位的强度。将各目的表位的信号噪音比为例如至少50、但优选大约80作为所评估抗体以特异方式结合目的表位、即为"特异结合物"的指标，其中所述的信号噪音比例如通过Biacore、ELISA或FACS测定。术语"结合至/与……相互作用，，也涉及由人靶分子或其部分的两个区域组成的构象表位、结构表位或非连续表位。在本发明上下文中，构象表位由两个或多个在一级序列中分离的不连续氨基,列定义，其中当多肽折叠成天然蛋白质时所述不连续氨基酸序列在分子表面上凑在一起(Sela，(1969)Science166，1365和Laver，(1990)Cell61，553-6)。术语"非连续表位"在本发明上下文中表示由多肽链间隔部分的残基组装成的非线性表位。当多肽链折叠成为三维结构时，这些残基在分子表面上凑在一起来构成构象/结构表位。根据本发明，文中与Ig衍生的抗原相互作用一起使用的"可变区"包含多肽的片段和衍生物，其中所述多肽至少包含一个衍生自抗体、抗体片段或其衍生物的CDR。本发明考虑了下列情况，即所述至少一个CDR优选地为CDR3、更加优选地为抗体重链的CDR3(CDR-H3)。但是，其它抗体衍生的CDR也特别地包含在术语"可变区"中。术语"抗体片段或其衍生物"涉及单链抗体或其片段、合成性抗体、抗体片段例如Fab、F(ab2)，、Fv或scFv片段、单结构域抗体等、或者任一这些的化学^^饰的衍生物。根据本发明采用的抗体或其相应的免疫球蛋白链可以进一步在基序之外用本领域已知的常规技术来修饰，例如通过单独或联合使用本领域已知的氨基酸缺失、插入、替换、添加和/或重组、和/或任意其它修饰(例如翻译后修饰和化学修饰，例如糖基化和磷酸化)。向编码免疫球蛋白链M酸序列的DNA序列中引入此类修饰的方法为本领域技术人员熟知，见，例如Sambrook等人；MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,第二版1989年和第三版2001年。本文所用术语"肽"或"多肽"描述了一类包含肽组和多肽组的分子。肽组由不超过30个氨基酸的分子组成，多肽组由多于30个氨基酸的分子组成。术语"抗体片段或其衍生物"尤其涉及包含至少一个CDR、优选CDR-H3的肽或多肽构建体。所述抗体分子的片段或衍生物限定了为上述抗体的部分、和/或通过化学/生物化学或分子生物学方法〗奮饰的肽或多肽。相应方法为本领域已知，并且尤其在实验室手册中进行了描述(见Sambrook等人，在上述引文中；Gerhardt等人；MethodsforGeneralandMolecularBacteriology;ASMPress,1994;Lefkovits;ImmunologyMethodsManual:TheComprehensiveSourcebookofTechniques;AcademicPress,1997;Golemis;Protein-ProteinInteractions:AMolecularCloningManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,2002)。在所给多肽的氨基^列中鉴定基序的方法为本领域技术人员已知，并在一些实验室手册中(例如，在Sambrook等人，在上述引文中；Miilhardt;DerExperimentator:Molekularbiologie/Genomics;SpektrumAkademischerVerlag，2001中)进行了描述。此外，所述方法在后附实施例中进行了例示。本文所用术语"施用"表示向个体施用治疗有效量的上述双特异性单链抗体。"治疗有效量"表示对其施用的对象产生效果的剂量。确切剂量依赖于治疗目的，并且通过本领域技术人员用已知技术确定。如本领域已知和上文所述地，根据全身递送和局部递送、年龄、体重、总体健康状态、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病症严重性进行调整可以是必需的，并且由本领域技术人员通过常规实验方法确定。主治医师和临床因素决定剂量方案。如医学领域熟知地，任意一名患者的剂量取决于许多因素，其中包括患者尺寸、身体表面积、年龄、施用的特定化合物、性别、施用时间和施用途径、总体健康状态以及其它同时施用的药物。如医学领域熟知地，任意一名患者的剂量取决于许多因素，其中包括患者尺寸、身体表面积、年龄、施用的特定化合物、性别、施用时间和施用途径、总体健康状态以及其它同时施用的药物。一般剂量可以例如设定在本发明的实施方案和所附实施例的范围内，然而，尤其是考虑上述因素，低于或高于这个示例性范围的剂量是可以的。如本文所述，先前研究优选使用大剂量输注来施用治疗性抗体。如本文所用，术语"大剂量输注"指的是在6小时之前被中断的输注，而"连续输注，，指的是可以持久地进行至少6小时而不被中断的输注。"连续输注"指的是持久地施用的输注。因此，在本发明上下文中，术语"持久的"和"连续的"用作同义词。在本发明意义之内，术语"施用超过至少6小时"表示下列情形，即在本发明药学方式和方法所需的整个周期期间以持续、恒定的方式向患者身体连续施用用于根据本发明药学方式和方法的双特异性单链抗体。避免中断双特异性单链抗体的导入，即除了需要补充供给施用的双特异性单链抗体或医学调停等外，在本发明药学方式和方法所需的整个施用期间不因为其它原因出现或不显著地出现下列转变，所述转施用的状态。就此类必需的补充导致所施用抗体的导入短暂中止而言，仍然将此类施用理解为本发明药学方式和方法意义内的"不间断的"或"持久的"。在大多数情况中，此类补充通常为如此短的持续时间以至于未向患者身体导入抗体的时间相比根据本发明药学方式和方法的整个施用方案的预期时间是非常小的。尤其优选双特异性单链抗体的施用方案不间断或持久地发生至少1周或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周或者甚至更长。在大多数优选的实施方案中，双特异性抗体连续4-8周即4、5、6、7或8周地施用超过24小时。例如，它可以是在4周连续施用后分期治疗的患者，可诊断到对双特异性单链抗体治疗最小或部分的反应(如下定义)。在这种情况中，延长连续施用来完成甚至更好的治疗结果，例如完全的反应(completeresponse)。以才艮据本发明药学方式和方法的方式持续不间断地施用双特异性单链抗体以允许下述的有利的T细胞活化，从而使其发挥足够长时间的效果来有利地从身体清除所有患病细胞。由于将不间断施用的双特异性单链抗体的比率保持在很低，所以可以持续应用治疗剂更长时间，而没有对患者有害副作用的风险。已发现，通过以每日每平方米身体表面积10照至80照的剂量施用双特异性单链抗体能获得本发明药学方式和方法有益和意外的效果。日剂量在施用期间保持恒定。然而，下列施用方式也在这个实施方案的范围之内，其中在本文所述药物方法之前，在输注周期的最初几天施用更低剂量("初始剂量")的双特异性单链抗体，而在剩余输注期应用更高剂量("维持剂量，，)。例如，可以在输注期的第一天施用每平方米身体表面积5照的双特异性单链抗体，然后在剩余阶段施用每平方米身体表面积15照的日剂量。或者在输注期的第一天施用每平方米身体表面积15^ig的双特异性单链抗体，然后在剩余阶段施用每平方米身体表面积45照的日剂量。也考虑下列方式，即在输注期的第一天施用每平方米患者身体表面积5照的双特异性单链抗体，然后输注期的第二天施用每平方米身体表面积15將的双特异性单链抗体，然后在剩余阶段施用每平方米身体表面积45jig的每日(维持)剂量。因此，在治疗的第一天或在第一和第二天，本文所述的双特异性单链抗体构建体可以以低于每平方米患者身体表面积10照-80照的(每日)初始剂量施用来慢慢使患者组织适应治疗。此后，可以施用每平方米患者身体表面积10jug-80照的实际维持剂量。因此，在根据本发明的方法、药盒或用途的上下文中计算的患者平均身体表面积在1,7-2,21112的范围。已发现，通过将不间断施用(即连续输注)的双特异性单链抗体比率维持在达到预期治疗效果的绝对最小值一段时间，可以最好地实现在上文描述为极其有利的T细胞活化增加。除了下文列举的与模拟天然T细胞活化相关绝对量更低。这导致个体患者更低的费用，使得根据本发明药学方式和方法的治疗是更大范围需要其的患者负担得起的。在本发明含义内，术语"B细胞非霍奇金淋巴瘤"或"B细胞衍生的非霍奇金淋巴瘤"包含惰性和迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)。如本文所用，术语"惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)，，表示恶性B细胞衍生的肿瘤性疾病。惰性BNHL为低恶性淋巴瘤。迅速蔓延性BNHL为高恶性淋巴瘤。B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)可以有利地为滤泡性淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、边缘区细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL/CLL)以及任意其它B细胞衍生的亚群。本文所用术语"B细胞白血病，，可以有利地为任意的B细胞白血病(例如慢性淋巴细胞白血病或急性淋巴细胞白血病)。进一步的参考见例如http:〃www,cancer.org。优选地，惰性非霍奇金B细胞淋巴瘤可以如下列实施例所述地用抗人CD3和人CD19两者的双特异性单链抗体治疗。本文所用术语"防止"理解如下在用化学疗法或放射治疗淋巴瘤病灶、完全减轻人类患者的淋巴瘤病灶后，情况是并非所有淋巴瘤细胞都能从身体清除。然而，这些剩余的肿瘤细胞可能产生再发的淋巴瘤。本发明的药学方式和方法可以用来杀死这些剩余的肿瘤细胞，从而防止淋巴瘤(起源于初始治疗后剩余在身体中的隐藏性淋巴瘤细胞)复发。以这种方式，本药学方式和方法帮助防止患者复发BNHL或B细胞白血病。在体内的临床研究中，进一步评估了抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体的安全镨。作为结果，在向患顽固性B细胞肿瘤的患者以重复的大剂量输注相同剂量的双特异性单链抗体后发现不希望的首剂效应。如下文所示，CRS强度在施用首剂量后最高，对随后输注的抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体的反应渐减。在6次输注后，与基线水平相比，几乎没有观察到对细胞因子水平的诱导。此外，当增加向患复发或顽固性B细胞慢性淋巴细胞白血病的患者施用的双特异性单链抗体的剂量时，在反复施用双特异性单链抗体后观察到CRS强度下降。不束縛于理论，所述现象最可能起因于T细胞对反复刺激的适应("T细胞沉默，，)。此外，当在受治疗的患者中监控T细胞数量时，发现T细胞数量基于每次输注起伏很大，表明短期、爆发式的T细胞活化。抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体的生物学活性可以在这些研究中得到证明，导致T细胞活化、细胞因子释放以及B细胞计数下降，但未确定最佳的生物学剂量(OBD)。此外，观察到与CRS相关的副作用。相反地并且在本发明上下文中令人惊讶地发现，例如通过以每平方米患者身体表面积10照-80照的日剂量施用至少1周的双特异性单链抗体，可以通过本文所述的双特异性单链抗体完成预期的生物学效果，即长期的T细胞活化和表达、以及对肿瘤细胞的毒性(同时降低、最小化或完全废止与大剂量施用治疗性抗体相关的不希望的负作用)，其中所述的日剂量施用超过至少6小时。如后附的非限制性实施例所述，向患小淋巴细胞淋巴瘤(SLL/CLL)或滤泡性淋巴瘤的患者超过24小时地连续施用至少两周小量的双特异性单链抗体即15照/1112的双特异性单链抗体对体内长期的T细胞活化和增殖是足够的，并且导致相当的抗肿瘤反应两名患者具有部分的反应(PR)，即相比六个参考淋巴瘤收缩高于50%。