一种阻断uPA与uPAR相互作用的化合物及其应用的制作方法

专利名称：：一种阻断uPA与uPAR相互作用的化合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物制药领域，涉及一种能阻断尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinaseplasminogenactivator，uPA)与它的受体(urokinaseplasminogenactivatorreceptor，uPAR)相互作用的化合物，本发明还涉及该化合物在制备预防或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
背景技术：
：动脉粥样硬化是一种脂质物质堆积在动脉血管壁上引起炎性疾病，Lusis，Nature，407233-241(2000)。美国约有1200万的动脉粥样硬化病患者，英国有39％的死亡是由动脉粥样硬化引起。尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)通过与其受体(uPAR)结合促进炎症细胞的粘附与迁移[Guetal.，J.CellPhysiol.，204(1)73-82]。在ApoE缺陷小鼠(一种动脉粥样硬化小鼠模型)中，uPAR与uPA协同作用可促进巨噬细胞穿过内皮细胞进入血管壁[Guetal.，J.CellPhysiol.，204(1)73-82(2005)]。进入血管壁的巨噬细胞可转化成泡沫细胞，泡沫细胞过量表达的uPA在动脉粥样硬化损伤处的累积加速了动脉粥样硬化的形成[Cozenetal.，Circulation，109(17)2129-35(2004)]。所有这些研究表明过量表达的uPA与uPAR在动脉粥样硬化的发展过程的作用。但是，ApoE小鼠中uPA基因缺失对动脉粥样硬化损伤的形成没有影响[Carmelietetal.，Nat.Genet.，17(4)439-44(1997)；Dengetal.，CircRes.，92(5)510-517(2003)]。目前，没有文献报导正常表达的uPA和uPAR对动脉粥样硬化的形成具有何种影响。uPA的氨基末端片段(aminoterminalfragment，ATF)是uPA与uPAR的结合区域，研究表明ATF和抗ATF抗体能有效治疗肿瘤，Lietal.，Hum.GeneTher.，16(10)1157-67；Mazaretal.，U.S.PatentApplication2005/0232924。但没有ATF和抗ATF抗体能够预防或治疗动脉粥样硬化的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种通过阻断uPA与uPAR相互作用而发挥预防或治疗动脉粥样硬化的化合物。本发明另一个目的是提供上述化合物在制备预防或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。发明人研究发现，采用一种阻断uPA与uPAR相互作用的物质(例如ATF或其片段，抗ATF的抗体，uPAR或其片段，抗uPAR抗体)能有效预防或治疗动脉粥样硬化。ATF或其片段既能与uPAR结合，从而竞争性阻断uPA与uPAR相互作用，同时，又能引发针对ATF的免疫反应，产生的抗体与uPA竞争性结合，也能阻断阻断uPA与uPAR的相互作用，并且，这种阻断uPA与uPAR相互作用的效应可预防或治疗动脉粥样硬化，因而提出以下技术方案一种阻断uPA与uPAR相互作用的化合物，该化合物包括ATF、ATF片断、uPAR片断、抗ATF的抗体、或者抗uPAR的抗体；其中ATF是uPA的ATF。所述的化合物，其中ATF是氨基酸序列为SEQIDNO1的多肽，或者是氨基酸序列与SEQIDNO1至少有70％同源性的多肽，较好的是至少有80％同源性的多肽，更好的是至少有95％同源性的多肽，尤其是至少有98％同源性的多肽，最好是至少有99％同源性的多肽；且该多肽具有抗动脉粥样硬化活力。ATF可能是天然的也可能是人工合成的，例如ATF可以从哺乳类动物(如人、狒狒、小鼠、大鼠、牛、猪)或者非哺乳类动物(如鸡)中获得；ATF可能是人ATF的变体，例如与人ATF(SEQIDNO1)氨基酸序列有70％，80％，90％，95％或者99％相同的多肽；也可以是嵌合型的人ATF，例如将人ATF与其受体的结合区域用其它物种(如狒狒、小鼠、大鼠、牛、猪或鸡)的ATF与其受体的结合区域代替。SEQIDNO1为人的uPA的ATF氨基酸序列。所述的化合物，该化合物是人ATF与其受体的结合区域被其它物种的ATF与其受体结合区域所替代的嵌合型的人ATF。其他物种为哺乳动物或非哺乳动物；其中哺乳动物优选狒狒、小鼠、大鼠、兔、牛或猪；非哺乳动物优选鸡。所述的化合物，其中ATF以及ATF片断中含有SEQIDNO.3～55中任一序列的氨基酸残基，该化合物具有较强的免疫原性。本发明的化合物包括含有上述任一多肽的药用制剂，该制剂能引发病人体内的免疫反应，本发明的化合物还包括与上述这些多肽专一性地结合的抗体。所述的化合物，其中抗ATF的抗体的氨基酸序列包含SEQIDNO2中任一片段的多肽，该片段包括至少一个ATF结合位点。SEQIDNO2为人的uPAR氨基酸序列(＞gi|8050815|gb|AAF71751.1|urokinase-typeplasminogenactivatorreceptor；UPAR[Homosapiens])。所述的化合物，其中该片段至少由8个氨基酸组成；优选该片段至少由15个氨基酸组成。本发明的化合物还包括专一性与这些片段结合的抗体。所述的化合物，其中抗ATF的抗体中包括的ATF结合位点手相当于SEQIDNO2的下列结合位点中的一个或多个T8，R25，V29，L31，L40，R53，L55，Y57，L66，E68，R137，K139，R142，H143，R145，H166，H251，L252，D254，或A255。所述的化合物与能延长其在病人身体中半衰期的物质偶联；通常采用该化合物与聚乙二醇(PEG)共价连接；或者该化合物与钥孔虫戚血蓝素(KLH)共价连接。该化合物可与白蛋白的单独混合使用；也可与PEG及白蛋白混合使用，或者与KLH及白蛋白混合使用。表达权利要求1所述化合物的核苷酸序列。一种药物组合物，含有治疗有效量的上述的化合物及药学上允许的辅料。上述的任一化合物在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。制剂可以给予病人如静脉途径单剂量或多次剂量，可能在病人动脉粥样硬化发生之前，之中和之后使用。本发明提供的药用制剂中可以包括佐剂。本发明还提供筛选阻断uPA与uPAR相互作用的化合物的方法，筛选能阻断相互作用(如两个多肽结合反应)的方法是已知的。经典的方法包括如下步骤(a)假如第一个多肽包含了能与uPAR结合的ATF片段(如受体结合区域)，第二个多肽包含了能与uPA结合片段(如包含一个或多个ATF结合位点)，在一定的条件下，这二个多肽可以相互作用。(b)让受试化合物与第一和第二多肽接触。(c)测定受试化合物是否使第一、第二个多肽的结合水平下降，如果二者的结合水平下降则表明受试化合物能够阻断uPA和uPAR相互作用。本发明的范围包括采用能够阻断uPA与uPAR结合的物质(如ATF或其片段，抗ATF的抗体，uPAR或其片段，抗uPAR的抗体)制造治疗动脉粥样硬化的药物制剂。“有效剂量”和“治疗有效”是指在一段时间(包括急性或慢性使用、阶段性或连续性地使用)使用的物质的量或浓度在受试者的体内产生预期的效果或有生理学变化。本发明中采用的ATF和抗uPAR的抗体的有效剂量包括能有效阻止或抑制有动脉粥样硬化倾向的病人的动脉粥样硬化，或者缓解病人的动脉粥样硬化症状。“病人”是指用本发明的方法治疗的动物，人或者非人类。本发明可以明确的预见其医牲畜的应用，该术语包括但不限于鸟类，爬行类，两栖类和哺乳类(如人类，其它灵长类，猪，牛，马，狗，绵羊和山羊)，啮齿类(如小鼠，大鼠，兔，豚鼠，沙土鼠)等。“动脉粥样硬化”是由于动脉粥样斑块形成导致的动脉硬化或增厚，如脂质物质在动脉管血管壁内和血管壁上的堆积。