此外，在一名这些患者中，证实从骨髓消耗了淋巴瘤细胞，这通过常规方法例如化学疗法是难以达到的。重要地，该低剂量的双特异性单链抗体在患者中导致比大剂量施用双特异性单链抗体更多的生理性T细胞反应。此外，本文提供的方法和用途不引起通常与T细胞活化相关的、显著的副作用，例如CRS。这些低的剂量仍然能够在患惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)或B细胞白血病的患者中诱导有益的抗肺瘤反应。在先前用重复性大剂量输注的施用方案中，即使在体内I期临床试验中施用最低的起始剂量，也观察到外周血中白细胞计数突然降低，其中所述白细胞包括CD3+、CD4+和CD8+T细胞(见实施例)。这种降低的一个解释是活化的T细胞与其它活化的白细胞突然粘附、并至少部分迁移入组织。由大剂量施用双特异性单链抗体引起的这种爆发式T细胞活化导致局部细胞因子镨内皮功能异常和紊乱，这被认为是通常在CRS中观察到的副作用的主要原因。相反地，如下列实施例所述，根据本发明的药学方式和方法可以更加緩和地活化(并转换)T细胞群体，表明释放的细胞因子数量是剧烈减少的。因此，根据本发明的药学方式和方法进行供应就避免了例如局部细胞因子网络突然紊乱的现象。所以，才艮据本发明方法和用途治疗的患者未见才艮道有显著的副作用。此外，根据本发明药学方式和方法施用双特异性单链抗体不引起任何如大剂量输注双特异性单链抗体所观察到的剧烈T细胞起伏。如实施例中所示，虽然在输注期起始时能观察到T细胞数量轻微减少(最可能是因为共施用的类固醇)，但根据本发明的治疗更导致血液中活化的T细胞数量增加。具体地，细胞毒性的CD8+T细胞数由于增殖而增加。这对显示不利效应细胞:靶细胞(E:T)比率的肿瘤性疾病是尤其适合的，其中所述肿瘤性疾病例如体内E:T比率达1:100-1:1000的B细胞淋巴瘤病灶。先前的体外实验表明，此类不利的E:T比率导致更加緩慢的B细胞杀伤。在此种条件下，必须假定相同T细胞具有重复的导致胂瘤块显著减小的B细胞杀伤潜力。此外，假定扩大定位在B细胞肿瘤中(例如在B细胞淋巴瘤中)的T细胞库来提高E:T比率对完成治疗结果也是必需的。因为根据本发明的药学方式和方法提供了血流中至少不变或者甚至增加的活化的T细胞数量，所以长期改善了对肿瘤细胞例如B细胞淋巴瘤中的肿瘤性B细胞的细胞毒性潜能。此外，根据本发明的药学方式和方法导致CD8+T细胞如T细胞活化标记HLA-DR(长期活化标记)与CD69或CD25(短期活化标记)相比所例证的长期活化。如上文指出地，持续施用低量的抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体足以在长时间内增加活化的CD8+T细胞数量，如例如所附实施例和图6-8中所述。这与在大剂量施用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体中观察到的爆发式T细胞活化形成鲜明对比；参见例如图1。因此，根据本发明药学方式和方法而延长存在的双特异性单链抗体允许平緩的、长期的T细胞活化和增殖，这尤其适合治疗表征为不利E:T比率的肿瘤性疾病，例如B细胞淋巴瘤。此外，观察到在重新开始连续输注后(例如在医学干涉后)，发生更快并且更强的细胞毒性CD8+T细胞活化和增殖。因此，优选在几轮输注循环后是无输注的期间。例如，患者可以接受连续四周的本文定义的双特异性单链抗体输注、然后四周的无输注期间，这也在本发明范围内。此后，这个顺序通常可以重复一次、两次、三次或者甚至更多次。此外，虽然在根据本发明的药学方式和方法治疗的患者中能观察到长期的T细胞活化，但相关副作用显著降低或者甚至消除。因此，可以通过应用根据本发明药学方式和方法的双特异性单链抗体来最小化或防止CRS相关性副作用。最后，要强调的是，虽然在本文所述用途、方法和药盒中仅施用了低量的双特异性单链抗体，但抗体治疗在消除肿瘤性B细胞、从而在体内引起可检测的抗肿瘤反应上是非常有效的。这通过图9和11中的B细胞计数以及通过图10和13中所示的淋巴瘤大小下降进行了例证。具体地，两名根据本发明药学方式和方法治疗的患者具有部分的反应，即比6个参考淋巴瘤病灶高于50%的收缩。此外，在一名这些患者中，证实从骨髓有效地消除了淋巴瘤细胞；参见图12。因此，当应用本发明的药学方式和方法时，副作用得到降低或消除，但不伴随任何细胞毒性的下降。相反，大剂量施用模式的抗体疗法导致大量、短期的T细胞活化和随后活化的T细胞向内皮和组织的重新定位/迁移，而在血流中仅剩下小量的有效T细胞。如本领域熟知地，内皮可以通过大量的T细胞活化、随后T细胞粘附于内皮细胞、并迁移入组织而致严重受损。在病理学条件下，可以观察到此类突然的T细胞活化，例如在由细菌毒素引起的严重败血病中(见，例如Li(2004)，Br.J.Pharmacol.141(4):709-16;Matzen(2004)，VirusRes.104(2):145-55;JacobHS.(1980)Arch.Pathol.Lab.Med.104(12):617-20;Salyer(1990)，Am.J.Pathol.136(4):831-41;Okajima(2004)Curr.Vase.Pharmacol.2(2):125-33;Ferrero(2004)MethodsMol.Med.98:127-36)。此外，这种爆发式的T细胞活化与细胞因子引起的副作用相关。在先前使用重复性大剂量输注的剂量研究中，甚至在体内I期临床试验中施用最低的起始剂量，也观察到外周血中白细胞计数突然降低，其中所述白细胞包括CD3+、CD4+和CD8+T细胞。这种降低的一个解释是活化的T细胞与其它活化的白细胞突然粘附、并至少部分迁移入组织。假设该大量活化的T细胞群体(任意时间大约70。/。的人T细胞库存在于外周血中)的突然活化和迁移导致组织中T细胞稳态和局部细胞因子i普的紊乱。因此，与比先前的I期研究相比，显著延长地暴露于双特异性单链抗体、以及每个时间单位所给剂量的显著下降潜在地增加了药物耐受性、并最大化了药物的抗胂瘤活性。在先前调查重复性大剂量输注的双特异性单链抗CD19x抗CD3抗体的安全性和耐受性的临床研究中，在每次输注后观察到不希望的T细胞数起伏现象，表明T细胞依赖于每次输注爆发式地活化。值得注意的是，施用相同和增加剂量的所述双特异性单链抗体都观察到这个效果。根据本发明药学方式和方法进行的供给显示与大剂量输注更大量抗体获得的T细胞活化模式在性质上不同的T细胞活化模式。具体地，已经发现，施用根据本发明药学方式和方法的双特异性单链抗体导致体内初期緩慢增加、然后维持恒定、或者甚至增加的细胞免疫反应，所述免疫反应与在天然感染例如病毒感染过程中观察到的反应类似。在天然感染中，当致病性抗原特异的循环性T细胞在引流的淋巴组织中碰到该抗原时，其会活化。在天然感染中的此类活化之后，致病性抗原特异的T细胞亚群发生增殖。由于CD8+T细胞的增殖，这种增加与对入侵病原体或对被该病原体感染的细胞的细胞毒性潜能增加。因此，本发明的药学方式和方法刺激对天然感染如病毒感染的免疫反应，因为发生緩慢和逐渐增加的活化的T细胞数。总之，本发明提供下列主要优点-模拟更加生理化的T细胞反应，没有剧烈的T细胞起伏现象，血流中的效应细胞(细胞毒性)T细胞数量恒定或者甚至增加-细胞因子释放减少/没有由于低量双特异性单链抗体的首剂效应，具有效的抗肺瘤(CTL)活性(两名患者有部分的反应，其中一人从骨髓有效地消除淋巴瘤细胞)-降低的不利副作用-最小化由反复的T细胞活化和失活周期引起的异常T细胞活化-细胞毒性T细胞的长期活化和增殖-药物的延长存在帮助克服通常存在于淋巴瘤病灶中的导致比原先预料的更慢的B细胞杀伤的不利E:T比率-药物的延长存在允许通过一个并且相同的T细胞发生反复的B细胞杀伤，并因此确保肿瘤块显著减小-增殖局部的T细胞库而提高E:T比率和治疗结果画在不同外周血单核细胞(PBMC)供体之间体外活性存在显著差异(反映在ECso值的差异)。对药物延长的暴露时间在相当比例的患者中提高了抗CD19针对的细胞毒活性。因此，与先前的I期研究相比，显著延长地暴露于药物和每个时间单位所给剂量的显著下降潜在地增加了耐受性、并最大化了药物的抗肿瘤活性，产生更好的安全镨。根据本发明方案的施用可以每天超过6小时、7小时、8小时、9小时、IO小时、ll小时、12小时、13小时、14小时、或者甚至超过24小时。优选地，根据本发明方案的施用为超过10小时、更加优选超过12小时、或者甚至更加优选超过24小时。在本发明的方法、用途或药盒的优选实施方案中，所述双特异性单链抗体构建体的日剂量为施用超过至少8小时、更加优选至少10小时。在本发明的方法、用途或药盒甚至更加优选的实施方案中，日剂量为施用超过至少12小时、14小时、16小时、18小时、20小时或22小时。最优选地，日剂量为全天施用，即超过24小时。在本发明的方法、用途或药盒的另一优选实施方案中，所述CD3特异的結枸域的所述Vh和Vl区衍生自CD3特异的抗体，其中所述的CD3特异的抗体选自OKT-3、X35画3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、Flll-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT31、WT32、SPv誦T3b、11D8、XIII画141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2画4B6、OKT3D、M-T301、SMC2和F101.01。每个这些抗体都在现有技术进行了详细描述。更加具体而言，所述CD3特异的结构域的所述VH区包含至少一个CDR3区，所述CDR3区包含或为SEQIDNO.11所示氨基紗列，所述CD3特异的结构域的所述VH区包含至少一个CDR2区，所述CDR2区包含或为SEQIDNO.10所示氨基酸序列，和/或所述CD3特异的结构域的所述VH区优选地包含至少一个CDR1区，所述CDR1区包含或为SEQIDN0.9所示氨基酸序列。本发明的构建体也包含VL区。所述CD3特异的结构域的所述VL区包含至少一个CDR3区，所述CDR3区包含或为SEQIDNO.14所示氨基酸序列，所述CD3特异的结构域的所述V]L区包含至少一个CDR2区，所述CDR2区包含或为SEQIDNO.13所示氨基酸序列，和/或所述CD3特异的结构域的所述Vt区包含至少一个CDRl区，所述CDR1区包含或为SEQIDNO.12所示氨基酸序列。理解为，在大多数优选实施方案中，将如上文定义的CDR(CDRl、CDR2、CDR3)包含在一个单独的双特异性构建体中来进行根据本发明的施用。在本发明的方法、用途或药盒的另一优选实施方案中，所述CD3特异的结构域的VH区包含或者为SEQIDNO17，所述CD19特定结构域的VH区包含或者为SEQIDNO15，所述CD3特异的结构域的VL区包含或者为SEQIDNO18，和/或所述CD19特定结构域的V^区包含或者为SEQIDNO16。本发明的方法、用途或药盒也考虑利用包含选自下列序列的氨基*列的双特异性单链抗体构建体(a)在SEQIDN02、4、6或8中描述的氨基酸序列；(b)由SEQIDNOl、3、5或7中所示核麟列编码的氨基紗歹'J;(c)由与(b)的核酸序列具有至少70%、80%、卯％、95%或99%同一性的核酸序列编码的M酸序列，其中所述氨基酸序列能够(特异地)结合至CD3和CD19;并且(d)由与(b)的核苷酸序列遗传密码简并的核酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够(特异地)结合至CD3和CD19。任意特定核酸分子或多肽是否与本文定义的核苷酸或氨基酸序列为至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性可以用已知的计算枳4呈序有利地测定。测定查询序列(本文定义的序列)和目标序列之间最佳整体匹配、也称为整体序列比对的优选方法可以用基于Brutlag等人算法(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))的FASTDB计算机程序来测定。在序列比对中，查询和目标序列都为DNA序列。RNA序列通过将U转换为T来进行比较。在本发明的方法、用途或药盒的优选实施方案中，所述可变结构域通过如上文定义的额外接头和/或间隔物序列连接，并且如WO2004/106381中所示。在本发明的方法、用途或药盒的优选实施方案中，日施用持续至少2周、至少3周、至少4周或者至少8周。因此，施用也考虑以持久的^i^出进行，每天至少6小时、优选每天至少8小时、更加优选每天至少10小时、最优选每天24小时，进行至少l、2、3、4、5、6、7或8周或者甚至更长。也考虑在几轮输注循环后进行无输注的期间。例如，患者可以接受四周连续输注的本文定义的双特异性单链抗体，然后接受四周无输注的期间。此后，这个顺序可以重复一次、两次、三次或者甚至更多次，直至淋巴瘤病灶低于通过常规方法例如计算的x射线断层术可检测的水平。有利地，延长施用直至达到完全的反应，即杀死所有或者基本所有的淋巴瘤细胞。此外，在重新开始连续输注后(例如在无输注期之后或在医学干涉后)观察到细胞毒性CD8+T细胞发生更快并且更强的活化和增殖。因此，优选在几轮输注循环后进行无输注的期间。在本发明的方法、用途或药盒的另一优选实施方案中，药物组合物联合一种或多种其它药物制剂施用。本发明也用于联合治疗(co-therapy)方法和联合疗法的方案中。在一些实施方案中，本文定义的双特异性单链抗体与一种或多种其它疗法联合施用。在一些实施方案中，本文定义的双特异性单链抗体与一种或多种其它疗法同时施用于患者。优选地，此类疗法用于治疗如本文定义的BNHL或B细胞白血病。术语"同时地，，不限制药物或治疗剂在确切相同的时间施用，而是表示本文定义的双特异性单链抗体和其它药剂按次序并在一定时间间隔内向受试者施用、以便本文定义的双特异性单链抗体能够和其它试剂一起提供比它们单独施用增加的效应。例如，每种药物或治疗剂可以在相同时间或在不同时间点以任意次序依次地施用；然而，如果不在相同时间施用，那么它们应当在足够接近的时间内施用以4更提供预期的治疗或药物效果。每种(联合)治疗剂可以单独地以任意适当的形式或者通过任意适当的途径施用。在其它实施方案中，本文定义的双特异性单链抗体在手术前、同时或之后施用。优选地，手术完全移去局部的淋巴瘤或者降低大肺瘤的大小。手术也可以作为预防性措施进行或者用来緩解疼痛。本文提供的剂量数量和施用频率包含在术语"治疗有效的"中。剂量和频率一般进一步地根据每名患者的特定因素而不同，其中所述因素取决于施用的特定治疗性或药物制剂、BNHL或B细胞白血病的严重程度和类型、施用途径、以及患者的年龄、体重、反应和过往医疗史。适当的方案可以由本领域技术人员通过考虑此类因素、并遵从例如文献中报道和Physicians'DeskReference(笫59版，2005)中推荐的剂量来进行选择。在一些实施方案中，施用本文所述双特异性单链抗体的疗法与施用一种或多种疗法例如化学疗法、放射疗法、激素疗法和/或生物疗法/免疫疗法联合。药物或治疗剂包括但并不限于蛋白质分子，其中包括但不限于肽、多肽、蛋白质、包括翻译后修饰的蛋白质、抗体等；或者小分子(少于1000道尔顿)、无机或有机化合物；或者核酸分子，其中包括但不限于双链或单链DNA、或双链或单链RNA、以及3股螺旋核酸分子。药物或治疗剂可以源自任意已知的生物(包括但不限于动物、植物、细菌、真菌和原生生物或病毒)或合成性分子文库。所述联合疗法包括在不间断施用双特异性单链抗体之前、期间和/之后共同施用一种或多种治疗剂或药物制剂。与双特异抗体共同施用的所述治疗剂或药物制剂优选为用于标准非霍奇金淋巴瘤(NHL)疗法的化疗药物，如铂、蒽环类、烷化剂、抗代谢物、拓朴异构酶抑制剂、抗生素、有丝分裂抑制剂和抗微管蛋白剂等。然而，联合疗法也旨在减少炎症。此处，尤其优选以上文列出的任意方式共同施用抗炎剂，例如糖皮质激素。如本文所附实施例所述，在连续施用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体之前，已经向患者施用了100mg类固醇来抑制连续施用起始阶段的细胞因子生成。备选地，类固醇也可在连续施用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体第1天至第4天的起始阶段进行施用。施用类固醇的剂量如在第1天连续输注前的1小时为500mg、在第2天(连续输注24小时后)为250mg、在第3天(连续输注48小时后)为125mg，并且在第4天(连续输注72小时后)为125mg。然而，也考虑在连续施用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体之前、期间或之后不施用类固醇。当然，化疗药物和抗炎药物/药剂也可以共施用(co-administration)。在连续施用双特异性单链抗体期间发生共施用的事件中，此类共施用可以发生在施用所述抗体的整个持续时间、或者仅为其一个或多个部分。例如，此类共施用可以在施用双特异性单链抗体之前起始、并且可以在开始连续施用双特异性单链抗体后结束，这都在在本发明实施方案的范围内。在此种情况下，在不间断施用双特异性单链抗体的剩余阶段省略任何进一步的共施用是有利的，或者备选地在不间断施用双特异性单链抗体期间和/或之后的稍后时间点重新共施用药物制剂也是有利的。将联合疗法设计成使任意共施用都仅发生在不间断施用双特异性单链抗体之前和/或之后、而不发生在不间断施用期间也是有利的。如此地，必须将在本发明实施方案意义内的"联合疗法方案"理解为在时序意义上包含连续施用双特异性单链抗体。这意味着在一些情况下联合疗法方案可以进行比不间断施用双特异性单链抗体更长的时间，因为可能在连续施用双特异性单链抗体之前和/或之后共同施用药剂作为联合疗法的一部分。相反地，联合疗法的方案可以进行比连续施用双特异性单链抗体更短的时间，因为共同施用联合疗法仅发生在连续施用双特异性单链抗体期间的时间段内。优选地，所述类固醇跟据实施例中显示或上文所述的方案和剂量进行施用。如果在不间断地施用根据本发明的双特异性单链抗体的整个时间段中都以连续输注进行共同施用，那么就可以将两种药剂-用于联合疗法的药剂和双特异性单链抗体-组合在一种溶液中。将用于联合疗法的药剂直接添加到应用于患者的双特异性单链抗体溶^/制剂中。进一步地，也可以将用于联合疗法的药剂和双特异性单链抗体作为单独的溶液在相同的时间平行施用。在一些情况中，联合疗法是有利的或必需的，这取决于接受根据本发明药学方式和方法治疗的患者存在、怀疑有或预期有的其它疾病。此类共同施用可以在根据本发明药学方式和方法的不间断施用之前、期间或/和之后以一种或多种大剂量应用。备选地，如根据本发明方法、药盒或用途中所示，这种共同施用也可以是不间断性质的，并且在这种情况下可以同时、行。本文定义的双特异性单链抗体和其它的治疗剂可以协同作用。如本文所用，术语"协同的"指的是比任意两种或多种单独疗法(例如，一种或多种药物或治疗剂)的相加效应更加有效的联合疗法(例如，联合本文定义的双特异性单链抗体和(a)本文列出的其它药物或治疗剂)。联合疗法(例如，本文定义的双特异性单链抗体和(a)本文列出的其它药物或治疗剂的联合)的协同效应允许使用更低剂量的一种或多种疗法(例如，一种或多种药物或治疗剂)和/或向患有本文定义的BNHL或B细胞白血病的患者更低频率地施用所述疗法。利用更低剂量的疗法(例如，药物或治疗剂)和/或更低频率地施用所述疗法的能力减少与向受试者施用所述疗法相关的毒性，而不降低所述疗法在预防或治疗疾病、例如本文定义的BNHL或B细胞白血病中的效力。此外，协同效应能产生在预防、管理、治疗和/或改善本文定义的BNHL或B细胞白血病中具改善疗效的疗法(例如，药物或治疗剂)。最后，联合疗法(例如，药物或治疗剂)的协同效应可以避免或减少与使用任何一种疗法相关的不利或不期望的副作用。在另一实施方案中，联合疗法旨在降低炎症。此处，尤其优选以上文列出的任意方式共同施用抗炎剂，例如糖皮质激素。本发明这项实施方案的联合疗法也有利地提供对免疫效应细胞、细胞增殖或细胞刺激的活化信号。不间断施用双特异性单链抗体可以是静脉内的、肠胃外的、皮下的、经皮肤的、腹膜内的、肌内的或肺的。在大多数情况下，静脉内的施用模式为选择用来不间断施用双特异性单链抗体的模式，并且在这种情况中为选择用来共同施用作为联合疗法部分服法的药物制剂的模式。如此地，尤其优选静脉内的施用。在这种情况下，可有利地选择合适的计量设备如由Baxter制备的多治疗用输注泵模型6060。不论选择什么计量设备，其都应当设计和建造成最小化或更好地防止治疗剂施用在药筒交换和/或电池更换或充电过程中的中断。这可以例如通过选择具有与交换药筒分开的双特异性单链抗体二级容器的设备来实现，如此选择以便甚至当移去空的或几乎空的药筒、并换上新的药筒时也可以从二级容器持续输注入患者。静脉内施用的模式以及在共同施用联合疗法的部分服药法的情况中涉及向患者体内植入泵来计量此类施用。本领域普通技术人员知道此类计量泵，例如上文列出的由Baxter制备的模型6060。作为非限制性实例，其可以是，不间断、即连续的施用通过携带或植入患者体内计量治疗剂进入患者体内流入量的小型泵系统来实现。此类泵系统通常为本领域已知，并且通常依赖于定期交换的、含有待注入治疗剂的药筒。当在此泵系统中交换药筒时，不间断地流入患者体内的治疗剂会随之发生暂时中断。在这种情况下，仍然在本发明药学方式和方法的意义范围内认为更换药筒之前的施用阶段和更换药筒之后的施用阶段共同组成一种此类治疗剂的"不间断施用"。相同的系统将应用非常长的施用，其中需要不止一次地更换药筒、或者需要更换其中驱动泵的电池、这导致治疗剂暂时中断流入患者身体。由于长期创伤特别容易感染，所以将采取适当措施来最d、化施用进入患者身体的穿刺位点的感染危险。上文所述也应用于通过相似递送系统的肌内施用。连续施用可以为通过贴在皮肤上的贴片来经皮肤，并以一定时间间隔进行替换。本领域技术人员知道适合这个目的药物递送贴片系统。应当注意，经皮肤施用尤其适合连续施用，因为更换第一张用完的贴片可以通过同时将其替换为第二张新贴片来方便地实现，例如贴在紧邻第一张用完的贴片的皮肤表面上，并且在移去第一张贴片前立即进行。流动中断问题或电池衰竭问题都不会出现。在进一步优选的实施方案中，连续施用通过肺途径来实现，例如通过戴在鼻子一个或两个鼻孔的导管，所述导管与加压罐连接，其含量被精确然而，如本文和所附实施例中所述，最优选的施用模式为在给定时间/时间段内的静J3^内施用。本文所用的双特异性单链抗体有利地以药物组合物的形式施用于人类患者。虽然可以仅施用本文所用的双特异性单链抗体，但优选在可药用载体中施用。合适的药物载体实例为本领域熟知，并且包括磷酸緩沖盐溶液、水、脂质体、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。含有此类载体的组合物可以通过众所周知的常规方法进行制剂。这些药物组合物可以以合适的剂量施用于受试者。剂量方案由主治医师和临床因素决定。如医学领域众所周量取决于许多因素，其中包括患者的尺寸、身体表面积、年龄、所施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、总体健康以及其它同时施用的药物。肠胃外施用的制剂包括无菌的含水或无水溶液、或者悬浮液。无水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机脂例如油酸乙酯。含水的载体包括水、含水溶液或悬浮液，其中包括盐和緩冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠，或者乳酸化林格液。静脉内的载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格右旋糖的电解质补充剂)等。也可存在防腐剂和其它添加物，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，组合物可包含蛋白质性质的载体，像例如血清白蛋白或免疫球蛋白，其中优选人源的。