参见http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/000171.htm患者动脉粥样硬化的病人是指至少有一个能用日常医学方法检测的动脉粥样斑块。该患者由于斑块破裂和(或)或动脉狭窄表现的出某一器官的供血不足。如果动脉粥样硬化发生在通往心脏的的动脉，患者会有胸痛的症状；如果是发生在股动脉上则会产生腿疼。具有动脉粥样硬化倾向的病人是指具有一个或多个动脉粥样硬化的诱因，例如有个人或家族心脏病史，高脂肪饮食习惯，抽烟，肥胖，高血压和(或)血液中的高胆固醇。“治疗动脉粥样硬化”(除非特指)是指缓解动脉粥样硬化的症状，逆转、改善或抑制动脉粥样硬化的进程，或者阻止动脉粥样斑块的形成。以下对本发明作更详细的说明1.用ATF蛋白质治疗动脉粥样硬化a.ATF蛋白质ATF是指uPA与相同物种的受体uPAR结合的N-末端结构域。与uPA具有丝氨酸蛋白水解酶活性的C-末端不同，ATF没有催化活性。ATF蛋白质可以是全长的ATF，也可以是能与uPAR结合的ATF片段，也可以是能诱导抗ATF的免疫反应的ATF片段。ATF可以是天然提取的或人工合成的。ATF蛋白质的一个例子是人ATF，它包括人尿激酶的Ser1～Lys135的氨基酸残基，人ATF的氨基酸序列见SEQIDNO1。ATF蛋白质的另一个例子是人ATF的变体，倘若该变体与人ATF功能相同，即它可与至少一个物种的uPAR结合并具有抗动脉粥样硬化活力。该变体的氨基酸序列与人ATF(SEQIDNO1)至少具有40％的同源性，如有70％、80％、90％的同源性更好，最好是具有95％或99％的同源性。人ATF变体可能来源于其它物种的ATF。通过在人ATF中插入突变序列，如保守氨基酸残基的替换，但这些改变不影响人ATF的功能。本发明两个氨基酸序列中相同残基的比例的联配分值采用的运算法则是KarlinandAltschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268(1990)，修正版见KarlinandAltschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877(1993)。将该运算法则编入NBLAST和XBLAST程序Altschuletal.J.Mol.Biol.，215403-410(1990)。运行XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，score＝50，wordlength＝3，寻找与已知多肽(如SEQIDNO1)同源的氨基酸序列。为得到可以相互对照的序列图，采用了GappedBLAST参见Altschuletal.，NucleicAcidsRes.，253389-3402(1997)。当运行BLAST和GAPPEDBLAST程序时，采用了相似程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。ATF蛋白质的另一个例子是从非人类的物种获得的，诸如鸟类(如鸡)、爬行类或哺乳类(如猴，狒狒，小鼠，大鼠，兔，牛或猪)。如图1所示，许多物种(如人，狒狒，小鼠，大鼠，牛，猪或鸡)的尿激酶的ATF结构域是十分相似的。给出不同物种间ATF结构相似性，本领域技术人员通过将具有未知ATF结构域的尿激酶氨基酸序列与已知ATF结构域的尿激酶氨基酸序列比较，能很容易地确定ATF结构域。本发明所用的ATF蛋白质还可以是嵌合型的ATF，即包含了不同物种的ATF片段。嵌合ATF的一个例子就是一个物种的ATF的天然受体结合区域被另一物种的受体结合区域取代。ATF的受体结合区域是指直接与uPAR结合的结构域见图1和2。本领域技术人员通过将具有未知受体结合区域的ATF氨基酸序列与一已知受体结合区域的ATF氨基酸序列比较便能很容易地确定ATF受体结合区域。如人的ATF或小鼠的ATF。一种嵌合型ATF可能是人ATF的受体结合区域(VSNKYFSIHW)被其它物种的受体结合区域所替代，如小鼠(VSYKYFSRIRR)、大鼠(VSYKYFSSIRR)、牛(VTYKYFSNIQR)、猪(VSYKYFSNIQR)、兔(VTYKYFSNIWR)或鸡(ITYRFFSQIKR)。除了上述所有的全长ATF外，ATF蛋白质还包括这些全长ATF的片段，ATF片段可以与uPAR结合，或者抑或同时具有能引起T细胞反应的II型MHC结合结构域。II型MHC结合结构域可以通过已知的方法预测，参见Singhetal.，Bioinformatics，17(12)1236-37。另一种ATF片段的例子是包括一个抗体的抗原决定簇足以引发病人的抗体反应，超过8个氨基酸的多肽通常就能诱导抗体反应。ATF蛋白质治疗动脉粥样硬化的作用机制可能通过下述两种途径第一，ATF蛋白质与内源性uPA竞争，与uPAR的结合，从而阻断uPA与uPAR的相互作用，这种相互作用对于动脉粥样硬化的发展是重要的。第二，ATF蛋白质作为抗原诱导免疫反应而引起抗动脉粥样硬化作用，如ATF蛋白质诱导的抗ATF抗体可阻止内源性的uPA和uPAR的结合。ATF诱导的T细胞反应也可在抗动脉粥样硬化中起了一定的作用。b.ATF蛋白质的制备ATF蛋白质可以是用重组技术生产或从天然原料中分离，例如可以用文献Stoppellietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，824939-4943(1985)，所述的方法用尿激酶制备ATF。ATF的片段也可以用重组技术生产或化学合成。ATF蛋白质另外一种考虑还可以是部分为天然的部分为化学合成的。ATF蛋白质还可以是经过修饰以延长其在病人体内的半衰期。其中一个例子，多肽与其它物质(如聚乙二醇或白蛋白)一起(共价连接或融合)能够用已知的方法延长其半衰期；另外一个例子，ATF蛋白质还可以进行化学修饰。ATF或ATF片段的化学修饰物包含并不限制于侧链的修饰，肽的合成过程中为了控制肽及其类似物的构象而引入非自然氨基酸及/或它们的衍生物。侧链修饰的例子包含对氨基的修饰，例如通过NaBH4与一个醛类化合物反应得到还原烷化后的氨基酸，甲基亚氨乙酸酯对氨基的酰氨化修饰，乙酸酐对氨基的酰基化修饰。氰酸盐对氨基的氨基甲酰化修饰，TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸)对氨基的三硝基苯基化修饰，琥珀酸酐与四氢邻苯二甲酸酐对氨基的酰基化修饰，还有如通过]5’-磷酸吡哆醛与赖氨酸反应，在NaBH4的还原下得到的赖氨酸的吡哆衍生物。精氨酸的侧链胍基可以与2，3-丁二酮，苯基乙二醛和乙二醛进行缩合反应得到各种杂环产物。羧基的修饰可以包括如与碳二酰亚胺类的活化试剂反应形成O-酰基异脲的中间体，中间体可以与许多活性官能团反应，如与氨基形成酰氨键。氨基酸上的巯基可以通过很多方式进行修饰，如可以与碘乙酸，碘乙酰氨反应得到巯基的羧基甲酰化与氨基甲酰化产物；可以被过甲酸氧化为磺基；与其他硫醇化合物形成各种混合二硫化物；与马来酰亚胺，马来酸酐以及其各种取代物反应；与各种含汞试剂如4-氯汞基安息香酸，4-氯汞基苯磺酸，苯基氯化汞，2-氯苯基-4-硝基苯酚以及其他含汞试剂生成含汞衍生物；与氰酸盐在pH碱性条件下形成氨基甲酰化产物。色氨酸可以被N-溴基琥珀酰亚胺氧化或者与2-羟基5-硝基苯基溴或磺酰基卤化物反应生成吲哚环上的烷化物。酪氨酸可以与四硝基甲烷发生硝基置换反应转变为3-硝基酪氨酸衍生物。组氨酸的咪唑环可以通过与碘乙酸衍生物进行烷基化，也可以与焦碳酸二乙酯生成N-乙酯基化衍生物。在肽的合成过程中引入的非自然氨基酸及其衍生物包含并不限制于正亮氨酸，4-氨基丁酸，4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸，6-氨基己酸，叔丁基甘氨酸，正缬氨酸，苯基甘氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，4-氨基-3-羟基-6-甲基戊酸，2-吩噻基丙氨酸以及各种D构型的氨基酸。c.