还考虑了，组合物除了包含蛋白质性质的双特异性单链抗体外，还包含进一步的生物学活性试剂，这取决于药物组合物的预期用途。此类药剂可以是用作细胞生长抑制剂的药剂、预防高尿酸血的药剂、抑制免疫反应的药剂(例如糖皮质激素，FK506)、作用于循环系统的药物和/或诸如T细胞共刺激分子的药剂或者本领域已知的细胞因子。优选地，将本文定义的双特异性单链抗体在緩冲液、稳定剂和表面活性剂中制剂。緩冲液可以是磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐或醋酸盐緩冲液。稳定剂可以是氨基酸和/或糖。表面活性剂可以是去污剂、PEG等。更加优选地，本文定义的双特异性单链抗体制剂在柠檬酸盐、赖氨酸、海藻糖和吐温80中。优选等渗的盐和吐温80作为本发明药物组合物的稀释剂。优选地，在本发明的用途、方法或药盒中，药物组合物向人类患者施用。双特异性单链抗体疗法的成功可以通过已建立的对各种疾病的标准方法来监控对于B细l包白血病的治疗，可以4吏用例如白细胞计数、分化物(differentials)、荧光活化细胞分选术(FACS)、骨髓穿刺和多种白血病特异的临床化学参数以及其它已经建立的标准方法。对B细胞淋巴瘤的治疗，可以使用例如计算机辅助的X射线断层术、X射线、核磁共振X射线断层术(例如，用于基于国家癌症研究所标准的反应评估(Cheson(1999)，J.Clin.Oncol.;17(4):1244)、正电子发射X射线断层术扫描、白细胞计数、分化物、荧光活化细胞分选术、骨髓穿刺、^^巴结活体解剖/组织学和多种淋巴瘤特异的临床化学参数(例如乳酸脱氢酶)以及其它已建立的标准方法。的方法进4于检测。图1:向患有复发性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)的患者静脉内施用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体(bscCD19xCD3)的剂量逐渐增加研究-对外周CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞计数的影响。已诊断为患有复发性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)的患者0202在每周两次的治疗方案中接受6次超过4小时由静脉内施用的bscCD19xCD3。bscCD19xCD3的剂量按以下剂量逐渐增加1、2、4、7、10和13照/m2身体表面积。CD3+T淋巴细胞(灰色菱形)、CD4+T淋巴细胞(黑色方块)和CD8+T淋巴细胞(黑色三角形)的数目分别在第0、2、7、9、14和16天的4小时输注前和结束时通过流式细胞计量术测定，其中所述得各种T淋巴细胞数目以占总淋巴细胞数的百分数表示。4小时的输注期间用箭头和灰色条带标示。图2:对患有顽固性B细胞恶性肺瘤的患者静脉内施用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体(bscCD19xCD3)的剂量逐渐增加研究-对TNFoc血清浓度的影响。已诊断患有套细胞淋巴瘤(MCL)的患者1003在研究的第0、2、4、14、16和18天接受6次、超过4小时、1，5照(在第0天的起始剂量)和3ng(在随后研究时间的维持剂量)的bscCD19xCD3输注。在4小时输注期间之前和之后测定TNFoc的血清浓度。4小时输注期间用箭头和灰色条带标示。图3:如图2图例中所述地向患者1003静脉内施用bscCD19xCD3的剂量逐渐增加研究-对IFNY血清浓度的影响。图4:如图2图例所示地向患者1003静脉内施用bscCD19xCD3的剂量逐渐增加研究-对IL6血清浓度的影响。图5:如图2图例所示地向患者1003静脉内的施用bscCD19xCD3的剂量逐渐增加研究-对IL10血清浓度的影响。图6:CD3+/CD8+和CD3+/CD4+T细胞计数分析。在开始输注bscCD19xCD3后，CD8+和CD4+T细胞从外周血大量消失，这解释为bscCD19xCD3介导外周血T细胞和B细胞交联，导致T细胞活化，从而触发分布现象。然而，治疗半周后，CD8+和CD4+T细胞重新出现在血液中，并且数量进一步分别增加直至第7天和第21天。与起始值相比，CD8+和CD4+T细胞显示为在血液中增加了3.5到4倍。在T细胞数量于治疗的第4周开始减少之前，CD8+和CD4+T细胞的数量在治疗的第2和3周保持高。在输注bscCD19xCD34周后，当诊断出相当的肿瘤缩小满足部分的反应的标准时，CD8+和CD4+T细胞计数仍高于相应的治疗前数值。图7:CD8+T细胞亚群分析。效应细胞记忆亚群TEM几乎是负责由bscCD19xCD3谦导的CD8+T细胞增殖的唯一亚群。CD8+T细胞负责所有T细胞大多数的细胞毒性，并且TEM细胞和TEMRA亚群一起负责CD8+T细胞的大多数细胞毒性。除了TEM亚群外，在其它CD8+T细胞亚群间未能观察到细胞计数上的显著变化，如幼稚T细胞不能基于bscCD19xCD3提供的单个活化信号增殖，或者TEMRA亚群完全不能增殖。因此，能增殖的CD8+TEM细胞的选择性增殖可明确地归因于应答肿瘤内受bscCD19xCD3修饰的CD8+TEM细胞与B淋巴瘤细胞接触的细胞分裂和增殖。由于循环性B淋巴瘤细胞在第3天、即在观察的T细胞增殖前已经从外周血中耗竭，所以可以排除血液中循环的bscCD19xCD3修饰的B淋巴瘤细胞对T细胞增殖的显著贡献。图8:CD8+T细胞活化标记分析。在高度活化CD8+T细胞之后，CD8+T细胞增殖，其中CD8+T细胞的高度活化通过持续上调的活化标记HLA-DR表示。其它活化标记例如CD69和CD25仅在起始输注bscCD19xCD3后显示短暂的上调，这可以通过外周血中循环性bscCD19xCD3修饰的B淋巴瘤细胞的活化来解释，只要循环性B淋巴瘤细胞在治疗的第一个3天期间就耗竭了。相反，超过3周的持续上调HLA-DR反映了肿瘤内CD8+T细胞通过与肿瘤固有B淋巴瘤细胞接触而引起的活化，其中所述的B淋巴瘤细胞受bscCD19xCD3的修饰。瘤内T细胞的活化产生肺瘤内的增殖性T细胞反应，进而导致T细胞增殖，这继而也出现在循环血中。这些在肿瘤中活化并随后迁移入血液的T细胞仍然显示长期活化标记HLA-DR，但短期活化标记CD69和CD25已经下调了。图9:患者#105003的B细胞计数。患者以治疗前大约每亳升血液140个B(淋巴瘤)细胞开始。在起始输注后，循环性B(淋巴瘤)细胞在治疗的第一个3天内迅速下降，并最终在第一周治疗末完全从外周血中消失。因此，由于bscCD19xCD3对所述细胞的细胞毒性，所以其能够完全清除循环性B(淋巴瘤)细胞。图10:(A):在用bscCD19xCD3治疗4周之前(左边；05年9月26日)和之后(右边；05年10月31日)通过计算辅助的X射线断层术(CT)测定淋巴瘤病灶#2的大小(如图IO(B)表中所示)。(B):对(A)中所示淋巴瘤以及5个其它选来进行功效判定的淋巴瘤病灶在大小上的下降进行了量化，如(B)中所示的表所述。总淋巴瘤大小下降表示为这6个所选淋巴瘤病灶最大横截面直径产物总和(即总产物直径或SPD)的百分数下降。因此，将淋巴瘤收缩58.0%诊断为达到部分的反应(PR)的标准。图11:患者#102003的B细胞计数。患者以治疗前大约每毫升血液920个B(淋巴瘤)细胞开始。在起始输注bscCD19xCD3后，循环性B(淋巴瘤)细胞在治疗的第一个3天内显示与细胞重新分布一致的迅速下降、然后在每毫升600个细胞处短期的有限恢复。在进一步的治疗过程中，B(淋巴瘤)细胞从循环中完全耗竭、直至在治疗两周后诊断到部分的反应(PR)。这些数据肯定了，作为其部分临床效果，bscCD19xCD3能够完全地清除循环性B(淋巴瘤)细胞。图12:在用bscCD19xCD3治疗之前和两周之后患者#102003的骨髓组织病理学。左图为在用bscCD19xCD3治疗前骨髓显示小淋巴细胞性淋巴瘤细胞40-50%的骨髓迁移。右图为用bscCD19xCD3治疗两周后不再能发现小淋巴细胞性淋巴瘤细胞迁移的证据，而观察到T细胞显著增加。图13:(A):在用bscCD19xCD3治疗之前(左图；05年5月2日)和2周之后(右图；05年5月31日)通过计算机辅助的X射线断层术(CT)测定患者#102003的4个纵隔淋巴瘤病灶的大小(如图13(B)中表的表所示)。(B):对(A)中所示淋巴瘤以及2个其它选来进行有效判定的淋巴瘤病灶(腹膜后的和隔膜的)在大小上的下降进行了量化，如(B)中所示的表所述。总淋巴瘤大小下降表示为这6个所选淋巴瘤病灶最大横截面直径产物总和(即总产物直径或SPD)的百分数下降。因此，将淋巴瘤收缩57.2%诊断为达到部分的反应(PR)的标准。图14:CD8+T细胞增殖与不同临床反应相关。显示了2名患者008+TEM亚群的细胞过程，其中所述患者即达到不同临床反应的患者#109002(完全的反应)和#105003(部分的反应)。也分别描述了第一和第二个4周对整体临床反应的贡献、以及第一个4周在TEM亚群曲线(AUC)下的面积。对患者临床反应最大的贡献发生在治疗的第一个4周内，并且^艮好地和CD8+TEM亚群的增殖相关。这些高度细胞毒性T细胞的增殖似乎是临床效果的前提条件，这基于下列观察，即增殖时达到的绝对细胞数和相比处理前的水平的相对增加两者都有助于最佳的临床反应。图15:在患者#109002中通过CT扫描检测到的髏(Iliacal)淋巴瘤(用圆圏标记)抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体治疗前的大小为3.2x2.2cm2。在4周连续输注抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体后，同一淋巴瘤病灶缩小到1，7xl.2cm2的大小。在8周连续输注抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体后，淋巴瘤消失，即大小正常到正常的淋巴结大小(0.8x0.8cm2)。图16:向患者#10卯02连续输注抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体使治疗前急剧增大的脾脏大小正常化。现在，本发明将通过参考下列仅为示例性、并且不解释为限制本发明范围的实施例来进行描述。实施例1:1.构建包含各种结构域重排的CD19xCD3和CD3xCD19双特异性单链抗体一般地，包含特异性结合人CD3抗原的结构域以及特异性结合人CD19抗原的结构域的每一双特异性单链抗体分子如下文表1所述命名。表1:包含抗CD3特异性和抗CD19特异性的双特异性单链抗体分子的形式<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>40根据标准的PCR方法(Orlandi，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)，3833-7)克隆HD37杂交瘤的可变轻链(VL)结构域和可变重链(VH)结构域(Pezzutto，J.Immunol.138(1997)，2793-9)。用寡聚dT引物和Taq聚合酶进行cDNA合成。基于Diibel，J.Immunol.Methods175(1994)，89-95所述的引物用与VL结构域侧翼的引物5'LI(SEQIDNO:19)和3'K(SEQIDNO:20)以及用于重链的5'H1(SEQIDNO:21)和3'G(SEQIDNO:22)引物通过PCR扩增抗CD19V结构域。抗CD3scFv片段的cDNA由Traunecker惠赠(Traunecker，EMBOJ.10(1991)3655-9)。表1所示的构建体1如下文所述产生。将相应的VL和VH区域克隆到分别的质粒载体中，用作分别用寡核苷酸引物对5'VLB5RRV(SEQIDNO:23)/3VLGS15(SEQIDNO:24)和5VHGS15(SEQIDNO:25)/3'VHBspEl(SEQIDNO:26)进行VL和VH特异性PCR的模板，以获得抗CD19scFv片段。在PCR产物中引入重叠互补序列，其组合以形成随后融合PCR中的15-氨基酸(Gly4Sen)3-接头的编码序列。用引物对5'VLB5RRV(SEQIDNO:23)/3'VHBspEl(SEQIDNO:26)进行扩增步骤，用限制性酶EcoRV和BspEl切割得到的融合产物(或者抗CD19scFv片段)并且从而克隆入bluescriptKS载体中(Statagene),其含有(EcoRl/Sal的编码序歹'J(Kufer，CancerImmunol.Immunother.45(1997)193)。因此，抗17-1A特异性由抗CD19-scFV片段替代，保留连接C末端抗CD3scFv片段的5个氨基酸的Gly4Ser接头。随后，将编码具有VLCD19-VHCD19-VHCD3-VLCD3结构域排列的抗CD19/抗CD3双特异性单链抗体的DNA片段亚克隆到所述表达载体pEF-DHFR的EcoRl/Sall位点(Mack,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)，7021-5)。通过电穿孔将得到的质粒DNA转染到DHFR缺陷的CHO细胞中。如上文所述进行选择、基因扩增和蛋白质生产(Mack，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)，7021-5)。对应于如上文表1所述构建体1的DNA序列示于SEQIDNO:1。此DNA序列(具有前导序列)的蛋白质翻译示于SEQIDNO:2。如下所述构建上文表1所述的其它构建体。在设计上述表1所示的各种抗CD3/抗CD19单链双特异性抗体时用对应于SEQIDNO:1(构建体l)的DNA序列(其蛋白质翻译示于SEQIDNO:2)作为PCR模板。用分别的引物組合5'VHCD19BsrGI(SEQIDNO:36)和3VHCD19GS15(SEQIDNO:37)或者5VLCD19GS15(SEQIDNO:38)和3'VLCD19BspEI(SEQIDNO:39)进行PCR以在位点Al和A2中(如WO2004/106381中的图1A和IB所定义)产生CD19的VH-VL排列。在这些PCR循环过程中，在PCR产物中引入重叠互补序列以形成随后融合PCR中的15个氨基酸接头的编码序列。在第二个PCR反应中(融合PCR)融合扩增的VL和VH结构域，其中仅使用外侧引物(即5'VHCD19BsrGI(SEQIDNO:36)和3'VLCD19BspEI(SEQIDNO:39))并且需要这两种扩增子。使用利用其它引物组合的类似方法构建其它结构域排列。设计一组适当引物以进行基于多重PCR的克隆步骤，最终得到各种VL-VH结构域排列。所用的引物组合列于下表表2:构建表1所示的构建体1-4的位点Al和A2所使用的基于PCR的克隆步骤概述<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>设计包含所述限制性酶识别位点的下列引物进行基于PCR的克隆步骤以改变C端位置的VH-VL结构域排列，即WO2004/106381的图1A和IB所定义的位点Bl和B2。表3:构建表1所示的构建体1-4的位点Bl和B2所使用的基于PCR的克隆步骤概述PCR步骤所用引物得到的C端结构域顺序PCRBl+B25'VLCD19BspEIGS(SEQIDNO:31)3'VHCD19BspEI(SEQIDNO:44)CD19VL-VH5，VHCD19BspEIGS(SEQIDNO:29)3，VLCD19BspEI(SEQIDNO:30)CD19VH-VL5，VLL2KBspEIGS(SEQIDNO:27)3，VHL2KBspEI(SEQIDNO:28)抗CD3VL國VH将侧翼为两个BspEI位点的相应PCR产物克隆到用BspEI和Xmal限制性酶消化的称为BS-CTI的质粒中。用限制性酶切割位点Xbal和Sail在之前将称为CTI(SEQIDNO:45)的多接头插入BluescriptKS载体中(GenBank登录号X52327)以提供其它切割位点以及编码G4S接头的序列、6个连续的组氨酸残基和终止密码子。在此克隆步骤中，VH结构域的BspEI位点与质粒的Xmal位点融合从而破坏这两个位点。根据标准的方法测序發汪可变结构域的正确方向。上文所述的所有分子生物学方法根据Sambrook，MolecularCloning(实验手册，第3版，冷泉港实验出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，纽约，冷泉港(2001)所述的标准方法进行。将编码表l的双特异性单链抗体的DNA(SEQIDNO:1、3、5、7)转染到DHFR缺陷的CHO细胞中以如Mack等人所述(Mack，ProcNatlAcadSciUSA92(1995)，7021-25)在DHFR缺陷的CHO细胞中进行真核蛋白质表达。通过将氨甲蝶呤(MTX)的浓度增加到20nM的终浓度诱导构建体的基因扩增。然后扩大所转染的细胞并产生l升上清液。2.表达和纯化抗CD3和CD9的双特异性单链抗体在中国仓鼠卵巢细胞中(CHO)表达双特异性单链抗体。根据细胞的磷酸钾处理("MolecularCloning",Sambrook等人，1989)进行表达载体转染。在滚瓶中用改良的CHODMEM培养基(HiQ紙HiClone)培养细胞7天然后收获。通过离心去掉细胞，将含所表达蛋白质的上清液存于-20。C。用AktaFPLCSystem(Pharmacia)和UnicornSoftware进4亍层冲斤。所有的化学试剂为研究级的并且购自Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。根据制造商提供的方法用载有ZnCl2的Fractogel⑧柱(Merck)进行固定的金属螯合亲和层析("IMAC")。用緩冲液A2(20mM砩酸钠緩冲液，pH7.5，0.4MNaCl)平衡柱并以3毫升/分钟的流速将细胞培养上清液(500ml)加入柱(10ml)中。用緩冲液A2洗柱以去除未结合的样品。用两步梯度的緩冲液B2(20mM磷酸钠緩冲液pH7.5，0.4MNaCl，0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白质，如下所述步骤1:6个柱体积的20%緩沖液B2;步骤2:6个柱体积的100%緩沖液B2。合并步骤2的洗脱蛋白质级分用于进一步纯化。在用PBS(Gibco)平衡的SephadexS200HiPrep柱(Pharmacia)上进行凝胶过滤层析。洗脱的蛋白质样品(流速1亳升/分钟)进行标准的SDS-PAGE和蛋白质印迹检测。纯化之前用分子量测定(分子量标准试剂盒，SigmaMWGF-200)校准柱。用蛋白质测定染料(MicroBCA，Pierce)和IgG(Biorad)作为标准蛋白质确定蛋白质浓度。在IMAC和凝胶过滤的两步纯化方法中分离双特异性单链抗体。通过在PBS中凝胶过滤确定主要的产物在天然条件下具有大约52kDa的分子量。此分子量对应于双特异性单链抗体。所有的构建体根据此方法纯化。纯化的双特异性单链抗体蛋白质通过用预制4-12%BisTris凝胶(Invitrogen)在还原条件下进行SDSPAGE分析。根据制造商提供的方法进行样品制备和应用。用MultiMark蛋白质标准(Invitrogen)测定分子量。凝胶用胶体考马斯(Invitrogen方法)染色。通过SDS-PAGE测定，分离的蛋白质的纯度大于95%。根据制造商提供的方法用OptitranBA-S83膜和InvitrogenBlotModule进行蛋白质印迹。所用的抗体为抗HisTag(PentaHis,Qiagen)抗体和碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗小鼠Ig(Sigma)，用BCIP/NBT(Sigma)作为底物。双特异性单链抗体可通过蛋白质印迹特异性地检测。在对应于纯化的双特异性分子的52kD处检测到单一的条带。3.CD19xCD3特异性多肽的流式细胞术结合分析进行FACS分析以检测构建体结合CD19和CD3能力相关的功能。为此目的4吏用了CD19阳性NALM-6细胞(人B细胞前体白血病)和CD3阳性Jurkat细胞(人T细胞白血病)。200,000个NALM-6细胞和200,000个Jurkat细胞分别与50pl表达具有CD19和CD3的不同VH和VL结构域排列的双特异性抗体的CHO细胞培养物纯细胞上清液(如上文第二部分所述)在冰上孵育30分钟。在PBS中洗涤细胞两次并如下检测构建体的结合。如上所述处理的细胞与未标记的鼠PentaHis抗体(1:20稀释于含2%FCS的50jilPBS中)接触，其中所述未标记的鼠PentaHis抗体通过构建体的C端组氨酸标签与结合细胞的构建体特异性结合。之后进行洗涤步骤以去除未结合的鼠PentaHis抗体。用1:100稀释于含2%FCS的50piPBS的缀合有藻红蛋白的Fcy特异性抗体(Duanova)检测结合的抗His抗体。新鲜培养基用作阴性对照替代培养物上清液。通过流式细胞术在FACS-Calibur仪器(BectonDickinson,Heidelberg)上分析细胞。如CurrentProtocolsinImmunology(Coligan，Kruisbeek，Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)所述进行FACS染色和荧光强度测定。几种结构域排列的结合能力如WO2004/106381所示清晰地可检测到。在FACS分析中，具有CD19和CD3特异性的VH和VL结构域不同排列的所有构建体与用培养基和1、2检测抗体的阴性对照相比都显示与CD3的结合。在表1提到的构建体中观察到强结合活性造成的荧光强度变化^xl01。4.CD19和CD3双特异性单链抗体的生物活性用基于荧光色素释放的细胞毒活性测定法测定VH和VL结构域重排的双特异性抗体的细胞毒活性。CD19阳性NALM-6细胞用作耙细胞(1.5xl()7个)，其于37t:在细胞培养基中用10钓黄绿素AM(MolecularProbes，Leiden，Netherland,编号C-1430)标记30分钟。在细胞培养基中洗涂两次之后，对细胞进行计数并与CD4阳性T细胞克隆CB15细胞(德国UniversityofErlangen/Nuernberg的Fickenscher博士惠赠)混合。每毫升混合2x106个CB15细胞和2x105个NALM-6细胞(E:T=1:10)并且96孔圆底板的每个孔中使用50此悬液。将抗体在RPMI/10%FCS中稀释到所需浓度并将50jil此溶液加到细胞悬液中。在37。C/5。/。C02中孵育标准的反应2小时。细胞毒性反应之后，孵育培养基中释放的染料可在荧光读数器中(Tecan，Crailsheim，德国)定量并与对照反应(不含双特异性抗体)的荧光信号和全部裂解细胞的荧光信号(在1%皂苷中孵育10分钟)比较。在这些读数的基础上，根据下式计算比细胞毒性[焚光值(样品)-荧光值(对照)[荧光值(全部裂解)-荧光值(对照)1x100。Prism软件(GraphPadSoftwareInc.,SanDiego，USA)确定的S形剂量反应曲线一般具有>0.97的W数值。由分析程序计算的ECso值用于比较生物活性。如WO2004/106381所示，所有构建体针对表达CD19的NALM-6细胞显示细胞毒性。在上文表1所示的构建体中检测到了EC50值<500pg/ml的最强生物活性。实施例2:在B细胞r淋巴瘤患者中临床应用bscCD19xCD3在批准的应用中，患有B细胞衍生的慢性淋巴白血病(B-CLL)的患者(女性，1937年生)如WO99/54440中详述用双特异性单链抗体bscCD19xCD3(SEQIDNO,2)治疗。FACS分析显示患者的95%的外周血细胞为CD19阳性细胞，而77。