含有ATF蛋白质药用制剂的制备ATF蛋白质可以做成药用制剂，例如免疫原性组合物。其中一个例子，该制剂中包含药用可接受的载体、稀释剂、辅料或赋形剂。“可接受的”是指该载体、稀释剂、辅料或赋形剂与制剂中的活性成分是可配伍的(最好是能够稳定活性成分)，并对病人无害。可以使用一种或多种的增溶剂做载体，如胶态二氧化硅、硬脂酸镁盐、纤维素、十二烷基硫酸钠和10#D&C黄色染料(D&CYellow#10)。另一个例子是制剂中除了ATF或其片段外，还包括佐剂，如卵磷脂、油脂、表面活性剂或它们的组合，一种合适的佐剂包括载体的水溶液，如磷酸盐缓冲液(PBS，DulbeccoPBS)制剂中的卵磷脂可以是0.25-12.5％(v/v)，较好是0.5-5％，最好是0.5-1.25％；油脂的含量可以是1％-23％(v/v)，较好的是3.5-10％，最好是4.5％；两亲型表面活性剂的含量可以是1.5-6％(v/v)，较好是1.5-4％，最好是2％。上述制剂中的佐剂可以多于一个。如佐剂包含了二种两亲型表面活性剂，如表面活性剂TWEEN3和SPAN3，在制剂中一个主要分布在水相(如TWEEN803)，另一个主要分布在油相(如SPAN803)，当TWEEN803和SPAN803同时作为表面活性剂时，TWEEN803DE浓度约为1/2至SPAN803浓度的三倍，最适宜的是二倍。另一个例子，佐剂包含了卵磷脂的油脂的混合物(DRAKEOL35LtMineralOil)，卵磷脂可按专利CentralSoya，FortWayne，Ind.SeealsoU.S.Pat.No.5,084,269的方法获得，表面活性剂TWEEN3和SPAN3从VanWatersandRogers，Omaha，Nebr.购买。其它已知的佐剂如油乳剂，氢氧化铝，氢氧化锌，氢氧化钙，吡啶，油和皂化物，也可作为上述药用制剂的配方。含有ATF或其片段的药用制剂可以通过传统的方法制备，如混合，溶解，造粒，糖丸制作，捻成细粉，乳化，胶囊，包埋或冻干。d.ATF蛋白质药用制剂的给药途径已知的传统给药方式均可用于上述的药用制剂，如口服，皮下注射，静脉注射或肌肉注射，另外，本制剂还可通过注射贮存途径(iniectabledepotroute)给药，如采用1、3或6个月长效或生物降解的物质和方法。制剂注射型长效处方包括许多种载体如植物油、DMF、乳酸乙脂、碳酸乙酯、乙基碳酸异丙酯、乙醇、多元醇(甘油、聚乙二醇、液体聚乙二醇等等)。对于静脉注射剂量可以采用制剂的水溶液的点滴方式，即含有多肽(ATF或其片段)的药剂用生理上可以接受的辅料溶解。生理上可接受的辅料包括5％葡萄糖，0.9％的生理盐水，Ringer′s溶液或其它适宜的辅料。蛋白质制剂也可以是粉末的形式，临用前用适合的溶液如注射用水复溶。制剂还可以做成储存的形式，这些长效的配方可以通过植入法给药(如皮下包埋或肌肉包埋)或者肌肉注射，因此，在制剂的配方中加入适宜的多聚物或疏水物质(如用适宜的油做成的乳化剂)或离子交换树脂或微溶的衍生物(如微溶盐类)另外，制剂还可做成口服形式。口服的片剂通常包括适宜的载体或辅料，诸如玉米、淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸盐、碳酸钙、氯化钠或藻酸。崩解剂包括(但不限于)微甘醇酸酯和藻酸。片剂的粘合剂可以包括明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙、羟丙基、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。润滑剂可以使用硬脂酸镁、硬脂酸、硅流体、滑石粉、蜡、石油和二氧化硅。经设计的固体制剂可保证在小肠中释放。例如复合物在固相亚单位或由微囊多聚物组成的相对独立基质、壁或腔的胶囊中，到达大肠或小肠后因PH的改变溶解或降解，而将药物释放出来。适宜的多聚物如前所述，也可参见专利U.S.Pat.NO.5,705,189。另外，还可以采用其它的药物传递系统。脂质体和乳化物是常见的用来传输多肽制剂的载体。一些有机溶剂如二甲基亚砜(DMSO)虽然具有较大的毒性也会使用。再者，还可以做成缓释剂，如将复合物装入半渗透的固体聚合物中，很多不同的缓释物质均为已知的。根据缓释胶囊的天然化学性质不同，可以花费几周到100天缓慢释放制剂的活性成分如ATF或它的片段。制剂也可通过吸入法给药。“吸入”是指从鼻腔和口腔吸入，可以用传统的技术制备成适当的剂量形式，如气溶液配方或剂量吸气器。确定制剂有效剂量的方法是已知的，特别是根据本文所详细描述的的方法。按如上所述的方法给入有效剂量的制剂后能够缓解病人的动脉粥样硬化症状，逆转、改善或抑制动脉粥样硬化进程，阻止动脉粥样硬化斑块的形成。有效剂量的确定最初是通过体外测定。例如，可以在动脉粥样硬化动物模型如兔主动脉球囊损伤模型或ApoE缺陷小鼠模型中得到一个抗动脉粥样硬化的有效剂量，本领域技术人员可以根据本文所述的结果逐步优化所有物种的给药方法。分别摸索给药剂量和给药频率。例如含有40-100mgATF和适当佐剂的制剂在1-2月内静脉给药2次或2-3月内静脉给药3次，如果病人体内的抗ATF抗体滴度低于1∶10000时应间歇性的增加一次。制剂可以在病人动脉粥样硬化发生前或后给予一次或多次。“动脉粥样硬化发生前”是指用日常的医学方法未检测到动脉粥样硬化的斑块。“动脉粥样硬化发生后”是指可以检测到动脉粥样硬化斑块，病人已经或正在出现动脉粥样硬化症状。当病人多次给药时，可以在不同的给药时间通过不同的途径给药。2.用抗uPAR抗体治疗动脉粥样硬化本方法所描述的是给病人使用能与uPAR专一性结合的抗体。抗uPAR抗体包括但不限于多抗，单抗，抗体片段(如抗体的单链或Fab)，嵌合抗体和人源化抗体，典型的抗uPAR抗体的靶点是uPAR上的uPA结合位点。a用来生产抗uPAR抗体的抗原全长的uPAR蛋白质可以用作生产抗uPAR抗体的抗原。例如人的uPAR，其氨基酸序列(SEQIDNO2)如图3所示。uPAR可以是从天然原料中纯化的也可以是重组技术生产的，或者是天然的和人工合成的结合体。uPAR的片段也能用来作为抗原诱导产生抗uPAR抗体，uPAR片段可能包括至少8个氨基酸残基，还可另加一个uPA结合位点。例如一个15个氨基酸的uPAR片段含有至少一个氨基酸残基直接与uPA相互作用。某些uPAR蛋白质(如人的uPAR)直接与uPA的作用位点的氨基酸残基是已知的，如图3所示，人uPAR包括三个结构域(结构域I，结构域II，结构域III)与人的uPA(它的ATF区域)相互作用。根据rhATF-uPAR复合物的三维结构Huai，etal.，Science311656-659(2006)。下述uPAR的氨基酸残基直接与人的ATF结合T8，R25，V29，L31，L40，R53，L55，Y57，L66，andE68(inDomainI)；R137，K139，R142，H143，R145，andH166(inDomainII)；andH251，L252，D254，andA255(inDomainIII)。其它物种的uPAR与uPA相互作用的氨基酸残基可以通过比较已知uPA结合位点的uPAR(如人uPAR)与未知uPAR结合位点的uPA结合位点的uPA的结构来确定。b.抗uPAR抗体的制备用动物制备单抗、多抗及其片段的方法是已知的。参见HarlowandLane，(1988)AntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork。“抗体”是包括完整的抗体分子及其片段，如Fab，F(ab′)2，FV，scFV(单链抗体)和dAb(抗体结构域，Ward，et.al.(1989)Nature，341，544)。通常生产多肽的抗体，多肽可与载体蛋白如KLH偶联，与佐剂混合注射到宿主动物上，动物产生的抗体用多肽亲和层析柱纯化。常用的宿主动物有兔、小鼠、豚鼠和大鼠。根据不同的宿主动物可以选择不同的佐剂增强免疫反应，包括弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物油如氢氧化铝、表面活性物质如卵磷脂，多元醇、聚阴离子(polyanions)、乳化油、钥孔虫戚血蓝素(KLH)、二硝基酚。