/。的细胞表达CD20抗原。将患者的外周血细胞与bscCD19xCD3孵育显示了CD19阳性B细胞的显著耗竭。为防止任何急性细胞因子反应和肿瘤裂解并发征，给患者施用预防的IV剂量的2mg氯马斯汀(Tavegil⑧)和200mg西咪替丁(Tagamet)以及300mg别嘌呤醇和20mg奥美拉唑(Antra⑧)。患者初次给药为20分钟输注溶于含5。/o人血清白蛋白(HSA)的等渗磷酸盐緩沖液的3照bscCD19xCD3。在输注过程中患者不显示任何不良反应。输注后大约1小时患者发冷约5分钟然后出汗，血压适度降低约10mmHg和体温适度增加(+0.5'C)数小时。此外，她的头痛症状轻度恶化。患者用另夕卜的2mgTavegil⑧和200mgTagamet、250mg强的木〉龙(Solu-Decortin⑧)和50mg哌替啶(Dolantin⑧)治疗。所有症状都在同一天得到释放，而没有后遗症。一天后在上述相同条件下施用第二剂，为10照bscCD19xCD3。输注后大约1小时患者明显发冷、发烧(39,2X:)、轻度喘气和低血压反应。患者用2mg氯马斯汀、200mg西咪替丁、300mgSolu-Decortin和15mg氰苯双哌酰胺(Dipidolor⑧)治疗。为稳定她的心血管功能，患者接受多巴胺输注并进行容积替换。此治疗之后症状显著减少。接下来的3天中，患者继续为微热体度(大约37.2'C)，在第二剂给药后1天出现轻孩i的胸膜积液和下端轻度浮肿。第二剂施用bscCD19xCD3之后的1天和4天进行脾、5个腹淋巴结和腋淋巴结的超声检查。10照剂量给药之后的1天淋巴结和脾与治疗前的淋巴结和脾相比已经缩小大约20%。此观察在第二次超声评价中得到了验证。脾的重量降低了350g(从治疗前的1630g降低到治疗后的1280g)。在治疗过程中和之后的几天中，白细胞(包括大多数恶性B细胞)的数量减少。C反应蛋白(CRP)为反映T细胞活化和促炎细胞因子效应的急性期反应蛋白。其在施用10照bscCD19xCD3之后显著增加，之后在接下来的3天观察中持续减少。在施用化合物之前和施用化合物之后的多个间隔期测定反映施用化合物之后急性免疫反应的血清细胞因子水平。根据制造商的说明通过定量ELISA测定法测定血清细胞因子水平。施用bscCD19xCD3之后的第一个小时内肿瘤坏死因子TNF-a以剂量依赖的方式显著增加。白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素8(IL-8)也表现显著和剂量依赖的增加。它们的最高水平在施用bscCD19xCD3之后2-4小时观察到。总之，bscCD19-CD3可安全地给患有顽固性B-CLL的患者施用。虽然不利的副作用很可能是由于观察到的细胞因子释放，但是3照和IO照剂量的bscCD19xCD3的耐受性是可以接受的并可通过预防性测定和症状的治疗很好地控制。重要的是，如超声检查所示bscCD19xCD3造成患者之前变大的脾和淋巴结的缩小。既然脾和淋巴结的增大由于恶性B细胞浸润造成，那么缩小反映了由于施用bscCD19xCD3造成恶性B细胞的石皮坏。实施例3:剂量递增I期研究-患者0202这个剂量递增I期研究的目的是研究复发的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者肿瘤靶组织中免疫活性变化的剂量依赖性。为此目的，给每一位患者静脉内施用6次抗CD19x抗CD3双特异性抗体(SEQIDNO.2;也见于WO99/54440)，在第0，2,7，9，14和16天的每周一次或两次的治疗方案中超过4小时施用。在个体内以下列剂量逐渐增加抗CD19x抗CD3抗体的剂量1、2、4、7、10和13微克/平方米体表面积。收集施用过程之前和过程中的全血样品以评价增加bscCD19xCD3剂量对循环淋巴细胞亚群的数量和分布的影响。通过血细胞分类计数分析法测定淋巴细胞的总数并通过FACS分析测定淋巴细胞亚群的数量，并如实施例2所述表述为总淋巴细胞百分数。特别地，通过流式细胞仪(FACS)测定了外周血单核细胞中CD3+、CD4+和CD8+T细胞数量。如图l例示的完成药物治疗期的一位患者(即患者0202)，即使施用最低起始剂量的双特异性抗体，在4小时的输注期间内仍观察到CD3+、CD4+和CD8+T细胞数量(以总淋巴细胞百分数显示)的骤然降低。T细胞数量在24-38小时恢复到大约给药前的数值。在本研究包括的其它患者中观察到T细胞计数的类似曲线进程。这种降低的一种解释为T细胞和其它活化的淋巴细胞突然l^附和至少部分地迁移到组织中。一种假设是大量活化的T细胞群体(人T细胞库的大约80%在任何时间都停留在外周血中)的此种突然活化和迁移造成T细胞稳态失调以及组织中局部细胞因子组成的破坏。确实地，根据图l所示的方式给患者施用药物导致不利的副作用。这个结果表明T细胞的逐步活化和迁移更接近生理免疫反应并可避免如局部细胞因子网络骤然失调和由此造成不利副作用的现象。实施例4:I期临床试验-患者1003在另一个临床试验中，在顽固性惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)和B细胞白血病患者中检测反复静脉内输注双特异性单链抗CD19x抗CD3抗体(SEQIDNO.2;也见于WO99/54440中)的安全性、最大耐受剂量和最佳生物剂量。在研究的第0、2、4、14、16和18天*一位患者输注6次抗CD19x抗CD3抗体超过两个小时或超过四个小时。共15位患者用3.0將/12的剂量治疗。在施用药物之前或者施用过程中的不同时间点取血液样品以跟踪生物化学的、血液学和免疫学参数。如上所述测定T细胞数量。此外，使用酶因子的血清水平。当监测受治疗的患者中的T细胞数量时，每一次输注之后观察到T细胞数量的剧烈波动，表明也观察到了以前的研究中的短期、突发样的T细胞活化；见实施例3。此外，如图2-5所示的一例诊断为套细胞淋巴瘤(MCL)的患者(即患者1003),经输注双特异性抗体后，在治疗的患者中发现TNFa、干扰素y、白细胞介素-6和白细胞介素-10的剧烈细胞因子释^:。在施用初次剂量后的细胞因子释放强度最高，随后输注抗CD19x抗CD3双特异性抗体的反应降低(首剂效应)。6次输注之后几乎没有观察到细胞因子水平的诱导。如实施例3所示的研究，突然的T细胞活化和细胞因子释;^文导致对患者的不利的副作用。这些事件中的大多数具有温和或者适度的严重性，并且所有都是暂时的。最经常观察到血液参数和凝固参数的实验室异常，同样时暂时的，并且大多在性质和临床显著性上是温和到适度的。在本研究中获得的结果表明较渐进的T细胞活化是避免如上述临床试l^中观察到的局部细胞因子网络骤然紊乱的现象所必需的。实施例5:1.用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体(SEOIDNO.2)连续输注治疗非霍奇金淋巴瘤fBNHL)患者的研究通过长期输注施用化合物来评价抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体(bscCD19xCD3;SEQIDNO.2所示的氨基酸序列)的安全性和耐受性。两例复发的B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)患者示于下文的第2部分和第3部分(患者#105003和患者#102003)。在治疗的第一天，两个患者以连续静脉内输注(i.v.)接受"初始暴露剂量"的5照/m2/24小时的抗CD19x抗CD3双特异性抗体。之后将剂量逐渐增加到15jtg/m2/24小时的"维持剂量，，，所述剂量在余下的2周(患者#102003)或4周(患者#105003)的输注期间内以连续静脉内输注施用。所研究药物的日剂量在500ml含5%HAS的等渗NaCl溶液中施用。开始输注双特异性抗体之前每一位患者接受浓度为1x100mg的糖皮质激素(曱基强的松龙)的联合治疗(i.v.)1小时以抑制输注初始阶段的细胞因子释放。本实施例5的第4部分提供了用"初始暴露剂量，，(0.5-5照/m2/24小时)和15ng/mV24小时的"维持剂量"治疗的患者的其它概括数据。2.i會断为滤泡性淋巴瘤(B细胞非霍奇金'淋巴瘤)的患者#105003这位44岁的男性患者在2000年诊断为滤泡性淋巴瘤。患者以前接受多次化疗(CHOP;Bendamustin)和免疫治疗(利妥昔单抗；抗CD20单克隆抗体)。参与两年的接种试验后疾病一度更加严重。2005年秋季，患者经历骨髓浸润，造成贫血；肺浸润引起呼吸机能损伤。此外，这位患者的生活质量由于B-症状(脾大、夜间盗汗增加和3周体重下降3kg)的恶化明显降低。这种临床状况使新的疗法成为必需。在下文中，患者如上文详述连续输注4周以15ng/m2/24小时的剂量水平接受抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体(SEQIDN0.2)。治疗从2005年10月3日开始并且很好的耐受，即没有观察到显著不利的副作用。2.1抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体引起的T细胞活化和增殖用下面4种不同抗体或表面标志物组合染色之后通过四色流式细胞术分析根据研究方法在不同时间点的患者#105003外周血样品中的单核细胞第l组CD2xCD3xCD4xCD8(T细胞)第2组CD3xCD16xCD19xCD56(淋巴细胞计数B细胞、T细胞和NK细胞)第3组CD8xCD25xCD69xHLA-DR(CD8+T细胞活化)第4组CD8xCD28xCD45RAxCCR7(CD8+T细胞亚群)由第2组计算绝对淋巴细胞亚群(即分别定义为CD19+ZCD3-、CD3+和CD37CD56+细胞的B细胞、T细胞和NK细胞)数，表示为(B细胞、T细胞或NK细胞)/(。/。B细胞十。/。T细胞十。/。NK细胞)乘以常规试验测定的各个血液样品的总淋巴细胞数。由第1组计算绝对CD4+和CD8+T细胞数，分别表示％€03+€04+€08_细胞/%€03+细胞或者％€03+€04-€08+细胞/%€03+细胞，乘以由第2组计算的绝对T细胞数。CD8+T细胞亚群的绝对细胞计数通过从第4组获得的下列百分数比例乘以从第2组计算的绝对€08+T细胞计数来计算。/oCD8+CD45RA+CD28+细胞/%€08+细胞(对应于幼稚〔08+T细胞)，。/。CD8+CD45RA:CCR7+细胞/%008+细胞(对应于中枢记忆€08+T细胞-Tcm)，y。CD8+CD45RAXCRT细胞/%008+细胞(对应于效应记忆€08+T细胞-Tem)，和。/。CD8+CD45RA+CD28-细胞/。/。CD8+细胞(对应于终末分化的CTL(细胞毒性T细胞)=〔0451^阳性效应记忆€08+1细胞=Temra)。此患者中的T细胞活化测定为表达所有CD8+T细胞的细胞表面活化标志物CD25、CD69或HLA-DR(流式细胞术的第3组)的％CD8+T细胞。首先，分析了CD4+和CD8+T细胞计数。如图6所示，CD8+和CD4+T细胞从开始输注抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体之后很大程度上从外周血消失，其解释为T细胞通过抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体介导的外周血T细胞和B细胞交联引发的分布。然而，治疗半周之后，CD8+和CD4+T细胞在血液中重新出现并进一步增加数量分别直到第7天和第21天。与它们的初始值相比，CD8+和CD4+T细胞在血液中显示3.5-4倍的扩增。CD8+和CD4+T细胞计数在治疗第2周和第3周期间和第4周治疗T细胞数量开始减少之前居高不下。如下文所述当诊断实质的肺瘤缩小满足部分的反应标准时，输注抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体4周之后CD8+和CD4+T细胞计数仍然高于相应的治疗前数值。接下来，更加详细地分析了CD8+T细胞亚群。如图7所示，CD8+T细胞亚群分析表明，效应记忆亚群TEM几乎专门地负责由抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体诱导的CD8+T细胞的增殖。CD8+T细胞负责所有T细胞中大多数的细胞毒活性，并且TEM-细胞和TEMRA亚群一起负责CD8+T细胞中的大多数细胞毒活性。除了TEM-亚群外，在其它CD8+T细胞亚群间未能观察到细胞计数上的显著变化，如幼稚T细胞不能基于抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体提供的单个活化信号增殖，或者TEMRA-亚群完全不能增殖。因此，能增殖的CD8+TEM细胞的选择性增殖可以明确地归因于应答肺瘤内受抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体修饰的CD8+TEM细胞与B淋巴瘤细胞接触的细胞分裂和增殖；也见图14。由于循环性B淋巴瘤细胞在第3天、即在观察T细胞增殖前已经从外周血中耗竭，所以可以排除血液中循环性抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体修饰的B淋巴瘤细胞对T细胞增殖的显著贡献。最后，分析了CD8+T细胞的活化，因为T细胞活化的标记物如图8所示。在高度活化〔08+1细胞之后。08+T细胞增殖，其中〔08+T细胞的高度活化通过持续上调的活化标记HLA-DR表示。其它活化标记例如CD69和CD25仅在起始输注本发明构建体后显示短暂的上调，这可以通过外周血中循环性抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体修饰的B淋巴瘤细胞的活化来解释，因为循环性B淋巴瘤细胞在治疗的第一个3天期间就耗竭了。相反，超过3周持续上调HLA-DR反映了肿瘤内CD8+T细胞通过与肿瘤固有B淋巴瘤细胞接触而引起的活化，其中所述的B淋巴瘤细胞受抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体的修饰。瘤内T细胞的活化导致肿瘤内的增殖性T细胞反应，进而导致T细胞增殖，这继而也出现在循环血中。这些在肿瘤中活化并迁移进入血液的T细胞仍然显示长期活化标记HLA-DR，但短期活化标记CD69和CD25已经下调了。作为结论，使用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体的治疗引起长期的T细胞活化和增殖。具细胞毒性表型的1细胞主要归因于€08+T细胞的增殖。T细胞活化和增殖在肿瘤内由抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体修饰的B淋巴瘤细胞诱导。在输注的第三周期间T细胞活化减少、并且在第四周期间T细胞数减少可以通过抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体在这名患者中的效力来解释，这导致肿瘤在用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体治疗4周后诊断为收缩58.0%(见下文)、并因此降低了B淋巴瘤细胞总数，这能诱导由抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体介导的T细胞活化和增殖。2.2通过抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体消耗外周血B(淋巴瘤)细胞用针对下列四种细胞表面标志物的抗体组合染色之后根据标准的方法通过四色流式细胞胞/巨噬细胞标志物)xCD19(B细胞标志物)xCD56(NK细胞标志物)。分别定义为CD19"7CDT、CD3+和CD37CD56+细胞的淋巴细胞亚群即B细胞、T细胞和NK细胞的绝对细胞计数通过y。(B、T或NK细胞)/(V。B+%T+。/。NK细胞)乘以常规实验室测定的各个血液样品的总淋巴细胞计数计算。因此，B(淋巴瘤)细胞的绝对数量计算为CD19"CD3-细胞的总数。如图9所示，患者以治疗前大约每毫升血液140个B(淋巴瘤)细胞开始。在开始输注抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体后，循环性B(淋巴瘤)细胞在治疗的第一个3天内迅速下降，并最终在第一周治疗末完全从外周血中消失。此外，B(淋巴瘤)细胞保持在外周血中不存在，直至在治疗4周后诊断到部分的反应；见下文。这些数据表明，由于抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体对所述细胞的细胞毒活性，所以其能够完全清除循环性B(淋巴瘤)细胞。2.3通过抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体减小淋巴瘤的尺寸使用非霍奇金淋巴瘤(NHL)反应评价的标准化反应标准评价抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体治疗的功效。根据这些标准需要选择6个代表性淋巴瘤病灶。将淋巴瘤病灶最大横截面直径的产物总和定义为基线SPD(SumProductDiameters)。然后用此SPD的变化评价整个治疗过程中和研究后期的关见律基础(regularbase)。例如，部分的反应定义为SPD降低50%或者以上。如图IO所示，治疗4周之后的再分期(restaging)发现根据上文所述的NHL反应评价淋巴瘤块明显减小诊断到6个参考淋巴瘤病灶中58%的SPD降低，对应于X射线计算机断层术(CT)评价的肿瘤反应中的部分的反应(PR)。用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体治疗8周后通过X射线计算机断层术验证了部分的反应，显示了66%的肿瘤缩小(SPD)。3.诊断为小淋巴细胞性淋巴瘤(B一CLL)的患者#102003这例60岁的男性患者在1999年4月诊断为小淋巴细胞性淋巴瘤。在患者病史的相关发现有睡眠呼吸暂停综合证、急性肾功能衰竭、带状疱渗、间歇性支气管炎和间歇性肝病。患者有多次化疗(苯丁酸氮芥、氟达拉滨、Knospe、环磷酰胺)、免疫治疗(利妥昔单抗；抗CD20单克隆抗体)和腹部区放疗的历史。在7年的病史中，患者接受7种不同的化疗方案以及利妥昔单抗作为单一疗法或联合疗法以及未显示任何主要反应的放疗。施用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体是此患者的第13种治疗方案。患者以上文详述的连续输注以15pg/m2/24小时的剂量接受抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体(SEQIDNO.2)2周。治疗从2005年5月9日开始。治疗后两周发生了完全的再分期，其结果在下文展示。3.1抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体引起的外周血B(淋巴瘤)细胞耗竭如上文2.2部分所述确定B细胞数。如图11所示，治疗前患者每毫升血液中有920个B(淋巴瘤细胞)细胞。开始输注抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体之后，循环B(淋巴瘤)细胞迅速下降，之后是最初3天内有限恢复到每毫升600个细胞的暂时阶段，这与细胞重新分布一致。在进一步的治疗过程中，B(淋巴瘤)细胞从循环中完全耗竭直到治疗两周后诊断为部分的反应。这些数据证明作为其部分的临床功效，抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体能完全消除循环的B(淋巴瘤)细胞。3.2抗CD19xCD3双特异性单链抗体消除骨髓的淋巴瘤浸润此外，在用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体治疗前和治疗后进行骨髓组织病理学实验。如图12左图所示，治疗前可观察到小淋巴细胞性淋巴瘤40-50%的骨髓浸润。证明了小淋巴细胞性淋巴瘤/CLL的诊断。如图12右图所示，用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体治疗后没有发现明显的小淋巴细胞性淋巴瘤浸润，而观察到T细胞的显著增加。这些数据表明抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体从骨髓中消除了淋巴细胞，其中所述淋巴细胞在检测限下。这个发现与完全骨髓反应一致，这例如在常规化疗下是难以实现。3.3抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体引起的淋巴瘤大小降低此外，在2周治疗后的再分期观察到淋巴瘤块明显减小如图13所示，X射线计算机断层术(CT)诊断到6个参考淋巴瘤病灶的大小降低了57.2%,对应于肿瘤反应评价中的部分的反应(PR)。在7年的病史中，患者接受7种不同的化疗方案以及免疫疗法和放疗，没有显示任何主要的反应，第一次用抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体治疗患者提供了一个成功的疗法，因为实现了参考淋巴瘤病灶缩小50%以上。4.临床数据总结才艮据经典的3+3剂量递增方案以0.5pg/m2/24小时的初始剂量治疗复发的惰性NHL的患者。开始施用类固醇以緩解提到的细胞因子释放症状。通过CTC-AE(常见不良事件标准)评价安全性和耐受性。NCI(美国国家癌症研究所)常见不良事件标准为可用于不良事件(AE)分类的描述性术语。为每一种AE标准提供了分级(严重性)范围、并且只在数据查看委员datareviewcommittee)从14天的具有DLT(剂量限制性毒性(doselimitingtoxicity))的先前剂量所总结的安全性后才允许剂量提高。通过用特异性ELISA研究体内细胞因子水平以及通过FACS分析对外周免疫细胞进行定量和描述监测生物学活性。抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体治疗4周之后进行对照CT(X射线计算机断层术)扫描。如果根据标准化的Cheson标准(由中心放射科调查)患者至少是稳定的，那么对患者再进行额外的4周抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体周期。Cheson标准由国家癌症研究所和国际药学工业会建立来提供评价NHL临床反应的指导。根据这个标准，当所有疾病和疾病相关症状的可检测临床和放射迹象完全消失，所有的淋巴结恢复正常大小，脾恢复大小和骨髓中没有淋巴瘤时获得了完全的反应。对部分的反应来说，6个最大的明显淋巴结的大小必需降低50%，其它淋巴结、肝和脾的大小不增加，脾结节、肝结节必需缩小至少50%并且必需没有新的疾病位置。至今，已经包括了具有4个之前的化学疗法/免疫疗法的中位数的19名患者。在从DL1(0.5|ig/m2/24小时)(DI^剂量水平)至DL3(5ng/m2/24小时)的剂量扩大期间，观察到剂量限制性毒性，并且AE(副作用)通常为中等的。在DL4(第一天5照/m2/24小时，维持剂量15|ug/m2/24小时)，治疗了7名患者，其中的2位接受少于14天的治疗(1DLT，每次调查人决定时中断1次)。在14名可评估患者(治疗>2周，并且在输注抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体之前，外周血中的B细胞是可检测的)中，有9名在结束CD19xCD3双特异性单链抗体输注后观察到循环性B(淋巴瘤)细胞完全耗竭。在DL4，剂量依赖性增加的频率达到100%。