有效的人用佐剂有卡介苗(BCG)和微小棒状杆菌素(coryhebacterinmparvum)。包含一组异质的抗体的多抗存在于免疫动物的血清中，单一抗体成分的单抗可用经典的杂交瘤技术制备参见Kohleretal.(1975)Nature256，495；Kohleretal.(1976)Eur.J.Immunol.6，511；Kohleretal.(1976)EurJImmunol6，292；andHammerlingetal.(1981)MonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier，N.Y.。特别是单抗可以通过培养能生产抗体分子的稳定细胞株的获得，参见Kohleretal.(1975)Nature256，495andU.S.PatentNo.4,376,110；人B细胞杂交瘤技术参见Kosboretal.(1983)ImmunolToday4，72；Coleetal.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80，2026。EBV-杂交瘤技术参见Coleetal.(1983)MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)。这些抗体可能是任何一类免疫球蛋白，包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD和它们的亚型。杂交瘤技术生产单抗可以是体内培养也可以是体外培养。能够通过活体生产高滴度的单抗是特别有用的生产方法。生产嵌合抗体的技术参见Morrisonetal.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，6851；Neubergeretal.(1984)Nature312，604；andTakedaetal.(1984)Nature314452。嵌合抗体是指分子的不同部分来源于不同的物种，如具有鼠源单抗的可变区和人源免疫球蛋白的不变区。生产单链抗体的技术(参见U.S.PatentNos.4,946,778and4,704,692)同样适用于生产噬菌体文库的单链FV抗体。抗体片段可由已知的技术生产。例如这样的片段包括的但不限于由胃蛋白酶水解抗体分子得到的F(ab′)2的片段，还原F(ab′)2片段的二硫键得到的Fab片段，抗体还可以通过已知的方法人源化。例如，具有所需要结合专一性的单抗可被商业性地人源化(参见Scotgene，Scotland；andOxfordMolecular，PaloAlto，Calif)。由转基因动物生产的人源抗体也属于本发明的范畴(参见Greenetal.(1994)NatureGenetics7，13；andU.S.PatentNos.5,545,806and5,569,825)。c.制备和使用含抗uPAR抗体的药用制剂如上所述的抗uPAR抗体可以按前文所述的方法(1.c)做成药剂给病人使用。抗uPAR抗体在治疗动脉粥样硬化中的作用机制包括但不限于是通过干扰uPA和uPAR的结合而有效地治疗动脉粥样硬化。3.用其它物质治疗动脉粥样硬化除了ATF蛋白质和抗uPAR抗体，其它能阻断uPA和uPAR相互作用的物质也能用于本发明，可以阻断uPA和uPAR结合的物质包括但不限于抗ATF抗体，uPAR，能与uPA结合的uPAR，表达ATF蛋白质、uPAR、uPA结合片段的核苷酸，小分子有机化合物(如非多肽类分子)。通常本方法所用的小分子的有机化合物的分子量小于2500道尔顿(Da)，小分子可能从至少100Da到2000Da，这些分子能够与uPAR的uPA结合位点(如结构域I，结构域II，结构域III)结合或uPA的uPAR结合位点(如ATF或受体结合区域)结合，其亲和常数至少约2×104M-1，例如105M-1、106M-1、107M-1和108M-1。可以用已知的方法如高通量筛选来确定能阻断uPA与uPAR相互作用的物质。其中一个例子是，假设有多肽1和多肽2，多肽1是可能是uPA或其能与uPAR的结合的片段(如ATF或受体结合区域)，多肽2是uPAR或其能与uPA结合的片段(如包括一个或多个ATF结合位点的片段)。多肽1，多肽2和受试物质相互接触，测定未标记的多肽上的标记量，多肽1和多肽2之间相互作用的减少通过测定结合的标记量确定，从而判定该物质抑制uPA与uPAR相互作用的有效性。高通量筛选是指能方便快捷地筛选大量的受试物质的方法。例如许多受试物质与多肽1和多肽2接触，不同的受试物质可以同时或分别与其它的多肽接触。又如，这种方法可以筛选待测物质文库，文库包括天然产物文库，有机化合物文库，联合化合物文库(combinatorialchemicallibraries)，多肽文库，经修饰多肽文库(如包括D型氨基酸，非常用氨基酸或N端取代氨基酸)。这些文库能适用与多孔板(如96孔板)筛选。这些分析特别适用于由计算机控制机器人操作的自动执行程序，文库还可用于其它方式如人工合成化合物文库与固体支持物相连可以得到微滴。除了治疗动脉粥样硬化，抗ATF抗体和抗uPAR抗体还可用于检测或纯化uPA和uPAR。用抗体检测和(或)纯化蛋白质的方法是已知的。本发明的有益效果本发明提供的化合物可以阻断uPA和uPAR的相互作用，可抑制动脉粥样硬化的形成并能改善动脉粥样硬化，可用于制备预防或治疗动脉粥样硬化药物。具体实验数据详见实施例。图1是人、狒狒、小鼠、大鼠、牛、猪和鸡的ATF的氨基酸序列及序列比较。图2是兔、人、小鼠的ATF受体结合的环状区域。图3是人uPAR的氨基酸序列及与人uPA结合的结构域。图4是重组人ATF-人uPAR复合物的三维结构。图5是兔主动脉球囊损伤术后动脉粥样硬化损伤的形成与时间的关系。图6是兔主动脉的显微照片说明静脉注射重组人ATF的抗动脉粥样硬化作用。图7是兔主动脉的显微照片说明用重组人ATF免疫的抗动脉粥样硬化作用。图8是兔主动脉的显微照片说明皮下注射兔抗重组人ATF多抗的抗动脉粥样硬化作用。图9是兔主动脉的显微照片说明重组人ATF免疫加静脉注射重组人ATF的抗动脉粥样硬化作用。图10A是ApoE缺陷小鼠的动脉粥样硬化损伤形成与时间的关系。图10B和10C分别是雄性和雌性ApoE缺陷小鼠主动脉弓和主动脉瓣的动脉粥样硬化损伤的显微照片。图11A和11B分别是雄性和雌性ApoE缺陷小鼠主动脉弓和主动脉瓣的动脉粥样硬化损伤的显微照片，显示重组人ATF免疫的抗动脉粥样硬化效果。图11C和11D分别是雄性和雌性ApoE缺陷小鼠主动脉弓和主动脉瓣的动脉粥样硬化损伤的显微照片，显示静脉注射重组人ATF的抗动脉粥样硬化效果。图11E和11F分别是是雄性和雌性ApoE缺陷小鼠主动脉弓和主动脉瓣的动脉粥样硬化损伤的显微照片，显示皮下注射重组人ATF的抗动脉粥样硬化效果。图10B～图11F中均为主动脉弓(左)和主动脉瓣(右)处的动脉粥样硬化损伤的油红O(ORO)染色图。图12用重组人ATF处理的兔的抗重组人ATF的抗体滴度。处死时rhATF免疫兔的抗体滴度(V)和rhATF免疫加静脉注射rhATF(V+A)约为1∶200,000。两组的抗体滴度没有显著差异。图13抗重组人ATF的抗体对尿激酶激活纤溶酶原活性的影响。所有图中相同的符号代表相同的意思。C代表对照组。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1重组人ATF(rhATF)的制备按照文献(汪晶等，重组人尿激酶原氨基末端片段的制备及活性测定，南京大学学报，2004年1月，第40卷第1期，p64～74)的记载，从人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)中纯化总RNA，经RT-PCR获得人的ATF基因，将ATF基因克隆到大肠杆菌表达载体PET-29a(+)中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。发酵液中表达的rhATF经变复性，再经CM柱和SuperdexG-75柱纯化，得到的样品纯度大于95％。