在DL4，7名患者中的3名具有相关的骨髓(BM)浸润(>10%)，其中1名患者显示改善，并且2名患者显示'淋巴瘤细胞从BM完全消失。在14名评估患者(治疗>2周，并且扫描所有相关区域)中，最好的整体肿瘤反应(overalltumourresponse)为1名CR(在患者弁109002中完全的反应，所述患者为诊断为滤泡性、淋巴瘤1级、IIIa期的61岁男性患者)、2名PR(部分的反应)、1名MR(小的反应(minorresponse))、7名SD(稳定的疾病)和3名PD(恶化的疾病)。特别地，患者#109002显示了进一步给人深刻印象的结果，即完全消除(CR);见图14-16。这种完全的消除在所述患者中通过4周在治疗第一天5ng/m2/24小时的初始剂量和15|ig/m2/24小时的后继剂量实现。这4周之后，患者#109002显示部分的反应，并且患者立即接受另外4周进一步的15pg/m2/24小时剂量，进而导致完全的反应。不受下文限制，本领域如下定义"完全的反应"、"部分的反应"、"恶化的疾病"和"小的反应"如果通过CT成像和其它测试检测不到病灶，那么就通常称为完全的反应。如果CT成像和骨髓测试显示没有疾病迹象，那么其就更加严格地定义了完全的反应。部分的反应描述其中检测到可测定肿瘤负荷至少下降50%的疗法的反应。当患者经历症状(发烧、夜间出汗等)、并且当淋巴结大小增加或者观察到新扩大的淋巴结，那么就认为其患有恶化的疾病。当患者不经历症状、并且当淋巴结不增长、或者观察到在退化，那么就认为其患有稳定或退化的疾病。有时将这种病症或该疾病在临床上观察到的不活动性描述为緩解。"小的反应"大致表示小量的收缩。小的反应不是真正标准的术语，但其越来越多地被使用。大致说来，小的反应是高于肿瘤总体积的25%但低于50%,后者为部分的反应(PR)。权利要求1.双特异性单链抗体构建体用于制备预防、治疗或改善惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)或B细胞白血病的药物组合物的用途，所述双特异性单链抗体构建体包含对人CD3和人CD19特异的结合结构域，其中相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(VL)从N端到C端以下列次序排列VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)，VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)，VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)，或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)，并且其中所述的双特异性单链抗体构建体以每平方米患者身体表面积10μg至80μg的日剂量施用至少1周，并且其中所述的日剂量施用超过至少6小时。2.预防、治疗或改善惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)或B细J包白血病的方法，所述方法包括向需要其的患者施用包含双特异性单链抗体构建体的药物组合物，所述双特异性单链抗体构建体包含对人CD3和人CD19特异的结合结构域，其中相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(VO从N端到C端以下列次序排列Vl(CD19)-Vh(CD19)-Vh(CD3)-Vl(CD3)，Vh(CD19)-Vl(CD19)-Vh(CD3)-Vl(CD3)，Vh(CD3)國Vl(CD3)國Vh(CD19)-Vl(CD19)，或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)，其中所述的双特异性单链抗体构建体以每平方米患者身体表面积10fig至80pg的日剂量施用至少l周，并且其中所述的日剂量施用超过至少6小时。3.药盒，其包含在人中预防、治疗或改善惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)或B细胞白血病的药物组合物和说明书，所述药物组合物包含药学活性的双特异性单链抗体构建体，所述双特异性单链抗体构建体包含对人CD3和人CD19特异的结合结构域，其中相应的可变重链区(Vu)和相应的可变轻链区(Vl)从N端到C端以下列次序排列Vl(CD19)-Vh(CD19)-Vh(CD3)誦Vl(CD3)，Vh(CD19)-Vl(CD19)-Vh(CD3)-Vl(CD3),Vh(CD3)-Vl(CD3)-Vh(CD19)-Vl(CD19)，或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)，并且所述说明书描述了双特异性单链抗体构建体的施用方案，包括以每平方米患者身体表面积10照至80照的日剂量施用至少l周，并且其中所述的日剂量施用超过至少6小时。4.用来在人中预防、治疗或改善惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)或B细胞白血病的药盒，根据至少一周包括施用包含对人CD3和人CD19特异的结合结构域的双特异性单链抗体构建体的治疗方案，其中相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(V。从N端到C端以下列次序排列Vl(CD19)-Vh(CD19)-Vh(CD3)-Vl(CD3)，Vh(CD19)-Vl(CD19)-Vh(CD3)誦Vl(CD3)，VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)，或Vh(CD3)-Vl(CD3)画Vl(CD19)國Vh(CD19),其中所述的双特异性单链抗体构建体以每平方米患者身体表面积IO网至80照的日剂量施用至少1周，并且其中所述的日剂量施用超过至少6小时，并且其中所述的药盒含有下列组分(a)至少7份140照至320照所述药学活性的双特异性单链抗体构建体的单独的日剂量；和(b)将组分以促进对治疗方案顺应性的方式安排的装置。5.根据权利要求1的用途、根据权利要求2的方法或者根据权利要求3或4的药盒，其中所述的日剂量施用超过至少IO小时。6.根据权利要求1的用途、根据权利要求2的方法或者根据权利要求3或4的药盒，其中所述的日剂量施用超过至少12小时。7.根据权利要求1的用途、根据权利要求2的方法或者根据权利要求3或4的药盒，其中所述的日剂量施用超过至少24小时。8.根据权利要求1、5、6或7中任意一项所述的用途、根据权利要求2、5、6或7中任意一项所述的方法、或者根据权利要求3-7中任意一项所述的药盒，其中所述CD3特异的结构域的所述VH区和VL区衍生自选自OKT-3、X35画3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、Fl11-409、CLB画T3.4.2、TR-66、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M画T301、SMC2和F101.01的CD3特异性抗体。9.根据权利要求1-8中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述CD3特异的结构域的所述VH区包含至少一个包含氨基酸序列SEQIDNO.11的CDR3区。10.根据权利要求l-9中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述CD3特异的结构域的所述VH区包含至少一个包含氨基酸序列SEQIDNO.10的CDR2区。11.根据权利要求1-10中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述CD3特异的结构域的所述VH区包含至少一个包含氨基酸序列SEQIDNO.9的CDR1区。12.根据权利要求l-ll中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述CD3特异的结构域的所述Vt区包含至少一个包含氨基酸序列SEQIDNO.14的CDR3区。13.根据权利要求1-12中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述CD3特异的结构域的所述VL区包含至少一个包含氨基酸序列SEQIDNO.13的CDR2区。14.根据权利要求1-13中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述CD3特异的结构域的所述Vl区包含至少一个包含M酸序列SEQIDNO.12的CDR1区。15.才艮据权利要求1-14中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述CD3特异的结构域的所述VH区包含SEQIDNO.17,所述CD19特异的结构域的所述VH区包含SEQIDNO.15，所述CD3特异的结构域的所述VL区包含SEQIDNO.18，和/或所述CD19特异的结构域的所述VL区包含SEQIDNO.16。16.根据权利要求1-15中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述双特异性单链抗体构建体包含选自以下的氨基酸序列(a)在SEQIDNO2、4、6或8中描述的氨基酸序列；(b)由SEQIDNOl、3、5或7中所示核紗列编码的氨基^歹'J;(c)由与(b)的核酸序列具有至少70%、80%、卯％、95%或99%同一性的核酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够特异地结合至CD3和CD19;以及(d)由与(b)的核苷酸序列遗传密码简并的核酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够特异地结合至CD3和CD19。17.才艮据权利要求1-16中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述的可变区通过额外的接头序列连接。18.根据权利要求1-17中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述曰施用持续至少2周、至少3周或者至少4周。19.根据权利要求1-18中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述的药物组合物与一种或多种其它的药剂联合施用。20.根据权利要求1-19中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述的药物组合物向人类患者施用。21.根据权利要求1-20中任意一项所述的用途、方法或药盒，其中所述的双特异性单链抗体构建体在第一天以低于每平方米患者身体表面积10pg至80jtg的日剂量施用。全文摘要提供了预防、治疗或改善惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)和B细胞白血病的方式和方法，包括向需要其的患者施用双特异性单链抗体构建体；提供了所述双特异性单链抗体构建体在制备预防、治疗或改善惰性或迅速蔓延性B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)和B细胞白血病的药物组合物中的用途，其中所述的构建体以指定的日剂量施用至少1周。此外，本发明涉及待根据本发明使用的包含双特异性单链抗体构建体的药盒。文档编号A61P35/02GK101331151SQ200680047162公开日2008年12月24日申请日期2006年11月29日优先权日2005年12月16日发明者E·里奥,M·克灵格尔,P·库弗,P·鲍尔勒申请人:麦克罗梅特股份公司