获得rhATF能够阻止uPA与uPAR的结合。实施例2兔主动脉球囊损伤模型中的动脉粥样硬化损伤形成取健康雄性新西兰白兔(2.8-3.5Kg)进行下述实验经耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉兔，仰卧位固定，切开右股动脉，插入4FFogarty导管20cm至腹主动脉，球囊中注入0.85ml生理盐水充盈，温和的拉动充盈球囊10cm，反复四次确保内皮完全损伤，取出导管，缝合伤口，在伤口处涂抹200,000IU青霉素的生理盐水预防感染。术后，立即给兔用高脂饲料(HFD，普通饲料中按重量百分比加入1％胆固醇，5％猪油和7.5％蛋黄粉)喂养7、10、14天。动物处死后，用下述步骤观察受损主动脉处的动脉粥样硬化损伤的形成。先将兔深度麻醉后颈动脉取血，待兔死亡后，从主动脉弓到股动脉分叉的动脉条剥离，截断，用油红O(ORO)染色。用Image-ProPlus5.1(MediaCybernetics，Inc.)图像分析系统确定损伤面积的百分比。用高脂饲料喂养7天的兔在其受损主动脉处有明显的动脉粥样硬化损伤的形成。见图5。图5显示主动脉球囊损伤术后损伤面积的百分数(Lesionareapercentage)随着时间的延长而增加。12只新西兰兔接受主动脉球囊损伤术后分别在第7、10和14天处死。结果用平均值±标准差(n＝4)表示，p＜0.05表示有显著性差异。(*p＜0.05；**p＜0.01)。实施例3静脉注射rhATF阻止兔受损动脉的动脉粥样硬化损伤形成在施予动脉球囊损伤术后，实验组即静脉注射1mgrhATF，每日一次，共七天；对照组中静脉给予PBS。在此期间喂育高脂饲料(HFD)。在动脉球囊损伤术后的第七天处死，观察兔受损主动脉处的动脉粥样硬化损伤的形成。本实验的结果见如图6及表1，与注射PBS的对照组相比静脉注射rhATF的实验组兔受损主动脉处的动脉粥样硬化损伤减少了约50％。表1实施例4rhATF免疫阻止兔受损动脉的动脉粥样硬化损伤形成用rhATF(2mg/只)与完全弗氏佐剂混合免疫兔，每周一次共二次，在第二次免疫的第7天用ELISA测定每只免疫动物的抗体滴度。ELISA测定抗体滴度的方法简述如下用rhATF(1ug/well)包被酶标板，4℃过夜。用含0.1％Tween-20和5％脱脂奶粉的PBS室温封闭2小时，稀释经免疫动物的血清，将稀释后的血清及对照组的血清分别加入各孔后孵育2小时，然后每孔加入100ul辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗兔的二抗(1∶10000倍稀释，Pierce公司产品)并孵育30min，再在每孔中加入四甲基联苯胺(TMB)底物，用酶标仪测OD450nm。样品孔OD450nm的值大于4倍的对照孔的最大稀释度即为该抗体的滴度。如图12所示用rhATF免疫后的兔抗rhATF抗体滴度高于1∶100000。测定抗体滴度后，对免疫兔施予主动脉球囊损伤术，高脂饲料喂育7天后处死，观察受损动脉处的动脉粥样硬化损伤的形成。结果见图7及表2，与用PBS免疫的对照组相比，rhATF免疫组中动脉粥样硬化损伤减少了约50％。表2实施例5皮下注射兔抗rhATF的多抗治疗主动脉球囊损伤兔兔抗rhATF的多抗是用protein-A亲和层析柱纯化rhATF免疫的兔血清制备得到。试验组每只兔皮下注射10mg兔抗rhATF多抗，每周一次，连续四周，对照组注射PBS。在第三周的第3天施予主动脉球囊损伤术，高脂饲料喂育7天后处死，观察受损动脉处的动脉粥样硬化损伤的形成。如图8及表3所示，与对照组相比，用兔抗rhATF多抗治疗组的动脉粥样硬化损伤的减少不明显。再如图7所示，兔抗rhATF多抗治疗动脉粥样硬化的效果，也比rhATF直接免疫的效果差，因此由rhATF免疫诱发的全面的免疫反应对抗动脉粥样硬化治疗是重要的。表3实施例6rhATF免疫和静脉注射rhATF联合治疗主动脉球囊损伤兔如前所述先免疫兔，测定抗体滴度后施予主动脉球囊损伤术。以高脂饲料喂育，静脉注射rhATF(每只兔1mg，每天一次)，7天后处死，观察受损动脉处的动脉粥样硬化损伤的形成。如图9及表4所示，与PBS治疗的对照组相比，rhATF免疫和静脉注射rhATF联合使用的试验组动脉粥样硬化损伤的形成有显著减少。rhATF免疫和静脉注射rhATF联合使用中动脉粥样硬化损伤形成的减少比单独的静脉注射rhATF或rhATF免疫的更明显(见图6和7)。表4实施例7运用ApoE缺陷小鼠模型治疗动脉粥样硬化雄性和雌性的C57BL/6J背景的ApoE杂合系小鼠从Jackson实验室购得(BarHarbar，ME)。在SPF级动物房饲养和繁殖，子代小鼠的基因型用JacksonLaboratory提供(UnderkofflerLAetal.，BiolProcedOnline.2003；5116-122)的PCR方法鉴定，根据基因鉴定的结果选择ApoE缺陷小鼠(ApoE-/-)小鼠饲养在明暗各12小时的空调房间里(温度为20-22℃，相对湿度40-70％)自由饮水进食。ApoE缺陷小鼠分别于12，16，19.5，和22周龄时处死，用下述步骤观察动脉弓处的动脉粥样硬化损伤的形成。小鼠深度麻醉后，用含0.38％柠檬酸三钠的PBS进行心脏灌流，剥离动脉弓，用油红O(ORO)染色。将主动脉瓣切成5μm厚的冰冻切片，置于加拿大树胶处理的玻片上，ORO染色。显微镜下观察，主动脉瓣上ORO染色处即为粥样硬化斑块区域。用Image-ProPlus5.1图像分析系统分析，计算主动脉瓣处的动脉粥样硬化损伤面积。如图10A所示，主动脉弓和主动脉瓣的动脉粥样硬化损伤在19.5周龄的ApoE-/-小鼠上开始形成。ApoE-/-小鼠生长至9周龄时，随机分组。A组用rhATF1mg/ml，与完全弗氏佐剂按体积比1∶1混合，每只小鼠多点皮下注射共0.2ml，每周一次，连续免疫两周。用ELISA方法检测，免疫小鼠抗rhATF抗体滴度高于1∶100,000，见表5。通过加强免疫的方法使抗体滴度在ApoE-/-小鼠19.5周龄前都维持在1∶100,000以上。19.5周龄时处死小鼠，观察主动脉和主动脉瓣处粥样硬化损伤的情况。表5.ATF免疫治疗的ApoE-/-小鼠血清抗原滴度注由于抗rhATF抗体滴度产生较低，444号和445号小鼠在11周龄时追加一次免疫；455号和456号小鼠在13周龄时追加一次免疫；454号和455号在15周龄时追加一次免疫。B组12周龄时，静脉注射rhATF(每只小鼠每天2.8μg)；C组12周龄时，皮下注射rhATF(每只小鼠每天2.8μg)。19.5周龄处死小鼠，观察主动脉和主动脉瓣动脉粥样硬化损伤的情况。A组，B组和C组小鼠的实验结果见表6A和6B及图11A-11F。简言之，在接受治疗的三组中抗动脉粥样硬化作用最强的是rhATF免疫治疗的A组小鼠。静脉给药组(B组)动脉粥样硬化损伤的减少较皮下给药组(C组)明显。该结果可能是由于皮下注射rhATF降解或者吸收不足造成的。在三组动物实验中，雄性抗粥样硬化作用均较雌性明显。该性别差异与ApoE-/-小鼠表现出的性别在动脉粥样硬化形成中的作用一致，见图11A。在兔动脉球囊损伤模型中也观察到性别在动脉粥样硬化中的作用，并与上述结果一致。表6A.19.5周龄雄性ApoE-/-小鼠ORO染色的主动脉瓣粥样硬化损伤情况.表6B.19.5周龄雌性ApoE-/-小鼠ORO染色的主动脉瓣粥样硬化斑块情况实施例8rhATF与uPAR(兔/小鼠)的结合试验用3.8％枸橼酸钠收集兔或小鼠外周血，用PBS按体积比1∶1稀释。稀释后的血液按体积比2∶1小心地加入到淋巴细胞分离液(皓扬生物科学技术有限公司，中国)上，2000rpm，19℃离心20分钟。收集单核细胞层(PBMCs)，PBS洗两次。用含0.1MNaCl的1ml甘氨酸-盐酸缓冲液(50mM，pH3.0)室温孵育细胞3分钟以洗去uPA，再用1mlPBS中和。用甘氨酸-盐酸缓冲液处理后，用含0.1％BSA的RPMI1640培养液洗细胞4次，在同样培养基中与10nM的125I-rhATF4℃孵育1.5小时.离心除去未结合的125I-rhATF后，用PBS洗3次，随后产生的射线用γ计数器检测。上述测定结果显示125I-rhATF能够结合兔uPAR，而不能与小鼠uPAR结合。该实验结果与结构分析的结论是一致的，重组人ATF在结构上与兔ATF比小鼠的更为相似。rhATF在治疗小鼠动脉粥样硬化有效，其抗粥样硬化效应可能是由于rhATF诱导产生抗体，能同时与人和小鼠uPAs(ATFs)作用。实施例9动脉粥样硬化损伤处的uPA的检测兔和小鼠动脉粥样硬化模型见上述方法。称取粥样硬化损伤组织样品的重量，用2×SDS缓冲液提取，用10％聚丙烯酰胺平板Laemmli缓冲系统电泳分离。根据Granelli-Piperno等(Granelli-Pipernoetal.，J.Exp.Med.，148223-234，1978)和Vassalli等(Vassallietal.，J.Exp.Med.，1591653-68，1984)描述的方法进行酶谱(Zymography)分析。通常，电泳后的凝胶先用2.5％TritonX-100洗45分钟，再用0.1Tris-HCl洗1小时，以去除SDS。然后，将凝胶放置在一个含0.0125g/ml琼脂糖，0.02g/ml酪蛋白和10mg/ml纤溶酶原的酪蛋白平板上，37℃孵育过夜。uPA的量根据酪蛋白平板中溶解区域的大小进行半定量推测，参考文献见Lietal.，ThrombosisResearch，103221-232(2001)。在ApoE-/-小鼠粥样硬化斑块中检测到uPA，而在ATF免疫的小鼠未检测到。在兔动脉球囊损伤模型中，经rhATF免疫的动物uPA水平比对照组明显降低。本实验结果表明rhATF免疫是通过抑制uPA和其受体uPAR的结合在治疗动脉粥样硬化中发挥作用。实施例10静脉注射rhATF和rhATF免疫副作用的研究1.血清中uPA的水平rhATF免疫的动物血清中uPA按实施例9的方法进行测定。实验组和对照组动物的血清uPA水平无明显差别，提示rhATF免疫不影响血液中uPA的水平。2.尿激酶的催化活性按下述方法用底物S2444(L-焦谷氨酰-甘氨酰-L-精氨酸-p-硝基苯胺盐酸盐)和纤溶酶原检测抗rtATF抗体对尿激酶催化活性的影响。首先，尿激酶(10nmol/L)分别与兔抗rhATF多抗(3μmol/L)或者兔抗(3μmol/L)孵育1小时后，加入生色底物S2444(0.3mmol/L)。用酶标仪测定波长410nm(参考波长490nm)的光吸收(OD值)随时间的增长得到反应速率Liu，etal.，Blood，81980-7(1993)。其次，先将尿激酶(0.5nmol/L或0.05nmol/L)与抗rhATF多抗或兔IgG混合，再加入H-D-缬氨酰-亮氨酰-L-赖氨酸-对硝基苯胺二盐酸盐(S2251，0.3mmol/L)和纤溶酶原(2μmol/L)，在0.05％磷酸钠，0.15mol/L氯化钠，0.2％牛血清白蛋白，0.01％吐温-80，pH7.8缓冲液中，室温孵育1小时。用酶标仪测定波长410nm(参考波长490nm)的光吸收(OD值)随时间的增长得到反应速率。该实验结果显示兔抗rhATF多克隆抗体对尿激酶水解生色底物S2444和纤溶酶原激活的活性均没有影响。见表7和图13。表7.抗rhATF抗体(Ab)对尿激酶水解生色底物S2444作用的影响3.血液分析收集兔或ApoE-/-小鼠治疗中或处死时的柠檬酸盐血。使用自动血细胞计数仪计数血细胞的种类和数目，结果见表8～表10.rhATF处理的动物中未见明显的血液学参数变化。表8.静脉注射rhATF7天的兔血常规注每组4只兔，用平均数±标准差表示。表9.rhATF免疫的小鼠和对照组的血液学参数注对照组的值用平均值±标准差表示。括号中数目为实验动物数目。表10.静脉注射rhATF的小鼠和对照组血液学参数注小鼠自12周龄始静脉注射rhATF(每只每天2.8μg)，用平均数±标准差表示。4.血脂分析治疗动物的胆固醇，三甘油，高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平在南京大学医院中心实验室检测。如表11所示，在rhATF治疗的兔中未见明显的血脂浓度变化。但是，静脉注射rhATF和rhATF免疫联合使用的动物中三甘油和低密度脂蛋白-胆固醇水平比对照组和单独静脉注射rhATF组低。以上数据表明静脉注射rhATF和rhATF免疫对实验动物的纤维蛋白溶解、血液学参数和血脂水平没有影响。表11.rhATF免疫或静脉注射治疗的兔血脂浓度注V+A，rhATF免疫和静脉注射联合使用；单位为mmol/L；用平均值±标准差表示；每组4只动物.；*p＜0.05；**p＜0.01。实施例11ATFs结构中的MHCII型分子的结合部位根据Singh等描述的方法(Singhetal.，Bioinformatics，17(12)1236-37)得到人、狒狒、大鼠、牛、猪和鸡ATFs中的MHCII类分子结合位点。结果见表12A～表12G。表12A.人ATF表12B.狒狒ATF表12C.小鼠ATF表12D.大鼠ATF表12E.牛ATF表12F.猪ATF表12G.鸡ATF实施例12人类动脉粥样硬化的治疗需要采取该治疗措施的动脉粥样硬化病人是指有可检测到的动脉粥样硬化斑块，或者是有动脉粥样硬化症状的人。此外，具有一个或多个前文所述的动脉粥样硬化诱因的病人也可以采用本治疗方案。药用制剂包含ATF和载体或佐剂，并根据上面描述的方法制备而成。动脉粥样硬化发生之前或发生后给予病人静脉注射剂量为40-100mgATF，一到两个月内两次。若患者血液中抗ATF抗体滴度低于1∶10,000应追加注射。如果病人已经发生了动脉粥样硬化，应每天注射含40-100mgATF的药剂。序列表<110>刘建宁<120>一种阻断uPA与uPAR相互作用的化合物及其应用<160>55<210>1<211>135<212>PRT<213>天然序列，来源于人。<400>1SerAsnGluLeuHisGlnValProSerAsnCysAspCysLeuAsn151015GlyGlyThrCysValSerAsnLysTyrPheSerAsnIleHisTrp202530CysAsnCysProLysLysPheGlyGlyGlnHisCysGluIleAsp354045LysSerLysThrCysTyrGluGlyAsnGlyHisPheTyrArgGly505560LysAlaSerThrAspThrMetGlyArgProCysLeuProTrpAsn657075SerAlaThrValLeuGlnGlnThrTyrHisAlaHisArgSerAsp808590AlaLeuGlnLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnPro95100105AspAsnArgArgArgProTrpCysTyrValGlnValGlyLeuLys110115120ProLeuValGlnGluCysMetValHisAspCysAlaAspGlyLys125130135<210>2<211>322<212>PRT<213>天然序列，来源于人<400>2MetGlyHisProProLeuLeuProLeuLeuLeuLeuLeuHisThr151015CysValProAlaSerTrpGlyLeuArgCysMetGlnCysLysThr202530AsnGlyAspCysArgValGluGluCysAlaLeuGlyGlnAspLeu354045CysArgThrThrIleValArgLeuTrpGluGluGlyGluGluLeu505560GluLeuValGluLysSerCysThrHisSerGluLysThrAsnArg657075ThrLeuSerTyrArgThrGlyLeuLysIleThrSerLeuThrGlu808590ValValCysGlyLeuAspLeuCysAsnGlnGlyAsnSerGlyArg95100105AlaValThrTyrSerArgSerArgTyrLeuGluCysIleSerCys110115120GlySerSerAspMetSerCysGluArgGlyArgHisGlnSerLeu125130135GlnCysArgSerProGluGluGlnCysLeuAspValValThrHis140145150TrpIleGlnGluGlyGluGluGlyArgProLysAspAspArgHis155160165LeuArgGlyCysGlyTyrLeuProGlyCysProGlySerAsnGly170175180PheHisAsnAsnAspThrPheHisPheLeuLysCysCysAsnThr185190195ThrLysCysAsnGluGlyProIleLeuGluLeuGluAsnLeuPro200205210GlnAsnGlyArgGlnCysTyrSerCysLysGlyAsnSerThrHis215220225GlyCysSerSerGluGluThrPheLeuIleAspCysArgGlyPro230235240MetAsnGlnCysLeuValAlaThrAspThrHisGlyProLysAsn245250255GlnSerTyrMetValArgGlyCysAlaThrAlaSerMetCysGln260265270HisAlaHisLeuGlyAspAlaPheSerMetAsnHisIleAspVal275280285SerCysCysThrLysSerGlyCysAsnHisProAspLeuAspVal290295300GlnTyrArgSerGlyAlaAlaProGlnProGlyProAlaHisLeu305310315SerLeuThrIleThrLeuLeu320<210>3<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>3TyrArgGlyLysAlaSerThrAspThr15<210>4<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>4TrpCysTyrValGlnValGlyLeuLys15<210>5<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>5ValGlyLeuLysProLeuValGlnGlu15<210>6<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>6TyrValGlnValGlyLeuLysProLeu15<210>7<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>7MetValHisAspCysAlaAspGlyLys15<210>8<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>8TrpAsnSerAlaThrValLeuGlnGln15<210>9<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>9TyrValGlnValGlyLeuLysGlnArg15<210>10<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>10ValGlyLeuLysGlnArgValGlnGlu15<210>11<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>11TyrArgGlyLysAlaAsnThrAspThr15<210>12<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>12PheGlnCysGlyGlnLysAlaLeuArg15<210>13<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>13PheSerArgIleArgArgCysSerCys15<210>14<211>10<212>PRT<213>天然序列<400>14TrpCysTyrValGlnIleGlyLeuArgIle1510<210>15<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>15IleArgArgCysSerCysProArgLys15<210>16<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>16TyrValGlnIleGlyLeuArgGlnPhe15<210>17<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>17ValGlnIleGlyLeuArgGlnPheVal15<210>18<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>18TyrLysTyrPheSerArgIleArgArg15<210>19<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>19MetValHisAspCysSerLeuSerLys15<210>20<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>20TyrPheSerArgIleArgArgCysSer15<210>21<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>21PheSerSerIleArgArgCysSerCys15<210>22<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>22TrpCysTyrValGlnIleGlyLeuLys15<210>23<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>23IleArgArgCysSerCysProLysLys15<210>24<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>24TrpAsnSerProAlaValLeuGlnGln15<210>25<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>25TyrPheSerSerIleArgArgCysSer15<210>26<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>26TyrValGlnIleGlyLeuLysGlnPhe15<210>27<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>27TyrLysTyrPheSerSerIleArgArg15<210>28<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>28MetValGlnAspCysSerLeuSerLys15<210>29<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>29PheSerAsnIleGlnArgCysSerCys15<210>30<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>30TyrPheSerAsnIleGlnArgCysSer15<210>31<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>31TyrLysTyrPheSerAsnIleGlnArg15<210>32<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>32TyrArgGlyLysAlaAsnArgAspLeu15<210>33<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>33ValGlnPheCysMetValGlnAspCys15<210>34<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>34ValGlnIleGlyLeuLysGlnPheVal15<210>35<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>35MetValGlnAspCysSerValGlyLys15<210>36<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>36LeuLysMetTyrHisAlaHisArgSer15<210>37<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>37PheSerAsnIleGlnArgCysSerCys15<210>38<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>38TyrArgGlyLysAlaAsnThrAsnThr15<210>39<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>39TrpCysTyrValGlnValGlyLeuLys15<210>40<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>40TrpAsnSerAlaThrValLeuLeuAsn15<210>41<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>41ValGlyLeuLysGlnLeuValGlnGlu15<210>42<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>42TyrPheSerAsnIleGlnArgCysSer15<210>43<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>43TyrValGlnValGlyLeuLysGlnLeu15<210>44<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>44TyrLysTyrPheSerAsnIleGlnArg15<210>45<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>45ValTyrIleArgGlnTyrTyrLysLeu15<210>46<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>46ValIleArgTrpGlyAspTyrHisAla15<210>47<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>47TyrTyrLysLeuSerHisLysHisArg15<210>48<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>48TyrHisAlaAspLeuLysAsnAlaLeu15<210>49<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>49TrpCysTyrThrLysArgArgTyrSer15<210>50<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>50PhePheSerGlnIleLysArgCysLeu15<210>51<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>51LeuYyrTrpAspHisProSerValIle15<210>52<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>52TyrArgPhePheSerGlnIleLysArg15<210>53<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>53TyrSerIleGlnGluThrProCysSer15<210>54<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>54IleArgGlnTyrTyrLysLeuSerHis15<210>55<211>9<212>PRT<213>天然序列<400>55TyrLysTyrPheSerAsnIleTrpArg1权利要求1.一种阻断uPA与uPAR相互作用的化合物，其特征在于该化合物包括ATF、ATF片断、uPAR片断、抗ATF的抗体、或者抗uPAR的抗体；其中ATF是uPA的ATF。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于ATF是氨基酸序列为SEQIDNO1的多肽，或者是氨基酸序列与SEQIDNO1至少有70％同源性的多肽，较好的是至少有80％同源性的多肽，更好的是至少有95％同源性的多肽，尤其是至少有98％同源性的多肽，最好是至少有99％同源性的多肽；且该多肽具有抗动脉粥样硬化活力。3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于该化合物是人ATF与其受体的结合区域被其它物种的ATF与其受体结合区域所替代的嵌合型的人ATF。4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于其他物种为哺乳动物或非哺乳动物；其中哺乳动物优选狒狒、小鼠、大鼠、兔、牛或猪；非哺乳动物优选鸡。5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于ATF以及ATF片断中含有SEQIDNO.3～55中任一序列的氨基酸残基。6.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于抗ATF的抗体的氨基酸序列包含SEQIDNO2中任一片段的多肽，该片段包括至少一个ATF结合位点。7.根据权利要求6所述的化合物，其特征在于该片段至少由8个氨基酸组成；优选该片段至少由15个氨基酸组成。8.根据权利要求6所述的化合物，其特征在于ATF结合位点相当于SEQIDNO2的下列结合位点中的一个或多个T8，R25，V29，L31，L40，R53，L55，Y57，L66，E68，R137，K139，R142，H143，R145，H166，H251，L252，D254，或A255。9.权利要求1所述的化合物与能延长其在病人身体中半衰期的物质偶联或融合；通常采用该化合物与聚乙二醇(PEG)共价连接；或者该化合物与钥孔虫戚血蓝素(KLH)共价连接；或者该化合物与白蛋白单独混合使用；或者该化合物与PEG及白蛋白混合使用，或者该化合物与KLH及白蛋白混合使用。10.表达权利要求1所述化合物的核苷酸序列。11.一种药物组合物，其特征在于含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物及药学上允许的辅料。12.权利要求1～10所述的任一化合物在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种阻断uPA与uPAR相互作用的化合物及其应用。该化合物包括ATF、ATF片断、uPAR片断、抗ATF的抗体、或者抗uPAR的抗体；其中ATF是uPA的ATF。该化合物可阻断uPA与uPAR的相互作用，可用于制备预防或治疗动脉粥样硬化药物。文档编号A61P9/10GK101050237SQ20071002043公开日2007年10月10日申请日期2007年2月26日优先权日2007年2月26日发明者刘建宁申请人:刘建宁